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Medicine

主动脉钙化和炎症血管平滑肌细胞和成像的钙化

Published: May 31, 2016 doi: 10.3791/54017
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 2, 1, 2, 1, 1, 1, 1,4, 1,4, 2,4, 1,2,4, 5, 1,4, 3,4, 1,2,4, 3,4, 1,5,6, 2,4
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital
* These authors contributed equally

Introduction

心血管疾病是发病率和死亡率在世界上的首要原因，包括美国在那里它占每年超过78万例死亡。1冠状动脉钙化和主动脉钙化是动脉粥样硬化性疾病的标志，服务心血管事件的强预测因子。2- 4两种主要类型的血管钙化已经报道在成人：内膜钙化，与动脉粥样硬化有关，和内侧（也称为Mönckeberg）钙化，慢性肾脏疾病和糖尿病相关的脂质积累和巨噬细胞的设置发生5内膜钙化。浸润到血管壁。5,6-内侧壁钙化发生独立的内膜钙化，定位于弹性蛋白纤维或平滑肌细胞，并且不与脂质沉积或巨噬细胞浸润有关。5,7,8研究的分子机制血管钙化都依赖细胞系和动物模型系统。对于atherocalcific疾病的啮齿动物模型包括小鼠在任一载脂蛋白E（ApoE基因）9,10或低密度脂蛋白受体（LDLR）11喂食高脂肪食物不足，而型号为膜钙化包括与基质Gla的蛋白质的小鼠（MGP）缺乏症12，或任一由邻近总肾切除术（5/6肾切除模型）或通过暴露于高腺嘌呤饮食开发尿毒症大鼠13

在这里，MGP缺乏相关的内侧血管钙化模型的重点是。 MGP是抑制动脉钙化的细胞外蛋白。在MGP基因12的突变已在Keutel综合征，一种罕见的人类疾病除了brachytelephalangy特征在于漫射软骨钙化，听力丧失，外围肺动脉狭窄已确定。14-18虽然未经常观察，19多动脉钙化同心已经Keutel综合征24被描述。同时，未羧化，无生物活性MGP更高的循环水平预测心血管疾病的死亡率在人类基因MGP 20种常见多态性与冠状动脉钙化风险增加，21-23有关。与人类不同与Keutel综合征，MGP缺陷小鼠制定严重的血管型自发组成的广泛动脉钙化的开始两周年龄和出生后死亡6-8周因主动脉破裂。12

不像的ApoE - / -和LDLR - / -小鼠饲喂高脂肪的饮食，其发展与相关巨噬细胞诱导的炎症内膜血管钙化，MGP - / -小鼠发展内侧血管钙化在没有巨噬细胞浸润的11,25虽然这些研究结果表明为intim不同的潜在刺激人及内侧钙化，有在介导有助于血管钙化包括炎症介质例如肿瘤坏死因子α和IL-1和促成骨因子钙化。26多个信号通路已经鉴定的两种形式的信号机制重叠如缺口，Wnt信号，和骨形态发生蛋白（BMP）信令。27,28，这些信号传导途径增加了转录因子侏儒相关转录因子2（Runx2的）和osterix的，这反过来又增加骨相关蛋白表达的表达（ 如 ：，骨钙素，硬化，和碱性磷酸酶）在介导钙化脉管28-30我们和其他人已经表明，在ApoE基因中观察到的血管钙化- / -和LDLR - / -小鼠喂食高脂肪饮食和自发/ - -在MGP观察血管钙化小鼠都依赖于骨形态发生蛋白（BMP）SIgnaling，它是这一途径，重点是在这里。11,25,31 BMP是骨形成所需的强效的成骨因子和已知呈现在人类动脉粥样硬化的增加的表达。32-34 体外研究在调节牵连BMP信号成骨因子如Runx2的表达。35-37表达的BMP配体，BMP-2，加速血管钙化中的ApoE缺陷小鼠发展喂食高脂肪的饮食。38此外，信令抑制剂例如使用特定的BMP作为LDN-193189（LDN）39,40和/或ALK3-Fc的防止血管钙化的发展都LDLR - / -小鼠喂食高脂肪的饮食和MGP缺陷小鼠11,25。

血管平滑肌细胞（VSMC）在血管钙化的发展具有关键作用。30,41,42内侧血管钙化，在开发MGP缺陷小鼠是CHARAC由血管平滑肌细胞的转terized到成骨表型。 MGP的结果，包括心肌素和α-平滑肌肌动蛋白VSMC标志物的表达减少损失，具有成骨标记，如Runx2的骨桥蛋白和随之而来的上升。这些变化与血管钙化的发展相吻合。25,43,44

主动脉钙化和小鼠的炎症通常是评估利用组织化学技术，如早期钙化和成骨活性，冯·科萨和茜素红染色后期钙化碱性磷酸酶活性，并针对巨噬细胞蛋白标志物（ 如免疫组化协议，CD68，F4 / 80，苹果-1，Mac的-2，Mac的-3）。9,45然而，这些标准成像技术需要主动脉组织成横截面的处理，这是耗时和不完善由于抽样偏差，并且被限制了它们的量化炎症和calcificat能力离子在整个主动脉。这个协议描述的方法来可视化和量化整个主动脉和中型动脉钙化和利用近红外荧光（NIR）分子成像体外的巨噬细胞积聚。还提供了用于收集和小鼠培养初级主动脉平滑肌细胞和诱导的方法为了鼠和体外人平滑肌钙化来确定血管钙化的分子机制。这些技术提供了研究者在体内和在研究atherocalcific疾病的体外方法用。

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Protocol

严格按照指南中的建议为美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用进行小鼠所有的研究。住房和涉及本研究中所描述的小鼠的所有程序是由马萨诸塞州总医院的机构动物护理和使用委员会（小组委员会研究动物保健）的批准。所有的程序都小心进行，以尽量减少痛苦。

1.试剂的制备

  1. 所有主动脉的近红外荧光成像
    注：A二膦酸盐衍生的，近红外荧光成像探针可用于通过46,47结合羟磷灰石来标记在脉管成骨活性的组织蛋白酶活化荧光成像探针可作为巨噬细胞的蛋白酶解和弹性蛋白酶在标记。脉管9要允许同时使用荧光探针的，重要的是以使用在光谱上不同的探针。符号钙NIR将被用于指示特定钙化近红外荧光成像探针和组织蛋白酶NIR指示组织蛋白酶活动专有近红外荧光成像探针。
    1. 准备钙NIR和组织蛋白酶NIR的解决方案。根据制造商的协议，添加1.2毫升1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）的含有钙NIR或组织蛋白酶NIR 24纳摩尔的小瓶中并轻轻摇动。
      注：根据制造商，一旦与PBS重组，在2-8℃下避光保存时，钙NIR和组织蛋白酶NIR解决方案仍然是14天稳定。
  2. 隔离和小鼠主动脉平滑肌细胞钙化
    1. 主动脉消化解决方案：
      1. 制备含有175单位/毫升的2型胶原酶和1.25 U / ml的蛋白酶新鲜溶液（〜3-5毫升，每主动脉收获）用Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中。灭菌水溶液W第i个0.22微米真空驱动过滤系统，并保持在冰上的解决方案，直到使用。
    2. 细胞培养基：
      1. 补充500毫升Dulbecco氏改良Eagle培养基（DMEM）中的10％胎牛血清，100单位/ ml青霉素，和100μg/ ml链霉素。温热至使用前的媒体至37℃。
    3. 钙化媒体：
      1. 钙化媒体A（NaPhos;在小鼠细胞系使用）：
        1. 补充100-500毫升的DMEM（体积根据需要），用10％胎牛血清，2 mM磷酸钠，100单位/ ml青霉素，和100μg/ ml链霉素。温热至使用前的媒体至37℃。

          要么
      2. 钙化介质B（βGP/ ASC / DEX;在小鼠或人细胞系中使用）：
        1. 补充100-500的DMEM毫升（体积如需要），用10％胎牛血清，10mM的β-甘油二钠，50微克/毫升L-抗坏血酸，10纳米塞米松，100单位/ ml青霉素，和100μg/ ml链霉素。温热至使用前的媒体至37℃。

2.尾静脉注射

  1. 尾注射前，温热温和加热灯下小鼠5分钟。
  2. 抑制在管啮齿类支架鼠标。用消毒酒精棉签尾巴。
  3. 为利用尾静脉注射为30G针头。尾静脉位于侧面。
    1. 应用在注射器向前压力的温和量当针被推进到尾。静脉被访问一次注射的电阻不再存在。
    2. 注入100μl的钙NIR和/或100微升蛋白酶NIR的体积以稳定的速度。在注射结束时，一个5秒的暂停后，撤回的针头。
  4. 收获了主动脉（见第3节）注射后3-24小时。

3.鼠标解剖

  • 安乐死鼠标采用了200毫克/公斤腹腔注射巴比妥。
  • 躺在的夹层板动物仰卧和每个爪子录音向董事会稳定。使用解剖显微镜和小剪刀，使从下腹部延伸到上部胸部一个中线切口。
  • 剥开用钳子皮肤和去除腹膜，露出腹部器官。取出胃肠器官，注意不要横切主动脉。
  • 使前膜片的横向切口，并继续穿过腹部切口。用解剖剪，通过肋的侧面切削去除软组织附着在胸骨的上部释放胸腔。取出肋骨，揭示了肺。
  • 留在原地的心脏开始（以帮助识别和解剖近端主动脉），并小心地取出肺。取出胸腺，气管，食管和谨慎，ensuri纳克的主动脉保持不变。
  • 使用直细镊子和微解剖剪刀，去除软组织髂分叉主动脉周围的主动脉弓，取出围主动脉脂肪（ 图 1A）时，请特别注意。除去周围主动脉弓（ 即头臂，颈和锁骨下动脉， 图1B）的大树枝剩余的脂肪和软组织。
    注意：从主动脉除去脂肪，因为在进行荧光摄像时脂肪可增加背景信号是很重要的。
  • 从胸腔中取出心脏，小心地从近端主动脉分离，再将其丢弃。在样髂分叉远端主动脉。使用胰岛素针，注射生理盐水进入主动脉从主动脉弓洗出剩余的血细胞。拆下主动脉主动脉弓船沿，完全删除它从主体。
  • 放置在冰上生理盐水溶液中的主动脉，直到准备用于成像。

    • 4.主动脉成像

    1. 图片主动脉体外立即收获近红外荧光反射成像后25
      1. 在适当的多信道波长设置荧光成像器，从钙的NIR和组织蛋白酶NIR-注射的小鼠的主动脉量化荧光信号强度，如前面所述。25根据生产商，钙NIR可以通过〜650-678纳米的光与被激发在680-700〜nm范围内的最大排放量。组织蛋白酶NIR可以通过〜745-750纳米的光与〜770纳米的最大发射激发。

    5.隔离原代鼠主动脉血管平滑肌细胞

    1. 如上所述执行步骤3.1-3.7。
    2. 将主动脉冷HBSS直至解剖完成。小心切掉任何REM癌宁主动脉周围脂肪和软组织，只留下主动脉。
    3. 下的无菌组织培养罩，转移主动脉到主动脉消化解35毫米×10毫米组织培养皿中。地方在37℃温和间歇摇动30分钟的孵化器。消化后，将主动脉表现出拉伸或磨损的外观。
    4. 用解剖显微镜和无菌镊子，取出主动脉的外外膜层同时保持内侧层完好。除去外膜的一种技术是在一端剥离主动脉的外层和底层中间层像短袜可剥离背面除去其删除。
    5. 一旦外膜层已被去除，并将其余主动脉与细胞培养基并储存一个新的组织培养皿在37℃，5％CO 2的2-4小时。
    6. 在无菌罩，并用无菌3毫米显微解剖剪，主动脉到1-2毫米宽戒指。
    7. 放置在主动脉消化解一个新组织培养皿这些环，并在37℃下轻轻摇动间歇120分钟孵育。吸取该温育重悬细胞中的溶液上下数次。
    8. 5毫升温暖细胞培养基加入到消化溶液，并转移到15毫升锥形管中。
    9. 离心管，在200×g下5分钟。
    10. 吸媒体和悬浮细胞在细胞培养基（ 例如 ，5ml）中的所需量。
    11. 从在的25cm 2细胞培养烧瓶中的每个主动脉板分离的细胞的全部的量，并在37℃用5％CO 2孵育。传播用标准技术的细胞，如前面所述。25,48在孵育的最初7-10天，改变介质每72-96小时。随着细胞汇合接近，补充媒体更频繁（每隔48小时）。
      注意：这可能需要几个星期长出足够QUA细胞ntity。
    12. 一旦汇合，用胰蛋白酶代细胞被加热到37℃。
      1. 添加0.5-1.0 ml胰蛋白酶的每个培养瓶中，孵育3-5分钟;根据需要从表面分离细胞轻轻敲打烧瓶的侧面每30-60秒。
      2. 一旦细胞从烧瓶底部分离，在胰蛋白酶加入10 ml的细胞培养基的细胞中。离心细胞，在200×g离心5分钟。从细胞沉淀中吸出介质和胰蛋白酶。悬浮细胞在新鲜细胞培养基（ 例如 ，5-10毫升）的所需量，并转移到新的烧瓶（带转移至腔室滑动一些细胞）。
    13. 在细胞的第一通道，确认与标准的免疫细胞化学技术，平滑肌细胞谱系，如前所述，49使用针对α平滑肌肌动蛋白的抗体。

    6.培养平滑肌诱导钙化细胞

    1. 从5.12在6孔格式获得的板的细胞。注意：用1×10 5细胞/孔在2.0 ml的细胞培养基的总体积开始每建议很好。
    2. 让细胞在钙化媒体A或B生长至少7天的6孔板格式。孵育细胞在37℃，5％的CO 2。
    3. 改变细胞介质每48小时。

    7.评估VSMC钙化使用冯Kossa染色方法

    注意：用于测量组织或培养细胞的细胞外基质钙化冯科萨方法是基于磷酸盐结合的钙离子与银离子的置换50在光和有机化合物的存在下，银离子被还原并且可视化为金属银。任何未反应的银通过用硫代硫酸钠处理，除去50为冯Kossa染色的方案如下：

    1. 从细胞吸铜介质lture板。
    2. 通过在室温下将其放置在1毫升10％福尔马林的20分钟固定细胞。
    3. 除去福尔马林，并用蒸馏水洗涤固定细胞5分钟。
    4. 孵育细胞在1ml的5％硝酸银溶液中的60-100W¯¯灯泡1-2小时下。
    5. 吸出硝酸银溶液，并用蒸馏水冲洗5分钟。
    6. 通过将细胞在1毫升5％硫代硫酸钠的（重量/体积）的蒸馏水溶液中5分钟，除去未反应的银。
    7. 用蒸馏水冲洗细胞5分钟。重复洗涤3倍。冯·科萨染色准备好与标准倒置光学显微成像。
    8. 可选步骤：用核固红1毫升染液5分钟。用洗涤三次，用蒸馏水（每次5分钟）按照此。

    要么

    8.评估血管平滑肌细胞钙化与近红外荧光成像

    注：在力所能及的类似鼠标主动脉内识别钙化，钙NIR容易结合培养细胞钙化沉积矿物。使用这种技术，荧光显微镜和板读者长波长的过滤器可以在图像和量化体外钙化，分 ​​别。钙NIR的长波长发射允许更低波长发射荧光团的同时利用检测其它功能。钙NIR染色的协议如下：

    1. 正如第1.1.1节所述，加1.2毫升1X PBS以含钙NIR的24纳摩尔小瓶。
    2. 在适当的钙化或控制媒体100的稀释：钙NIR股票1。
    3. 从培养板吸细胞介质，并与含钙NIR-培养基更换。
    4. 孵育钙NIR介质培养板在37℃下过夜。
    5. 吸从孔中的介质，并用PBS洗一次孔中。
      注意：在这一点上，原始培养介质可被加入到孔中，并且细胞可以实时成像。否则，请继续下面的步骤。
    6. 通过在室温下将其放置在1毫升10％福尔马林的20分钟固定细胞。
    7. 除去福尔马林，并用蒸馏水洗涤固定细胞5分钟。重复洗涤3倍。
    8. 可选步骤：执行免疫荧光染色或其他counterstains感兴趣蛋白质8,9
    9. 图片或使用相应的荧光激发的波长（ 例如 ，钙NIR可以通过650-678纳米的光激发）和发射器（680-700〜nm）的检测钙NIR污点。

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    Representative Results

    / - -在MGP主动脉钙化和野生型小鼠中使用钙NIR荧光成像测定。在从野生型小鼠的主动脉中没有检测到钙的NIR信号，指示不存在钙化的（ 图2）。从MGP缺陷小鼠，这是与先进的血管钙化一致主动脉检测到强烈的钙NIR信号。从野生型和主动脉的组织切片MGP - / -小鼠用茜素红25（ 图3A - B）中染色，证实在MGP缺陷小鼠中观察到没有在野生型小鼠中检测钙化的广泛血管钙化。以确定与MGP缺乏相关的血管钙化是否依赖于BMP信号传导，MGP - / -小鼠用LDN，ALK3-Fc的，或载体处理开始于生命的第1天。这些小鼠用钙NIR注射第27天及主动脉收获翌日。 BMP药物抑制信令减少钙NIR（ 图2）检测主动脉钙化。 - / -小鼠（ 图3B - D）与钙NIR结果相似，LDN-和的主动脉ALK3-Fc的处理MGP - / -相比载体处理MGP当小鼠减少了茜素红染色为钙。这些结果表明，BMP信号需要在MGP观察到的血管钙化- / -小鼠。

    LDLR - / -小鼠喂食高脂肪饮食发展动脉壁的两个巨噬细胞的炎症和钙化钙化和特定组织蛋白酶的11同时尾静脉注射的NIR探针在MGP - / -进行的小鼠，以确定是否MGP的血管钙化-deficiency与巨噬细胞聚集相关的25 LDLR - / -小鼠喂食高脂肪饮食和野生型小鼠分别用作阳性和阴性对照。从野生型小鼠的主动脉几乎没有表现出钙NIR或组织蛋白酶NIR信号，如预期的（ 图4A）。 / - -在LDLR中观察到的青睐主动脉弓区域合作本地化钙NIR和组织蛋白酶NIR信号的小鼠，表明在这个模型内膜动脉粥样硬化的巨噬细胞浸润和血管钙化之间有很强的相关性。 / - -尽管在MGP的主动脉中观察到一个弥漫强钙NIR信号小鼠中，组织蛋白酶NIR信号是从野生型小鼠的没有什么不同。这些结果表明，在MGP不足的血管钙化在没有巨噬细胞聚集的发生。为了进一步证实这些发现，从野生型，MGP主动脉- / - ，和LDLR - / -小鼠收获，切片，染色与特异于巨噬细胞标记物的MAC-2（抗体- / -小鼠表现出丰富的MAC-2染色;没有检测到的MAC-2染色在MGP的主动脉- / -小鼠，表明不存在血管的巨噬细胞。

    在含介质的高磷酸盐，使用上述的协议小鼠和培养- / -模型体外血管钙化，主动脉平滑肌细胞，从野生型和MGP隔离。为了确定MGP在调节培养的血管平滑肌细胞的钙化作用，表达MGP的腺病毒（Ad.MGP）被用来在从MGP主动脉平滑肌细胞恢复MGP - / -小鼠。感染用表达绿色荧光蛋白（Ad.GFP）的腺病毒MGP缺陷平滑肌用作对照。此外，为了确定从对随后钙化血管平滑肌除去MGP表达的效果，从野生型小鼠的主动脉平滑肌细胞用的siRNA针对MGP（siMGP）处理或对照siRNA（SISC）。钙化是由不断增长的钙化媒体A中的细胞培养7天培养的血管平滑肌细胞诱导。随后将细胞固定并用冯科萨法染色钙。 MGP与Ad.MGP恢复降低MGP钙化- / -平滑肌相比，控制的腺病毒处理的细胞（ 图5A - B，E）。与siMGP野生型主动脉血管平滑肌，导致> 95％MGP表达击倒治疗，25增加钙化相比SISC处理的细胞（ 图5C - D，F）。这些结果表明，血管平滑肌细胞的钙化模仿这种体外模型在MGP缺陷小鼠的结果，并表明，MGP调节培养的血管平滑肌细胞的钙化。

    于检测培养的血管平滑肌细胞的钙化的另一种方法是用钙NIR。为了模拟第五血管钙化 itro，人冠状动脉平滑肌细胞被购买并培养21天钙化媒体B.继治疗期间，钙化是使用钙的NIR方法鉴定和培养物复染与自定义绿色荧光胶原探针51和Hoechst的染料（1微克/毫升，在10％福尔马林固定后，5分钟）（ 图6）。通过共聚焦显微镜（ 图6A）蓝色Hoechst的荧光观察VSMC细胞核。代表性的光学部分示出了由血管平滑肌细胞（ 图6B）中产生的胶原基质内钙近红外染钙化矿物。光学Z-堆叠的三维重建示出了在培养创建为上的井产生其中所沉积的钙化矿物变得截留（ 图6C - D）一种胶原基质底部的血管平滑肌细胞的层。

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    图1：从野生型小鼠的主动脉夹层代表 （A）胸椎和延伸至髂总动脉分叉处腹主动脉的图片被去除覆机关和近郊主动脉脂肪后表示。 （B）聚焦视图主动脉弓与头臂，左颈，和左锁骨下动脉。比例尺= 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图2
    图2：血管钙化中MGP - / - 小鼠是对BMP信号相依 MGP - / -的任一小鼠用腹腔内治疗（ip）注射已经。 hicle，LDN-193189（LDN，2.5毫克/千克/天），或ALK3-Fc的（2毫克/千克隔日）和野生型小鼠用车辆的腹腔注射处理在生命的第1天开始至第28天时。第27天，小鼠用钙NIR经尾静脉注射。主动脉收集在第28天，并用近红外荧光成像。图像在所有四个面板，指示3mm处比例尺相同的放大倍率。 - / -小鼠产生了强烈的钙NIR信号而从MGP主动脉野生型小鼠主动脉没有表现出钙NIR信号。相比载体处理MGP - / -小鼠，MGP的主动脉- / -与任一LDN或ALK3-Fc处理的小鼠表现出显著减少钙近红外信号。这个数字是从参照图25所。 请点击此处查看本图的放大版本。

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    图3：BMP 信号传导防止主动脉钙化的药物抑制在MGP缺陷小鼠野生型小鼠用载体（A）和腹腔注射处理MGP - / -小鼠用车辆（B）LDN任腹腔注射处理。 （C，2.5毫克/千克/天），或ALK3-Fc的（D，2毫克/千克隔日）开始在直到第28天主动脉收获，切片，染色钙茜素红生命的第1天。图像是在所有四个面板与表示400微米的比例尺相同的放大倍数拍摄。类似于图2中的钙NIR信号，茜素红染色表明钙化在赋形 ​​剂处理MGP的主动脉的沉重负担- / -小鼠。钙化在LDN-和的主动脉降低ALK3-Fc的处理MGP - / -小鼠。这个数字是取自参考25。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图4
    图4：主动脉钙化及巨噬细胞浸润钙NIR和组织蛋白酶NIR同时测定 （A）野生型，MGP - / - ，和低密度脂蛋白受体- / -小鼠喂食高脂肪的饮食与钙NIR和组织蛋白酶NIR注射经尾静脉注射。主动脉收集24小时后，用近红外荧光成像进行评估。图像在显示与3mm处比例尺相同的放大倍率。野生型小鼠显示出几乎没有主动脉钙化或巨噬细胞的存在。从LDLR主动脉- / -小鼠有广泛钙化的共定位与巨噬细胞聚集。与此相反，MGP - / -小鼠具有发生在没有巨噬细胞浸润的主动脉钙化。 （B）主动脉野生型收获，MGP - / - ，和低密度脂蛋白受体- / -小鼠喂食高脂肪的饮食。这些主动脉切片并染色的巨噬细胞与MAC-2特异性的抗体。细胞核用DAPI染色。的腔表面是朝着在每个面板的右侧。图像在所有三个面板与表示为100μm比例尺相同的放大倍数拍摄。类似于在（A）中的结果，出现了在MGP的主动脉无巨噬细胞积累的证据- / -小鼠。这个数字是参考25这个数字的修改版本。 请点击这里查看该图的放大版本。

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    图5： - / - MGP保护培养的VSMC从钙化培养的主动脉平滑肌细胞从MGP分离小鼠和感染腺病毒表达或GFP（A）或MGP（B）。从野生型小鼠中分离的主动脉平滑肌细胞与加扰的siRNA（C）或siRNA的靶向MGP（D）的任一控制转染。细胞在钙化介质A中生长7天，随后固定并用冯科萨染色。 （ - D A），指示200微米的比例尺图像是在相同的放大倍率在所有四个面板服用。的视图序列字段被拍照并使用影像j软件背景扣除后（E和F）钙染色量化，与表示SEM误差线。该图是从参照图25的图的修改版本。4017fig5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

    图6
    图6：钙NIR标识钙化的协会与细胞外基质 在体外 （A）人类的冠状动脉血管平滑肌细胞钙化介质B培养21天通过核染色用染料赫斯特确定。用绿色荧光胶原探针组合（B）中由钙NIR染色（红色）的共聚焦显微镜获得的光学部分显示整个胶原基质钙化矿物。图像A - B在有指示10微米的比例尺相同的放大倍率拍摄。 （C和D）的三维重建显示t的范围内的钙化矿物的包封他胶原基质。 请点击此处查看该图的放大版本。

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    Discussion

    动脉钙化是人类的心血管疾病的重要危险因素，并可能直接向心血管事件的发病贡献。在动脉粥样硬化性疾病的薄纤维帽1,5,52内膜钙沉积已提出增加本地生物力学应力并有助于斑块破裂。通过增加动脉僵硬度，从而可诱发心肌肥厚，影响心脏功能53,54膜钙化影响临床疗效。55因此，了解背后血管钙化将提供重要的见解人类疾病和可能确定新的目标的分子机制治疗。

    这里，描述了用于检测主动脉钙化，并在动脉粥样硬化和利用NIRF成像血管钙化的鼠模型的巨噬细胞积累的方法。9，这一点至关重要准确注入近红外˚F剂到尾静脉。这是一个需要掌握实现之前显著实践的技术。56另外，从主动脉去除所有的周围主动脉脂肪，因为这种脂肪可以在相同的波长的钙NIR和组织蛋白酶引起自体荧光信号是非常重要的近红外信号。使用NIRF代理商拥有超过评估血管钙化和炎症的组织学的标准方法，很多重要的优点。与常规的组织学技术，这些试剂允许整个主动脉钙化和巨噬细胞浸润的量化。此外，它们用于检测与主动脉钙化的发展比组织学染色相关的早期变化提供更敏感的方法，因此，可以提供机械的见解疾病的早期阶段。早期钙NIR信号的9站点与骨形成标记物相关联的包括增加碱性磷酸酶活性逢l由于Runx2的骨桥蛋白和基因表达。此外，同时使用光谱不同的探针钙化和组织蛋白酶的活性能够量化和动脉粥样硬化都和钙化疾病的时空进展的相关性。9

    确定在我们的血管疾病的病理生理机制的理解血管钙化和炎症艾滋病的时空特征。例如，使用NIRF剂已经证明，在内膜钙化模型（ApoE基因- / -和LDLR - / -在高脂肪饮食的小鼠），血管钙化共定位于巨噬细胞聚集的位点（ 图4）和钙化如下的巨噬细胞在时间上的累积。9,11有趣的是，在MGP缺陷小鼠中发现的内侧血管钙化中检测组织蛋白酶NIR无巨噬细胞积聚。25星期四S，从利用NIRF剂实验，可以得出结论，尽管巨噬细胞聚集与血管内膜钙化有关，它不需要用于血管内侧钙化。

    其在成像和研究血管疾病的作用相似，NIRF成像已经被用于研究主动脉瓣疾病。47主动脉瓣疾病是由在阀载脂巨噬细胞和钙化病变标记并表现出相似的分子机制和遗传因素如动脉粥样硬化57-59主动脉瓣钙化引起小叶功能受损，是老年人临床主动脉瓣狭窄的主要原因。目前可用于症状的主动脉瓣狭窄的唯一治疗是瓣膜置换。更好地理解主动脉瓣疾病的分子机制是必要的，以防止后期逐行主动脉瓣钙化的临床并发症。 NI的利用RF剂分子成像工具的动物模型提供了在其早期阶段评估主动脉瓣病变的敏感方法。60

    的标准技术来可视化冠状动脉斑块都集中在狭窄的严重程度，但多数急性冠状动脉综合征的非流限制性斑块的破裂引起的。斑块内6生物学过程，如炎症，作为斑块破裂的更好的预测比狭窄61的程度相对于常规成像技术，NIRF成像提供以测量细胞活性（ 即 ，巨噬细胞与基质金属蛋白酶（MMP）活化剂，具有组织蛋白酶NIR蛋白酶和弹性蛋白酶的蛋白水解活性，和成骨活性的机会与钙NIR）。9本方法因此提供了心血管疾病的同时功能和解剖评估。 NIRF成像利用电子在650至900纳米范围内，其具有增加的组织渗透的优点相比，在较低的波长的光xcitation波长，因此允许病病灶更深入评估。60另外也减少血管组织的自体荧光背景信号，在不久的 - 红外波长范围。虽然该协议的重点是利用NIRF成像体外的，NIRF成像也代表用于体内纵向分子成像的有用的平台。9 NIRF成像，当与活体显微镜相结合，可以具有将来诊断应用在人类。61然而，限制钙成像NIR纵向是双膦酸盐衍生探头本身可能改变钙化的生理过程。62

    心血管钙化是一个主动调节的过程，涉及的血管平滑肌细胞向成骨细胞表型转分化。25,41,42 63，并已取得每鼠主动脉细胞足够数量进行体外研究（ 图5）。另一种我为的ThOD VSMC隔离不涉及酶消化，而是植主动脉环的直接培养;这种技术已经报道，得到较少的细胞比利用酶消化技术。63,64

    两种不同的钙化媒体，无论是与βGP/ ASC / DEX 65,66或NaPhos，描述25,43都可以被用于诱导血管平滑肌细胞的钙化。这两种类型的媒体已被用于钙化具有同等成功鼠血管平滑肌细胞。虽然含有βGP/ ASC钙化媒体/ DEX已被用于人类钙化血管平滑肌细胞（ 图6），含NaPhos媒体一直没有有效的在我们的经验钙化血管平滑肌细胞的人类。此外，21 - 检测钙化之前，可能需要在钙化介质B人类血管平滑肌细胞的培养28天。当MGP的表达水平与siRNA和calcificati减少体外野生型血管平滑肌细胞钙化增加在MGP减少- / -平滑肌的时候恢复了MGP表达（ 图5）。这些发现与在MGP观察到的主动脉钙化一致- / -小鼠，并建议该体外血管平滑肌细胞的钙化的方法作为在体内钙化的一个有用的模型。但必须注意的是，有在制订有关完整的血管从培养的血管平滑肌细胞的结论的局限性是非常重要的。培养的血管平滑肌细胞可能会失去它们在体内收缩性能，特别是在较高的通道中，除了发展中的基因表达模式，形态和刚性的变化。67-70平滑肌中钙化媒体做分化钙化前成骨谱系培养，但不要显示出，往往是在体内观察到软骨中间71因此重要的是，从培养的细胞中得出机械结论在体内系统中进行验证。上Ë潜力克服这种限制的方法是使用一个完整的培养容器环来研究它们在体内的血管平滑肌细胞的状态。70

    两种不同的方法被提出，用于检测培养血管平滑肌细胞的钙化，冯科萨方法（ 图5）和钙的NIR染色（ 图6）。虽然经常用于评估钙化，冯科萨方法在某种程度上被其减小特异性钙晶体的限制。50钙NIR被认为是特异性的钙化，并且特别有利的，因为它允许用额外光谱上不同的荧光同时进行染色代理商。9利用额外的分子探针的钙NIR可以提供重要的见解钙化的机制，这个协议的未来应用，并可以使血管平滑肌细胞钙化的小分子抑制剂的快速评估在高通量的方式，为IDEntify潜在的新疗法血管钙化。

    总之，心血管钙化是一个重要的危险因子和潜在贡献者临床疾病。心血管钙化和动脉粥样硬化性疾病的机制的认识依赖于动物和基于细胞的模型。在体内 ， 离体 ，和在体外模型评估钙化方法是推进我们心血管疾病的认识至关重要。

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

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    References

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