Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחלות לב וכלי דם הוא הגורם לתחלואה ותמותה המובילות בעולם, כולל ארצות הברית, שם היא מהווה מעל 780,000 מקרי מוות בשנה. 1 הסתיידות עורקים כליליים הסתיידות העורקים הם מסימני ההיכר של טרשת עורקים ולשמש מנבאים חזקים של אירועים קרדיווסקולריים. 2- 4 שני סוגים עיקריים של הסתיידות כלי הדם דווחו במבוגרים: הסתיידות intimal, הקשורים טרשת עורקים, המדיאלי (הידוע גם בשם Mönckeberg) הסתיידות, הקשורים למחלת כליות כרונית וסוכרת 5 הסתיידות intimal מתרחשת על רקע של הצטברות שומנים מקרופאג. החדרתם בדפנות כלי הדם. 5,6 הסתיידות הקיר המדיאלי מתרחשת באופן עצמאי של הסתיידות intimal, לוקליזציה לסיבי האלסטין או תאי שריר חלק, והוא לא קשור בתצהיר השומנים או חדירה מקרופאג. 5,7,8 מחקרים על המנגנונים המולקולריים שלהסתיידות כלי דם יש לסמוך על מערכות מודל מבוססי תאים ובבעלי חיים. מודלים מכרסמים למחלת atherocalcific כוללים עכברים חסר או אפוליפופרוטאין E (APOE) 9,10 או קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLR) 11 שקיבלו תזונה עשירה בשומן, בעוד מודלים הסתיידות המדיאלי כוללים עכברים עם חלבון מטריקס GLA (MGP) חסר 12 או חולדות לפתח uremia באמצעות כריתת כליה כמעט מוחלטת (מודל כריתת הכליה 5/6) או על ידי חשיפת דיאטה עתירה אדנין. 13

כאן, המודל של הסתיידות כלי דם המדיאלי הקשורים מחסור MGP מתמקד. MGP הוא חלבון תאיים המעכבת הסתיידות עורקים. 12 מוטציות בגן MGP זוהו תסמונת Keutel, למחלה אנושית נדירה המאופיינת הסתיידות הסחוס מפוזר בנוסף brachytelephalangy, אובדן שמיעה, היצרות ריאתי הפריפריה. 14-18 למרות שלא לעתים קרובות ציינו, 19הסתיידות קונצנטריים של העורקים מרובים תוארה תסמונת Keutel. 20 פולימורפיזם Common בגן MGP אדם קשורים לסיכון מוגבר הסתיידות עורקים כליליים, 21-23 בעוד שרמות במחזור גבוה של uncarboxylated, MGP פעיל ביולוגית לחזות התמותה ממחלת לב כלילית. 24 בניגוד לבני אדם עם תסמונת Keutel, עכברים MGP מחסר לפתח פנוטיפ כלי הדם חמורה המורכב הסתיידות עורקים נפוצה ספונטנית החל שבועיים של להזדקן ולמות 6-8 שבועות לאחר הלידה עקב קרע באבי העורקים. 12

בניגוד ApoE - / - ו LDLR - / - עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן, אשר לפתח הסתיידות כלי הדם intimal עם דלקת מקרופאג הנגרמת הקשורים, MGP - / -. עכברים לפתח הסתיידות כלי הדם המדיאלי בהעדר חדירה מקרופאג 11,25 למרות ממצאים אלה מראים גירויים בסיסיים שונים עבור intimאל ו הסתיידות המדיאלי, קיימת חפיפה במנגנוני איתות כי לתווך שתי צורות של הסתיידות. 26 מסלולי איתות מרובים זוהו שתורמים הסתיידות כלי הדם כולל מתווכים דלקתיים כגון-α גורם נמק הגידול ו- IL-1 וגורמים פרו-osteogenic כגון Notch, Wnt, וחלבון העצם המוךפו"גנטי שהולך (BMP) איתות. 27,28 מסלולי איתות אלו להגדיל הביטוי של גורמי שעתוק גורם שעתוק הקשורות גמד 2 (Runx2) ו osterix, אשר בתורו להגדיל ביטוי של חלבונים הקשורים העצם ( . למשל, osteocalcin, sclerostin, ו phosphatase אלקליין) בכלי הדם אשר מתווכים הסתיידות 28-30 אנו ואחרים הוכיחו כי הסתיידות כלי הדם שנצפתה ApoE - / - ו LDLR - / - עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן ואת ספונטנית הסתיידות כלי הדם שנצפתה MGP - / - עכברים הכל תלוי חלבון המוךפו"גנטי שהולך העצם (BMP) סיgnaling, וזה מסלול זה כי הוא התמקד כאן. 11,25,31 BMPs גורמי osteogenic חזקים הנדרשים היווצרות עצם ידוע להפגין ביטוי מוגבר טרשת עורקי אדם. 32-34 במבחנה יש מעורב איתות BMP בויסות הביטוי של גורמים osteogenic כגון Runx2. 35-37 התבטאות יתר של ליגנד BMP, BMP-2, מאיצה את הפיתוח של הסתיידות כלי הדם בעכברים ApoE לקוי שקיבלו תזונה שומן גבוה. 38 יתר על כן, השימוש הספציפי BMP איתות מעכבי כזה כמו LDN-193,189 (LDN) 39,40 ו / או ALK3-Fc מונע התפתחות של הסתיידות כלי הדם בשני LDLR - / - עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן ועכברים MGP מחסר 11,25.

תאי דם שריר חלק (VSMCs) יש תפקיד קריטי בהתפתחות של הסתיידות כלי דם. 30,41,42 הסתיידות כלי הדם המדיאלי שמתפתחת MGP מחסר עכברים הוא characterized ידי transdifferentiation של VSMCs כדי פנוטיפ osteogenic. הפסד של תוצאות MGP בביטוי ירידה של סמנים VSMC כולל myocardin אקטין שריר חלק אלפא, עם עלייה מקבילה סמנים osteogenic כגון Runx2 ו osteopontin. שינויים אלה עולים בקנה אחד עם הפיתוח של הסתיידות כלי דם. 25,43,44

הסתיידות ודלקת אבי העורקים בעכברים מוערכים בדרך כלל תוך שימוש בטכניקות histochemical כגון פעילות phosphatase אלקליין עבור הסתיידות מוקדם ופעילות osteogenic, פון Kossa ו Alizarin מכתים אדום עבור הסתיידות מאוחר, ופרוטוקולים immunohistochemical כי למקד סמנים חלבוניים מקרופאג (למשל., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 עם זאת, שיטות הדמיה סטנדרטיות אלו דורשים עיבוד של רקמות העורקים לתוך חתכים, מה שגוזל זמן רב ולא מושלם בשל דגימה מוטה, ו מוגבלים שלהם היכולת לכמת דלקת calcificatיון באבי העורקים כולו. פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לחזות ולכמת הסתיידות עורקים אבי העורקים ובינוניים כולו וצבירת מקרופאג ניצול פלורסנט קרוב אינפרא אדום (ניר) הדמיה מולקולרית vivo לשעבר. גם סיפק היא שיטה להכנת זרעים culturing VSMCs אבי העורקים הראשי מעכברים זירוז הסתיידות של murine ו VSMCs אדם במבחנה כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הסתיידות כלי הדם. טכניקות אלה מספקים את החוקר עם הן in vivo ו בשיטות במבחנה לחקר מחלת atherocalcific.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל המחקרים שנעשו בעכברים בוצעו בהתאם קפדנית עם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. שיכון כל הנהלים הקשורים עכברים המתוארים במחקר זה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש ועדות של החולים הכללי במסצ'וסטס (ועדת המשנה על מחקר טיפול בבעלי חיים). כל הנהלים בוצעו בזהירות כדי למזער את הסבל.

1. הכנת ריאגנטים

  1. קרוב אינפרא אדום קרינת הדמיה של פריטי Aortas
    הערה:. A-נגזר בביספוספונטים, קרוב אינפרא אדום בדיקת דימות פלואורסצנטי ניתן להשתמש כדי לסמן פעילות osteogenic בכלי הדם באמצעות קשירת hydroxyapatite 46,47 בדיקת דימות פלואורסצנטי המופעל cathepsin יכולה לשמש כסמן פרוטאוליטים מקרופאג ופעילות elastolytic ב כלי הדם. 9 כדי לאפשר שימוש בו זמני של שתי בדיקות ניאון, חשובלהשתמש בדיקות שאינן ספקטרלית ברורים. הסידן בסימון NIR ישמש כדי לציין את ספציפיים ההסתיידות האינפרה-אדום קרוב חללית הדמית פלורסנט cathepsin NIR כדי לציין את הפעילות הספציפית cathepsin האינפרה-אדום קרוב חללית הדמית ניאון.
    1. הכן את הפתרונות של סידן ניר cathepsin NIR. על פי הפרוטוקולים של היצרן, להוסיף 1.2 מ"ל של בופר פוספט 1x (PBS) בקבוקון המכיל 24 nmol של סידן NIR או cathepsin NIR ולנער בעדינות.
      הערה: לדברי היצרן, פעם מחדש עם PBS, פתרונות Nir Nir סידן cathepsin להישאר במצב יציב למשך 14 ימים, כאשר הם מאוחסנים בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס.
  2. בידוד הסתיידות Murine אבי העורקים VSMCs
    1. אבי העורקים עיכול פתרון:
      1. הכן פתרון חדש (~ 3-5 מ"ל לכל האאורטה שנקטפו) עם תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) המכיל 175 U / ml סוג 2 collagenase ו -1.25 אלסטט U / ml. לעקר את הפתרון wה- i מערכת סינון מונחה ואקום 0.22 מיקרומטר ולשמור הפתרון על הקרח עד לשימוש.
    2. Cell Media:
      1. מוסף 500 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברית, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. מומלץ לחמם את התקשורת ל -37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    3. הסתיידות מדיה:
      1. הסתיידות Media A (NaPhos; בשימוש שורות תאי עכבר):
        1. מוסף 100-500 מ"ל של DMEM (נפח לפי הצורך) עם 10% בסרום שור עוברית, סודיום פוספט 2 מ"מ, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. מומלץ לחמם את התקשורת ל -37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

          אוֹ
      2. הסתיידות מדיה B (βGP / עולה / DEX; שימושית בשני עכבר או שורות תאים אנושיות):
        1. מוסף 100-500 מ"ל של DMEM (נפח לפי הצורך) עם 10% בסרום שור עוברית, 10 Disodium מ"מ β-glycerophosphate, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​חומצה L-אסקורבית, 10dexamethasone ננומטר, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. מומלץ לחמם את התקשורת ל -37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

הזרקת 2. זנב וריד

  1. לפני הזרקת זנב, לחמם את העכברים תחת מנורת חימום קלה למשך 5 דקות.
  2. לרסן את העכבר בבעל מכרסם צינור. לחטא את הזנב עם ספוגית אלכוהול.
  3. לנצל מחט 30 G עבור הזרקה לווריד הזנב. ורידי זנב ממוקמים רוחבי.
    1. למרוח כמות עדינה של לחץ קדימה על המזרק כמו המחט היא מתקדמת לתוך הזנב. הווריד הוא לגשת פעם התנגדות ההזרקה הוא כבר לא קיים.
    2. להזריק נפח של 100 μl של סידן NIR ו / או 100 μl של cathepsin NIR בקצב קבוע. בסוף הזריקה, לאחר הפסקה שנייה 5, לשלוף את המחט.
  4. קציר aortas (ראה סעיף 3) 3-24 שעות לאחר ההזרקה.

3. עכבר Dissection

  • להרדים העכבר עם זריקה פנטוברביטול intraperitoneal 200 מ"ג / ק"ג.
  • הנח את פרקדן חיה על קרש החיתוך ולייצב ידי מקליטה כל כפה ללוח. באמצעות מיקרוסקופ לנתח ומספריים קטנים, לעשות חתך קו אמצע המשתרעת הבטן התחתונה אל החזה העליון.
  • לקלף את העור עם מלקחיים ולהסיר את הצפק, חושף את אברי הבטן. הסר את האיברים במערכת העיכול, נזהר שלא transect האאורטה.
  • ביצוע חתך לרוחב הסרעפת הקדמית ולהמשיך את החתך לרוחב הבטן. בעזרת מספריים לנתיחה, לשחרר את בית החזה על ידי חיתוך דרך צידי הצלעות והסרת חסיד הרקמות הרכה לחלק המעולה של עצם החזה. הסר את בית החזה, חושף את הריאות.
  • השאירו את הלב במקום בתחילה (לעזרתו בזיהוי לנתח את אבי העורקים הפרוקסימלי) ובזהירות להסיר את הריאות. הסר את התימוס, קנה הנשימה והוושט בזהירות, ensuring כי אב העורקים נותרו בשלמותה.
  • שימוש ישר מלקחיים בסדר ומספריים לנתח-מיקרו, להסיר את הרקמות הרכות סביב האאורטה מ הסתעפות הכסל אל קשת אבי העורקים, תשומת לב קפדנית בעת הסרת שומן פרי-אבי העורקים (איור 1 א). הסר את רקמת שומן ורכה הנותרת סביב הסניפים הגדולים של קשת אב העורקים (כלומר, brachiocephalic, עורקי ראש ואת subclavian משותפים, איור 1B).
    הערה: חשוב להסיר את השומן מן האאורטה בגלל השומן יכול להגדיל את אות הרקע בעת ביצוע דימות פלואורסצנטי.
  • הסר את הלב מחלל בית החזה, בזהירות ניתוק זה מן האאורטה הפרוקסימלית, וזורקים. Transect האאורטה דיסטלי ב הסתעפות הכסל. באמצעות מחט אינסולין, להזריק מלח רגיל לתוך אבי העורקים מן קשת אבי העורקים לשטוף את תאי הדם הנותרים. לנתק את אבי העורקים יחד עם כלי קשת אבי העורקים, לגמרי הסרתומהגוף.
  • מניח את אב העורקים בתמיסת מלח רגיל על קרח עד מוכן הדמיה.
  • 4. הדמיה אבי העורקים

    1. Aortas תמונה vivo לשעבר מיד לאחר הקציר על ידי הדמיה ההחזרה הקרינה האינפרה-אדום הקרוב. 25
      1. הגדר את תרמי הקרינה בבית אורכי הגל רב המתאים לכמת עוצמות אות הקרינה מן aortas של סידן NIR ועכברים NIR-מוזרק cathepsin, כפי שתואר לעיל. 25 לדברי היצרן, NIR סידן יכול להיות נרגש על ידי ~ 650-678 ננומטר אור עם פליטה מקסימלי בטווח ~ 680-700 ננומטר. Cathepsin NIR יכול להיות נרגש על ידי ~ 745-750 ננומטר אור עם פליטה מרבית ב ~ 770 ננומטר.

    בידוד 5. Murine ראשיים אבי העורקים וכלי דם שריר חלק תאים

    1. בצע שלבים 3.1-3.7 כמתואר לעיל.
    2. מניחים aortas בקור HBSS עד והניתוחים הושלמו. בזהירות לחתוך משם כל remaining שומן periaortic ורקמות רכות, עוזב את אבי העורקים בלבד.
    3. מתחת למכסה המנוע בתרבית רקמה סטרילי, להעביר את aortas אל פתרון העיכול אבי העורקים ב -35 מ"מ x 10 מ"מ צלחות בתרבית רקמה. מקום באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם נדנדה לסירוגין עדינה. לאחר העיכול, aortas להפגין מראה מתוח או בלוי.
    4. עם מיקרוסקופ לנתיחה ו מלקחיים סטרילית, להסיר את שכבת adventitial החיצונית של אב העורקים, תוך שמירה על שכבת המדיאלי ללא פגע. טכניקה אחת עבור הסרת adventitia היא לקלף את השכבה החיצונית של האאורטה בקצה אחד ולהסירו משכבה המדיאלי הבסיסית כמו גרב יכול להיות קלף והוסר.
    5. לאחר שכבת adventitial הוסר, למקם את אבי העורקים הנותרים לתוך צלחת בתרבית רקמה חדשה עם תרבית תאים התקשורת ולאחסן ב 37 ° C עם 5% CO 2 עבור 2-4 שעות.
    6. מתחת למכסה המנוע סטרילית באמצעות מספריים 3 מ"מ מיקרו לנתיחה סטרילי, לחתוך את אבי העורקים לתוך 1-2 מ"מ רחבטבעות.
    7. מניחים טבעות אלה בצלוחית בתרבית רקמה חדשה עם פתרון העיכול אבי העורקים ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה לסירוגין עדין עבור 120 דקות. פיפטה את הפתרון ומטה מספר פעמים במהלך הדגירה זה כדי resuspend תאים.
    8. הוסף 5 מ"ל של תרבית תאים התקשורת חם הפתרון לעיכול והעברת צינור חרוטי 15 מ"ל.
    9. צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 200 x ז.
    10. לשאוב תקשורת ותא resuspend בהיקף הרצוי של תקשורת תרבית תאים (למשל, 5 מיליליטר).
    11. פלייט את כל הסכום של תאים מבודדים מכל האאורטה בבקבוק תרבות 25 ס"מ 2 תאים ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הפץ תאים באמצעות טכניקות סטנדרטיות, כפי שתואר לעיל. 25,48 במהלך הדגירה 7-10 הימים הראשוניים, לשנות את התקשורת בכל 72-96 שעות. כאשר התאים להתקרב מפגש, לחדש תקשורת בתדירות גבוהה יותר (כל 48 שעות).
      הערה: זה עלול לקחת שבועות רבים לגדל קואה מספיקntity של תאים.
    12. לאחר ומחוברות, תאי המעבר עם טריפסין כי הוא חימם עד 37 מעלות צלזיוס.
      1. הוסף 0.5-1.0 מ"ל של טריפסין לכל בקבוק תרבות דגירה של 3-5 דק '; לטפוח בעדינות את הצד של הבקבוק כל 30-60 שניות לפי הצורך לנתק תאים מפני השטח.
      2. לאחר התאים להתנתק החלק התחתון של הבקבוק, להוסיף 10 מיליליטר של תא תקשורת התאים טריפסין. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב התקשורת טריפסין מן התא גלולה. Resuspend התאים את הכמות הרצויה של התקשורת תא טרי (למשל, 5-10 מ"ל) ולהעביר בבקבוק חדש (עם תאים מסוימים הועבר שקופית קאמרית).
    13. במעבר של תאים הראשון, לאשר את שושלת תא שריר חלק עם טכניקות immunocytochemistry סטנדרטיות, כפי שתואר לעיל, 49 באמצעות נוגדן המכוון נגד יקטין שריר α-חלקה.

    6. התרמת הסתיידות של שריר חלק מתורבתתאים

    1. פלייט תאים המתקבל 5.12 במתכונת 6 באר. הערה: חל 1 x 10 5 תאים / טוב בנפח כולל של 2.0 מיליליטר של תקשורת תא לכל טוב מומלץ.
    2. אפשר לתאים לגדול ב קלציפיקציה Media A או B למשך 7 ימים לפחות במתכונת 6-גם צלחת. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
    3. שינוי בתקשורת תא כל 48 שעות.

    7. הערכת VSMC קלציפיקציה שימוש בשיטה פון Kossa מכתים

    הערה:. שיטת Kossa פון למדידת הסתיידות תא מטריקס של רקמות או תאים בתרבית מבוססת על ההחלפה של יוני סידן הנכנס פוספט עם יוני כסף 50 בנוכחות תרכובות אור ואורגני, יוני הכסף מופחת ו מדמיין מתכתי כסף. כל כסף unreacted הוסר על ידי טיפול עם נתרן תיוסולפט 50 פרוטוקול מכתים פון Kossa הוא כדלקמן.:

    1. תקשורת לשאוב מ"ק תאצלחות lture.
    2. תקן תאים על ידי הצבתם 1 מ"ל של פורמלין 10% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    3. הסר את פורמלין לשטוף את התאים הקבועים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות.
    4. דגירה התאים 1 מ"ל של תמיסת כסף חנקתי 5% מתחת לנורה W 60-100 במשך 1-2 שעות.
    5. לשאוב את תמיסת כסף חנקתי ולשטוף עם מים מזוקקים במשך 5 דקות.
    6. הסר כסף unreacted ידי הצבת התאים 1 מ"ל של נתרן תיוסולפט 5% (w / v) פתרון במים מזוקקים למשך 5 דקות.
    7. יש לשטוף את התאים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות. 3x שטיפות חוזרות. כתם פון Kossa מוכן הדמיה עם מיקרוסקופ אור ההפוכה סטנדרטית.
    8. שלב אופציונלי: Counterstain עם 1ml של אדום מהיר גרעיני במשך 5 דקות. בצע את זה עם שלושה שוטף עם מים מזוקקים (5 דקות כל אחד).

    אוֹ

    8. הערכת קלציפיקציה VSMC עם קרוב אינפרא אדום דימות פלואורסצנטי

    הערה: בדומה יכולתהלזהות הסתיידות בתוך aortas עכבר, סידן NIR נקשר שהופקדו מינרליים calcific בקלות על ידי תאים בתרבית. באמצעות טכניקה זו, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וקורא צלחת עם מסננים באורכי גל ארוכים יותר יכול תמונה ולכמת הסתיידות במבחנה, בהתאמה. הפליטה באורכי הגל הארוכה יותר של סידן NIR מאפשרת הניצול סימולטני של fluorophores פולטת באורך הגל נמוך כדי לזהות תכונות אחרות. הפרוטוקול מכתים סידן NIR הוא כדלקמן:

    1. כפי שתואר בסעיף 1.1.1, להוסיף 1.2 מ"ל של 1x PBS בקבוקון המכיל 24 nmol של סידן NIR.
    2. לדלל את הסידן NIR מניות 1: 100 בתקשורת ההסתיידות או בקרה הנאותה.
    3. תקשורת התא לשאוב תרבות צלחות ולהחליף עם סידן NIR המכיל תקשורת ותרבות.
    4. דגירת צלחות התרבות עם תקשורת NIR סידן הלילה ב 37 מעלות צלזיוס.
    5. לשאוב התקשורת המבארת ולשטוף את הבארות פעם עם PBS.
      הערה: בשלב זה,ניתן להוסיף בתקשורת התרבות המקורית על הבארות, והתאים ניתן הדמיה חיה. אם לא, המשך לשלבים הבאים.
    6. תקן תאים על ידי הצבתם 1 מ"ל של פורמלין 10% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    7. הסר את פורמלין לשטוף את התאים הקבועים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות. 3x שטיפות חוזרות.
    8. שלב אופציונלי:. בצע מכתים immunofluorescence או counterstains אחרים עבור חלבונים בעלי עניין 8,9
    9. תמונה או לזהות את כתם NIR סידן באמצעות אורכי גל עירור קרינה מתאימה (למשל, NIR סידן יכול להתרגש 650-678 אור ננומטר) ומסנן פליטה (~ 680-700 ננומטר).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    הסתיידות עורקים ב MGP - / - ו עכברי-בר נמדדה באמצעות הדמיה של קרינת NIR סידן. אין אות NIR סידן זוהתה aortas מעכברי wild-type, המציינת את עדר ההסתיידות (איור 2). אות NIR סידן חזקה זוהתה aortas מעכברי MGP המחסר, אשר עולה בקנה אחד עם הסתיידות כלי דם מתקדמת. קטעי aortas הרקמות של wild-type ו MGP - / - עכברים הוכתמו 25 אדום Alizarin (איור 3 א - ב), המאשר את הסתיידות כלי הדם נרחב נצפתה בעכברים MGP מחסר ללא הסתיידות זוהה עכברי-בר. כדי לקבוע אם הסתיידות כלי הדם הקשורים מחסור MGP תלויה איתות BMP, MGP - / - עכברים שטופלו LDN, ALK3-FC, או רכב החל מהשעה יום 1 של החיים. עכברים אלו הוזרקו סידן NIR ביום 27 וaortas נבצר ביום שלמחרת. עיכוב תרופתי BMP איתות מופחת הסתיידות העורקים מזוהה עם סידן NIR (איור 2). בדומה לממצאים עם סידן ניר, aortas של LDN- ו ALK3-Fc שטופלו MGP - / - עכברים הפחית כתם אדום Alizarin לסידן בהשוואה שטופלו הרכב MGP - / - עכברים (איור 3 ב - D). תוצאות אלו מצביעות כי איתות BMP נדרשה עבור הסתיידות כלי הדם שנצפתה MGP - / - עכברים.

    LDLR - / - עכברים שקיבלו תזונה שומן גבוה לפתח הן דלקת מקרופאג הסתיידות של דופן העורק 11 הזרקה לווריד הזנב סימולטני של calcific ו cathepsin ספציפי בדיקות NIR ב MGP -. / - עכברים בוצעה על מנת לקבוע אם הסתיידות כלי הדם של MGP -deficiency קשורה הצטברות מקרופאג 25 LDLR -. / - העכברים שהוזנודיאטה שומן גבוהה עכברי-בר שימשו שולטת חיוביות ושליליות, בהתאמה. Aortas מ עכברי-בר הציג כמעט שום אות NIR סידן או cathepsin NIR, כמצופה (איור 4 א). שותף מקומי סידן NIR אותות cathepsin NIR שמעדיפים באזור קשת אב העורקים נצפו LDLR - / - העכברים, מה שמעיד על קשר חזק בין חדירת מקרופאג הסתיידות כלי דם במודל זה של טרשת עורקי intimal. למרות אות מפוזרת NIR סידן החזק נצפתה aortas של MGP - / - עכברים, אות NIR cathepsin לא הייתה שונה מזה של wild-type עכברים. ממצאים אלו מעידים כי הסתיידות כלי דם מחסור MGP מתרחשת בהיעדר הצטברות מקרופאג. כדי להמשיך לאשר את הממצאים הללו, aortas מ wild-type, MGP - / -, ו LDLR - / - עכברים נבצרו, מחולק, ומוכתמת עם נוגדן ספציפי עבור הסמן מקרופאג-2 MAC ( - / - עכברים הראו מכתים MAC-2 שופע; אין מכתים MAC-2 מורגשות על aortas של MGP - / - עכברים, מה שמעיד על העדר מקרופאגים וסקולרית.

    מודל הסתיידות כלי דם במבחנה, VSMCs אב העורקים בודדו wild-type ו MGP - / - עכברים בתרבית-פוספט גבוה המכיל תקשורת, באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. כדי לקבוע את התפקיד של MGP בויסות הסתיידות VSMCs תרבותי, גידול אדנו להביע MGP (Ad.MGP) שימש כדי לשחזר MGP ב VSMCs אבי העורקים מן MGP - / - עכברים. MGP מחסר VSMCs נגוע עם אדנו לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (Ad.GFP) שימשו כבקרה. בנוסף, כדי לקבוע את ההשפעה של הסרת ביטוי MGP מ VSMCs על הסתיידות עוקבות VSMCs אבי העורקים מ עכברי-בר טופלו siRNA מכוונת נגד MGP (siMGP) או לשלוט siRNA (siSC). הסתיידות הושרה VSMCs בתרבית על ידי גידול תאי הסתיידות לתקשורת למשך 7 ימים. תאים לאחר מכן קובעו ונצבעו לסידן בשיטת פון Kossa. שיקום של MGP עם Ad.MGP מופחת הסתיידות של MGP - / - VSMCs לעומת שליטת תאי האד שטופל (איור 5 א - B, E). טיפול VSMCs אבי העורקים wild-type עם siMGP, וכתוצאה מכך> 95% מציאה הביטוי MGP, 25 עלה הסתיידות לעומת תאים שטופלו siSC (איור 5 ג - ד, ו). תוצאות אלו מצביעות כי מודל במבחנה של מחקת הסתיידות VSMC הממצאים בעכברים MGP מחסר ומדגים כי MGP מודולציה הסתיידות VSMCs התרבותי.

    שיטה חלופית לאיתור הסתיידות של VSMCs התרבותי היא עם סידן NIR. מודל הסתיידות כלי הדם ב נ itro, VSMCs עורקים כליליים האדם נרכשו ותרבותי במשך 21 ימים קלציפיקציה מדיה .ב להלן תקופת הטיפול, זוהה הסתיידות בשיטת סידן NIR ואת התרבויות היו counterstained עם בדיקה קולגן ירוק-ניאון מותאם אישית 51 וצבע Hoechst (1 מיקרוגרם / מ"ל במשך 5 דקות לאחר קיבוע בפורמלין 10%) (איור 6). גרעיני VSMC נצפו עם קרינה כחולה Hoechst ידי מיקרוסקופיה confocal (איור 6 א). קטע אופטי נציג תערוכות סידן מינרל calcific NIR מוכתם בתוך המטריצה ​​קולגן המיוצר על ידי VSMCs (איור 6). תלת ממדי שחזורים של Z- ערימות אופטיות להמחיש את השכבות שנוצרו בתרבות כמו VSMCs על תחתית באר לייצר מטריצת קולגן, אשר מינרל calcific שהופקד הופך לכודה (איור 6 ג - ד).

    בתשובה לשאלה 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,017 / 54017fig1.jpg "/>
    איור 1:. נציג דיסקציה של אבי העורקים מתוך wild-type עכבר (א) תמונה של בית החזה אבי העורקים בבטן הארכת אל הסתעפות הכסל עורק משותף מתואר לאחר הסרת האיברים שמעל ופרי-אבי העורקים שומן. (ב) התמקד לאור קשת אב העורקים עם brachiocephalic, עזב ראש נפוץ, ועורקי subclavian שמאל. ברי סולם = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    איור 2: כלי דם קלציפיקציה ב MGP - / - עכברים תלויה איתות BMP MGP - / - עכברים שטופלו הזרקה (IP) זריקות של או ve. hicle, LDN-193,189 (LDN, 2.5 מ"ג / ק"ג / יום), או ALK3-FC (2 מ"ג / ק"ג בכל יום אחר) ו עכברי-בר טופלו בזריקות ip של הרכב החל ביום 1 של החיים עד יום 28 . ביום 27, עכברים הוזרקו NIR סידן דרך וריד הזנב. Aortas נבצרו ביום 28 צילמו עם הקרינה האינפרה-אדום הקרוב. תמונות באותו הגדלה בכל ארבעת לוחות עם סרגל המידה מציין 3 מ"מ. Aortas עכבר wild-type ולא הציג אות סידן NIR בעוד aortas מן MGP - / - העכברים היו אות NIR סידן חזקה. לעומת שטופלו הרכב MGP - / - עכברים, aortas של MGP - / - העכברים שטופלו גם LDN או ALK3-FC הפגין מופחת משמעותית אותות NIR סידן. נתון זה נלקח מתוך התייחסות 25. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    3 "src =" / files / ftp_upload / 54,017 / 54017fig3.jpg "/>
    איור 3: Pharmacologic עיכוב של איתות BMP מונע אבי העורקים קלציפיקציה בעכברים MGP מחסר עכברי-בר טופלו בזריקות ip של הרכב (א) ו MGP - / - עכברים שטופלו או זריקות ip של הרכב (B), LDN. (C, 2.5 מ"ג / ק"ג / יום), או ALK3-FC (D, 2 מ"ג / ק"ג בכל יום אחר) החל ביום 1 של החיים עד יום 28. Aortas נבצרו, מחולק, ומוכתמת לסידן עם Alizarin אדום. תמונות צולמו באותו ההגדלה בכל ארבעת לוחות עם סרגל מידה המציינת 400 מיקרומטר. בדומה אותות NIR סידן באיור 2, מכתים אדום Alizarin מדגים נטל כבד של הסתיידות בתוך aortas של שטופלו הרכב MGP - / - עכברים. הסתיידות הוא ירד ב aortas של LDN- ו ALK3-Fc שטופלו MGP - / - עכברים. נתון זה נלקח מתוךאסמכתא 25. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    . איור 4: קביעת סימולטני של אבי העורקים קלציפיקציה ו Macrophage הסתננות עם סידן ניר Cathepsin NIR (א) wild-type, MGP - / -, ו LDLR - / - עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן הוזרקו NIR סידן cathepsin NIR דרך וריד הזרקת זנב. Aortas נבצרו 24 שעות מאוחר יותר והעריכו עם דימות פלואורסצנטי האינפרה-אדום הקרוב. תמונות באותו הגדלה עם סרגל המידה מציין 3 מ"מ. עכברי-בר להפגין כמעט ללא הסתיידות עורקת או נוכחות מקרופאג. Aortas מ LDLR - / - יש עכברים הסתיידות נרחבת כי שיתוף לוקליזציה עם הצטברות מקרופאג. לעומת זאת, MGP - / - יש עכברי הסתיידות עורקים המתרחשת בהעדר החדיר מקרופאג. (ב) Aortas נבצרו מן wild-type, MGP - / -, ו LDLR - / - עכברים שקיבלו תזונה עשירה בשומן. aortas אלה היו מחולקים ומוכתם עבור מקרופאגים עם נוגדן ספציפי עבור MAC-2. גרעינים הוכתמו DAPI. משטח lumenal הוא לכיוון הימין בפנל. תמונות צולמו באותו ההגדלה בכל שלושה פאנלים עם סרגל מידה המציינת 100 מיקרומטר. בדומה לממצאים ב (א), לא היו שום ראיות של הצטברות מקרופאג של aortas של MGP - / - עכברים. נתון זה הוא גרסה שונה של דמות בהפניה 25. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    .jpg "/>
    . איור 5: MGP מגן VSMCs בתרבית קלציפיקציה VSMCs אב עורקים המתורבת בודד MGP - / - עכברים נגועים להביע אדנו או GFP (א) או MGP (B). VSMCs אבי העורקים מבודד עכברי-בר היו transfected עם שליטה או מקושקשות siRNA (C) או siRNA מיקוד MGP (D). התאים גדלו ב קלציפיקציה Media A עבור 7 ימים ולאחר מכן קבוע מוכתם פון Kossa. תמונות צולמו באותו ההגדלה בכל ארבעת לוחות (A - D) עם סרגל מידה המציינת 200 מיקרומטר. שדות סידוריים מבט צולמו לכמת מכתים סידן באמצעות תוכנת J תמונה לאחר חיסור רקע (E ו- F), עם ברי שגיאה המציינת SEM. נתון זה הוא גרסה שונה של דמות בהפניה 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 6
    איור 6:. סידן NIR מזהה קלציפיקציה בשיתוף עם מטריקס במבחנה (א) VSMCs עורקים כליליים האדם בתרבית קלציפיקציה מדיה B במשך 21 ימים אותרו על ידי מכתים גרעיני באמצעות לצבוע Hoechst. (ב) בסעיף אופטי מתקבל על ידי מיקרוסקופיה confocal של סידן NIR מכתים (אדום) בשילוב עם בדיקה קולגן ירוק-ניאון תערוכות מינרליים calcific ברחבי מטריקס קולגן. תמונות A - B נלקחו באותו הגדלה עם סרגל מידה המציין 10 מיקרומטר. (C ו- D) שחזורים תלת מימדי להראות ולכידתו של מינרלים calcific בתוך tהוא קולגן מטריקס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    הסתיידות העורקים היא גורם סיכון חשוב למחלות לב וכלי דם בבני אדם ועשויים לתרום ישירות בפתוגנזה של אירועים קרדיווסקולריים. 1,5,52 בתצהיר סידן intimal ב כיפה סיבית דקה של מחלת טרשת עורקים הוצע להגדיל מתח ביומכנית המקומי ולתרום קרע פלאק. 53,54 משפיע הסתיידות המדיאלי התוצאות הקליניות על ידי הגדלת קשיות העורקים, מה שיכול לגרום להיפרטרופיה לב להשפיע על תפקוד הלב. 55 לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הסתיידות כלי הדם יספק תובנות חשובות מחלות אנושיות ואפשרות לזהות מטרות הרומן עבור תֶרַפּיָה.

    כאן, שיטה לאיתור הסתיידות העורקים והצטברות מקרופאג במודלים Murine של טרשת עורקים הסתיידות כלי הדם ניצול הדמיה NIRF מתואר. 9 זה קריטי כדי במדויק להזריק את NIRסוכני F לוריד הזנב. זוהי טכניקה הדורשת תרגול משמעותי לפני מושגת שליטה. 56 בנוסף, חשוב להסיר את כל השומן פרי-אבי העורקים מאבי העורקים, כמו זה של שומן יכול לגרום אות autofluorescent באותו הגל כמו ניר סידן cathepsin אותות NIR. שימוש סוכני NIRF יש יתרונות חשובים רבים על פני שיטות היסטולוגית רמה בהערכת הסתיידות כלי דם ודלקת. בניגוד טכניקות קונבנציונליות היסטולוגית, סוכנים אלה מאפשרים כימות של הסתיידות עורקים כולו וחדיר מקרופאג. יתר על כן, הם מספקים שיטה רגישה יותר לאיתור שינויים המוקדמים קשורים בהתפתחות של הסתיידות עורקים מ מכתים היסטולוגית ולכן יכולים להציע תובנה מכניסטית לתוך בשלבים מוקדמים יותר של מחלה. 9 אתרים של אות NIR סידן מוקדם משויכים לסמנים של היווצרות עצם כולל מוגבר פעילות phosphatase אלקליין כמו well ביטוי גנים Runx2 ו osteopontin. יתר על כן, שימוש בו זמני של בדיקות נפרדות ספקטרלית עבור הסתיידות ופעילות cathepsin מאפשרת כימות וההתאגדות של התקדמות spatiotemporal הנוגעים למחלות atheromatous ו calcific. 9

    זיהוי המאפיינים במרחב ובזמן של עזרי הסתיידות ודלקת כלי דם בהבנתנו את מנגנוני pathophysiologic הבסיסיים של מחלת כלי דם. למשל, שימוש בחומרים NIRF הוכיחה כי במודלים של הסתיידות intimal (ApoE - / - ו LDLR - / - עכברים בדיאטה עתירת שומן), הסתיידות כלי הדם שיתוף לוקליזציה לאתרים של הצטברות מקרופאג (איור 4) ו ההסתיידות כי בעקבות ההצטברות של מקרופאגים במסגרת זמן נתונה. 9,11 מעניין, לא הצטברות מקרופאג עם cathepsin NIR זוהתה הסתיידות כלי הדם המדיאלי שנמצאה בעכברי MGP מחסרים. 25 ה 'הים, מניסויי ניצול סוכני NIRF, ניתן להסיק כי למרות הצטברות מקרופאג קשורה הסתיידות intimal וסקולרית, היא אינה נדרשת עבור הסתיידות המדיאלי כלי דם.

    בדומה ותפקידה הדמיה ולימוד מחלת כלי דם, הדמית NIRF נוצלה כדי ללמוד מחלה מסתם אאורטלי. 47 מחל שסתום אב עורקים מסומנת על ידי נגעי מקרופאג calcific שומנים-לאדן על השסתום ותערוכות מנגנונים מולקולריים שבבסיס דומה גורמים גנטיים כמו טרשת עורקת . 57-59 הסתיידות מסתם אאורטלי גורמת לירידת ערך של פונקצית עלונים הוא הגורם העיקרי של היצרות מסתם אאורטלי קליניים בקרב הקשישים. הטיפול היחיד הזמין כעת עבור היצרות מסתם אאורטלי סימפטומטי הוא החלפה מסתם. הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים של מחלה מסתם אאורטלי נחוצה כדי למנוע סיבוכים קליניים בשלב מאוחר של הסתיידות מסתם אאורטלי פרוגרסיבי. ניצול של NIסוכני RF ככלי הדמיה מולקולריים במודלים של בעלי חיים מספקים שיטה רגישה להערכת מחלה מסתם אאורטלי בשלבים המוקדמים שלה. 60

    טכניקות סטנדרטיות לדמיין הפלאק בעורקים הכליליים התמקד חומרת היצרות, אך הרוב של תסמונת כלילית חריפה לנבוע קרע של הפלאק הלא הגבלת זרימה. 6 תהליכים ביולוגיים בתוך הפלאק, כגון דלקת, לשמש מנבאים טובים יותר של קרע פלאק מ מידת היצרות. 61 בניגוד שיטות הדמיה קונבנציונאלי, הדמיה NIRF מספק הזדמנות למדוד את פעילות הסלולר (כלומר, פעילות פרוטאוליטים מקרופאג עם מטלו מטריקס (MMP) סוכן activatable, פרוטאוליטים ופעילות elastolytic עם cathepsin NIR, ופעילות osteogenic עם ניר סידן). 9 שיטה זו ולכן מספקת הערכה תפקודית אנטומי סימולטני של מחלות לב וכלי דם. הדמית NIRF מנצלת דואראורכי גל xcitation בטווח 650 עד 900 ננומטר, אשר יש את היתרון של חדירה לרקמות גדלה לעומת אור באורך גל נמוך, ובכך מאפשרים הערכה יותר עומק נגעי מחלה. 60 יש מצטמצם גם אות רקע autofluorescent של רקמת כלי דם הקרוב טווח אורכי גל -infrared. למרות בפרוטוקול זה מתמקד בשימוש של הדמית NIRF vivo לשעבר, הדמית NIRF גם מהווה פלטפורמה שימושית הדמיה מולקולרית אורך in vivo. 9 הדמית NIRF, בשילוב עם מיקרוסקופ intravital, ייתכן יישומי אבחון עתידיים בבני אדם. 61 עם זאת, מגבלה של הדמית NIR סידן longitudinally הוא החללית נגזר בביספוספונטים עלול עצמו לשנות את תהליך ההסתיידות הפיזיולוגי. 62

    הסתיידות לב וכלי דם היא תהליך מוסדר באופן פעיל המערב את transdifferentiation של VSMCs כדי פנוטיפ osteogenic. 25,41,42 63 השיג מספר הולם של תאים לכל האאורטה murine לבצע מחקרים במבחנה (איור 5). לי אלטרנטיבהthod לבידוד VSMC אינו כרוך עיכול אנזימטי אלא בתרבות ישירה של טבעות אבי העורקים explanted; טכניקה זו דווחה להניב פחות תאים מאשר טכניקת ניצול עיכול אנזימטי. 63,64

    שתי בתקשורת הסתיידות שונה, בין אם עם βGP / עולה / DEX 65,66 או NaPhos, 25,43 מתוארים כי ניתן להשתמש כדי לגרום הסתיידות VSMCs. שני הסוגים של תקשורת שמשו להסתייד VSMCs בעכברים עם הצלחה מקבילה. בעוד תקשורת ההסתיידות המכילה βGP / עולה / DEX נעשה שימוש כדי להסתייד VSMCs אדם (איור 6), התקשורת המכיל NaPhos לא הוכחה כיעילה calcifying VSMCs אדם מניסיוננו. יתר על כן, 21 - 28 ימים של התרבות של VSMCs האדם קלציפיקציה מדיה B עשויים להידרש לפני ההסתיידות מזוהית. הסתיידות של VSMCs wild-type במבחנה הוגדלה כאשר רמות ביטוי של MGP הופחתו עם siRNA ו calcificatiעל הופחת ב MGP - / - VSMCs כאשר הביטוי MGP שוחזר (איור 5). ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם הסתיידות העורקים שנצפתה MGP - / - עכברים מראים כי שיטה במבחנה זו של הסתיידות VSMC משמשת כמודל שימושי של הסתיידות in vivo. חשוב לציין, עם זאת, כי יש מגבלות בהסקת מסקנות לגבי כלי דם ללא פגע מן VSMCs התרבותי. VSMCs המתורבתת עלולה לאבד תכונות התכווצות in vivo שלהם, במיוחד קטעים גבוהים, בנוסף לפיתוח שינויי דפוסי ביטוי גנים, מורפולוגיה, ונוקשות. 67-70 VSMCs בתרבית calcifying תקשורת אל לבדל אל שושלת osteoblastic לפני ההסתיידות, אך לא תערוכת ביניים chondrocytic כי הוא נצפה לעתים קרובות in vivo. 71 לכן חשוב כי מסקנות מכניסטית שנשאבו תאים בתרבית להיות מאומתות במערכות in vivo. עַלשיטת פוטנציאל הדואר להתגבר על מגבלה זו היא ללמוד VSMCs במצב שלהם vivo באמצעות טבעת כלי שלמה תרבותית. 70

    שתי שיטות שונות מוצגות לאיתור הסתיידות של VSMCs התרבותי, שיטת Kossa פון (איור 5) וסידן NIR המכתים (איור 6). למרות משמש לעתים קרובות כדי להעריך עבור הסתיידות, שיטת פון Kossa מוגבלת במקצת על ידי הספציפיות המצומצמת עבור גבישי סידן. 50 סידן NIR מורגשת להיות ספציפי עבור הסתיידות והוא יתרון במיוחד בכך שהוא מאפשר מכתים סימולטני עם ניאון נוסף ספקטרלית-מובחן סוכנים. 9 יישומים עתידיים של פרוטוקול זה ניצול NIR סידן עם בדיקות מולקולריות נוספים עשויים לספק תובנות חשובות מנגנונים של הסתיידות ועשויים לאפשר הערכה מהירה של מעכבי מולקולה קטנה של הסתיידות VSMC באופן תפוקה גבוהה, כדי IDEטיפולים חדשניים פוטנציאל ntify עבור הסתיידות כלי דם.

    לסיכום, הסתיידות לב וכלי דם הוא גורם סיכון חשוב ותורם פוטנציאל מחלה קלינית. ידע של מנגנוני הסתיידות לב וכלי דם טרשת עורקים מסתמך הוא על בעלי חי מודלים מבוססי תאים. מתודולוגיות להערכת הסתיידות ב in vivo, vivo לשעבר, ומודלים במבחנה הם קריטיים לקידום ההבנה שלנו של מחלות לב וכלי דם.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), e28-e292 (2014).
    2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103, (11), 1529-1534 (2001).
    3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114, (16), 1761-1791 (2006).
    4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291, (2), 210-215 (2004).
    5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 724-736 (2014).
    6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47, (8 Suppl), C13-C18 (2006).
    7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3, (6), 1599-1605 (2008).
    8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119, (13), 1785-1794 (2009).
    9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116, (24), 2841-2850 (2007).
    10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14, (9), 1480-1497 (1994).
    11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, (3), 613-622 (2012).
    12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386, (6620), 78-81 (1997).
    13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31, (6), 471-481 (2010).
    14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96, (43), 1676-1681 (1971).
    15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21, (1), 142-144 (1999).
    16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24, (2), 289-294 (1986).
    17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142, (3), 201-203 (1984).
    18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48, (4), 357-361 (2006).
    19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9, (6), 1225-1235 (2011).
    20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17, (3), 566-569 (2001).
    21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6, (3), 271-278 (2013).
    22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, (3), 645-651 (2013).
    23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55, (1), 59-65 (2009).
    24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65, (2), 463-470 (2015).
    25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10, (1), e0117098 (2015).
    26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 715-723 (2014).
    27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4, (3), 148-156 (2008).
    28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25, (4), 267-274 (2015).
    29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109, (5), 564-577 (2011).
    30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97, (2), 105-114 (2005).
    31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107, (4), 485-494 (2010).
    32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91, (4), 1800-1809 (1993).
    33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23, (4), 609-620 (2011).
    34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586, (14), 1993-2002 (2012).
    35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20, (23), 8783-8792 (2000).
    36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283, (43), 29119-29125 (2008).
    37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199, (2), 271-277 (2008).
    38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, (10), 1908-1915 (2010).
    39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18, (15), 4388-4392 (2008).
    40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14, (12), 1363-1369 (2008).
    41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19, (4), 217-226 (2013).
    42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104, (6), 733-741 (2009).
    43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110, (4), 935-947 (2010).
    44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89, (12), 1147-1154 (2001).
    45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67, (6), 2488-2493 (2005).
    46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19, (12), 1148-1154 (2001).
    47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115, (3), 377-386 (2007).
    48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
    49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
    50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56, (3-4), 177-185 (1978).
    51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350, (2), 177-185 (2006).
    52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99, (10), 1044-1059 (2006).
    53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (40), 14678-14683 (2006).
    54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (5), H619-H628 (2012).
    55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12, (5), 500-509 (2007).
    56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39, (4), 264-270 (2011).
    57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312, (17), 1764-1771 (2014).
    58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368, (6), 503-512 (2013).
    59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90, (2), 844-853 (1994).
    60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108, (11), 1381-1391 (2011).
    61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, (7), 1017-1024 (2009).
    62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101, (5), 1087-1096 (2007).
    63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
    64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59, (1), 1-61 (1979).
    65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308, (1-2), 25-33 (2008).
    66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, (9), 2112-2118 (1999).
    67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
    68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49, (5-6), 365-373 (2012).
    69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
    70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
    71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104, (6), 710-711 (2009).
    הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter