Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Förkalkning av vaskulära glatta muskelceller och avbildning av aorta förkalkning och inflammation

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste orsaken till sjuklighet och dödlighet i världen, inklusive USA, där den står för över 780.000 dödsfall årligen. 1 Kranskärls förkalkning och aorta förkalkning är kännetecken av aterosklerotisk sjukdom och fungerar som starka prediktorer för kardiovaskulära händelser. 2- 4 Två huvudtyper av vaskulär förkalkning har rapporterats hos vuxna: intima förkalkning, i samband med ateroskleros och mediala (även känd som Mönckeberg) förkalkning associerad med kronisk njursjukdom och diabetes 5 intimal förkalkning sker i fastställandet av lipidackumulering och makrofager. infiltration i kärlväggen. 5,6 Medial vägg förkalkning sker oberoende av intimal förkalkning, lokaliserar till elastinfibrer eller glatta muskelceller, och är inte associerat med lipid nedfall eller makrofaginfiltration. 5,7,8 Studier på de molekylära mekanismerna förvaskulär förkalkning har förlitat sig på cellbaserade och djurmodellsystem. Gnagarmodeller för atherocalcific sjukdom inkluderar möss som saknar antingen apolipoprotein E (ApoE) 9,10 eller low-density lipoprotein-receptor (LDLR) 11 matas en fettrik kost, medan modeller för medial förkalkning inkluderar möss med matrix Gla protein (MGP) brist 12 eller råttor som utvecklar uremi antingen genom nästan total nefrektomi (den 5/6. nefrektomi modell) eller genom exponering för en hög-adenin diet. 13

Här är en modell av mediala vaskulär förkalkning i samband med MGP brist fokuserat på. MGP är ett extracellulärt protein som inhiberar arteriell förkalkning. 12 Mutationer i MGP-genen har identifierats i Keutel syndrom, en sällsynt sjukdom hos människor som kännetecknas av diffus brosk förkalkning förutom brachytelephalangy, hörselnedsättning, och perifer pulmonell stenos. 14-18 Även om det inte observeras ofta, 19koncentriska förkalkning av flera artärer har beskrivits i Keutel syndrom. 20 Vanliga polymorfismer i den humana MGP-genen är förknippade med ökad risk för kranskärls förkalkning, 21-23 medan högre cirkulerande nivåer av uncarboxylated, biologiskt inaktiva MGP förutsäga kardiovaskulär mortalitet. 24 Till skillnad från människor med Keutel syndrom, MGP-brist möss utvecklar en allvarlig vaskulär fenotyp bestående av spontan utbredd åderförkalkning börjar vid två veckors ålder och dör 6-8 veckor efter födseln på grund av aorta bristning. 12

Till skillnad från ApoE - / - och LDLR - / - möss som utfodrats en fettrik kost, som utvecklar intima vaskulär förkalkning med tillhörande makrofag-inducerad inflammation, MGP - / -. Möss utvecklar medial vaskulär förkalkning i frånvaro av makrofaginfiltration 11,25 Även dessa fynd tyder på olika underliggande stimuli för intimal och medial förkalkning, det finns en överlappning i de signalmekanismer som förmedlar båda formerna av förkalkning. 26 Flera signalvägar har identifierats som bidrar till vaskulär förkalkning inklusive inflammatoriska mediatorer, såsom tumörnekrosfaktor-α och IL-1 och pro-osteogena faktorer såsom Notch, Wnt, och benmorfogenetiskt protein (BMP) signalering. 27,28 Dessa signaleringsvägar öka expression av transkriptionsfaktorer runt relaterade transkriptionsfaktor 2 (Runx2) och osterix, vilket i sin tur ökar expression av benrelaterade proteiner ( . t.ex. osteokalcin, sclerostin och alkalinfosfatas) i kärlsystemet som förmedlar förkalkning 28-30 Vi och andra har visat att vaskulär förkalkning observerades i ApoE - / - och LDLR - / - möss som utfodrats en fettrik kost och den spontana vaskulär förkalkning observerades i MGP - / - möss är alla beroende av benmorfogenetiskt protein (BMP) signaling, och det är denna väg som är inriktad på här. 11,25,31 BMPs är potenta osteogena faktorer som krävs för benbildning och är kända att uppvisa ökat uttryck i human ateroskleros. 32-34 In vitro studier har blandat in BMP-signalering i att reglera uttrycket av osteogena faktorer såsom Runx2. 35-37 uttryck~~POS=HEADCOMP av BMP-liganden, BMP-2, påskyndar utvecklingen av vaskulär förkalkning i ApoE-brist möss livnärde en fettrik kost. 38 Vidare användning av särskilda BMP signalering hämmare sådana som LDN-193.189 (LDN) 39,40 och / eller ALK3-Fc hindrar utvecklingen av vaskulär förkalkning i både LDLR - / - möss som utfodrats en fettrik kost och MGP-brist möss 11,25.

Vaskulära glatta muskelceller (VSMC) har en avgörande roll i utvecklingen av vaskulär förkalkning. 30,41,42 Den mediala kärl förkalkning som utvecklas i MGP-brist möss är kännetecknas av en transdifferentiering av VSMC till en osteogen fenotyp. Förlust av MGP resulterar i minskat uttryck av VSMC markörer inklusive myocardin och alfa glatt muskulatur aktin, med en åtföljande ökning av osteogena markörer som Runx2 och osteopontin. Dessa förändringar sammanfaller med utvecklingen av vaskulär förkalkning. 25,43,44

Aorta förkalkning och inflammation i möss normalt bedöms att använda histokemiska tekniker såsom alkalisk fosfatasaktivitet för tidig förkalkning och osteogen aktivitet, von Kossa och Alizarin röd färgning för sent förkalkning, och immunohistokemiska protokoll som riktar makrofag proteinmarkörer (t ex., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 dessa standardavbildningstekniker kräver behandling av aortavävnader i tvärsnitt, vilket är tidskrävande och ofullkomliga som beror på urvalet bias, och är begränsade i sin förmågan att kvantifiera inflammation och calcificatjon i hela aorta. Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera och kvantifiera hela aorta och medelstora åderförkalkning och makrofager ackumulering utnyttjar nära infraröda fluorescerande (NIR) molecular imaging ex vivo. Vidare tillhandahålles en metod för att skörda och odling primära aorta VSMC från möss och inducera förkalkning av murina och humana VSMC in vitro för att bestämma de molekylära mekanismerna bakom vaskulär förkalkning. Dessa tekniker ger utredaren med både in vivo och in vitro metoder för att studera atherocalcific sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla studier med möss utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Bostäder och alla procedurer som involverar möss som beskrivs i denna studie har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittéer Massachusetts General Hospital (underutskottet för forskning Animal Care). Alla förfaranden genomfördes med omsorg för att minimera lidandet.

1. Beredning av reagenser

  1. Near-Infrared Fluorescence Imaging av hela artärer
    Anm: a. Bisfosfonat härrörande, nära infraröda fluorescerande avbildningssonden kan användas för att markera osteogen aktivitet i kärl genom att binda till hydroxiapatit 46,47 En cathepsin-aktiverade fluorescerande avbildningssonden kan tjäna som en markör för makrofag proteolytisk och elastolytisk aktivitet i kärl. 9 för att möjliggöra samtidig användning av både fluorescerande prober, är det viktigtatt använda prober som är spektralt distinkt. Notationen kalcium NIR kommer att användas för att indikera den förkalkning specifika nära infraröda fluorescerande avbildningssonden och katepsin NIR att indikera den katepsin verksamhetsspecifika nära infraröda fluorescerande avbildningssonden.
    1. Bered lösningar av kalcium NIR och cathepsin NIR. Enligt tillverkarens protokoll, tillsätt 1,2 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till flaskan innehållande 24 nmol kalcium NIR eller cathepsin NIR och skaka försiktigt.
      Obs: Enligt tillverkaren, en gång rekonstitueras med PBS, kalcium NIR och cathepsin NIR lösningar förblir stabila under 14 dagar vid förvaring i mörker vid 2-8 ° C.
  2. Isolering och förkalkning av murin Aorta VSMC
    1. Aorta Uppslutning Lösning:
      1. Bered en färsk lösning (~ 3-5 ml per aorta skörd) med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) innehållande 175 U / ml typ 2 kollagenas och 1,25 U / ml elastas. Sterilisera lösningen wed en 0,22 um vakuumdriven filtreringssystem och hålla lösningen på is fram till användning.
    2. Cell Media:
      1. Komplettera 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum, 100 enheter / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin. Värma media till 37 ° C före användning.
    3. Förkalkning Media:
      1. Förkalkning Media A (NaPhos, som används i mus-cellinjer):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volym efter behov) med 10% fetalt bovint serum, 2 mM natriumfosfat, 100 enheter / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin. Värma media till 37 ° C före användning.

          ELLER
      2. Förkalkning Media B (βGP / ASC / DEX; användas antingen mus eller humana cellinjer):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volym efter behov) med 10% fetalt bovint serum, 10 mM β-glycerofosfat dinatrium, 50 | ig / ml L-askorbinsyra, 10nM dexametason, 100 enheter / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin. Värma media till 37 ° C före användning.

2. injektion i svansvenen

  1. Innan svans injektion värma mössen under en mild värmelampa under 5 min.
  2. Hålla musen i ett rör gnagare hållare. Desinficera svansen med en tuss.
  3. Utnyttja en 30 G nål för injektion i svansvenen. Svansvenerna ligger i sidled.
    1. Tillämpa en mild mängd tryck framåt på sprutan när nålen förs in i svansen. Venen nås när motståndet mot injektion är inte längre närvarande.
    2. Injicera en volym av 100 | j, l av kalcium NIR och / eller 100 ul av katepsin NIR i jämn takt. Vid slutet av injektionen, efter en 5 sek paus, dra ut nålen.
  4. Skörda artärer (se avsnitt 3) 3-24 timmar efter injektion.

3. Mus Dissection

  • Avliva mus med en 200 mg / kg intraperitoneal pentobarbital injektion.
  • Lägg djuret liggande på dissekering ombord och stabilisera genom att tejpa varje tass till styrelsen. Med användning av ett dissektionsmikroskop och en liten sax, gör en mittlinjeincision sträcker sig från den nedre delen av magen till den övre bröstkorgen.
  • Skala tillbaka huden med pincett och ta bort bukhinnan, avslöjar bukorganen. Ta bort de gastrointestinala organen, noga med att inte transekt aorta.
  • Göra ett lateralt snitt i den främre membranet och fortsätter incisionen över buken. Med användning av dissektion sax, släpp bröstkorgen genom att skära igenom sidorna av ribborna och avlägsnande av mjuk vävnad vidhäftande till den överlägsna delen av bröstbenet. Ta bröstkorgen, avslöjar lungorna.
  • Låt hjärtat på plats från början (för att underlätta identifiering och dissekera den proximala aorta) och försiktigt bort lungorna. Ta bräss, luftstrupe och matstrupe med omsorg, ensuring att aorta förblir intakt.
  • Använda rak fin pincett och mikro dissekera sax, ta bort den mjuka vävnaden som omger aorta från höftbifurkationen till aortabågen, noggrann uppmärksamhet när du tar bort peri-aorta fett (Figur 1A). Avlägsna kvarvarande fett och mjuk vävnad som omger de stora grenarna av aortabågen (dvs brachiocephalic, gemensamma hals och subclavia artärer, Figur 1B).
    Obs: Det är viktigt att ta bort fett från aorta eftersom fett kan öka bakgrundssignalen när du utför fluorescens avbildning.
  • Ta hjärtat från brösthålan, försiktigt bort den från den proximala aorta, och kasta. Transekt distala aorta vid höftbifurkationen. Med användning av en insulin nål, injicera fysiologisk koksaltlösning i aorta från aortabågen för att tvätta ut kvarvarande blodceller. Lossa aorta tillsammans med aortabågen fartyg, helt ta bort denfrån kroppen.
  • Placera aortan i normal saltlösning på is tills redo för avbildning.
  • 4. Aorta Imaging

    1. Bild Aorta ex vivo direkt efter skörd av nära infraröda fluorescens reflektans avbildning. 25
      1. Ställa in fluorescens imager på lämpliga flerkanals våglängder för att kvantifiera fluorescenssignalintensiteterna från aorta av kalcium NIR och katepsin NIR-injicerade möss, såsom beskrivits tidigare. 25 Enligt tillverkaren, kan kalcium NIR exciteras av ~ 650-678 nm ljus med en maximal emission i ~ 680-700 nm. Cathepsin NIR kan exciteras av ~ 745-750 nm ljus med en maximal emission vid ~ 770 nm.

    5. Isolering av Primär Murine Aorta vaskulära glatta muskelceller

    1. Utför steg 3,1-3,7 såsom beskrivits ovan.
    2. Placera aorta i kallt HBSS tills dissektioner är klar. Skär försiktigt bort någon remaining periaortic fett och mjuk vävnad, vilket innebär att endast aorta.
    3. Under en steril vävnadsodling huva, överföra aorta till aorta Uppslutning lösning i 35 mm x 10 mm vävnadsodlingsskålar. Plats i en inkubator vid 37 ° C under 30 min med försiktig intermittent gungning. Efter digestion, aorta uppvisar en sträckt eller nött utseende.
    4. Med dissektion mikroskop och steril tång, ta bort det yttre adventitiala lagret av aorta medan den mediala lagret intakt. En teknik för att ta bort adventitia är att skala bort det yttre lagret av aorta i ena änden och ta bort den från den underliggande mediala skiktet som en strumpa kan skalas tillbaka och tas bort.
    5. När adventitiala skiktet har avlägsnats, placera de återstående aorta i en ny vävnadsodlingsplatta med cellodlingsmedia och förvara vid 37 ° C med 5% CO2 under 2-4 timmar.
    6. Under en steril huva och med sterila 3 mm mikro-dissektion sax, klippa aorta i 1-2 mm bredaringar.
    7. Placera dessa ringar i en ny vävnadsodlingsskål med Aortic Digestion Solution och inkubera vid 37 ° C med försiktig intermittent gungning under 120 min. Pipettera lösningen upp och ner flera gånger under denna inkubation för att återsuspendera cellerna.
    8. Tillsätt 5 ml varmt cellodlingsmedia till uppslutningslösningen och överför till en 15 ml koniska rör.
    9. Röret centrifugeras i 5 minuter vid 200 x g.
    10. Aspirera media och återsuspendera cellerna i den önskade volymen av cellodlingsmedier (t.ex., 5 ml).
    11. Plate hela mängden av isolerade celler från varje aorta i en 25 cm 2 cellodlingskolv och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2. Fortplanta celler med användning av standardtekniker, såsom beskrivits tidigare. 25,48 Under de inledande 7-10 dagars inkubation, ändra media varje 72-96 h. När cellerna närmar sig konfluens, fylla media oftare (varje 48 timmar).
      Obs: Det kan ta flera veckor att växa en tillräcklig förutsättningntity av celler.
    12. När sammanflytande, passage celler med trypsin som värms till 37 ° C.
      1. Lägg 0,5-1,0 ml trypsin till varje odlingskolv och inkubera i 3-5 min; knacka försiktigt på sidan av kolven varje 30-60 sek efter behov för att lösgöra cellerna från ytan.
      2. När cellerna lossnar från botten av kolven, tillsätt 10 ml av cellmediet till cellerna i trypsin. Centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 min. Aspirera media och trypsin från cellpelleten. Resuspendera cellerna i önskad mängd färsk cellmedia (t.ex. 5-10 ml) och överför till en ny kolv (med vissa celler överfördes till en kammare glida).
    13. Vid första passagen av celler, bekräftar den glatta muskelceller härstamning med standard immuncytokemi tekniker, såsom tidigare beskrivits, 49 med användning av en antikropp riktad mot α-glattmuskelaktin.

    6. Induktion förkalkning av Cultured Smooth MuscleCeller

    1. Plattceller erhölls från 5,12 i en 6-brunnsformat. Obs: Start med 1 x 10 5 celler / brunn i en total volym av 2,0 ml cellmedia per brunn rekommenderas.
    2. Låt cellerna att växa i Förkalkning Media A eller B för åtminstone 7 dagar i en 6-brunnar format. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2.
    3. Ändra cell media varje 48 timmar.

    7. Bedömning VSMC förkalkning Använda von Kossa färgningsmetoden

    Obs.: The von Kossa-metoden för mätning av extracellulär matris förkalkning av vävnader eller odlade celler är baserad på den substitution av fosfatbundna kalciumjoner med silverjoner 50 I närvaro av ljus och organiska föreningar, är silverjonerna reduceras och visualiserades som metalliskt silver. Eventuell oreagerad silver avlägsnas genom behandling med natriumtiosulfat 50 Protokollet för von Kossa-färgning är följande.:

    1. Aspirera media från cell culture plattor.
    2. Fixera celler genom att placera dem i 1 ml 10% formalin vid rumstemperatur i 20 min.
    3. Avlägsna formalin och tvätta de fixerade cellerna med destillerat vatten under 5 min.
    4. Inkubera cellerna i 1 ml 5% -ig silvernitratlösning under en 60 till 100 W glödlampa under 1-2 timmar.
    5. Aspirera silvernitratlösningen och tvätta med destillerat vatten under 5 min.
    6. Avlägsna oreagerad silver genom att placera cellerna i 1 ml 5% natriumtiosulfat (vikt / volym) lösning i destillerat vatten under 5 min.
    7. Skölj celler med destillerat vatten under 5 min. Upprepa tvättar 3x. Von Kossa fläcken är redo för avbildning med standard inverterad ljusmikroskop.
    8. Valfritt steg: motfärg med 1 ml av kärn snabb röd för 5 min. Följer detta med tre tvättningar med destillerat vatten (5 min vardera).

    ELLER

    8. Bedöma VSMC förkalkning med nära infraröd fluorescerande Imaging

    Obs: I likhet med sin förmågaatt identifiera förkalkning i mus artärer, kalcium NIR binder lätt calcific mineral deponerats av odlade celler. Med hjälp av denna teknik, fluorescensmikroskopi och plattläsare med långa våglängdsfilter kan bild och kvantifiera in vitro förkalkning, respektive. Den långa våglängd utsläpp av kalcium NIR möjliggör samtidig användning av lägre våglängd avger fluoroforer för att upptäcka andra funktioner. Protokollet för kalcium NIR färgningen är som följer:

    1. Som beskrivs i avsnitt 1.1.1, tillsätt 1,2 ml 1x PBS till flaskan innehållande 24 nmol kalcium NIR.
    2. Späd kalcium NIR lager 1: 100 i lämpliga förkalkning eller kontrollmedia.
    3. Aspirera cellmediet från odlingsplattor och ersätta med kalcium NIR-innehållande odlingsmedium.
    4. Inkubera odlingsplattor med kalcium NIR media över natten vid 37 ° C.
    5. Aspirera media från brunnarna och tvätta brunnarna en gång med PBS.
      Obs: Vid denna punkt,den ursprungliga odlingsmedier kan tillsättas till brunnarna, och cellerna kan avbildas live. I annat fall går till stegen nedan.
    6. Fixera celler genom att placera dem i 1 ml 10% formalin vid rumstemperatur i 20 min.
    7. Avlägsna formalin och tvätta de fixerade cellerna med destillerat vatten under 5 min. Upprepa tvättar 3x.
    8. Valfritt steg:. Utför immunofluorescensfärgning eller andra counterstains för proteiner av intresse 8,9
    9. Bild eller upptäcka kalcium NIR fläcken med lämplig fluorescensexciteringsvåglängder (t.ex. kan kalcium NIR exciteras av 650-678 nm ljus) och emissionsfilter (~ 680-700 nm).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Aorta förkalkning i MGP - / - och vildtyp möss mättes med användning av avbildning av kalcium NIR fluorescens. Ingen kalcium NIR signal detekterades i aorta från vildtyp möss, vilket tyder på avsaknad av förkalkning (Figur 2). En stark kalcium NIR signal detekterades i aorta från MGP-brist möss, vilket överensstämmer med avancerad kärl förkalkning. Vävnadssnitt av aorta från vildtyp och MGP - / - möss färgades med Alizarin red 25 (Figur 3A - B), vilket bekräftar den omfattande vaskulär förkalkning observerades i MGP-brist möss utan någon förkalkning detekteras i vildtyp möss. För att avgöra om den vaskulära förkalkning i samband med MGP-brist är beroende av BMP-signalering, MGP - / - möss behandlades med LDN, ALK3-Fc, eller fordon som börjar på dag ett av livet. Dessa möss injicerades med kalcium NIR på dag 27 ochAorta skördades följande dag. Farmakologisk hämning av BMP signalering minskat aorta förkalkning detekteras med kalcium NIR (Figur 2). I likhet med resultaten med kalcium NIR, aorta av LDN- och ALK3-Fc-behandlade MGP - / - möss hade minskat Alizarin röd fläck för kalcium jämfört med vehikelbehandlade MGP - / - möss (Figur 3B - D). Dessa resultat indikerar att BMP-signalering krävs för vaskulär förkalkning observerades i MGP - / - möss.

    LDLR - / - möss som utfodrats en fettrik kost utveckla både makrofag inflammation och förkalkning av artärväggen 11 Samtidig injektion i svansvenen av calcific och cathepsin specifika NIR sonder i MGP -. / - Möss utfördes för att bestämma om den vaskulära förkalkning av MGP -brist är associerad med makrofag ackumulering 25 LDLR -. / - möss som utfodratsen fettrik kost och vildtyp möss användes som positiva och negativa kontroller, respektive. Aorta från vildtypsmöss uppvisade praktiskt taget ingen kalcium NIR eller katepsin NIR-signal, som förväntat (figur 4A). Samlokaliserade kalcium NIR och cathepsin NIR signaler som gynnade aortabågen regionen observerades i LDLR - / - möss, vilket tyder på ett starkt samband mellan makrofaginfiltrering och vaskulär förkalkning i denna modell av intimal ateroskleros. Även om en diffus och stark kalcium NIR signal observerades i aorta i MGP - / - möss, cathepsin NIR signalen var inte skiljer sig från vildtyp möss. Dessa fynd tyder på att den vaskulära förkalkning i MGP-brist uppträder i frånvaro av makrofager ackumulering. För att ytterligare bekräfta dessa fynd, aorta från vildtyp, MGP - / -, och LDLR - / - möss skördades, snittades och färgades med en antikropp specifik för makrofag markör MAC-2 ( - / - möss visade riklig MAC-2-färgning; det fanns ingen detekterbar MAC-2 färgning i aorta av MGP - / - möss, vilket tyder på en frånvaro av vaskulära makrofager.

    Att modellera vaskulär förkalkning in vitro, var aorta VSMC isolerades från vildtyp och MGP - / - möss och odlas i hög fosfatinnehållande media, med användning av det protokoll som beskrivits ovan. För att bestämma vilken roll MGP i modulera förkalkning av odlade VSMC, var ett adenovirus som uttrycker MGP (Ad.MGP) används för att återställa MGP i aorta VSMC från MGP - / - möss. MGP-brist VSMC infekterade med ett adenovirus som uttrycker grönt fluorescerande protein (Ad.GFP) användes som kontroll. Dessutom, för att bestämma effekten av att ta bort MGP expression från VSMC på efterföljande förkalkning var aorta VSMC från vildtyp möss behandlades med siRNA riktat mot MGP (siMGP) eller kontroll siRNA (Sisc). Förkalkning inducerades i odlade VSMC genom att odla cellerna i förkalkning Media A i 7 dagar. Cellerna därefter fixeras och färgas för kalcium med hjälp av von Kossa-metoden. Restaurering av MGP med Ad.MGP minskad förkalkning av MGP - / - VSMC jämfört med kontroll adenovirus-behandlade celler (Figur 5A - B, E). Behandling av vildtyp aorta VSMC med siMGP, vilket resulterar i> 95% knockdown av MGP uttryck, 25 ökade förkalkning jämfört med Sisc-behandlade celler (Figur 5C - D, F). Dessa resultat tyder på att denna modell in vitro av VSMC förkalkning härmar resultaten i MGP-brist möss och visar att MGP modulerar förkalkning av odlade VSMC.

    En alternativ metod för att detektera förkalkning av odlade VSMC är med kalcium NIR. Att modellera vaskulär förkalkning i v itro mänskliga kranskärls VSMC köptes och odlades under 21 dagar i Förkalkning Media B. Efter behandlingsperioden, var förkalkning identifieras med användning av kalcium NIR-metoden och kulturerna motfärgades med en anpassad grönt fluorescerande kollagen sonden 51 och Hoechst färgämne (1 ^ g / ml i 5 min efter fixering i 10% formalin) (Figur 6). VSMC kärnor observerades med blå Hoechst fluorescens genom konfokalmikroskopi (figur 6A). Ett representativt optisk avsnitt visar kalcium NIR-färgade calcific mineral inom kollagenmatrisen produceras av VSMC (Figur 6B). Tredimensionella rekonstruktioner av optiska z-stackar illustrerar skikten som skapats i kulturen som de VSMC på botten av brunnen framställa en kollagenmatris i vilken den deponerade calcific mineral blir infångat (Figur 6C - D).

    re en "src =" / filer / ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
    Figur 1:. Representant Dissekering av en aorta från en vild-typ mus (A) En bild av bröst- och bukaorta som sträcker sig till den gemensamma höftartären bifurkation visas efter avlägsnande av överliggande organ och peri-aorta fett. (B) En fokuserad bild av aortabågen med brachiocephalic, vänstra gemensamma halspulsådern, och vänster subclavia artärer. Skalstrecken = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2: Vascular förkalkning i MGP - / - möss är beroende BMP Signaling MGP - / - möss behandlades med intraperitoneal (ip) injektioner av antingen ve. donet, LDN-193.189 (LDN, 2,5 mg / kg / dag), eller ALK3-Fc (2 mg / kg varannan dag) och vildtyp möss behandlades med ip injektioner av fordon som börjar på dag ett av livet till dag 28 . På dag 27 injicerades mössen med kalcium NIR via svansvenen. Aorta skördades på dag 28 och avbildas med nära infraröda fluorescens. Bilder är på samma förstoring i alla fyra paneler med skal indikerar 3 mm. Vildtyp mus aortor uppvisade inte kalcium NIR-signal medan aorta från MGP - / - möss hade en stark kalcium NIR-signal. Jämfört med vehikelbehandlade MGP - / - möss, aorta av MGP - / - uppvisade möss som behandlats med antingen LDN eller ALK3-Fc minskade signifikant kalcium NIR signaler. Denna siffra är hämtad från referens 25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    3 "src =" / filer / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    Figur 3: Farmakologisk Hämning av BMP Signaling förhindrar Aorta förkalkning i MGP-brist möss Vildtyp möss behandlades med ip injektioner av fordon (A) och MGP - / - möss behandlades med antingen ip injektioner av fordon (B), LDN. (C, 2,5 mg / kg / dag), eller ALK3-Fc (D, 2 mg / kg varannan dag) med början vid dag 1 av livet fram till dag 28. aorta skördades, snittades och färgades för kalcium med Alizarin red. Bilder togs vid samma förstoring i alla fyra paneler med skalfältet indikerar 400 pm. Liknande de kalcium NIR signalerna i fig 2, demonstrerar Alizarin röd färgning en tung börda av förkalkning i aorta hos vehikelbehandlad MGP - / - möss. Förkalkning minskas i artärer i LDN- och ALK3-Fc-behandlade MGP - / - möss. Denna siffra är hämtad frånreferens 25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    . Figur 4: samtidig bestämning av Aorta förkalkning och makrofaginfiltrering med kalcium NIR och cathepsin NIR (A) Vildtyp, MGP - / -, och LDLR - / - möss som utfodrats en fettrik kost injicerades med kalcium NIR och cathepsin NIR via injektion i svansvenen. Aorta skördades 24 timmar senare och bedöms med nära infraröda fluorescens avbildning. Bilder är på samma förstoring med skala bar indikerar 3 mm. Vildtyp möss uppvisar praktiskt taget ingen aorta förkalkning eller makrofag närvaro. Aorta från LDLR - / - möss har omfattande förkalkning som co-lokaliseras med makrofager ackumulering. I kontrast, MGP - / - Möss har aorta förkalkning som sker i frånvaro av makrofaginfiltration. (B) aorta skördades från vildtypen, MGP - / -, och LDLR - / - möss som utfodrats en fettrik kost. Dessa artärer sektionerades och färgades för makrofager med en antikropp specifik för MAC-2. Kärnor färgades med DAPI. Lumenytan är åt höger i varje panel. Bilder togs vid samma förstoring i alla tre paneler med skalfältet indikerar 100 pm. I likhet med resultaten i (A), det fanns inga tecken på makrofager ackumuleras i artärer i MGP - / - möss. Denna siffra är en modifierad version av en siffra från referens 25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    .jpg "/>
    . Figur 5: MGP skyddar Odlade VSMC från Förkalkning Odlade aorta VSMC isolerades från MGP - / - möss och infekterades med adenovirus, som uttrycker antingen GFP (A) eller MGP (B). Aorta VSMC isolerade från vildtyp möss transfekterades med antingen kontroll oordning siRNA (C) eller siRNA inriktning MGP (D). Celler odlades i Förkalkning Media A 7 dagar och därefter fixeras och färgas med von Kossa. Bilder togs vid samma förstoring i alla fyra paneler (A - D) med skalfältet indikerar 200 um. Serie synfält fotograferades och kvantifieras för kalcium färgning med hjälp av bilden J programvara efter bakgrundssubtraktion (E och F), med felstaplar som anger SEM. Denna siffra är en modifierad version av en figur från referens 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 6
    Figur 6:. Kalcium NIR identifierar förkalkning i samband med den extracellulära matrisen in vitro (A) Mänskliga kranskärls VSMC odlas i Förkalkning Media B för 21 dagar identifierades genom nukleär färgning hjälp av Hoechst färgämne. (B) Ett optiskt avsnitt erhålls genom konfokalmikroskopi av kalcium NIR färgning (röd) kombineras med en grön-fluorescerande kollagen sond visar calcific mineral hela kollagenmatrisen. Bilder A - B togs vid samma förstoring med skala bar anger 10 um. (C och D) Tredimensionella rekonstruktioner visar inneslutningen av calcific mineral inom than kollagenmatrisen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Åderförkalkning är en viktig riskfaktor för kardiovaskulär sjukdom hos människor och kan direkt bidra till patogenesen av kardiovaskulära händelser. 1,5,52 Intimal kalcium nedfall i de tunna fiber lock av aterosklerotisk sjukdom har föreslagits att öka den lokala biomekaniska stress och bidra till plackbristning. 53,54 Medial förkalkning effekter kliniska resultat genom att öka artärstelhet, som kan framkalla hjärthypertrofi och påverka hjärtfunktionen. 55 Därför att förstå de molekylära mekanismer som ligger bakom vaskulär förkalkning kommer att ge viktiga insikter i mänsklig sjukdom och potentiellt identifiera nya mål för terapi.

    Här, är en metod för detektering aorta förkalkning och makrofag-ackumulering i musmodeller av ateroskleros och vaskulär förkalkning utnyttjande NIRF avbildning beskrivits. 9 Det är kritiskt att noggrant injicera NIRF agenter i svansvenen. Detta är en teknik som kräver betydande praxis innan behärskning uppnås. 56 Dessutom är det viktigt att ta bort all peri-aorta fett från aorta, eftersom detta fett kan orsaka en autofluorescent signal på samma våglängd som kalcium NIR och cathepsin NIR-signaler. Användningen av NIRF medel har flera viktiga fördelar jämfört med vanliga histologiska metoder för att bedöma vaskulär förkalkning och inflammation. I motsats till konventionella histologiska tekniker, dessa medel tillåter kvantifieringen av hela aorta förkalkning och makrofag infiltration. Dessutom ger de en känsligare metod för att upptäcka tidiga förändringar i samband med utvecklingen av aorta förkalkning än histologisk färgning och kan därför erbjuda mekanistiska insikter tidigare stadier av sjukdomen. 9 platser för tidig kalcium NIR signal associeras med markörer för benbildning inklusive ökat alkalisk fosfatasaktivitet som well som Runx2 och osteopontin genuttryck. Dessutom samtidig användning av spektralt distinkta prober för förkalkning och cathepsin aktivitet möjliggör kvantifiering och association av Spatiotemporal utvecklingen av både ateromatös och calcific sjukdom. 9

    Identifiera den rumsliga och tidsmässiga egenskaper vaskulära förkalkning och inflammations hjälpmedel i vår förståelse av de bakomliggande patofysiologiska mekanismer för kärlsjukdom. Till exempel har användningen av NIRF medel visat att i modeller av intima förkalkning (ApoE - / - och LDLR - / - möss på en fettrik kost), vaskulär förkalkning co-lokaliseras till områden av makrofager ackumulation (Figur 4) och att förkalkning följer ansamling av makrofager tidsmässigt. 9,11 Intressant nog ingen makrofag ackumulering med katepsin NIR detekterades i den mediala vaskulär förkalkning hittas i MGP-saknande möss. 25 torss, från experiment med användning NIRF agenter, kan man dra slutsatsen att även om makrofager ackumulering förknippas med vaskulär intima förkalkning, är det inte nödvändigt för vaskulär medial förkalkning.

    I likhet med sin roll i bildbehandling och studera kärlsjukdom har NIRF avbildning använts för att studera aortaklaffen sjukdom. 47 aortaklaffen sjukdom kännetecknas av lipid-lastat makrofager och kalcifika lesioner på ventilen och uppvisar liknande molekylära mekanismerna bakom och genetiska faktorer som åderförkalkning . 57-59 aortaklaffen förkalkning orsakar försämring av broschyren funktion och är den främsta orsaken till den kliniska aortastenos hos äldre. Den enda behandling för närvarande tillgängliga för symtomatisk aortastenos är klaffen ersättning. En bättre förståelse för de molekylära mekanismerna för aortaklaffen sjukdomen är nödvändig för att förhindra sen klinisk komplikationer av progressiv aortaklaffen förkalkning. Utnyttjande av NIRF medel som molecular imaging verktyg i djurmodeller ger en känslig metod för att bedöma aortaklaffen sjukdomen hos dess mest tidiga scener. 60

    Standardtekniker för att visualisera kranskärls plack har fokuserat på svårighetsgraden av stenos, men majoriteten av akuta hjärtsyndrom resultera från att brista av icke-flödesbegränsande plack. 6 Biologiska processer inom plack, såsom inflammation, tjäna som bättre prediktorer för plackbristning än graden av stenos. 61 till skillnad från konventionella avbildningstekniker, ger NIRF avbildning en möjlighet att mäta cellulär aktivitet (dvs makrofager proteolytisk aktivitet med en matris metalloproteinas (MMP) aktiverbart medel, proteolytisk och elastolytisk aktivitet med cathepsin NIR, och osteogen aktivitet med kalcium NIR). 9 Denna metod ger därför samtidig funktionell och anatomisk utvärdering av hjärt-kärlsjukdom. NIRF avbildning utnyttjar excitation våglängder i 650-900 nm, vilket har fördelen av ökad vävnadspenetration jämfört med ljus vid en lägre våglängd, vilket möjliggör större djup bedömning av sjukdomsskador. 60 Det finns också minskat autofluorescent bakgrundssignalen av kärlvävnad i närheten -Infraröd våglängdsområde. Även om detta protokoll fokuserar på användningen av NIRF avbildning ex vivo, NIRF imaging utgör också en användbar plattform för längsgående molekylär avbildning in vivo. 9 NIRF avbildning, i kombination med intravital mikroskopi, kan ge framtida diagnostiska tillämpningar i människor. 61 emellertid en begränsning kalcium NIR imaging längdled är att bisfosfonat härrörande sonden kan själv ändra den fysiologiska processen för förkalkning. 62

    Hjärt-förkalkning är en aktivt reglerad process som involverar transdifferentiering av VSMC till en osteogen fenotyp. 25,41,42 63 och har uppnått tillräckligt många celler per mus aorta för att utföra in vitro-studier (Figur 5). En alternativ meThOD för VSMC isolering innebär inte enzymatisk spjälkning utan direkt kultur explanterade aortaringar; denna teknik har rapporterats ge färre celler än tekniken utnyttjar enzymatisk spjälkning. 63,64

    Två olika förkalkning media, antingen med βGP / Asc / DEX 65,66 eller NaPhos, 25,43 beskrivs, och de kan användas för att inducera förkalkning av VSMC. Båda typerna av medier har använts för att förkalkas murina VSMC med motsvarande framgång. Medan förkalkning media som innehåller βGP / ASC / DEX har använts för att förkalkas mänskliga VSMC (figur 6), har media som innehåller NaPhos inte varit effektiva i förkalkad mänskliga VSMC i vår erfarenhet. Dessutom 21 - kan 28 dagars odling av humana VSMC i Förkalkning Media B krävas innan förkalkning upptäcks. Förkalkning av vildtyp VSMC in vitro ökade när expressionsnivåer av MGP reducerades med siRNA och calcificatipå reducerades i MGP - / - VSMC när MGP uttryck återställdes (Figur 5). Dessa resultat överensstämmer med aorta förkalkning observerades i MGP - / - möss och föreslår att detta in vitro metod för att VSMC förkalkning tjänar som en användbar modell för in vivo-förkalkning. Det är viktigt att notera är dock att det finns begränsningar i att dra slutsatser om intakta blodkärl från odlade VSMC. Odlade VSMC kan förlora sina in vivo sammandragande egenskaper, speciellt vid högre passager, förutom att utveckla förändringar i genuttryck mönster, morfologi och styvhet. 67-70 VSMC odlas i förkalkad media inte differentiera till en osteoblastiska härstamning före förkalkning, men inte uppvisar en chondrocytic intermediär som ofta observeras in vivo. 71 Det är därför viktigt att mekanistiska slutsatser från odlade celler valideras i in vivo-system. Påe potentiell metod för att övervinna denna begränsning är att studera VSMC i deras in vivo tillstånd med användning av ett odlat intakt kärl ring. 70

    Två olika metoder presenteras för att detektera förkalkning av odlade VSMC, von Kossa-metoden (figur 5) och kalcium NIR färgning (Figur 6). Även används ofta för att bedöma om förkalkning är von Kossa metoden något begränsad av dess reducerade specificitet för kalcium kristaller. 50 Kalcium NIR upplevs vara specifik för förkalkning och är särskilt fördelaktig genom att den möjliggör samtidig färgning med ytterligare spektralt distinkt fluorescerande agenter. 9 framtida tillämpningar av detta protokoll som utnyttjar kalcium NIR med ytterligare molekylära prober kan ge viktiga insikter i mekanismerna för förkalkning och kan göra det möjligt för snabb bedömning av småmolekylära hämmare av VSMC förkalkning i en hög genomströmning sätt, IDEntify potentiella nya terapier för vaskulär förkalkning.

    Sammanfattningsvis är hjärt-förkalkning en viktig riskfaktor för och potentiella bidragsgivare till klinisk sjukdom. Kunskap om mekanismerna för hjärt-förkalkning och aterosklerotisk sjukdom förlitar sig på både djur och cellbaserade modeller. Metoder för att bedöma förkalkning in vivo, ex vivo och in vitro-modeller är avgörande för att öka vår förståelse av hjärt-kärlsjukdom.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), e28-e292 (2014).
    2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103, (11), 1529-1534 (2001).
    3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114, (16), 1761-1791 (2006).
    4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291, (2), 210-215 (2004).
    5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 724-736 (2014).
    6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47, (8 Suppl), C13-C18 (2006).
    7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3, (6), 1599-1605 (2008).
    8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119, (13), 1785-1794 (2009).
    9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116, (24), 2841-2850 (2007).
    10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14, (9), 1480-1497 (1994).
    11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, (3), 613-622 (2012).
    12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386, (6620), 78-81 (1997).
    13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31, (6), 471-481 (2010).
    14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96, (43), 1676-1681 (1971).
    15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21, (1), 142-144 (1999).
    16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24, (2), 289-294 (1986).
    17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142, (3), 201-203 (1984).
    18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48, (4), 357-361 (2006).
    19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9, (6), 1225-1235 (2011).
    20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17, (3), 566-569 (2001).
    21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6, (3), 271-278 (2013).
    22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, (3), 645-651 (2013).
    23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55, (1), 59-65 (2009).
    24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65, (2), 463-470 (2015).
    25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10, (1), e0117098 (2015).
    26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 715-723 (2014).
    27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4, (3), 148-156 (2008).
    28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25, (4), 267-274 (2015).
    29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109, (5), 564-577 (2011).
    30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97, (2), 105-114 (2005).
    31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107, (4), 485-494 (2010).
    32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91, (4), 1800-1809 (1993).
    33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23, (4), 609-620 (2011).
    34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586, (14), 1993-2002 (2012).
    35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20, (23), 8783-8792 (2000).
    36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283, (43), 29119-29125 (2008).
    37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199, (2), 271-277 (2008).
    38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, (10), 1908-1915 (2010).
    39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18, (15), 4388-4392 (2008).
    40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14, (12), 1363-1369 (2008).
    41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19, (4), 217-226 (2013).
    42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104, (6), 733-741 (2009).
    43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110, (4), 935-947 (2010).
    44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89, (12), 1147-1154 (2001).
    45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67, (6), 2488-2493 (2005).
    46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19, (12), 1148-1154 (2001).
    47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115, (3), 377-386 (2007).
    48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
    49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
    50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56, (3-4), 177-185 (1978).
    51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350, (2), 177-185 (2006).
    52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99, (10), 1044-1059 (2006).
    53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (40), 14678-14683 (2006).
    54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (5), H619-H628 (2012).
    55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12, (5), 500-509 (2007).
    56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39, (4), 264-270 (2011).
    57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312, (17), 1764-1771 (2014).
    58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368, (6), 503-512 (2013).
    59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90, (2), 844-853 (1994).
    60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108, (11), 1381-1391 (2011).
    61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, (7), 1017-1024 (2009).
    62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101, (5), 1087-1096 (2007).
    63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
    64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59, (1), 1-61 (1979).
    65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308, (1-2), 25-33 (2008).
    66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, (9), 2112-2118 (1999).
    67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
    68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49, (5-6), 365-373 (2012).
    69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
    70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
    71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104, (6), 710-711 (2009).
    Förkalkning av vaskulära glatta muskelceller och avbildning av aorta förkalkning och inflammation
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter