Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Aort Kalsifikasyon ve Enflamasyon Vasküler düz kas hücrelerinin ve Görüntüleme Kalsifikasyon

Published: May 31, 2016 doi: 10.3791/54017
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 2, 1, 2, 1, 1, 1, 1,4, 1,4, 2,4, 1,2,4, 5, 1,4, 3,4, 1,2,4, 3,4, 1,5,6, 2,4
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital
* These authors contributed equally

Introduction

O yılda 780.000 üzerinde ölüm hesapları nerede kardiyovasküler hastalık Amerika Birleşik Devletleri'nde olmak üzere dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedeni vardır. 1 Koroner arter kalsifikasyonu ve aort kalsifikasyon aterosklerotik hastalığın özellikleridir ve kardiyovasküler olayların güçlü belirleyicileri olarak hizmet vermektedir. 2- intimal kalsifikasyon ateroskleroza bağlı ve orta kronik böbrek hastalığı ve diyabet ile bağlantılı kalsifikasyon, (aynı zamanda, Mönckeberg olarak da bilinir) 5 intimal kalsifikasyon lipid birikimi ve makrofaj ortamda oluşur: vasküler kalsifikasyon 4 İki ana tip yetişkin bildirilmiştir. damar duvarı içine sızma. 5,6 Medial duvar kalsifikasyon, bağımsız intimal kalsifikasyon meydana elastin lifleri veya düz kas hücrelerinde lokalize ve lipid birikimi veya makrofaj infiltrasyonu ile ilişkili değildir. 5,7,8 Çalışmaları moleküler mekanizmaları üzerindeVasküler kalsifikasyon hücre bazlı ve hayvan modeli sistemlerinde yararlanmıştır. Medial kalsifikasyon için modeller matriks Gla proteini ile fareler dahil ederken atherocalcific hastalık için kemirgen modelleri, apolipoprotein E (Apo) 9,10 veya düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (LDLR) 11 yüksek yağlı diyetle beslenen ya eksik fareler dahil (MGP) eksikliği 12 veya yakınındaki total nefrektomi (5/6 nefrektomi modeli) ya da yüksek adenin diyet maruz ya üremi geliştirmek sıçanlar. 13

Burada, MGP eksikliği ile ilişkili vasküler kalsifikasyon modeli odaklanmıştır. MGP arteriyel kalsifikasyon inhibe eden bir hücre dışı bir proteindir. MGP geninde 12 mutasyon Keutel sendromu, brachytelephalangy ek olarak yaygın kıkırdak kalsifikasyon ile karakterize nadir insan hastalığı, işitme kaybı ve periferik pulmoner stenoz tespit edilmiştir. 14-18 olmasa da sık sık gözlenen, 19çoklu arter eş kireçlenme. Keutel sendromu tarif edilmiştir uncarboxylated, biyolojik olarak aktif olmayan mgp yüksek dolaşım düzeyleri kardiyovasküler mortalite tahmin ederken, insan MGP geninde 20 ortak polimorfizmler, koroner arter kalsifikasyon riski, 21-23 ile ilişkilidir. 24. İnsanlarda aksine Keutel sendromlu, MGP eksikliği fareler iki hafta başlayan ve aort rüptürü doğumdan sonra 6-8 hafta die spontan yaygın arteriyel kalsifikasyon oluşan ciddi vasküler fenotip gelişir. 12

ApoE aksine - / - ve LDLR - / - fareler yüksek yağlı diyetle beslenen, ilişkili makrofaj kaynaklı inflamasyon ile intimal vasküler kalsifikasyon geliştirmek, hangi MGP - / -. Fareler makrofajların yokluğunda medial vasküler kalsifikasyon geliştirmek 11,25 rağmen bu bulgular Sex Amaçlı altta yatan farklı uyaranlara önermekal ve medial kalsifikasyon, tümör nekroz faktörü-a ve IL-1 ve ön-osteojenik faktör gibi inflamatuar aracıları içeren vasküler kalsifikasyon katkı tespit edilmiştir kireçlenme. 26 Çoklu sinyal yollarının her iki yapı da aracılık sinyal mekanizmalarında örtüşme vardır Bu çentik Wnt ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal. 27,28 Bunlar sinyal yolları da kemik ilişkili proteinlerin ifadesini artırmak transkripsiyon faktörlerinin solucan ile ilgili transkripsiyon faktörü 2 (Runx2) ve Osterix ekspresyonunu (geliştirmek . / - - ve LDLR - / - fareleri, yüksek yağlı diyet ve kendiliğinden beslenen örneğin kalsifikasyon aracılık damar sisteminde, kemik sklerostin ve alkalin fosfataz) 28-30 Biz ve diğerleri ApoE gözlemlenen vasküler kalsifikasyon göstermiştir / - - MGP gözlenen vasküler kalsifikasyon tüm kemik morfogenetik protein bağlıdır farelerin (BMP) signaling ve burada odaklanmıştır, bu yoldur. 11,25,31 BMP kemik oluşumu için gerekli olan güçlü bir osteojenik faktör, insan ateroskleroz içinde arttırılmış ekspresyon sergileyen bilinmektedir. 32-34 in vitro çalışmalar, düzenlenmesinde BMP sinyal rol var bu Runx2 olarak osteojenik faktör sentezlenmesi. BMP ligandının 35-37 aşırı ekspresyonu, BMP-2, yüksek yağlı diyet ile beslenen ApoE eksikliği olan farelerde vasküler kalsifikasyon gelişimini hızlandırır. 38 Ayrıca, bu tür inhibitörleri sinyal belirli bir BMP kullanımını / - - 39,40 ve / veya LDN-193189 (LDN) olarak ALK3-Fc hem LDLR vasküler kalsifikasyon gelişimini engeller fareler yüksek yağlı diyet ve MGP eksikliği fareler beslenen 11,25.

Vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) vasküler kalsifikasyon gelişiminde önemli bir role sahiptir. 30,41,42 gelişen vasküler kalsifikasyon MGP yoksun fareler karakteristik olanbir osteojenik fenotipi VSMC'Ierin bir transdiferansiyonun tarafından terized. Böyle Runx2 ve osteopontin olarak osteojenik belirteçleri eşlik eden bir artış ile myocardin ve alfa düz kas aktin içeren VSMC belirteçlerin azalmış ifadesi MGP sonuçlarının kaybı. Bu değişiklikler vasküler kalsifikasyon gelişimi ile örtüşmektedir. 25,43,44

Aort kalsifikasyon ve farelerde iltihap tipik olarak geç kireçlenme erken kireçlenme ve osteojenik aktivite, von Kossa ve Alizarin kırmızı boyama için alkalin fosfataz aktivitesi ve makrofaj protein belirteçlerinin (örn. Hedef immünohistokimyasal protokoller olarak histokimyasal teknikler kullanılarak değerlendirilir, CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Bununla birlikte, bu, standart görüntüleme teknikleri, örnekleme yanlılığa alıcı ve kusurlu zaman enine bölüme aort dokularının işlenmesini gerektirir ve sınırlıdır kendi inflamasyon ve calcificat sayısal yeteneğiBütün aort iyon. Bu protokol, aynı zamanda sağlanan. Görselleştirmek ve bütün aort ve orta ölçekli arteryel kalsiyum ve yakın kızılötesi floresan (NIR) moleküler görüntüleme ex vivo olarak kullanılarak makrofaj birikimini ölçmek için bir yöntem tarif hasat ve farelerden primer aort VSMC'Ierin kültürlenmesi ve uyarılması için bir yöntemdir için sıçangil ve in vitro olarak insan VSMC'Ierinin kalsifikasyon vasküler kalsifikasyon altında yatan moleküler mekanizmaların belirlenmesi. Bu teknikler, in vivo ve atherocalcific hastalığı eğitimi için in vitro yöntemleri hem araştırmacı sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

fare ile tüm çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerilerine sıkı göre yapıldı. Konut ve bu çalışmada açıklanan fareler ile ilgili tüm işlemler (Araştırma Hayvan Bakım Alt Komitesi) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri Massachusetts General Hastanesi tarafından kabul edildi. Tüm prosedürler acıyı azaltmak için özenle yapıldı.

Reaktiflerin 1. Hazırlık

  1. Tüm aortalarının Near-Infrared Floresans Görüntüleme
    Not:. Flüoresan görüntüleme probu hidroksiapatit bağlanarak 46,47 damar osteojenik aktivitesi işaretlemek için kullanılabilir yakın kızıl ötesi bir bisfosfonat türevi, bir katepsin-aktif fluoresan görüntüleme probu makrofaj proteolitik ve elastolitik aktivite için bir gösterge olarak kullanılabilir damar. 9, hem flüoresan eşzamanlı kullanımına izin için önemlidirspektral ayrıdır problar kullanın. gösterimde kalsiyum NIR katepsin faaliyete özgü yakın kızılötesi flüoresan görüntüleme probu belirtmek için kalsifikasyon özgü yakın kızılötesi flüoresan görüntüleme probu ve katepsin NIR belirtmek için kullanılacaktır.
    1. Kalsiyum NIR ve katepsin NUR çözümleri hazırlayın. üreticinin protokollerine göre, kalsiyum NIR veya katepsin NIR 24 nmol ihtiva eden şişeye 1X fosfat tamponlu salin (PBS) 1.2 ml ilave edilir ve yavaşça çalkalayın.
      Not: 2-8 ° C'de karanlıkta saklandığında Üreticiye göre, bir kez PBS ile yeniden kalsiyum NIR ve katepsin NIR çözeltiler, 14 gün boyunca sabit kalır.
  2. İzolasyon ve murin aortik VSMC'Ierin kalsifikasyonu
    1. Aort Sindirim Çözümü:
      1. 175 U / ml tip 2 kolajenaz ve 1.25 U / ml elastaz içeren Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile yeni bir çözeltisi (~ 3-5 mi başına aorta hasat) hazırlayın. w çözüm sterilizeve 0.22 um vakum tahrik filtrasyon sistemi i kullanılana kadar buz üzerinde tutun çözeltisi.
    2. Celi Ortamı:
      1. % 10 cenin sığır serumu, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), 500 ml Supplement. kullanımdan önce, 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın.
    3. Kireçlenme Medya:
      1. Kalsifikasyon Ortam A (NaPhos, fare hücre çizgileri kullanılır):
        1. % 10 fetal bovin serumu, 2 mM sodyum fosfat, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile (gerektiğinde ses) DMEM 100-500 mi Supplement. kullanımdan önce, 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın.

          VEYA
      2. Kalsifikasyon Ortam B (βGP / Asc / DEX, fare veya insan hücre çizgileri ya da kullanılır):
        1. % 10 fetal bovin serumu ile, 10 mM β-gliserofosfat disodyum, 50 ug / ml L-askorbik asit, 10 DMEM 100-500 mi (gerektiğinde ses) EknM deksametason, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin. kullanımdan önce, 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın.

2. Kuyruk Ven Enjeksiyon

  1. Kuyruk enjeksiyondan önce, 5 dakika boyunca hafif bir ısıtma lambası altında fareler ısınmaya.
  2. Bir tüp kemirgen tutucu fare kısıtlamaktadır. alkollü bir bezle kuyruk dezenfekte edin.
  3. kuyruk damar enjeksiyonu için 30 G iğne yararlanın. Kuyruk damarlar yanal yer almaktadır.
    1. iğne kuyruk içine ilerletilir olarak şırınga ileri bir basınç hafif miktarda uygulayın. Enjeksiyon direnci artık mevcut kez damar erişilir.
    2. sabit bir oranda kalsiyum NIR 100 ul ve / veya katepsin NIR 100 ul bir hacim enjekte edilir. Enjeksiyon sonunda, 5 sn'lik aradan sonra, iğneyi çıkartın.
  4. aorta (Bölüm 3), enjeksiyondan sonra 3-24 saat hasat.

3. Fare Diseksiyon

  • 200 mg / kg intraperitonal pentobarbital enjeksiyon ile fare öldürülür.
  • diseksiyon gemide hayvan sırtüstü yatırın ve yönetim kuruluna her pençe bantlama ile stabilize. Bir mikroskop ve küçük makas kullanarak, üst toraks alt karın uzanan bir orta hat kesi yapmak.
  • forseps ile cilt soyma geri ve karın organları ifşa periton kaldırın. aorta transect vermemeye özen, gastrointestinal organlar çıkarın.
  • ön diyafram bir yanal kesi yapmak ve karın boyunca kesi devam ediyor. Diseksiyon makas kullanarak, kaburga kenarlarına ile kesme ve sternum üstün kısmına yumuşak doku yapışık kaldırarak göğüs kafesi bırakın. akciğerler açığa göğüs kafesi çıkartın.
  • ve dikkatlice akciğerlere çıkarın (belirlenmesi ve proksimal aort diseksiyon yardım) başlangıçta yerinde kalbi bırakın. bakım, ensuri ile timus, trakea ve özofagus kaldıraort bozulmadan kalmasını ng.
  • Düz ince forseps ve mikro-diseksiyon makas kullanarak, peri-aort yağ (Şekil 1A) sökerken dikkat ederek, aort kemer iliak bifurkasyonundan aorta çevreleyen yumuşak doku kaldırmak. Aort arkı (yani, brakiyosefalik, karotis ve subklavian arterler, Şekil 1B) büyük dalları çevreleyen kalan yağ ve yumuşak doku çıkarın.
    Not: floresan görüntüleme yaparken yağ arka plan sinyalini artırabilir çünkü aorta yağ çıkarmak için önemlidir.
  • , Göğüs boşluğunda kalp kaldırmak dikkatle proksimal aort ayrılmakta ve atın. iliak bifurkasyonundan distal aort transect. bir insülin iğne kullanarak, kalan kan hücrelerini yıkamak için aortik arktan aort içine serum fizyolojik enjekte edilir. tamamen kaldırılması, arkus damarları ile birlikte aort ayırmakvücuttan.
  • görüntüleme için hazır olana kadar buz üzerinde normal tuzlu su çözeltisi içinde aorta yerleştirin.

    • 4. Aort Görüntüleme

    1. Görüntü aorta ex vivo hemen yakın kızılötesi floresan yansıma görüntülemesi ile hasattan sonra. 25
      1. Daha önce tarif edildiği gibi, kalsiyum NIR ve katepsin NIR enjekte edilen farelerin aortlarından floresans sinyali yoğunluklarına ölçmek için uygun bir çok kanallı dalga boylarındaki floresans görüntüleyici ayarlayın. 25 Üreticiye göre, kalsiyum NIR ~ 650-678 nm ışığı ile uyarılmakta edilebilir ~ 680-700 nm aralığında maksimum emisyonu. Katepsin NUR ~ 770 nm maksimum emisyon ile ~ 745-750 nm ışık heyecanlı olabilir.

    Primer fare aort Vasküler düz kas hücrelerinin 5. Yalıtım

    1. Yukarıda açıklandığı gibi adımlar 3.1-3.7 gerçekleştirin.
    2. diseksiyonlar tamamlanıncaya kadar soğuk HBSS aorta yerleştirin. Dikkatli bir rem kesipsadece aort bırakarak periaortik yağ ve yumuşak doku Aining.
    3. Steril doku kültürü kaputu altında, 35 mm x 10 mm doku kültürü yemekleri Aort Sindirim Çözüm aorta aktarın. yumuşak aralıklı çalkalanarak 30 dakika 37 ° C'de bir kuluçka yerleştirin. sindirim sonra, aorta uzatılmış veya yıpranmış bir görünüm sergiler.
    4. sağlam medial katmanı tutarak diseksiyon mikroskobu ve steril forseps ile, aort dış adventisyal tabakayı kaldırmak. adventisya kaldırmak için bir teknik bir ucunda aort dış katmanını uzak soyun ve çorap geri soyulmuş ve kaldırılmış olabilir gibi altta yatan medial tabakasındaki onu kaldırmaktır.
    5. Adventisya katman çıkarıldı sonra, 2-4 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de, hücre kültür ortamı ve mağaza ile yeni bir doku kültürü çanağı içinde kalan aort yerleştirin.
    6. steril bir kaput ve steril 3 mm mikro diseksiyon makas kullanarak altında, geniş 1-2 mm içine aorta kestihalkalar.
    7. Aort Dijestiyon çözeltisi içeren yeni bir doku kültür tabağına, bu halkalar yerleştirin ve yumuşak aralıklı 120 dakika boyunca sallanarak 37 ° C'de inkübe edin. hücrelerin tekrar süspansiyon için bu inkübasyon sırasında çözüm yukarı ve aşağı birkaç kez pipetle.
    8. 15 ml konik tüp, sindirim çözeltisi ve transfer, sıcak hücre kültür ortamının 5 ml.
    9. Santrifüj 200 x g'de 5 dakika boyunca boru.
    10. Hücre kültür ortamı (örneğin, 5 mi) istenen hacmi içinde medya ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
    11. 25 cm 2 hücre kültürü şişesi içinde, her aortundan izole hücrelerin tüm miktarını Plate ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe edilir. Daha önce tarif edildiği gibi, kuluçka ilk 7-10 gün boyunca 25,48., Standart teknikler kullanarak hücreleri yayma ortamı her 72-96 saat değiştirin. Hücreler izdiham yaklaşırken, daha sık (her 48 saat) medya doldurmak.
      Not: yeterli nereye büyümek için birçok hafta sürebilirhücrelerin ntity.
    12. Birleşmiş sonra tripsin ile geçiş hücreleri 37 ° C'ye kadar ısıtıldı olduğundan emin olun.
      1. Her bir kültür şişesine tripsin 0.5-1.0 ml ilave edilir ve 3-5 dakika inkübe edilir; yüzeyden hücreleri ayırmak için gerektiği gibi yavaşça her 30-60 sn balonun yan dokunun.
      2. Hücreler şişe tabanından ayırmak sonra tripsin hücrelere hücre medya 10 ml. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Hücre pelet medya ve tripsin aspire. Taze hücre medya (örneğin, 5-10 mi) istenen miktarda hücrelerin tekrar (a odacık slayt aktarılır, bazı hücreler), yeni bir şişeye aktarın.
    13. Daha önce α-düz kas aktin karşı bir antikor kullanılarak, 49 tarif edildiği gibi hücre ilk geçiş de, standart immünositokimya teknikleri ile yumuşak kas hücre soyunu teyit etmektedir.

    Kültür Düz Kas 6. Yaratma kalsifikasyonuhücreler

    1. Plaka hücreler 6-çukurlu formatta 5.12 den elde edilmiştir. Not: de önerilir ortalama hücre medya 2.0 ml'lik toplam hacim içinde 1 x 10 5 hücre / göz ile başlayarak.
    2. Hücreler, 6 gözlü bir levha formatında en az 7 gün boyunca kalsifikasyon Ortam A veya B büyümeye olanak sağlar. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe hücreleri.
    3. Hücre Ortam her 48 saat değiştirin.

    7. von Kossa Boyama Yöntemiyle VSMC kalsifikasyon Değerlendirilmesi

    Not:. Dokular ya da kültürlenmiş hücreler hücre dışı matriks kalsifikasyonu ölçmek için von Kossa yöntemi gümüş iyonları ile fosfat bağlı kalsiyum iyonları yerine göre 50 hafif ve organik bileşiklerin varlığında, gümüş iyonları azaltılabilir ve metal olarak görselleştirilebilir gümüş. . Reaksiyona girmemiş gümüş sodyum tiyosülfat ile işlenerek 50, aşağıdaki gibi çıkanlır von Kossa boyama protokolü bulunmaktadır:

    1. Hücre cu aspire medyalture plakalar.
    2. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 10 formalin 1 ml yerleştirerek hücreleri saptamak.
    3. formalin çıkarın ve 5 dakika için damıtılmış su ile sabitleştirilmiş hücreler yıkayın.
    4. 1-2 saat için 60-100 W ampul altında,% 5 gümüş nitrat çözeltisi 1 ml hücreleri inkübe edin.
    5. Gümüş nitrat solüsyonu aspire edildi ve 5 dakika için damıtılmış su ile yıkayın.
    6. 5 dakika için damıtılmış su içinde çözelti (ağ / hac),% 5 sodyum tiyosülfat 1 ml hücre yerleştirerek tepkimemiş gümüş çıkarın.
    7. 5 dakika için damıtılmış su ile hücrelerin yıkayın. Tekrarlayın yıkar 3x. Von Kossa leke standart ters ışık mikroskobu ile görüntüleme için hazırdır.
    8. İsteğe bağlı Adım: 5 dakika süreyle nükleer fast red 1ml Counterstain. damıtılmış su (her biri 5 dakika) ile üç yıkama ile takip etmektedir.

    VEYA

    8. Yakın kızılötesi Floresan Görüntüleme ile VSMC kalsifikasyon değerlendirilmesi

    Not: kabiliyetini benzerFare aorta içinde kireçlenme tespit etmek, kalsiyum NUR kolayca kültürlü hücreler tarafından yatırılan kalsifik minerali bağlar. Uzun dalga boyu filtreleri ile bu tekniği, floresan mikroskop ve plaka okuyucuları kullanarak görüntü ve sırasıyla in vitro kalsifikasyon ölçmek olabilir. Kalsiyum NUR uzun dalga boyu emisyonu diğer özellikleri tespit etmek alt dalga boyu yayan fluorophores eşzamanlı kullanımı için izin verir. aşağıdaki gibi kalsiyum NUR boyama protokoldür:

    1. Bölüm 1.1.1 tarif edildiği gibi, kalsiyum NIR 24 nmol ihtiva eden şişeye 1x PBS 1.2 ilave edin.
    2. Kalsiyum NIR stok 1 seyreltin: 100 uygun kalsifikasyon veya kontrol medyada.
    3. Aspire hücre kültür plakaları medya ve kültür ortamı NUR içeren kalsiyum ile değiştirin.
    4. gece boyunca 37 ° C'de kalsiyum NIR ortam kültür inkübe edin.
    5. Kuyulardan medya aspire ve bir kez PBS ile kuyu yıkayın.
      Not: Bu noktada,orijinal kültür ortamı, oyuklara ilave edilebilir ve hücreler, canlı görüntülenebilir. Aksi takdirde, aşağıdaki adımlara devam edin.
    6. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 10 formalin 1 ml yerleştirerek hücreleri saptamak.
    7. formalin çıkarın ve 5 dakika için damıtılmış su ile sabitleştirilmiş hücreler yıkayın. Tekrarlayın yıkar 3x.
    8. İsteğe bağlı adım. Immünofloresan boyama veya ilgi duyulan proteinlerin diğer counterstains gerçekleştirme 8,9
    9. Görüntü veya (örneğin, kalsiyum NUR 650-678 nm ışık heyecanlı olabilir) uygun floresan uyarma dalga boylarını ve emisyon filtreleri (~ 680-700 nm) kullanılarak kalsiyum NIR leke algılar.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    - / - Aort MGP kireçlenme ve vahşi tip fare, kalsiyum NIR floresans görüntüleme kullanılarak ölçülmüştür. Resim kalsiyum NIR sinyal kalsifikasyon yokluğu (Şekil 2) gösteren, vahşi tip farelerden aorta saptandı. Güçlü bir kalsiyum NIR sinyali ileri vasküler kalsifikasyon ile tutarlıdır MGP eksikliği olan farelerde, gelen aorta saptandı. Yabani tip ve gelen aorta doku kesitleri MGP - / - vahşi tip farelerde tespit Resim kalsifikasyonla MGP eksikliği olan farelerde gözlenen yaygın vasküler kalsifikasyon teyit - fareler alizarin kırmızısı 25 (B Şekil 3A) ile boyanmıştır. MGP eksikliği ile ilişkili vasküler kalsifikasyon BMP sinyal bağımlı olup olmadığını belirlemek için, MGP - / - farelerin yaşam 1. gününde başlayarak LDN, ALK3-Fc ya da araç ile muamele edilmiştir. Bu fareler, günlük 27 kalsiyum NIR enjekte edildi veaorta ertesi gün toplandı. BMP farmakolojik inhibisyonu kalsiyum NIR (Şekil 2) ile tespit aort kalsifikasyon azaltılmış sinyalizasyon. - / - Farelerde (Şekil 3B - D) kalsiyum NIR bulgularımıza benzer bir şekilde LDN- ve aorta ALK3-Fc ile tedavi edilmiş MGP - / - araç-tedavi edilen MGP göre farenin kalsiyum Alizarin bir kırmızı leke azaltmıştır. - / - Farelerde Bu sonuçlar, BMP sinyal MGP görülen vasküler kalsifikasyon için gerekli olduğunu göstermektedir.

    LDLR - / - / - -. Fareler MGP NIR sondalar yüksek yağlı diyet arter duvarın her iki makrofaj inflamasyon ve kalsifikasyon geliştirmek beslenen kalsifik ve katepsin özgü 11 Eşzamanlı kuyruk ven enjeksiyon fareler belirlemek amacıyla yapılmıştır eğer MGP vasküler kalsifikasyon . -deficiency makrofaj birikimi ile bağlantılı olan 25 LDLR - / - fareler beslenenYüksek yağlı diyet ve vahşi tip fare, sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak kullanılmıştır. (Şekil 4A) beklendiği gibi, vahşi tip farelerden aorta, hemen hemen hiç kalsiyum NIR veya katepsin NIR sinyal arzetmiştir. Intimal ateroskleroz bu modelde makrofaj infiltrasyonu ve vasküler kalsifikasyon arasında kuvvetli bir ilişki gösteren fareler - / - aortik ark bölgesini tercih Co-lokalize kalsiyum NIR ve katepsin NUR sinyalleri LDLR gözlendi. / - - Bir yaygın ve kuvvetli kalsiyum NUR sinyali MGP ve aorta gözlendi rağmen fareler, katepsin NIR sinyali yabani tip farelerin olandan farklı değildi. Bu bulgular, MGP eksikliği vasküler kalsifikasyon makrofaj birikimi olmaksızın gerçekleştiğini göstermektedir. - / - Ve LDLR - daha vahşi tip, MGP bu bulgular, aorta doğrulamak için / - fareler makrofaj işaretleyici MAC-2 (özgü bir antikor ile hasat kesitli ve lekeli - / - fareler bol MAC-2 boyanmasını gösterdi; - / - farelerde vasküler makrofajların yokluğunu gösteren MGP aort ve tespit edilebilir bir MAC-2 boyandı.

    Yüksek fosfat, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak, ortam ihtiva eden fare ve kültürlenmiş - / - in vitro vasküler kalsifikasyon modellemek için, aort VSMC Yabani tip ve MGP izole edilmiştir. - / - Farelerde kültürlenmiş VSMC'Ierin kalsifikasyonu modüle MGP rolü belirlemek için, MGP sentezleyen bir adenovirüs (Ad.MGP) mgp aort VSMC'lerde MGP geri kullanılmıştır. Yeşil floresan proteini (Ad.GFP) sentezleyen bir adenovirüs ile enfekte edilmiş MGP eksikliği VSMC kontrol olarak kullanılmıştır. Buna ek olarak, daha sonra kalsifikasyon üzerine VSMC'Ierin gelen MGP ifade kaldırma etkisini belirlemek için, vahşi tip farelerden aort VSMC MGP (siMGP) karşı siRNA ile muamele edilmiş ya da (siRNA kontrolsiSC). Kalsifikasyon 7 gün kalsifikasyon ortamı, hücreleri büyüyerek kültürlenmiş VSMC'lerde indüklenmiştir. Hücreler, daha sonra sabit ve von Kossa yöntemiyle kalsiyum için boyandı. - / - Ad.MGP ile MGP restorasyonu MGP kalsifikasyonunu azaltılmış VSMC adenovirüs ile muamele edilmiş hücreler (- B, E Şekil 5A) kontrol ile karşılaştırıldığında. MGP ifade>% 95 demonte elde siMGP vahşi-aortik VSMC'Ierin, tedavisi, 25 siSC ile muamele edilmiş hücreler (- B, K Şekil 5C) ile karşılaştırıldığında kalsifikasyon yükselmiştir. Bu sonuçlar, MGP-eksikliği olan farelerde tespit ve MGP kültürlenmiş VSMC'Ierin kireçlenmeyi modüle göstermektedir VSMC kalsifikasyon taklit Bu in vitro modeli.

    kültürlü VSMC'Ierin kireçlenmeye tespit için alternatif bir yöntem kalsiyum NIR beraberdir. V vasküler kalsifikasyon model itro, insan koroner arter VSMC satın alındı ​​ve tedavi döneminin ardından Kireçlenme Medya B. 21 gün boyunca kültüre, kalsifikasyon kalsiyum NIR yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir ve kültürler özel bir yeşil floresan kollajen probu 51 ve Hoechst boyası (1 ile zıt | ig / ml% 10 formalin içinde tespit 5 dakika sonra) (Şekil 6). VSMC çekirdekler konfokal mikroskopi (Şekil 6A) tarafından mavi Hoechst floresan gözlendi. Temsili bir optik kısmı VSMC'Ierin (Şekil 6B) tarafından üretilen kolajen matris içinde kalsiyum NIR lekeli kalsifiye mineral gösterir. Optik z yığınlarının üç boyutlu rekonstrüksiyon iyi yatırılan kalsifik mineral (- D Şekil 6C) yakalanmış hale geldiği bir kollajen matris üretmek altındaki VSMC'lerde olarak kültür oluşturulan katmanları göstermektedir.

    1 re "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
    Şekil 1:., Bir vahşi tip fare, bir Aort Örnek Diseksiyon (A) göğüs ve ilyak arter bifurkasyonunun uzanan abdominal aorta bir resim üzerinde bulunan organların ve peri-aortik yağ çıkarılmasından sonra gösterilmiştir. (B) A, brakiyosefalik ile aortik arkın görünümü odaklı karotis ve sol subklavian arterler bıraktı. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    şekil 2
    Şekil 2: Vasküler kalsifikasyon MGP olarak - / - fareleri BMP sinyal bağımlı MGP - / - ya farelerin periton ile muamele edildi (ip) enjeksiyonlar ve. hicle LDN-193.189 (LDN 2.5 mg / kg / gün) ya da ALK3-Fc (2 mg / kg gün) ve vahşi tip fare, 28. günde kadar yaşamın 1. gününde başlayarak aracın IP enjeksiyonu ile muamele edilmiştir . gün 27, farelere kuyruk damarından kalsiyum NIR enjekte edilmiştir. Aorta günde 28 hasat ve yakın kızılötesi floresan ile görüntülendi. Görüntüler 3 mm belirten ölçek çubuğu ile dört panellerde aynı büyütme vardır. / - - Fareler, güçlü bir kalsiyum NIR sinyal vardı MGP gelen aorta ise Yabani tip fare aorta kalsiyum NIR sinyalini sergilemek vermedi. - / - Araçla tedavi edilen MGP kıyasla farelerin, MGP aorta - / - LDN ALK3-Fc ile tedavi fareler önemli ölçüde kalsiyum NIR sinyalleri düşük göstermiştir. Bu rakam referans 25 alınır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    3 "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    Şekil 3: MGP eksikliği olan farelerde BMP sinyal önler Aort Kalsifikasyonların Farmakolojik inhibisyonunun, yabani tip farelere araç (A) ve ip enjeksiyonları ile tedavi edilmiştir MGP - / - fareleri, aracın (B) LDN IP enjeksiyonları ile tedavi edilmiştir. (Cı-2.5 mg / kg / gün) ya da ALK3-Fc (D, 2 mg / kg gün) 28. aorta, hasat kesitli ve kırmızı alizarin ile kalsiyum için boyandı güne kadar hayatta 1. gününde başlayarak. Çıkan 400 um gösteren ölçek çubuğu Tüm dört panel aynı büyütme alınmıştır. - / - Farelerde Şekil 2'de kalsiyum NIR sinyalleri benzer şekilde, Alizarin kırmızı boyama araçla tedavi edilen MGP aorta kireçlenme ağır bir yük gösterir. - / - Fareler kalsifikasyon LDN- ve aorta azalmıştır MGP ALK3-Fc ile tedavi edilmiş. Bu şekil, alınan25 başvuru. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 4,
    . Şekil 4: Kalsiyum NIR ve Katepsin NIR ile Aort Kalsifikasyon ve Makrofaj İnfiltrasyonunun Eşzamanlı Tayini (A) Yabani tip, MGP - / - ve LDLR - / - fareler yüksek yağlı diyetle beslenen kalsiyum NIR ve katepsin NIR enjekte edildi kuyruk ven enjeksiyon yoluyla. Aorta 24 saat sonra hasat ve yakın kızılötesi floresan görüntüleme ile değerlendirildi. Görüntüler 3 mm belirten ölçek çubuğu ile aynı büyütmede bulunmaktadır. Vahşi tip farelerde hemen hemen hiç aort kalsifikasyon veya makrofaj varlığını gösterir. LDLR gelen aorta - / - fareler co-lokalize makrofaj birikimi ile geniş kalsifikasyon var. Bunun aksine, MGP - / - Fareler makrofajların yokluğunda meydana aort kalsifikasyonu var. (B) aorta vahşi tip hasat edilmiştir, MGP - / - ve LDLR - / - fareleri, yüksek yağlı diyet ile beslenen. Bu aorta bölümlere ve MAC-2 için spesifik bir antikor ile makrofajlar için boyandı. Çekirdekler DAPI ile boyanmıştır. lümene yüzey her panelde sağa doğru olduğunu. Çıkan 100 um gösteren ölçek çubuğu Tüm üç panel aynı büyütme alınmıştır. / - - Farelerde (A) bulgularına benzer şekilde, MGP ve aorta makrofaj birikimi hiçbir kanıt yoktu. Bu rakam referans 25 bir figür değiştirilmiş bir versiyonu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    .jpg "/>
    . Şekil 5: fareler ve adenovirüs GFP (A) ya da MGP (B) eksprese ile enfekte - - / MGP kireçlenmeden Yetiştirme VSMC'Ierin korur Yetiştirme aort VSMC MGP izole edilmiştir. Vahşi tip farelerden izole aort VSMC MGP (D) hedefleme siRNA (C) veya siRNA karıştırılmış kontrol ya da transfekte edildi. Hücreler 7 gün süre ile kalsifikasyon Ortam A büyütüldü ve daha sonra sabit ve Von Kossa ile boyandı. 200 mikron belirten ölçek çubuğu ile - (D A) Görüntüler dört panellerde aynı büyütme alındı. Görüş Seri alanları SEM belirten hata barları ile, fotoğraflandı ve arka plan çıkarma (E ve F) sonra görüntü J yazılımı kullanılarak kalsiyum boyama ölçüldü. Bu rakam referans 25 bir figür değiştirilmiş bir versiyonu.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 6,
    Şekil 6:. 21 gün Hoechst boya kullanılarak nükleer boyama ile tanımlanmıştır in vitro hücre dışı matris ile esas Kalsiyum NIR tanımlar kalsifikasyon (a) insan koroner arter VSMC kalsifikasyon Ortam B'de kültürlenmiştir. Yeşil floresan kollajen prob ile kombine (B) kalsiyum NIR boyama (kırmızı) konfokal mikroskobu ile elde edilen optik kesit kollajen matriks boyunca kalsifik minerali gösterir. Görüntüler A - B 10 mikron belirten ölçek çubuğu ile aynı büyütmede alındı. (C ve D) Üç boyutlu rekonstrüksiyon t içinde kalsifik mineralin sıkışmasını gösteriyorO matrisi kollajen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Arter kalsifikasyon insanlarda kardiyovasküler hastalık için önemli bir risk faktörüdür ve kardiyovasküler olayların patogenezinde doğrudan katkıda bulunabilir. Aterosklerotik hastalığın ince fibröz kapaklar 1,5,52 intimal kalsiyum birikimi yerel biyomekanik stresi arttıran ve katkıda bulunmak için öne sürülmüştür plak rüptürü. kardiyak hipertrofi neden ve kalp fonksiyonunu etkileyebilir arteriyel sertlik, artırarak 53,54 medial kalsifikasyon etkileri klinik sonuçları. 55 Bu nedenle, insan hastalığı önemli bilgiler sağlamak ve potansiyel için yeni hedefler belirlemeye olacak vasküler kalsifikasyon altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak tedavisi.

    Burada, aort kalsifikasyon ve ateroskleroz ve NIRF görüntüleme kullanılarak vasküler kalsifikasyon sıçangil modellerinde makrofaj birikimini tespit etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. 9 doğru olarak NIR enjekte etmek önemlidirkuyruk damar içine F ajanlar. Bu ustalık elde edilir önce önemli pratik gerektirir bir tekniktir. 56 Ayrıca, bu yağ, kalsiyum NIR ve katepsin aynı dalga boyunda bir autofluorescent sinyali neden olabilir, aort peri-aort yağ kaldırmak için önemlidir NUR sinyaller. NIRF ajanların kullanımı vasküler kalsifikasyon ve inflamasyonu değerlendirmek standart histolojik yöntemler üzerinde birçok önemli avantajlara sahiptir. Geleneksel histolojik teknikler aksine, bu ajanlar bütün aort kalsifikasyon ve makrofajların miktarının izin verir. Dahası, onlar histolojik boyama daha aort kalsifikasyon gelişimi ile ilişkili erken değişikliklerin tespit için daha hassas bir yöntem sağlamak ve bu nedenle hastalığın erken evrelerinde içine mekanistik anlayışlar sunabilir. Erken kalsiyum NIR sinyalinin 9 Yer artan dahil kemik oluşumu belirteçleri ile ilişkilidir wel alkalin fosfataz aktivitesiRunx2 ve osteopontin gen ifadesi olarak l. Ayrıca, kireçlenme ve katepsin faaliyeti için spektral farklı prob eş zamanlı kullanımı miktarının hem ateromatöz ve kalsifik hastalığın Spatiotemporal ilerlemesi ilişkisini sağlar. 9

    vasküler hastalığın altta yatan patofizyolojik mekanizmaları anlayışımıza vasküler kalsifikasyon ve inflamasyon yardımların zamansal ve mekansal özelliklerini belirleme. Örneğin, NIRF maddelerin kullanımı göstermiş olduğu intimal kalsifikasyon modellerinde (ApoE - / - ve LDLR - / - yüksek yağlı diyet fareler), vasküler makrofaj birikimi sitelere ko-lokalize kireçlenme (Şekil 4) ve bu kalsifikasyon zamansal makrofajların birikmesini takip eder. 9,11 İlginç bir şekilde, katepsin NIR ile bir makrofaj birikimi MGP eksikliği olan farelerde bulunan vasküler kalsifikasyon tespit edilmiştir. 25 Pers, NIRF ajanları kullanan deneyler, makrofaj birikimi vasküler intimal kalsifikasyon ile ilişkili olmasına rağmen, vasküler medial kalsifikasyon için gerekli değildir sonucuna varılabilir.

    Görüntüleme ve damar hastalığı okuyan rolüne benzer şekilde, NIRF görüntüleme aort kapak hastalığı incelemek için kullanılmıştır. 47 Aort kapak hastalığı vana üzerindeki lipid yüklü makrofaj ve kalsifik lezyonlar ile işaretlenmiş ve benzeri yatan moleküler mekanizmaları ve ateroskleroz gibi genetik belirleyicilerinin sergiler . 57-59 aort kapak kalsifikasyonu broşür fonksiyonu bozukluğu neden olur ve yaşlılarda klinik aort darlığı başlıca nedenidir. Semptomatik aort darlığı için mevcut tek tedavi vana yerine geçer. aort kapak hastalığı moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması geç evre progresif aort kapak kalsifikasyonu klinik komplikasyonları önlemek için gereklidir. NI KullanımıHayvan modellerinde moleküler görüntüleme araçları olarak RF ajanları en erken aşamalarında aort kapak hastalığı değerlendirmek için hassas bir yöntem sağlar. 60

    Standart teknikler koroner arter plaklar darlığının şiddeti odaklanmıştır, ancak akut koroner sendromlar çoğunluğu olmayan akış sınırlayıcı plakların yırtılması sonucu görselleştirmek için. Enflamasyon gibi plaklar içinde 6 Biyolojik süreçleri, plak yırtılması daha iyi belirleyicileri olarak hizmet geleneksel görüntüleme teknikleriyle aksine stenoz. 61 derece daha NIRF görüntüleme hücresel aktivite (matris metalloproteinaz (MMP) aktive edilebilir madde, katepsin NIR ile proteolitik ve elastolitik aktivitesi yani, makrofaj proteolitik etkinliği ve osteojenik aktivitesini ölçmek için bir fırsat sağlar ) kalsiyum NUR'daki ile. 9 Bu yöntem, bu nedenle kardiyovasküler hastalık eşzamanlı fonksiyonel ve anatomik değerlendirme sağlar. NIRF görüntüleme e kullanırDaha düşük dalga boyundaki ışığa kıyasla artmış doku penetrasyonu avantajına sahip 650 900 nm aralığında, içinde xcitation dalga boyları, böylece hastalık lezyonlarının daha derinlemesine bir değerlendirme için izin. 60 de yakın damar dokusunun autofluorescent arka plan sinyali var azalır -infrared dalgaboyu aralığı. Bu protokol, NIRF görüntüleme ex vivo kullanımı üzerine odaklanmış olmakla beraber, NIRF görüntüleme ayrıca, in vivo olarak, uzunlamasına moleküler görüntüleme için yararlı bir platform temsil eder. 9. NIRF görüntüleme, intravital mikroskobiyle ile birleştirildiğinde, insanlarda gelecekteki tanısal uygulamalara sahiptir. 61 Bununla birlikte, sınırlama kalsiyum NIR görüntüleme uzunlamasına bisfosfonat türetilmiş prob kendisini kalsifikasyon fizyolojik süreci değiştirebilir olmasıdır. 62.

    Kardiyovasküler kalsifikasyon bir osteojenik fenotip VSMC'Ierin transdiferansiyonun içeren aktif olarak düzenlenen bir süreçtir. 25,41,42 63 geçme benzer ve in vitro çalışmalar (Şekil 5) gerçekleştirmek için, murin aort başına hücre yeterli sayıda elde etti. Alternatif bir meVSMC izolasyonu için metod ile enzimatik sindirim ziyade eksplante aort halkaları doğrudan kültürünü içermez; Bu teknik, enzimatik sindirim kullanılarak tekniği daha az hücreleri elde etmek için rapor edilmiştir. 63,64

    İki farklı kalsifikasyon ortam ya βGP ile / Asc / deksmedetomidin 65,66 veya NaPhos, 25,43 VSMC'Ierin kalsifikasyonunu uyarılması için kullanılabileceğini açıklanmaktadır. ortam Her iki tür eş başarı ile sıçangil VSMC'Ierin taşlaşmasına kullanılmıştır. Kireçlenme medya βGP / Asc içeren ederken / deksmedetomidin insan VSMC'Ierinin (Şekil 6) calcify için kullanılır olmuştur, NaPhos içeren medya deneyimlerimiz insan VSMC'lerde kalsifiye etkili olmamıştır. Ayrıca, 21 - kireçlenme tespit edilmeden önce kalsifikasyon Ortam B insan VSMC'Ierinin kültürü 28 gün gerekebilir. Mgp ekspresyon seviyeleri siRNA ve calcificati azaltılmış zaman, in vitro olarak, vahşi tip VSMC'Ierin kalsifikasyonu arttırılmıştırMGP azaldı üzerinde - / - VSMC'lerde MGP ifade restore edilerek (Şekil 5). - / - Bu bulgular MGP gözlenen aort kalsifikasyon tutarlıdır fare ve VSMC kalsifikasyon Bu in vitro bir yöntem, in vivo kalsifikasyon faydalı bir model olarak hizmet göstermektedir. Kültür VSMC'lerde bozulmamış kan damarları ile ilgili sonuçlar çizim sınırlamalar vardır ki, dikkat etmek önemlidir. Kültürlü VSMC'Ier 67-70 VSMC kalsifikasyon önce osteoblastik soy ayrım yapmak medyayı kalsifiye kültüre. Gen ekspresyonu, morfolojisi ve sertlik değişimleri geliştirmenin yanı sıra, özellikle yüksek pasajlar da, in vivo kasılma özelliklerini kaybetmez, ama yapabilir genellikle in vivo görülür bir kondrositik ara ürün gösterirler. 71 o kültürlenmiş hücrelerden alınan mekanik sonuçlar, in vivo sistemlerde geçerli olması önemlidir. üzerindeBu sınırlamayı aşmak e potansiyel yöntemi kültürlü sağlam damar halkasını kullanarak in vivo devlet VSMC'lerde incelemektir. 70

    İki farklı yöntem von Kossa yöntemi (Şekil 5) ve kalsiyum NIR boyama (Şekil 6) kültürlenmiş VSMC'Ierin kalsifikasyonu saptanması için sunulmaktadır. Kireçlenme değerlendirmek için sık kullanılan, ancak von Kossa yöntem biraz kalsiyum kristaller için azaltılmış bir belirginliğe ile sınırlıdır. NIR hissedilir 50 Kalsiyum kireçlenme için spesifik ve özellikle avantajlı da ek spektral-tat floresan ile eş zamanlı boyama sağlar olmasıyla ajanlar. 9 Gelecek kalsifikasyon mekanizmalarına önemli bilgiler sağlayabilir ek moleküler problar ile kalsiyum NIR kullanan bu protokol uygulamaları ve ide için, yüksek verimli bir şekilde VSMC kalsifikasyon küçük molekül inhibitörlerinin hızlı değerlendirme sağlayabilirvasküler kalsifikasyon için ntify potansiyel yeni tedaviler.

    Özetle, kardiyovasküler kalsifikasyon klinik hastalığa bir için önemli bir risk faktörüdür ve potansiyel bir katkıda bulunuyor. Kardiyovasküler kalsifikasyon ve aterosklerotik hastalık mekanizmalarının bilinmesi hayvan ve hücre bazlı modellerde hem dayanmaktadır. In vivo, ex vivo ve in vitro modellerde kalsifikasyon değerlendirmek için metodolojiler kardiyovasküler hastalık anlayışımızı ilerletmek için kritik öneme sahiptir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
    2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
    3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
    4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
    5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
    6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
    7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
    8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
    9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
    10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
    11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
    12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
    13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
    14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
    15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
    16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
    17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
    18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
    19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
    20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
    21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
    22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
    23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
    24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
    25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098 (2015).
    26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
    27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
    28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
    29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
    30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
    31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
    32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
    33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
    34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
    35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
    36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
    37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
    38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
    39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
    40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
    41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
    42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
    43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
    44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
    45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
    46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
    47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
    48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
    49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
    50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
    51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
    52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
    53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
    54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
    55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
    56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
    57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
    58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
    59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
    60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
    61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
    62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
    63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
    64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
    65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
    66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
    67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
    68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
    69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
    70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
    71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

    Tags

    Tıp Sayı 111 vasküler kalsifikasyon düz kas hücresi bir matris GLA proteini ateroskleroz makrofaj yakın kızıl ötesi floresan görüntüleme vasküler iltihap
    Aort Kalsifikasyon ve Enflamasyon Vasküler düz kas hücrelerinin ve Görüntüleme Kalsifikasyon
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    O'Rourke, C., Shelton, G.,… More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter