Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) يصف عملية ظهارة transdifferentiating في اللحمة المتوسطة. EMT هو عملية أساسية أثناء التطور الجنيني الذي يحدث أيضا عادة في الإصابة بالورم الأرومي الدبقي، والأكثر شيوعا ورم خبيث في الدماغ. كما لوحظ EMT في سرطان متعددة خارج الدماغ بما في ذلك سرطان الثدي، سرطان الرئة، سرطان القولون، وسرطان المعدة. يرتبط EMT مركزيا إلى خبيثة من خلال تشجيع الهجرة والغزو وتشكيل ورم خبيث. ليست مفهومة تماما آليات EMT الاستقراء. نحن هنا وصف نظام في المختبر لعزل موحدة الخلايا القشرية الجذعية العصبية (NSCs) ولاحق EMT الاستقراء. ويوفر هذا النظام المرونة اللازمة لاستخدام إما الخلايا واحد أو ثقافة يزدرع. في هذا النظام، الفئران أو الماوس NSCs الدماغ المقدم الجنينية يتم تربيتها في وسط محددة، خالية من المصل والانزيمات. أعربت NSCs Olig2 وSox10، وهما عوامل النسخ التي لوحظت في oligodendrocخلايا YTE السلائف (يجد OPCs). باستخدام هذا النظام، والتفاعلات بين FGF-، BMP- وTGFβ-إشارات تنطوي Zeb1، Zeb2، ولوحظت Twist2 حيث TGFβ تفعيل زيادة كبيرة الهجرة الخلية، مما يشير إلى التآزر BMP- / TGFβ التفاعل. وتشير النتائج إلى شبكة من FGF-، BMP- وTGFβ-يشير إلى أن تشارك في EMT تحريض والصيانة. هذا النظام النموذج هو ذات الصلة لتحقيق EMT في المختبر. فمن فعالة من حيث التكلفة ويظهر استنساخ عالية. كما أنه يسمح للمقارنة بين المركبات المختلفة فيما يتعلق الردود هجرتهم (قياس المسافة الكمي)، وفحص الإنتاجية العالية من المركبات على تثبيط أو تعزيز EMT (قياس النوعية). ولذا فإن نموذج مناسبة تماما لاختبار مكتبات المخدرات عن المواد التي تؤثر EMT.

Introduction

خلال عدة مراحل من التطور الجنيني، تفقد الخلايا الظهارية الالتزام القوي لبعضها البعض (على سبيل المثال، منعطفات ضيقة) والحصول على النمط الظاهري المهاجرة في عملية تسمى الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) 1. مطلوب EMT لتشكيل أنواع الخلايا إضافية، مثل الخلايا العصبية قمة الوسيطة، يبلغ عدد سكانها أن تفصل من الظهارة العصبية 2. EMT ليست ضرورية فقط خلال المراحل الجنينية ولكن المطلوب أيضا في مراحل لاحقة من حياة الكبار للحفاظ على العمليات الفسيولوجية في الكائن الحي الكبار، مثل التئام الجروح 3 والجهاز العصبي المركزي (CNS) تجديد في المزيل للآفات 4.

ومن المعروف الأورام الظهارية لإعادة تنشيط EMT كخطوة بدء الهجرة والغزو وورم خبيث، مما يؤدي في النهاية الى الاصابة بالسرطان تقدم 1،3. في الواقع يرتبط EMT مركزيا إلى 1،3 الهجرة قوي. الخطوات الخلوية جonditioning، بدء، يمر بها والحفاظ على EMT لا تكون مفهومة تماما وتحتاج إلى مزيد من التحقيق.

هنا، يتم تقديم في المختبر نظام نموذجي موحد EMT على أساس NSCs، مع عوامل النمو تعريف وسائل الإعلام (أي مصل ولا استخدام انزيم). هذا النظام النموذج هو من أهمية للعلماء تعمل على EMT. وقد ثبت الحلزون، زيب وتويست أسر البروتين أن تكون حاسمة لEMT سواء في التنمية ومرض 1. وتشارك الحلزون، زيب وتويست العائلات أيضا في نظام المقدمة. ويستند هذا النظام على منطقة محددة من الدماغ الأمامي التي عادة لا يخضع EMT توفير ميزة خاصة لدراسة الأحداث الأولية خلال EMT الاستقراء.

من المحتمل أن يتم تطبيق نظام نموذجي لدراسة EMT في ظهائر خارج الجهاز العصبي المركزي، منذ محرضات EMT الأساسية، مثل الحلزون، زيب والبروتينات تويست، تم العثور أيضا خلال EMT في أنظمة الأنسجة خارج الجهاز العصبي المركزي. هذا النموذج الصورةystem يسمح للعزلة موحدة من NSCs من القشرة النامية لدراسة خصائص الخلايا الجذعية بشكل عام وEMT على وجه الخصوص. باستخدام هذا النظام، ونحن عزل NSCs، EMT يسببها ودرس الهجرة لاحقة تحت تأثير FGF2 وBMP4. لاحظنا أن FGF- وBMP-يشير يتفاعل مع TGFβ مما يشير إلى تشجيع الهجرة الخلية، وبالتالي إضفاء الشرعية على نظام نموذجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وجاءت جميع الإجراءات الحيوان "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (منشورات المعاهد الوطنية للصحة، ال 8 طبعة 2011) وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان في بازل (المبادئ التوجيهية السويسرية للرعاية واستخدام الحيوانات). من خلال هذه المبادئ التوجيهية يعتبر بروتوكول الحيوان من "أدنى الحيوان شدة الصف".

1. إعداد التوسع المتوسطة

ملاحظة: العمل في ظروف معقمة وفقا لمعايير زراعة الأنسجة.

  1. يستغرق عامين 15 مل أنابيب، وإضافة 5 مل من خالية L-الجلوتامين DMEM / F12 (1: 1) من 500 مل زجاجة المتوسطة في كل من اثنين من 15 مل الأنابيب. لأول أنبوب 15 مل، إضافة 50 ملغم البشري APO-ترانسفيرين، 50 ميكرولتر من بوتريسين 1 م الأوراق المالية (0.1 ملي تركيز النهائي) و 30 ميكرولتر من السيلينيوم الصوديوم 500 ميكرومتر الأسهم (تركيز النهائي 30 نانومتر).
    1. تصفية من خلال حقنة مرشح 0.2 ميكرون في زجاجة DMEM / F12 الأصلية.
  2. لثاني أنبوب 15 مل، إضافة 12.5 الأنسولين ملغ. إضافة6-9 قطرات من 1 M هيدروكسيد الصوديوم. دوامة بحل الأنسولين تماما. تصفية من خلال حقنة مرشح 0.2 ميكرون في زجاجة DMEM / F12 الأصلية.
    ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم هو السامة والمسببة للتآكل. استخدام القفازات الواقية، ومعطف، ونظارات السلامة.
  3. إضافة 5 مل البنسلين (10،000 وحدة / مل) / الستربتومايسين (10000 ميكروغرام / مل) / أمفوتيريسين ب (25 ميكروغرام / مل) إلى زجاجة / F12 المتوسطة DMEM.
  4. إضافة 5 مل من 200 ملي-الجلوتامين الأسهم إذابة طازجة أو oligopeptides تحتوي على الجلوتامين (200 ملي L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد) إلى زجاجة / F12 المتوسطة DMEM.
  5. هز جيدا. تجهيز 50 aliquots مل.
    ملاحظة: التوسع المتوسطة يمكن تخزينها لمدة لا تقل عن 2 أسابيع في 4 درجات مئوية. تظهر أنابيب Aliquoted أقل التغييرات الرقم الهيدروجيني مقارنة مع المتوسط ​​يوضع في 500 مل الزجاجات.

2. إعداد الركض المتوسطة

  1. إلى 1 L كا 2 + - والمغنيسيوم 2 + خالية HBSS وسائل الإعلام، إضافة 990.85 ملغ الجلوكوز (5 ملي تركيز النهائي) و840.10 ملغ NaHCO 3 ملاحظة: يمكن تخزين الركض متوسطة لمدة 4 أسابيع على الأقل في 4 درجات مئوية.

3. إعداد عوامل النمو

  1. إعداد العقيمة برنامج تلفزيوني 1X مع 1٪ BSA (PBS-BSA) وحده أو مع حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) في 4 ملم (PBS-BSA-حمض الهيدروكلوريك).
    تحذير: حمض الهيدروكلوريك هو تآكل والسامة ويتطلب اتخاذ تدابير خاصة سلامة (المعاطف، ونظارات واقية وقفازات، غطاء محرك السيارة).
  2. حل 10 ميكروغرام / مل المؤتلف الخلايا الليفية النمو البشري عامل 2 (rhFGF2) في برنامج تلفزيوني BSA (10 نانوغرام / مل تركيز النهائي)، و 10 ميكروغرام / مل المؤتلف الإنسان بروتين العظام تخلقية 4 (rhBMP4) في برنامج تلفزيوني BSA (10 نانوغرام / نهائي مل التركيز)، و 20 ميكروغرام / مل المؤتلف عامل البشري تحويل النمو بيتا 1 (rhTGFβ1) في برنامج تلفزيوني BSA، حمض الهيدروكلوريك (40 نانوغرام / مل تركيز النهائي).
    1. لا تصفية تعقيم. إعداد قسامات.
      ملاحظة: يمكن تخزين قسامات عامل النمو في-20 درجة مئوية لمدة 2 سنة على الأقل.

4. طلاء الخلية أطباق الثقافة

  1. حل 1،875 ملغ بولي-L-الأورنيثين (منظمة التحرير الفلسطينية) في 500 مل المقطر H 2 O لإعداد الأوراق المالية لمنظمة التحرير الفلسطينية 250X. فلتر تعقيم باستخدام فلتر حقنة 0.2 ميكرون، وجعل 2 مل قسامات.
    ملاحظة: يمكن تخزين هذه aliquots في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 سنوات.
  2. حل 1 ملغ الفيبرونكتين البقري في 1 مل العقيمة المقطر H 2 O لإعداد 1،000x الأسهم فبرونيكتين. لا دوامة لأن هذا قد تجلط البروتين اللزجة. يهز بلطف باليد لمدة 10 دقيقة.
    1. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهز في بعض الأحيان. تحقق من وجود حل كامل. تدفئة حل لأقل من 37 درجة مئوية لمدة حل كامل للفبرونيكتين. لا تصفية تعقيم.
      ملاحظة: قد يتم تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. استخدام البلاستيك أطباق زراعة الخلايا سابقة التجهيز البلازما (100 ملم أو أحجام أخرى على النحو المطلوب لالتجربة). لتقييم الهجرة، استخدام 35 ملم الأطباق مع شبكة 500 ميكرون. احتضان الأطباق بين عشية وضحاها مع 2 مل 1X منظمة التحرير الفلسطينية لمدة 12 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 نسيج الثقافة الحاضنة. يغسل مرتين مع 2 مل برنامج تلفزيوني 1X.
  4. إضافة 2 مل 1X فبرونيكتين (1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي)، واحتضان الأطباق مدة لا تقل عن 12 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. إزالة فبرونيكتين قبل طلاء الخلايا.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق المغلفة فيبرونكتين] ل2 أسابيع على الأقل عند 37 درجة مئوية.

5. الموحدة تشريح وإعداد المنطقة Subventricular القشرية (SVZ)

  1. الحصول على الفئران الجنينية يوم 14.5 (E14.5 سبراغ داولي) وE13.5 الماوس (C57BL / 6) الأجنة عن طريق توقيت التزاوج. تزاوج الحيوانات من الساعة 18:00 حتى 08:00 من صباح اليوم التالي. يعتبر ظهر بعد يوم من التزاوج E0.5.
  2. تخدير الحيوان حاملا 5٪ الأيزوفلورين وتدفق الأوكسجين 0.8 لتر / دقيقة. تحقق استجابة ضغط مخلب مع ديس حادملقط ection. قطع رأس الحيوان. تجنب CO 2 الاختناق كما يؤثر CO 2 وقف الانتعاش الخلية.
  3. استرداد الأجنة عن طريق عملية قيصرية.
    1. وضع الحيوان في موقف ضعيف وتطهير الفراء مع الايثانول 70٪. استخدام ملقط الجراحة ومقص لجعل على شكل حرف V شق الجلد من حوالي 8 سم في أسفل البطن فوق الرحم. شق الجلد الوحيد مع الفراء مع الحفاظ على جدران عضلية سليمة.
    2. استخدام ملقط الطازجة ومقص لشق العضلات والجدار العضلي في البطن لإدخال الصفاق.
    3. تحديد الرحم في الجزء الأسفل من الغشاء البريتوني الخلفي. إزالة الرحم عن طريق فصل حاد من الأنسجة المحيطة بها.
    4. غسل الرحم مع الجنين مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X ومكان في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
    5. استخدام مقص يميل غرامة لفتح جدران الرحم لاطلاق سراح الجنين عن طريق الجنين تحت المجهر تشريح (3X التكبير، الشكل 1B). استخدام زوج من ملقط لإزالة قشر الجنينية (
    6. تحقق من هذه المرحلة التنموية الصحيحة من قبل أطلس للتطوير الجرذ الجهاز العصبي 5. ويظهر حجم الجنين الصحيح في الشكل 1B.
    7. تحقق سن الصحيح أبعد من ذلك وجود بداية تشكيل أرقام في forelimb الفئران (فلوريدا) كما هو موضح في الشكل 1A.
      ملاحظة: أطرافهم هند (HL) لا تظهر بعد الفصل رقم (الشكل 1B).
  4. للتشريح، ونقل الأجنة إلى أطباق بتري غير المصقول مليئة الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. أداء تشريح تحت المجهر ستيريو تشريح (3X إلى 20X التكبير) باستخدام ملقط غرامة تعقيمها.
    ملاحظة: أطباق بتري منع الحجز على الأنسجة إلى سطح الطبق كما قد يحدث مع أطباق زراعة الخلايا المغلفة البلازما. شحذ الإبر سلك التنغستن أو ما شابه ذلك هي مفيدة لاتخاذ خطوات معينة من تشريح أيضا.
  5. إزالة الجلد الرأس والجمجمة بدءا من الأسواق العالمية ضغطهاrsection من الدماغ الانتهائي تطوير (TEL) والدماغ البيني (DI) (الشكل 1B) عن طريق سحب في وقت واحد من الأمام والخلف مع اثنين من ملقط من أجل الوصول إلى الأنبوب العصبي النامي (الشكل 1C).
  6. التعرف على الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر للحدود (MHB، أسود رأس السهم في الشكل 1B-D)، الذي يفصل بين الدماغ المتوسط ​​(MES) من الدماغ المؤخر. قطع الدماغ المؤخر فقط عند أو تحت MHB (1D الشكل، السهم الثلاثي).
    ملاحظة: الفضاء تحت الجلد إضافية في MHB يسهل إزالة الجلد دون الإضرار الأنبوب العصبي.
  7. قطع الصلة بين الدماغ الانتهائي / الدماغ البيني في قاعدة الجمجمة مع الهيكل العظمي في الوجه (الشكل 1E). هذه النتائج في كتلة تحتوي على الدماغ الانتهائي، الدماغ البيني والدماغ المتوسط ​​(TEL-DI-MES) (أرقام 1F-H).
  8. نقل كتلة TEL-DI-MES إلى متوسطة التوسع على الجليد. يبقيه الإنشائيةغطت اعل في متوسطة التوسع في طبق بيتري غير المصقول. عقد الكتلة في الدماغ المتوسط ​​مع زوج من ملقط لتجنب لمس الدماغ الانتهائي الذي يحتوي على SVZ القشرية مع NSCs.
  9. كرر الخطوات من 5،5-5،8 مع جميع الأجنة (الشكل 1F-H).
  10. نقل واحد TEL-DI-MES منع إلى الطازج المثلج برنامج تلفزيوني 1X. قطع على طول الخط المنقط في الدماغ المتوسط ​​الأمامي (الشكل 1F-H)، الذي يفصل بين الدماغ المتوسط ​​من الدماغ البيني، كما هو مبين في الشكل 1I.
  11. فصل DI من هاتف عن طريق قطع على طول الخطوط المتقطعة في الشكل 1F. انظر الدماغ الانتهائي معزولة في الشكل 1J.
  12. تقسيم نصفي الدماغ الانتهائي، وقطع على طول الخط المنقط في الشكل 1J. وهذا يؤدي إلى نصفين يفصل كما هو موضح في الشكل 1K.
    ملاحظة: ويضاعف من نصف الكرة المخية الأيسر في الشكل 1L.
  13. التعرف على عصابة سطيالفضيلة lionic (MGE، الشكل 2A؛ *) والبارزة العقدية الجانبية (إل جي، الشكل 2A، +) وضوحا من خلال interventriculare الثقبة المستقبل.
    1. باستخدام ملقط أو إبرة، تشريح على طول خط مستقيم عند تقاطع بين MGE وشركة إل جي والقشرة الأمامية (النمل-CTX، الشكل 2B). قطع خط مستقيم من خلال القشرة، قرن آمون (الورك) والضفيرة المشيمية (CP). هذا يفصل بين القشرة الأمامية بما في البصلة الشمية (OB) من البارزة العقدية (GE، أرقام 2B، C).
  14. قطع الخط الثاني على التوالي في تقاطع البارزة العقدية الذيلية (الفريق، الشكل 2C، D) والقشرة الخلفية (الشكل 2C)، ومرة أخرى من خلال قطع القشرة، الحصين والضفيرة المشيمية.
  15. حلق في الدماغ الانتهائي. تماما إزالة القطب الخلفي والبصلة الشمية (الشكل 2D). تحديدهدب القشرية التي تحتوي على الحصين والضفيرة المشيمية (الشكل 2C)، على النحو المحدد سابقا 6،7.
    ملاحظة: الحصين لديه الظهارة العصبية أرق من القشرة. وCP يحتوي على السفن الحمراء.
    1. فصل تنحنح القشرية من القشرة، وترك حجم قشرة مماثلة لحجم البارزة العقدية (الشكل 2D). وهذا يؤدي إلى كتلة من القشرة (النسيج المستهدف) والبارزة العقدية (GE، الشكل 2D).
  16. الوجه كتلة القشرة-GE مع (الداخلي) الجانب البطين على سطح الطبق.
    ملاحظة: سوف السطح الخارجي من نصف الكرة الأرضية تواجه المجرب (الشكل 2E). على السطح الخارجي هي السحايا التي تحتوي على الأوعية الدموية (الشكل 2E).
    1. دبوس GE على سطح الطبق مع اليد اليسرى وقشر السحايا قبالة مع زوج من الملقط في اليد اليمنى (المهيمن) (الشكل 2F ملاحظة: هذا هو تقنيا معظم خطوة تطالب لأن السحايا التمسك بقوة القشرة. ومما يسهل فصل السحايا من القشرة عن طريق قطع خط مستقيم تماما (ليست خشنة) في الخطوات 5.13.1 و 5.14.
  17. كرر الخطوات 5،12-5،16 لنصف الكرة الأرضية الأخرى وجميع الأجنة. قطع القشرة على طول إل جي في مسافة نصف قطرها الرئيسي لشركة إل جي الكترونيكس (الشكل 2G، 2H). القشرة تشريح تمتد على مساحة 1.2 مم × 2.4 مم (الشكل 2H) وتشمل SVZ / طبقة جرثومي مع NSCs.

6. التحضير للثقافات يزدرع

  1. قطع القشرة إلى إإكسبلنتس أقل من 400 ميكرون قطرها (الشكل 2I). استخدام شبكة ميكرون 400 (الشكل التكميلي 1) وضعه تحت تشريح طبق بتري كمرجع (الشكل 2H و2I). نقل جميع إإكسبلنتس في طبق بيتري جديدة مع الثلج المشتركدينار التوسع المتوسطة.
  2. إزالة الفيبرونكتين من صحن زراعة الأنسجة (الخطوة 4.4). اتركه حتى يجف. إضافة 1 مل من المتوسط ​​التوسع البارد إلى وسط الطبق 35 ملم مع البعد شبكة من 10 ملم × 10 ملم (الشكل 3). تسمح وسيلة لتشكيل قطرة كروية (الشكل 3).
  3. إدراج ما يصل إلى 8 إإكسبلنتس إلى مركز للانخفاض. وإإكسبلنتس يجب أن تتواجد بشكل مثالي على الشبكة وعلى مسافة 3 مم على الأقل بين بعضها البعض لتحليل الهجرة (انظر القسم 8).
  4. احتضان الطبق لمدة 1 ساعة في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، و 21٪ O 2، 5٪ CO 2) لمرفق من إإكسبلنتس. السماح للإإكسبلنتس لتسوية ونعلق على سطح فبرونيكتين المغلفة. لا تهزه الطبق، منذ إإكسبلنتس قد فصل والخروج من وسط الشبكة الأمثل.
  5. بعد 1 ساعة حضانة (37 درجة مئوية، و 21٪ O 2، 5٪ CO 2)، تملأ الطبق إلى الحجم الكلي لل2 مل توسع المتوسطة بالإضافة إلى النمو والجهات الفاعلة أو المواد ذات الفائدة لاختبار واحتضان.
    ملاحظة: لا الأنزيمية الهضم، ولا مصل أو الطرد المركزي ضرورية لإعداد يزدرع. هذا هو الأمثل لسلامة الخلية.

7. إعداد NSC الثقافة خلية واحدة

  1. الاحماء التوسع والركض المتوسط ​​عند 37 درجة مئوية.
  2. ونقل القطع القشرة تشريح (من الخطوة 5.17) في أنبوب 15 مل مع المتوسطة التوسع البارد (أنبوب A). أجهزة الطرد المركزي لقطع القشرة لمدة 5 دقائق في 1200 ز س. نضح طاف. إضافة 200 ميكرولتر التوسع قبل حرارة متوسطة إلى resuspend وقطع القشرة.
  3. إضافة 700 ميكرولتر من قبل حرارة متوسطة الركض إلى أنبوب 15 مل مع طرف P1،000 (أنبوب A). resuspend بلطف بيليه. ضع طرف في الجزء السفلي من أنبوب 15 مل. بلطف وببطء فصل القطع الأنسجة عن طريق شفط ثلاث مرات مع طرف P1،000.
    ملاحظة: الركض المتوسطة يعزز فصل الخلية ومطلوب لتجنب استخدام الإنزيمات.
  4. السماح للأنبوب إلى الجلوس لمدة 30 إلى 60 ثانية للحصول على أكبر (أثقل) قطع undissociated ليستقر في القاع. ستبقى خلايا فصل واحد في طاف. نقل حوالي 700 ميكرولتر من طاف لأنبوب 15 مل الطازجة (أنبوب B).
  5. كرر الخطوات من 7.3 و 7.4 لفصل القطع الكبيرة.
  6. كرر الخطوات من 7.3 و 7.4 مرة ثانية لفصل القطع الكبيرة. نقل جميع طاف لأنبوب 15 مل الطازجة (أنبوب B).
  7. إضافة المتوسطة التوسع إلى إجمالي حجم 5 مل. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تقييم الخلايا الميتة عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق.
    ملاحظة: NSCs الصغيرة تتسامح مع الخطوات 7،2-7،6 أفضل من خلايا أكبر. من 10 الأجنة نتوقع حوالي 4 × 10 6 الخلايا مع الخلايا الميتة 10٪.
  8. لتوسيع NSCs، لوحة 1.5 × 10 6 خلايا في صحن 10 سم زراعة الأنسجة المغلفة فبرونيكتين في حجم 8 مل توسع المتوسطة. للتوسع قياسي، إضافة 8 ميكرولتر من الأسهم 1،000x rhFGF2. إضافة 8 ميكرولتر rhFGF2 كل يوم وتغيير ليديا كل يوم.
    ملاحظة: القشرة في هذه المرحلة التنموية يحتوي على غالبية NSCs وأقلية فقط من الخلايا المتمايزة. الخلايا أقلية متباينة لا تستجيب إلى rhFGF2 المعالجة ويموت خلال ثقافة التوسع.
  9. توسيع مرور NSCs في 60٪ التقاء.
    1. لNSCs مرور، وإزالة المتوسطة التوسع. غسل الخلايا بسرعة ثلاث مرات مع المتوسط ​​5 مل الركض. الانتظار 2-4 دقائق. دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 + الخلايا فصل ببطء من على سطح الأرض، باعتقال. تحقق من مفرزة من الخلايا تحت المجهر المرحلة. انتظر بضع دقائق أخرى، إذا لزم الأمر، حتى لوحظ مفرزة البصرية من السطح.
      ملاحظة: خلايا واحدة وفصل تماما، ولكن معظم الخلايا لا تزال تلتزم سطح الطبق. مدة اللازمة لمفرزة تعتمد على مدة طلاء فبرونيكتين. طلاء الفيبرونكتين قصيرة (12 ساعة أو أقل) النتائج في أسرع مفرزة الخلية. للتجارب أطول (>. ينصح 1 أسبوع) طلاء الفيبرونكتين من أكثر من 24 ساعة.
  10. استخدام ماصة 10 مل لفصل بلطف الخلايا من السطح. جمع المتوسطة الركض 5 مل مع الخلايا وتحويلها إلى أنبوب 15 مل الطازجة. كرر مع 5 مل إضافية من المتوسطة الركض.
  11. فصل الخلايا في الأنبوب 15 مل من قبل pipetting صعودا وهبوطا ثلاث مرات، ووضع الماصة 10 مل في الجزء السفلي من الأنبوب. تدور الأنبوب لمدة 15 دقيقة في 1200 x ج في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف و resuspend بيليه في 2 مل توسع المتوسطة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. استخدام اللون الأزرق التريبان لتقييم الخلايا الميتة.
    ملاحظة: بعد توسع إلى 60٪ التقاء، ونتوقع 4-5 × 10 6 خلايا مع خلايا ميتة في حوالي 10٪.
  12. لوحة 8 × 10 5 خلايا لكل 10 طبق سم للمزيد من المقاطع.

8. تقييم الهجرة

  1. لتقييم الهجرة، عزل إإكسبلنتس وفقا للمادة 5. البذور وإإكسبلنتس في35 أطباق مم الشبكة. ساعة واحدة بعد الطلاء، إضافة FGF2 (rhFGF2). ضع الأطباق في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
    ملاحظة: للحصول على التعلق يزدرع الأمثل، وتجنب تحريك الأطباق.
  2. إزالة المتوسطة من 1000 غيض ميكرولتر. إضافة 2 مل من المتوسط ​​التوسع 1000 غيض ميكرولتر بدءا من الدائرة الداخلية (الشكل 3). وهذا يقلل التوتر السطحي على إإكسبلنتس.
  3. إضافة عوامل النمو وحده أو في مجموعة على النحو المطلوب لالتجربة. استخدام FGF2 / BMP4 / TGFβ1 تحكم إيجابية. ملاحظة: في هذه التجربة، تم إضافة 2 ميكرولتر FGF2 في 35 طبق ملم، 2 ميكرولتر BMP4 و 4 ميكرولتر TGFβ1 حده، وبالاشتراك (الشكل 5).
    1. إضافة عوامل إضافية و / أو المواد القابلة للقياس. حافظ على الأطباق مرة أخرى دون تغيير لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية.
  4. التقاط صور لإإكسبلنتس على مجهر مقلوب.
    ملاحظة: إإكسبلنتس المعيشة تسفر أفضل الصور الطوري من خلايا ثابتة. يمكن استخدامها على حد سواء.
  5. للهجرةالتقييم، واستخدام برامج الرسومات التي تسمح القياسات بكسل (على سبيل المثال، فيجي 8).
  6. قياس الشبكة طبق من 500 ميكرون المسافة بالبكسل واستخدامها كمرجع الداخلية.
  7. تحديد مركز يزدرع كنقطة بداية الهجرة. قياس المسافة بين وسط يزدرع ومجموعة الأبعد من 10 خلايا.
    ملاحظة: جميع تهاجر الخلايا بشكل مركزي بعيدا عن يزدرع. وهي تشكل بشكل عفوي ورقة في محيط تحت ظروف اختبار (الشكل 5).

9. تقييم الغزو

  1. إعداد زراعة الأنسجة 24 لوحات جيدا المغلفة فبرونيكتين وفقا للمادة بروتوكول 4.
  2. وضع 300 ميكرولتر من متوسطة التوسع الدافئ في البئر العلوي من غرف غزو الخلايا. احتضان غرف لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  3. إزالة المتوسطة توسع من البئر العلوي ووضع غرفة بويدن إلى المغلفة لوحة 24-جيدا.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من متوسطة التوسع دافئ مع 0.5 ميكرولتر من rhFGF2 وrhBMP4 0.5 ميكرولتر إلى أسفل أيضا.
  5. NSCs مرور والاعتماد كما هو موضح في القسم 7. مقاطع 1-4 هي مناسبة.
  6. لوحة 5 × 10 5 خلايا في حجم 300 ميكرولتر من متوسطة التوسع دافئ مع 0.3 ميكرولتر من rhFGF2 و 0.3 ميكرولتر من rhBMP4 في البئر العلوي من غرفة بويدن.
  7. ثقافة NSCs المصنفة لمدة 24 ساعة.
  8. إضافة عوامل إضافية و / أو المواد القابلة للقياس إلى الغرفة وثقافة الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا الغازية، أنها سوف تمر من أعلى أيضا من خلال طبقة الغشاء القاعدي إلى أسفل أيضا. والخلايا الغازية تتشبث إلى الجزء السفلي من الغرفة بويدن.
  9. متابعة بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة. استخدام قطعة قطن (المدرجة في المجموعة فحص الغزو) لإزالة الخلايا غير الغازية في البئر كبير عن طريق تنظيف مرتين.
  10. إزالة المتوسطة من الآبار وإضافة 500 ميكرولتر التوسع المتوسطة معوصمة عار غشاء البلازما للخلايا الحية ومع دابي صبغ النووي إلى الآبار.
  11. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: سوف الأصباغ الاندماج في الغشاء ونواة الخلايا الغازية، على التوالي، على التصور الأمثل 8. الخيار: حذفت البلازما غشاء صبغة إذا تم التخطيط مناعية متعدد الألوان.
  12. إزالة المتوسطة مع الأصباغ ويغسل مرتين مع المتوسط ​​التوسع. تصور وعدد الخلايا الغازية مع مجهر مضان مقلوب كما هو موضح سابقا 8.
    ملاحظة: بعض الخلايا الغازية قد فصل من الجزء السفلي من الغرفة وقد انخفضت إلى السطح أقل بكثير من حيث التمسك السطح المطلي. لتحليل كامل تضمين الخلايا في السطح جيدا.
  13. إزالة المتوسطة وإصلاح الخلايا في الجليد الباردة العذبة PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X. أداء مناعية على خلايا الغازية، كما هو موضح سابقا 10/08.

    14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويستند هذا النظام نموذج EMT على عزل موحدة من NSCs على حد سواء كما الخلايا واحد أو إإكسبلنتس من منطقة محددة من الأنبوب العصبي النامية، القشرة المركزية (الشكلان 1 و 2). للتقييم الكمي، وكانت المصنفة إإكسبلنتس الحق في وسط الطبق الثقافة شبكة 500 ميكرون (الشكل 3). وقد كشفت إإكسبلنتس من القشرة المركزية أول من FGF2 لمدة يومين، تليها يومين إضافيين في تركيبات مختلفة من عوامل النمو (الجدول 1). بدأنا مع القشرة التي هي أكبر من مناطق أخرى من الأنبوب العصبي النامي. لاحظنا أن الوحيدة إإكسبلنتس مثقف في BMP4 أظهرت استجابة المهاجرة (الجدول 1 والتكميلي الشكل 2).

تم تحليل podoplanin التالي (دائرة التغذية) التعبير في ظل ظروف محددة. دائرة التغذية هو الغشاء الصورةialomucin مثل البروتين الذي ارتبط مع الغزو في سرطانات متعددة 11،12 وأيضا في NSCs 8. وتزداد نسبة الخلايا معربا عن دائرة التغذية في الدرجة العالية الاورام الدبقية 13. ويرتبط دائرة التغذية أيضا مع بقاء فقرا في مرضى ورم أرومي 14. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت دائرة التغذية لتكون علامة على تطور خبيث في أورام متعددة بما في ذلك سرطان الثدي والرئة والقولون 15،16. وأعرب عن دائرة التغذية في كل من الغازية وكذلك المهاجرة NSCs 8. باستخدام بروتوكول أعلاه، تمت مقارنة دائرة التغذية التعبير السيطرة عليها، FGF2 فقط، في إإكسبلنتس تتعرض لTGFβ1 وBMP4 وحدها أو في مجموعات. تم الكشف عن دائرة التغذية التعبير في جميع BMP4 وTGFβ1 / إإكسبلنتس المعالجة BMP4. في المقابل، لم يلاحظ أي دائرة التغذية في إإكسبلنتس تحكم في FGF2 وحدها أو في إإكسبلنتس مع TGFβ1 وحدها (الجدول 2 والشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك استميلت الخلايا مع النمط الظاهري المهاجرة في BMP4 وTGFβ1 / BMP4-إإكسبلنتس المكشوفة، في حين أن إإكسبلنتس التحكم (FGF2 فقط) وTGFβ1 وحده لا تظهر الخلايا المهاجرة (الجدول 1). مراقبة الخلايا المهاجرة توفر منخفضة التكلفة، التقييم النوعي مباشرة إلى الأمام.

وعلاوة على ذلك، نحن اختبار المهاجرة استجابة وEMT تحريض عدة مناطق من الأنبوب العصبي النامية لBMP4 (الجدول 2). تم إعداد 400 ميكرومتر إإكسبلنتس من القشرة المركزية، القشرة الخلفية (المسمى القطب الخلفي)، وMGE والدماغ المتوسط، كما هو مبين في الشكل 1. وقد تتعرض إإكسبلنتس كل لFGF2 لمدة يومين، تليها يومين في FGF2 مع BMP4 . وقد عرفت الهجرة بظهور خلايا المهاجرة مسطحة مع الرائدة وراء حافة (الشكل 5 والشكل التكميلي 2). وتحريض قوي من الخلايا المهاجرة من القشرة الخلفية واستجابة وسيطة من MGE وزارة التربية والعلموقد لوحظ مخ (الجدول 2). 145 من 146 إإكسبلنتس من القشرة المركزية أظهرت استجابة المهاجرة في FGF2 / BMP4. وهكذا، أظهرت القشرة المركزية للتحريض أقوى من الخلايا المهاجرة من كل إإكسبلنتس اختبار (الجدول 2). إغفال BMP4 إلغاء أي رد المهاجرة (الجدول 1 و 2، والبيانات لا تظهر).

لتقييم كمي لعامل نمو قوة، وقد تم قياس المسافة الهجرة في إإكسبلنتس مثقف في عوامل النمو متعددة. كانت إإكسبلنتس مثقف على النحو الوارد أعلاه لمدة يومين في FGF2، ثم ليومين إضافيين في FGF2 دون العوامل (السيطرة) أو BMP4 واحد أو مجتمعة، وTGFβ1. في إإكسبلنتس السيطرة لوحظ وجود انتشار قوي ردا على FGF2، كما هو متوقع. وتستمد إإكسبلنتس من SVZ القشرية ويحتوي على NSCs جزء الكبيرة التي هي معروفة لتتكاثر ردا على FGF2 17. وم السيطرةوصلت LLS 689 ± 14، الخلايا TGFβ1 582 ± 49 ميكرون (الشكل 5.). أظهرت-مجموعة BMP4 مسافة الهجرة متوسط ​​من 935 ± 91 ميكرون. في المقارنة TGFβ1 / BMP4 خلايا هاجرت مزيد بشكل ملحوظ، إلى 1150 ± 23 ميكرون (الشكل 5). وأظهرت النتائج أن BMP4 هو الأمر الذي أدى إلى هجرة في NSCs المعرضة FGF2. هذه الهجرة يمكن تعزيزه عن طريق TGFβ1. وبالتالي الجمع بين FGF2، BMP4 وTGFβ1 هو الأكثر فعالية للحث على الهجرة. وباختصار، فإن نظام نموذجي ثقافة الخلية يسمح كلا نوعي وكذلك تقييم الهجرة الكمي.

وقد تم ربط EMT لعوامل النسخ (TFS)، مثل Snail1، Snail2، Zeb1، Zeb2، Twist1، Twist2 في النظم المختلفة بما في ذلك سرطانات الظهارية، مثل سرطان الثدي وسرطان القولون وسرطان الرئة وأيضا في الدماغ أورام 1،18. نحن حإعلان أظهرت في وقت سابق ان FGF2 وBMP2 أو BMP4 يمكن أن تحدث Snail1 وSnail2 8،9. باستخدام النظام المذكور أعلاه نحن التحقيق في مستويات التعبير من TFS الأخرى ذات الصلة EMT. يمكن أن يتم الكشف عن أي تغييرات في التعبير Twist1. مع Twist1 يجري في مستويات التعبير منخفضة خلال التعرض FGF2 (لا تظهر البيانات). في نموذج ثقافة الخلية لوحظ في upregulation من Zeb1 وZeb2 خلال FGF2 التعرض وTwist2 خلال FGF2 / BMP4 التعرض (الشكل 6).

ومن المعروف NSCs للمساهمة في السكان من خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف (يجد OPCs) 8،19،20. وتشير عدة خطوط من الأدلة على أن NSCs ويجد OPCs معينة قد تكون الخلية الأصلية للالاورام الدبقية 21،22. لتوصيف النموذج أعلاه أبعد من ذلك، ونحن التحقيق في التعبير عن علامات OPC. لاحظنا أن NSCs المعرضة FGF2 تظاهر شارك في التعبير عن Olig2 / Nestin لد Sox10 / Nestin في أكثر من 90٪ (الشكل 7). توضح هذه الملاحظة أن NSCs تظهر ميزات OPC في نظامنا. والواقع أن ميزات OPC المترابطة مع upregulation من Zeb'1 وZeb'2 (أرقام 6 و 7). وتشير هذه النتائج إلى أن FGF2 التوسع يستنتج هوية OPC، كما تقرره Olig2 وSox10، بينما في نفس الوقت يبدأ أول زيب المستندة خطوات EMT.

شكل 1
الشكل 1: جنين موحدة والدماغ الأمامي تشريح لمجلس الأمن القومي عزل وEMT التعريفي. (A) forelimb الأيسر من جنين فأر E14.5 بعد عملية قيصرية. وتتميز كل رقم أطرافه الصدارة مع السهم نصيحه الأسود. لاحظ تشكيل أرقام بداية نموذجية لE14.5. (ب) الجرذ E14.5 الجنين بعد إزالة بدن. لاحظ التجزئة (#) في ظهري الدماغ البيني ثهيك هو المثالي لبدء إزالة بدأة الجلد / الجمجمة. (C) هو بالفعل إزالة الجلد / الجمجمة في الغالب. يتم وضع علامة على الحدود بين الجلد إزالتها وunremoved مع اثنين من السهام الثلاثي. الجلد يمكن مقشر الأمامية من السهم الأمامي والخلف من مؤخرة السهم. والآن إزالة (D) في الجلد / الجمجمة تماما. ملاحظة الشق الحدود الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر (السهم) وقطع فقط caudally إلى ذلك، مع وضع علامة رأس السهم. (E) والدماغ الانتهائي-الدماغ البيني-الدماغ المتوسط ​​(TEL-DI-MES) تتم إزالة كتلة من بقية الجنين (F) عرض متفوقة من كتلة TEL-DI-MES. تبقى الجمجمة. (G) رأي منحرف من فوق. (H) رأي السفلي من كتلة TEL-DI-MES. (I) والدماغ المتوسط ​​وجزء من الدماغ البيني يتم فصل من الدماغ الانتهائي مع الجزء الأمامي من الدماغ البيني. الأعلى: عرض الأمامي من كلا حويصلات الدماغ الانتهائي. أسفل: Righر جهة النظر الجانبي الدماغ المتوسط، أعلى يواجه cranially (J) الأعلى: كلا حويصلات الدماغ الانتهائي دون الدماغ البيني. عرض أقل شأنا لتوضيح إزالة كاملة من الدماغ البيني. النجمة يصور MGE. أسفل: الجزء الأمامي من الدماغ البيني (K) الأعلى: يتم فصل كل من نصفي الكرة الأرضية في الشق بين نصفي المخ. نصف الكرة المخية الأيسر على الجانب الأيسر. النجمة يصور MGE. بالإضافة إلى علامة يصور إل جي. (L) التكبير من نصف الكرة المخية الأيسر مع وجهة نظر المتوسط. يواجه الحق cranially، غادر caudally، هو أعلى ظهري، أسفل بطني، على التوالي. يقع النجمة (*) في MGE. علامة الجمع (+) ويقع في إل جي. الفصل، تنحنح القشرية. فلوريدا، forelimb. دي، الدماغ البيني. زارة التربية والعلم، الدماغ المتوسط. MHB والحدود الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر. HL، أطرافهم هند. شركة إل جي الكترونيكس، الجانبية البارزة العقدية. MGE، سطي البارزة العقدية. أوب، البصلة الشمية. الكمبيوتر، والقشرة الخلفية. رو، الدماغ المؤخر. الهاتف، الدماغ الانتهائي. الشبكة على كل صورة تظهر خطوط سميكة 2 مم مع أربعة تقاطع مع خطوط رقيقة كل400 ميكرون. شريط النطاق لجميع الصور: 2 مم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: موحدة القشرية SVZ تشريح لمجلس الأمن القومي عزل وEMT التعريفي. (أ) عرض متوسط ​​من نصف الكرة المخية الأيسر. من خلال الثقبة مونرو في MGE وشركة إل جي هي واضحة، والتي تميزت النجمة وعلامة زائد. (ب) تتم إزالة البصلة الشمية فقط cranially من MGE-إل جي. (C) يتم إزالة القطب الخلفي من القشرة فقط وراء لفريق الخبراء الاستشاري (D) الأعلى: يتم فصل تنحنح القشرية من القشرة. اليسار: القطب الخلفي. الأوسط: مجمع يحتوي على الجزء المركزي من القشرة وكتلة CGE-إل جي-MGE. MGE وإل جي الوجه إلى اليمين. الصحيح: BUL حاسة الشمب. (E) وانقلبت كتلة CGE-إل جي-MGE-قشرة أفقيا. الآن على السطح الخارجي للالدماغ الانتهائي يواجه المجهر. MGE وإل جي تواجه الآن إلى اليسار. (F) تتم إزالة السحايا المحمر من قشرة شفافة مشرقة. والآن انقلبت كتلة CGE-MGE-إل جي-CTX الظهر أفقيا لاتخاذ الخطوة التالية. (G، H) ويتكرر نفس الإجراء مع النصف الأيمن. يتم فصل القشرة المركزية بعيدا عن كتلة CGE-MGE-إل جي. لاحظ أن هناك منطقة القشرة الوسيطة التي تبقى في كتلة CGE-MGE-إل جي، مع وضع علامة سهمين. هذا سماكة قشرة متوسطة يتوافق مع نصف قطرها من إل جي. يتم فصل خط منقط يمثل الحدود بين إل جي-فريق الخبراء الاستشاري والقشرة. (I) والقشرة المركزية في إإكسبلنتس أقل من 400 ميكرون قطر. شريط النطاق: 2 مم. شبكة على كل صورة تظهر 2 مم خطوط سميكة مع أربعة تقاطعات (خطوط رقيقة) كل 400 ميكرون. النجمة (*) ويقع علىر MGE. علامة الجمع (+) ويقع في إل جي. الاختصارات: النمل-CTX، القشرة الأمامية. CEN-CTX، قشرة المركزية؛ فريق الخبراء والذيلية البارزة العقدية. الفصل، تنحنح القشرية. حزب المحافظين، الضفيرة المشيمية. CTX، القشرة. شركة إل جي الكترونيكس، الجانبية البارزة العقدية. الرجال، السحايا، MGE، سطي البارزة العقدية. أوب، البصلة الشمية. الكمبيوتر، والقشرة الخلفية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: يزدرع البذر على 35 ملم شبكة خلية أطباق الثقافة ضع 1 مل من المتوسط ​​التوسع في وسط الطبق شبكة 500 ميكرون. ويرد قطرة حافة شبكة (الأسهم الصغيرة). إإكسبلنتس مكان الحق في وسط انخفاض 1 مل. إذا تم نشر إإكسبلنتس خارج الشبكة، SWأيرلندا الطبق في حركة دائرية بطيئة وسوف إإكسبلنتس انتقال إلى المركز من قبل قوة الجاذبية. ملاحظة: إإكسبلنتس هي فقط بالكاد مرئية بالعين (رؤساء السهم الأسود). شريط الحجم: 35 ملم.

الشكل (4)
الشكل (4): هو فعل دائرة التغذية في وجود BMP 4 ومثقف إإكسبلنتس وفقا لقسم بروتوكول 8 (2 أيام في FGF2 فقط، ثم تليها FGF2 مع العوامل كما هو مبين). لم تحكم (A) (FGF2 وحدها) وTGFβ1 (C) إإكسبلنتس لا تحتوي على خلايا دائرة التغذية إيجابية (الخضراء). هي ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). BMP4 (ب) وTGFβ1 / BMP4 (D) إإكسبلنتس أظهرت نسبة عالية من الخلايا دائرة التغذية إيجابية. مركز يزدرع هو على اليسار، في محيط على اليمين. ملاحظة: كانت الخلايا دائرة التغذية إيجابية في معظمها founد في محيط وليس في وسط يزدرع. وإإكسبلنتس TGFβ1 / BMP4 الواردة تملق، أكثر ضعت خلايا دائرة التغذية إيجابية. (E) والنسبة المئوية للخلايا دائرة التغذية إيجابية في إإكسبلنتس في ظروف مختلفة ويمثل. السيطرة وTGFβ1 كلاهما يختلف كثيرا عن الظروف مع BMP4. وتظهر وسائل ± SEM. السيطرة مقابل TGFβ1 ليست كبيرة (م). السيطرة وTGFβ1 مقابل BMP4: ع <0.0001 (***). TGFβ1 مقابل TGFβ1 / BMP4: ع <0.0001 (***). BMP4 مقابل TGFβ1 + BMP4 ليس كبيرا: ع = 0.0981 (م). السيطرة مقابل TGFβ1 + BMP4: ع <0.0001 (***). شريط النطاق لجميع الصور، كما هو موضح في الفقرة (أ): 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5 الرقم 5: تقييم هجرة الكمي. BMP 4 و TGF بيتا 1 المعرض المضافة تأثير على الهجرة الخلية. ومثقف إإكسبلنتس وفقا للمادة بروتوكول 8. (أ) مراقبة يزدرع. (ب) يزدرع في BMP4 وحدها. (C) يزدرع في TGFβ1 وحدها. (D) يزدرع في مزيج من TGFβ1 وBMP4. (E) بعد الهجرة في ميكرون. تم استخدام شبكة 500 ميكرون كمرجع. سيطرة وإإكسبلنتس TGFβ1 تظهر انتشار قوي بقطر يزدرع أكبر مما كانت عليه في ظروف أخرى. وتظهر وسائل ± SEM. لاحظ أن إإكسبلنتس BMP4 وTGFβ1 / BMP4 تتفكك جزئيا جوهر ازدراع والخلايا يهاجر بعيدا عن ذلك بشكل مركزي. السيطرة مقابل TGFβ1 ليست كبيرة (م). TGFβ1 مقابلBMP4: ع = 0.0353 (*). السيطرة مقابل BMP4: ع = 0.0351 (*). BMP4 مقابل TGFβ1 + BMP4: ع = 0.0372 (*). السيطرة مقابل TGFβ1 + BMP4: ع <0.0001 (***). شريط مقياس: 500 ميكرون. ويتميز مركز يزدرع من قبل علامة الجمع (+). يتم وضع علامة الحافة الخارجية من الخلايا المهاجرة مع السهم الثلاثي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل (6):.. Upregulation من عوامل النسخ EMT ذات الصلة التي QRT-PCR يرتبط EMT إلى عوامل النسخ الرئيسية للزيب-وتويست الأسرة (A، B) وupregulated Zeb'1 وZeb'2 خلال المرحلة الأولى من FGF2 التعرض. وقد upregulated (C) Twist'2 أثناء سكونالمرحلة د من FGF2 / BMP4 التعرض. وأظهرت مستويات التعبير النسبية على أساس QRT-PCR (ن = 2). وكانت مستويات مرنا طبيعية لGAPDH. وتظهر وسائل ± SEM. في اليوم 0 الفترة FGF2 كان حصادها مرنا، كان حصادها مزيد مرنا بعد أربعة أيام في FGF2، ثم بعد يوم واحد في FGF2 / BMP4 Zeb'1: السيطرة مقابل FGF2، ص = 0.0002 Zeb'2: السيطرة مقابل FGF2، ص = 0.0206 Twist'2: مراقبة مباراة. FGF2 + BMP4، ص = 0.003.

الرقم 7
الرقم 7: NSCs تظهر خصائص OPC في نظام نموذج تم عزل NSCs من القشرة المركزية ومثقف كما الخلايا وحيدة في وجود FGF2 (وفقا للمادة 5). بعد 8 د في الثقافة (مرور بعد 4 د وفقا للمادة 7.9) الخلايا شكلت المستعمرات NSC الصغيرة وكانت ملطخة للOlig2 (الأحمر، في ب، C)، Sox10 (الأحمر، في E، F) وNestin (الأخضر، A، C، D، F). وهناك نسبة عالية من الخلايا / يرد المشارك أعرب Olig2 Nestin (AC) وSox10 / Nestin (DF). (G) المشارك في التعبير عن Olig2 / Nestin وSox10 / Nestin في النسبة المئوية لجميع الخلايا. وتظهر وسائل ± SEM. شريط النطاق لجميع الصور كما هو موضح في الفقرة (أ) و (د): 20 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

شرط مجموع إإكسبلنتس (القشرة المركزية) إإكسبلنتس مع استجابة المهاجرة ٪ إإكسبلنتس مع التعبير Podoplanin ٪
مراقبة 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

الجدول 1. BMP 4 ومزيج من مركب بيتا 1 مع BMP 4 لحث على الاستجابة المهاجرة قوية. إإكسبلنتس من كان مسك القشرة المركزية في التوسع المتوسطة وFGF2 ليصبح المجموع أربعة أيام. بعد أوليومين، وإإكسبلنتس إما استمر لتلقي FGF2 وحدها (السيطرة) أو FGF2 وبالإضافة TGFβ1، BMP4 أو TGFβ1 / BMP4 كما مزيج. لم control مع وTGFβ1- إإكسبلنتس لا تظهر استجابة المهاجرة ولا التعبير دائرة التغذية. BMP4 وTGFβ1 / BMP4 التي يسببها كل من الخلايا المهاجرة وكذلك التعبير دائرة التغذية في جميع إإكسبلنتس.

منطقة مجموع إإكسبلنتس إإكسبلنتس مع استجابة المهاجرة في FGF2 / BMP4 ٪
قشرة المركزية 146 145 99.3
الخلفي القشرة 52 48 92.0
MGE 56 29 51.7
الدماغ المتوسط 53 28 52.8

الجدول 2. يظهر اللحاء المركزي الهجرة أقوى في الاستجابة لجمعية جيل المستقبل 2 / BMP 4 أعدت إإكسبلنتس من مناطق مختلفة من الأنبوب العصبي الفئران E14.5 تطوير: القشرة المركزية، القشرة الخلفية، والبارزة العقدية وسطي (MGE) و الدماغ المتوسط. تم مثقف جميع إإكسبلنتس مماثل في FGF2 / BMP4 (المادة 8). لم إإكسبلنتس علاجها بدون BMP4 لا تظهر أي استجابة المهاجرة (لا تظهر البيانات). تم فحص جميع إإكسبلنتس لظهور أي خلايا المهاجرة في يزدرع. كانت قادرة على الاستجابة لFGF2 مع BMP4 مع الهجرة جميع المناطق. القشرة المركزية، ومع ذلك، أظهر استجابة أقوى. لاحظ أن BMP4 كان مطلوبا للحث على أي خلايا المهاجرة. إإكسبلنتس مثقف في FGF2 وحده أظهرت انتشار ولكن لاالهجرة؛ ولم يلاحظ وجود خلايا المهاجرة مسطحة في FGF2 وحدها (الجدول 1 والشكل التكميلي 2).

الملحق الرقم 1
الشكل التكميلي 1. 400 ميكرون الشبكة الملف. قد تكون مطبوعة ملف الشبكة واستخدامها كمرجع خلال خطوات تشريح المذكورة أعلاه، وكما هو موضح في الشكلين 1 و 2. وتمثل تقاطعات كبيرة 2 ملم مع 400 ميكرون التقسيمات الفرعية. يرجى النقر هنا لتحميل نسخة PDF من هذا الرقم.

الملحق الرقم 2
الشكل التكميلي 2. BMP 4 -exposed إإكسبلنتس الشيخآه الخلايا المهاجرة مسطحة. التكبير من الخلايا هو موضح في الشكل (5). (أ) المجموعة الضابطة (FGF2 وحده) و (C) أظهرت TGFβ1-إإكسبلنتس تقسيم خلية قوية مع خلايا صغيرة مدورة. (ب) BMP4- و (D) TGFβ1 / وأظهرت BMP4-إإكسبلنتس خلايا مستطيلة مسطحة باستمرار. شريط النطاق لجميع الصور، كما هو موضح في الفقرة (أ): 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

شكل 1
الشكل التكميلي 3. ملخص في المختبر نموذج نظام لEMT التحقيق. الفئران E14.5 القشرة المركزية يحتوي على SVZ مجلس الأمن القومي التي تحتوي على. القشرة المركزية إما شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي من القطع يزدرع أو الخلايا وحيدة. قطع يزدرع هي أكثر ملاءمة للتحليل الكمي الهجرة (المادة 8). هي مناسبة الخلايا وحيدة للتحليل الكيفي، مثل الجينات أو تحليل البروتين (القسم 9.13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة تم وصف نظام موحد لEMT تحليل NSCs استخدام (تلخيصها في الشكل التكميلي 3). توحيد يضمن استنساخ (الجدول 1 و 2). وتستمد NSCs من القشرة النامية، والأنسجة التي عادة لا يخضع EMT. هذا هو ميزة لتحليل الخطوات الأولى في EMT. الخطوات الأولية في EMT لا يمكن دراستها بشكل كاف في الخلايا السرطانية التي تراكمت التغيرات الجينية وربما تكون قد اعتمدت بالفعل ملامح EMT. وعلاوة على ذلك، وعينات الأورام الأولية ليست مثالية لفهم EMT لأن معظم الأورام الخبيثة هي التي تحتوي على المتجانسة كل من الخلايا الغازية وغير الغازية. وينص البروتوكول قدم الباحثون EMT مع نموذج رواية لدراسة الخطوات الأولى من EMT الاستقراء. نحن هنا تبين أن محرضات EMT الرئيسية للزيب والأسرة تويست يتم تنشيط بالتتابع: خلال المرحلة الأولى Zeb1 وZeb2 وupregulated، خلال المرحلة الثانية Twist2 (شملت رقمه 6). في السابق، كنا قد أظهرت أن Snail1 وupregulated بالفعل بعد عدة ساعات من BMP4 التعرض 8. كنا قد أظهرت أيضا أن على BMP4 التعرض الخلايا الجذعية الظهارية العصبية من القشرة المركزية تفرق في خلايا اللحمة المتوسطة، إيجابية لالأكتين العضلات الملساء (SMA) وcalponin 9. نتائج فوق استكمال دراسة سابقة في إثبات أن كل من المنظمين EMT الرئيسية المعروفة ثلاث يشاركون في النظام. وبالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن TGFβ1 يمكن أن يعزز إلى حد كبير تأثير الهجرة من FGF2 / BMP4 وحدها. وتشير هذه النتائج إلى شبكة بين FGF-، BMP- وTGFβ-الإشارات خلال EMT الاستقراء.

الخطوات الأكثر أهمية لعزل ناجحة من NSCs لEMT وتحليل الهجرة هي: صحيح تحديد العمر الجنيني، وتحديد المعالم التشريحية للجنين النامي، وإعداد وسائل الإعلام ثقافة جديدة و(على الأقل بين عشية وضحاها) لوحات المغلفة، واستخدام الأدوات يميل غرامة والمواليةفي تشريح الجزء المركزي من القشرة النامية لإنشاء إإكسبلنتس القشرية.

ويمكن تعزيز التقنيات المعروضة من قبل بعض التعديلات. كما ذكر أعلاه، ومطلي إإكسبلنتس متعددة على صحن واحد مع شبكة. لفحص المركبات متعددة، ومع ذلك، قد تكون أكثر ملاءمة لوضع إإكسبلنتس واحدة في كل بئر من لوحة 96-جيدا. وعلاوة على ذلك، فإن نظام نموذجي يمكن تنقيته لاكتشاف المخدرات على نطاق واسع. كما هو موضح أعلاه، دائرة التغذية هي علامة قيمة للميزات المهاجرة المكتسبة حديثا منذ وجدت دائرة التغذية في الغازية NSCs 8. مراسل دائرة التغذية يمكن transfected في NSCs العادية قبل EMT الاستقراء. ونتيجة لذلك دائرة التغذية معربا عن الخلايا يمكن أن تكون بمثابة الرقابة الداخلية لتحول الخلية نظرا لعدم وأعرب عن دائرة التغذية في NSCs العادية (الشكل 4 والجدول 1). تتوفر العديد من علامات NSC الإضافية المتاحة، مثل Nestin، التي فقدت بعد EMT تحريض 8. ونتيجة لذلك،كل من الحالة الأولية، "غير المهاجرة / غير الغازية / Nestin +"، والحالة النهائية، "الهجرة / الغازية / دائرة التغذية +"، يمكن رصدها، والتي تمكن اكتشاف المخدرات الآلي. في لوحات ثقافة الخلية كبيرة مع آبار متعددة (على سبيل المثال، لوحات 96-جيدا وأكبر) خلايا أولية يمكن أن المصنف وتعامل مع الأدوية أو المركبات بدون وظيفة المعروف المعمول بها. وهكذا، لوحات multiwell يمكن مسحها تلقائيا للتعبير عن دائرة التغذية أو غيرها من علامات الهجرة / الغزو. إذا كان المانع هو الهدف الرئيسي من الشاشة، واختفاء التعبير دائرة التغذية يمكن أن تساعد على تحديد مثيرة للاهتمام مزعومة المركبات المثبطة جديدة.

أثناء اختبار مادة جديدة قد لا تظهر إإكسبلنتس الهجرة و / أو إإكسبلنتس قد محاصرة وفصل من الطبق. في هذه الحالة، فمن الأفضل أن تغيير نصف فقط من وسائل الإعلام كل يوم (بدلا من تغيير وسائل الاعلام كامل كل يوم). هذا يقلل من الإجهاد التي كتبها التوتر السطحي عند استبدال مع وسائل الإعلام الجديدة. القد لا نعلق إإكسبلنتس بعد الطلاء الأولي. في هذه الحالة، فبرونيكتين يجب أن تكون على اتصال مع سطح الطبق لمدة 36 ساعة على الأقل. الفيبرونكتين تستخدم لطلاء يجب الطازجة دون التعرض لأنبوب من البلاستيك لأكثر من 10 دقيقة منذ الفيبرونكتين قد التمسك البلاستيك. وعلاوة على ذلك، يجوز للإإكسبلنتس تسوية خارج الشبكة. في هذه الحالة، فإنه من المستحسن أن دوامة الطبق في حركة دائرية بطيئة. وهذا يسمح للإإكسبلنتس إلى تغيير موضع إلى المركز بواسطة قوة الجاذبية (راجع الشكل 3).

وهناك أدلة قوية على أن الاورام الدبقية مشتقة من NSCs و / أو يجد OPCs المستمدة من NSCs 23،24. ونتيجة لذلك أنشأت مجموعات أخرى نماذج نمو الورم على أساس NSCs: Sampetrean آخرون NSCs معزولة عن Ink4 الفئران / المنتدى الاقليمى للاسيان التي تعاني من نقص وoverexpression من H-رأس 25 اجبرت. أسفرت عالية الجودة الأورام الخبيثة التي أظهرت انتشار وغزو بعد زرع 25. MCNeill آخرون أيضا NSCs معزولة من الفئران المعدلة وراثيا (floxed RB1، NF1، KRAS، PTEN وحده، ومجموعات) 26. تم إبطال مفعولها الجينات عن طريق العدوى لجنة المساواة العرقية للفيروسات وتم زرع في NSCs 26. كل من هذه الأنظمة نموذج لديها ميزة أن الغزو يمكن رصدها في الجسم الحي والمحتملة العقاقير المضادة للغزو جديدة يمكن اختبار. من العيب الرئيسي هو أن بداية الغزو غير محددة بدقة، وأنه من غير الواضح ما إذا كانت الخلايا تظهر غزو الورم نموذجي EMT (الجينات EMT) أو الهجرة المحلية فقط. وعلاوة على ذلك دواء واحد فقط ويمكن اختبار لكل حيوان والتحليل يتطلب عدة أسابيع. للتعرف على دواء مضاد للغزو الرواية وشركات الأدوية تحتاج (أ) للكشف عن عدة آلاف من المركبات أو أكثر في آن واحد، (ب) لتكرار التجارب و (ج) في محاولة تركيز الدواء مختلفة. لإعداد عدة آلاف من الحيوانات المزروعة، تعاملهم مع الأدوية المختلفة واختبار أخيرا للآثار التي كتبها كيميائي نسيجي أو تلألؤ بيولوجيالتحليل هو ذاته الموارد المستهلكة. هنا يتم وصف نظام نموذجي على أساس NSC-رواية لغزو المتعلقة EMT التي تسمح للفحص فعالة من حيث التكلفة الآلاف من المركبات.

على الرغم من أن هذا النموذج يمكن فحص إنتاجية عالية من المركبات، بل هو منصة الفرز الأولية فقط. وبمجرد تحديد المركبات ذات الفائدة في هذا النموذج، وسوف تتطلب التحقق من صحة إضافية. في الجسم الحي اختبار ضروري لمعايير الأمن والسلامة والفعالية لأي مركب تحديدها ونماذج زرع كما هو موضح تصبح أعلى من المهم 25،26. ويقتصر هذا النموذج أيضا من حقيقة أنه قائم على خلايا القوارض. على الرغم من أن النموذج يمكن استخدامها لتحقيق الفئران أو EMT الماوس، أنه من غير الواضح إذا كان نفس الآليات المعمول بها في الخلايا البشرية أو في المرضى من البشر. وهناك حاجة إلى مزيد من التجارب للتحقيق إذا NSCs هي الغازية ليس فقط في المختبر، ولكن أيضا بعد الزرع. عدة أسطر من أدلة تدعم دور NSCsفي تشكيل الورم. وقد تم ربط تطور الورم إلى الجينات التالية: Tenascin C، Hey1، سبارك، Snail1 وSnail2، FGFR +، BMPR1a، EGFR، PDGFRβ، Sox2، Podoplanin، Gli3 وp75NGFR 8. يتم التعبير عن كل من هذه الجينات أيضا خلال التحول من NSCs العادية غير الغازية إلى خلايا اللحمة المتوسطة الغازية 8. في الوقت الحاضر، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت NSCs يمكن أن تتحول إلى أورام عوامل النمو الخارجية فقط.

الخلايا الجذعية بدء الورم (الحيازات) من الأورام المختلفة وقد تم عزل وتستخدم كنماذج لفهم تطور الورم 27. الحيازات، على أية حال، وليس مناسبة تماما لتحليل EMT، منذ EMT لم تحدث بالفعل في الحيازات 27. لفهم في وقت مبكر، وكذلك الخطوات متأخرة من EMT الاستقراء، وهناك حاجة السكان الأساسية الخلايا غير الأورام. من الناحية المثالية لم يكن يقصد هذا الشعب على الخضوع EMT في المقام الأول. كان قد ثبت سابقا أن NSCs الجنينية كانت المرشحين المناسبين لهذا الغرض9،28. وهي يمكن أن يتسبب الهجرة والغزو في NSCs من FGF2 وBMP4 9،28. تم المتعلقة بالهجرة التي يسببها BMP4-FGF2 / إلى الجينات ذات الصلة EMT واحدة، إلا أن الأدلة كاملة ولم يكن هناك منذ أسر EMT الرئيسية زيب وتويست لم يتم التحقيق 8. النتائج المذكورة أعلاه تبين أن تركيبة معينة من أربعة عوامل، FGF2، BMP4، TGFβ1 والانسولين يسبب EMT تحريض قوي جدا وكاملة، لم يلاحظ من قبل. توضح هذه الدراسة أن الجينات EMT الرئيسية للزيب-والعائلات تويست وupregulated أيضا. لذا تقدم هذه الدراسة أول دليل على أن ليس هناك upregulation الانتقائي للجينات واحدة، ولكن تظهر النتائج أن جميع الأسر EMT الرئيسية تنشط في خلية نظام الثقافة المقترحة.

كما لوحظ EMT في سرطانات الظهارية خارج الدماغ، مثل الرئة والثدي والقولون وسرطان المعدة 29. العديد من النماذج لدراسة EMT قيد الاستخدام لهذه الأورام 30-32، والتي تأتي، ولكن مع قيود كبيرة: (أ) استخدام خطوط الخلايا السرطانية تحولت تحمل عدة وراثية وجينية يتغير 33؛ لتحديد مثبطات EMT لمراحل السرطان في وقت مبكر، وسرطان الخلايا في وقت متأخر من مرحلة غير كافية. (ب) الثقافات التي تعتمد على المصل والتي تحتوي على العديد من عوامل النمو غير محددة. هذا يجعل تحديد العوامل الحاسمة في غاية الصعوبة. وعلاوة على ذلك، هو ضعف تجربة استنساخ منذ جودة مصل يختلف من دفعة لدفعة. (ج) مصل يحتوي على مثبطات والأنشطة الإنزيمية ربما تعطيل المركبات الخارجية يمكن أن تكون مفيدة. (د) ضرورة من الانزيمات لالركض الخلية التي تتحلل جزيئات سطح الخلية. (ه) لتحديد مستقبلات EMT لتعزيز EMT الفسيولوجية، وهناك حاجة الخلايا الطبيعية لاختبار تحريض. نماذج الخلايا السرطانية غير كافية لإيجاد المواد التي تشجع على تجديد الخلايا الجذعية العادية.

مطلوب الهجرة أيضا عن العمليات العادية، مثل التئام الجروح وREGENEالتموينية من الدماغ إصابة 18. بعد إصابات في الدماغ والسكتة الدماغية، وضرورية للهجرة إلى موقع الآفة للمشاركة في تجديد 4،34 NSCs. ويمكن أيضا أن تستخدم النظام الحالي لتحديد المواد التي تشجع الهجرة والغزو. كما هو مبين أعلاه، هو فعل الهجرة على بداية مع BMP4 المعالجة. إذا لم يتم كشفها الخلايا لأفضل الممارسات الإدارية ولكن بدلا من ذلك إلى مركبات جديدة، وهذه قد تكون بديلا عن العمل BMP والتي سوف تساعد على تحديد الرواية منبهات BMP. مع نظام المراسل أن يشير التعبير دائرة التغذية والاختبار على نطاق واسع للمواد جديدة يصبح ممكنا. إذا مجمع الرواية يمكن أن تكون بديلا لأفضل الممارسات الإدارية، الخلايا معربا عن دائرة التغذية يمكن التعرف تلقائيا.

النظام المقترح مفيد أيضا للتحقيق في التفاعلات إشارة الخلية. نتائجنا تظهر أن تأثير BMP بشأن الهجرة يمكن أن يتعزز من خلال تفعيل TGFβ1. النتائج تكشف تفاعل المضافة بين BMP- وTGFβ-الإشارات. ومع ذلك، مسارات إشارات إضافية، مثل Notch-، Wnt- أو EGFR- / MAPK- ويمكن أن تشارك شلالات الإشارات الأخرى. لذلك، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات في BMP / TGFβ التفاعلات وعبر الحديث إلى مسارات أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القشرة المركزية استجابة يمكن عزلها عن الفئران المعدلة وراثيا، والتي يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الكامنة وراء EMT القيادة. وباختصار، قد يكون نظام نموذجي EMT هو موضح هنا مفيدة في مجالات بيولوجية الخلايا الجذعية وتجديد، وكذلك في مجال أبحاث السرطان. ويمكن استخدامه لفحص المكتبات المخدرات للمواد تثبيط أو تعزيز الهجرة والغزو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من قبل مؤسسة جامعة بازل علوم ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية عن طريق منحة إلى MHS وAG (الجبهة الوطنية الصومالية IZLIZ3_157230). نشكر الدكتور تانيا رينالدي Burkat لتوفير بسخاء البنية التحتية. جميع أعضاء مجموعة Bettler للمناقشات وتعليقات. نشكر جيرهارد Dorne (لايكا مايكروسيستمز، سويسرا) لتركيب المهنية والكفاءة للالكاملة كاميرا الفيديو HD MC170 (لايكا مايكروسيستمز، سويسرا).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 114، العصبية الخلايا الجذعية، الظهارية للانتقال الوسيطة، والهجرة،
نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,… More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter