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Developmental Biology

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

Epithelial zu mesenchymale Transition (EMT) beschreibt den Prozess der Epithel Transdifferenzierung zu Mesenchym. EMT ist ein fundamentaler Prozess während der embryonalen Entwicklung, die auch tritt häufig bei Glioblastom, der häufigsten bösartigen Hirntumor. EMT wurde auch in mehreren Karzinomen außerhalb des Gehirns einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Magenkrebs beobachtet. EMT ist zentral zur Malignität verknüpft durch die Förderung von Migration, Invasion und Metastasenbildung. Die Mechanismen der EMT Induktions sind nicht vollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein in vitro - System für standardisierte Isolation kortikaler neurale Stammzellen (NSC) und anschließender EMT-Induktion. Dieses System bietet die Flexibilität, entweder einzelne Zellen oder Explantation Kultur zu verwenden. In diesem System werden Ratten- oder Maus sind embryonalen Vorderhirns NSC kultiviert in einem definierten Medium ohne Serum und Enzyme. Die NSCs ausgedrückt Olig2 und Sox10, zwei Transkriptionsfaktoren in oligodendroc beobachtetyte Vorläuferzellen (OPC). Mit diesem System Wechselwirkungen zwischen FGF, BMP- und TGF- & bgr;-Signalgebung beteiligt ZEB1, Zeb2 und Twist2 wurden beobachtet , wo TGF & beta; Aktivierung signifikant die Zellmigration verbessert, was auf eine synergistische BMP- / TGFß-Interaktion. Die Ergebnisse weisen auf ein Netzwerk von FGF, BMP- und TGF- & bgr;-Signalgebung in EMT Einleitung und Aufrechterhaltung beteiligt. Dieses Modellsystem ist relevant EMT in vitro zu untersuchen. Es ist kostengünstig und weist eine hohe Reproduzierbarkeit auf. Es ermöglicht auch den Vergleich von verschiedenen Verbindungen bezüglich ihrer Migrationsantworten (quantitative Entfernungsmessung) und Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen EMT (qualitative Messung) zu hemmen oder zu verstärken. Das Modell ist daher gut geeignet, Arzneimittel-Bibliotheken für Substanzen zu testen EMT zu beeinflussen.

Introduction

Während mehrere Stadien der embryonalen Entwicklung, verlieren Epithelzellen ihre starke Haftung zueinander (zB tight junctions) und erwerben einen Migrations Phänotyp in einem Prozess namens epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) 1. EMT ist für die Bildung von zusätzlichen Zelltypen, wie beispielsweise die mesenchymalen Neuralleistenzellen erforderlich, eine Population , die 2 aus dem Neuroepithel segregiert. EMT ist nicht nur wesentlich während Embryonalstadien , sondern auch in späteren Phasen des Erwachsenenlebens erforderlich physiologischen Prozesse im adulten Organismus zu halten, wie der Wundheilung 3 und des zentralen Nervensystems (ZNS) Regeneration in Läsionen 4 demyelinisierenden.

Epithelialen Tumoren sind bekannt für Migration, Invasion und Metastasierung von EMT als Initiations Schritt zu reaktivieren, was letztlich zu Krebs Progression führt 1,3. EMT in der Tat ist zentral zu starke Migration 1,3 verknüpft. Die zellulären Schritte conditioning, initiiert, unterziehen und EMT Aufrechterhaltung nicht vollständig verstanden werden und müssen weitere Untersuchungen.

Hier ist ein in - vitro - EMT Modellsystem auf Basis von NSCs, mit definierten Wachstumsfaktoren und Medien (kein Serum und keine Enzymeinsatz) wird vorgestellt. Dieses Modellsystem ist von Bedeutung für die Wissenschaftler auf EMT arbeiten. Die Schnecke, Zeb und Twist Proteinfamilien wurden für EMT sowohl in der Entwicklung und Krankheit 1 als kritisch gezeigt. Die Schnecke, Zeb und Twist Familien sind auch in dem vorgestellten System beteiligt. Das System basiert auf einem bestimmten Bereich des Vorderhirns, die normalerweise nicht EMT Bereitstellen während EMT Induktions für die Untersuchung der anfänglichen Ereignisse einen besonderen Vorteil erfährt.

Das Modellsystem könnte möglicherweise EMT in Epithelien angewendet werden außerhalb des ZNS zu studieren, da Schlüssel EMT-Induktoren wie die Schnecke, Zeb und Twist-Proteine, werden auch während der EMT in Gewebesystemen außerhalb des ZNS gefunden. Dieses Modell system ermöglicht die standardisierte Isolierung von NSCs aus der Entwicklung Cortex Stammzelleigenschaften im Allgemeinen und EMT insbesondere zu studieren. Mit diesem System isolierten wir NSCs, induzierte EMT und studierte die spätere Migration unter der Wirkung von FGF2 und BMP-4. Wir beobachteten, dass FGF und BMP-Signalgebung wirkt mit TGFß Signalzellmigration zu fördern, damit die Modellsystem zu validieren.

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Protocol

Alle Tier Verfahren folgte dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (NIH Veröffentlichung, 8. Auflage, 2011) und wurden von der Animal Welfare Committee von Basel (Schweizer Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren) zugelassen. Durch diese Leitlinien wird das Tier Protokoll des "niedrigsten Tierschweregrad" betrachtet.

1. Vorbereitung der Expansion Medium

Hinweis: Arbeiten unter aseptischen Bedingungen als Standard für die Gewebekultur.

  1. Nehmen Sie zwei 15-ml-Röhrchen und 5 ml L-Glutamin-freien DMEM / F12 (1: 1) aus einem 500 ml Medium Flasche in jede der zwei 15-ml-Röhrchen. Zum ersten 15-ml-Röhrchen, fügen Sie 50 mg menschliches apo-Transferrin, 50 ul Putrescin 1 M Stamm (0,1 mM Endkonzentration) und 30 ul Natrium Selen 500 uM Lager (Endkonzentration 30 nM).
    1. Man filtriert durch ein 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter in die ursprüngliche DMEM / F12-Flasche.
  2. Zu der zweiten 15-ml-Röhrchen, fügen 12,5 mg Insulin. Hinzufügen6 - 9 Tropfen 1 M NaOH. Vortex Insulin vollständig aufzulösen. Man filtriert durch ein 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter in die ursprüngliche DMEM / F12-Flasche.
    Hinweis: NaOH giftig und ätzend. Schutzhandschuhe, Mantel, und eine Schutzbrille.
  3. 5 ml Penicillin (10000 Einheiten / ml) / Streptomycin (10.000 & mgr; g / ml) / Amphotericin B (25 & mgr; g / ml) zu dem DMEM / F12-Medium Flasche.
  4. 5 ml 200 mM L-Glutamin Lager frisch aufgetauten oder Oligopeptide enthält Glutamin (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid) an die DMEM / F12-Medium Flasche.
  5. Gut schütteln. Bereiten Sie 50 ml Aliquots.
    Hinweis: Erweiterungsmedium kann für mindestens 2 Wochen bei 4 ° C gelagert werden. Aliquotiert Röhren zeigen weniger pH-Änderungen im Vergleich zum Medium in 500 ml Flaschen aufbewahrt.

2. Herstellung von Passagierung Medium

  1. Zu 1 L Ca 2+ - und Mg 2+ -freien HBSS Medien, fügen 990,85 mg Glucose (5 mM Endkonzentration) und 840,10 mg NaHCO 3 Anmerkung: Die Passage Medium kann mindestens 4 Wochen lang bei 4 ° C gelagert werden.

3. Herstellung von Wachstumsfaktoren

  1. Bereiten sterile 1x PBS mit 1% BSA (PBS-BSA) allein oder mit Chlorwasserstoffsäure (HCl) bei 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Achtung: HCl ist ätzend und giftig und erfordert besondere Sicherheitsmaßnahmen (Mäntel, Brille, Handschuhe, Haube).
  2. Man löst 10 & mgr; g / ml rekombinantem humanen Fibroblast Growth Factor 2 (rhFGF2) in PBS-BSA (10 ng / ml Endkonzentration), 10 & mgr; g / ml rekombinantem humanem Bone Morphogenetic Protein 4 (rhBMP4) in PBS-BSA (10 ng / ml final Konzentration) und 20 & mgr; g / ml rekombinantem humanem Transforming Growth Factor & beta; 1 (rhTGFβ1) in PBS-BSA-HCl (40 ng / ml Endkonzentration).
    1. Nicht sterilisieren filtern. Bereiten Sie Aliquots.
      Anmerkung: Die Wachstumsfaktor-Aliquots können gespeichert werden bei-20 ° C für mindestens 2 Jahre.

4. Beschichtung von Zellkulturschalen

  1. Man löst 1,875 mg Poly-L-Ornithin (PLO) in 500 ml destilliertem H 2 O eine 250x PLO Lager vorzubereiten. Filter sterilisieren eine 0,2 & mgr; m Spritzenfilter mit und stellen jeweils 2 ml.
    Anmerkung: Diese Aliquoten können für mindestens 2 Jahre bei -20 ° C gelagert werden.
  2. Man löst 1 mg Rinder Fibronektin in 1 ml steril-destilliertem H 2 O 1,000x Fibronektin Lager vorzubereiten. Nicht mit dem Vortex, da dies die klebrige Protein gerinnen kann. Schütteln Sie vorsichtig von Hand für 10 min.
    1. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Überprüfen Sie für die vollständige Auflösung. Wärmen der Lösung auf weniger als 37 ° C zur vollständigen Auflösung von Fibronektin. Nicht filtern sterilisieren.
      Anmerkung: Die Lösung kann für bis zu 6 Monate bei 4 ° C gelagert werden.
  3. Verwenden Sie Plasma-vorbehandelte Kunststoff Zellkulturschalen (100 mm oder andere Größen je nach Bedarf fürdas Experiment). Zur Beurteilung der Migration verwenden 35-mm-Schalen mit 500 & mgr; m Raster. Inkubieren Geschirr über Nacht mit 2 ml 1x PLO für 12 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Gewebekultur - Inkubator. Wasche zweimal mit 2 ml 1x PBS.
  4. 2 ml 1x Fibronectin (1 ug / ml Endkonzentration) und inkubiere Geschirr für mindestens 12 Stunden bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Entfernen Sie Fibronektin kurz vor dem Ausplattieren der Zellen.
    Hinweis: Fibronectin-beschichteten Schalen bei 37 ° C für mindestens 2 Wochen gelagert werden.

5. Standardisierte Dissection und Vorbereitung der Cortical Subventrikularzone (SVZ)

  1. Erhalten Ratte embryonalen Tag 14,5 (E14,5, Sprague-Dawley) und Maus E13.5 (C57BL / 6) Embryonen durch timed-Paarung. Mate-Tiere von 18:00 bis 08:00 Uhr am nächsten Morgen. Mittags nach dem Tag der Paarung wird E0.5 betrachtet.
  2. Anesthetize die trächtigen Tieres mit 5% Isofluran und 0,8 l / min Sauerstoffstrom. Überprüfen Sie Antwort von paw Kompression mit scharfen dissection Pinzette. Enthaupten das Tier. Vermeiden Sie CO 2 Ersticken als CO 2 Stamm wirkt sich die Erholung der Zellen.
  3. Abrufen Embryonen, die durch Kaiserschnitt.
    1. Platzieren Tier in Rückenlage und desinfizieren Fell mit 70% Ethanol. Verwenden Sie chirurgische Pinzette und Schere, um V-förmige Hautschnitt von ca. 8 cm im Unterbauch über dem Uterus zu machen. Inzision nur Haut mit Fell, während Muskelwände intakt zu halten.
    2. Verwenden Sie frische Pinzette und Schere, um die Muskeln einzuschneiden und die Bauchmuskelwand das Peritoneum zu betreten.
    3. Identifizieren Sie die Gebärmutter im unteren hinteren Peritoneum. Entfernen Sie die Gebärmutter durch scharfe Trennung von den umliegenden Geweben.
    4. Waschen Sie die Gebärmutter mit Embryonen mit sterilem 1x PBS und in eiskaltem 1x PBS.
    5. Verwenden Sie fein kippte Schere , um die Uteruswand zu öffnen Embryo zu lösen durch Embryo unter einem Präpariermikroskop (3 - facher Vergrößerung, Abbildung 1B). Verwenden Sie eine Zange, die embryonale Rümpfe zu entfernen (
    6. Stellen Sie sicher , die richtige Entwicklungsphase durch den Atlas der Entwicklung Ratte Nervensystem 5. Die richtige embryo Größe wird in 1B gezeigt.
    7. Prüfen Sie weitere korrekte Alter durch die Anwesenheit von Beginn stelligen Bildung in der Ratte forelimb (FL) , wie in 1A dargestellt.
      Hinweis: Die Hinterbein (HL) noch nicht Ziffer Trennung zeigen (Abbildung 1B).
  4. Für Dissektion, Transfer Embryonen zu unbeschichteten Petrischalen mit eiskaltem 1x PBS gefüllt. Führen Sie Dissektion unter einem Stereomikroskop Dissektion (3- bis 20-facher Vergrößerung) mit autoklaviert feinen Pinzette.
    Anmerkung: Die Petrischalen Befestigung von Gewebe an der Geschirroberfläche verhindern, wie mit einem Plasma-beschichteten Zellkulturschalen passieren kann. Geschärfte Wolframdraht Nadeln oder ähnliches sind auch hilfreich für bestimmte Schritte der Dissektion.
  5. Entfernen Sie die Kopfhaut und Schädel an der inte Ausgangsrsection der Entwicklung Telenzephalon (TEL) und Zwischenhirns (DI) (1B) , indem Sie gleichzeitig nach vorn und hinten mit zwei Zangen , um Ziehen Zugang zu den Entwicklungs Neuralrohr (1C) zu gewinnen.
  6. Identifizieren Sie die Mittelhirns-hindbrain-Grenze (MHB, schwarzer Pfeil Kopf in 1B-D), Trennen des Mittelhirns (MES) von Rhombencephalon. Schneiden Sie die rhombencephalon nur bei oder unterhalb der MHB (1D, dreieckigen Pfeil).
    Hinweis: Die zusätzlichen subkutanen Raum an der MHB erleichtert Hautentfernung, ohne das Neuralrohr zu schädigen.
  7. Sever die Verbindung zwischen dem Telenzephalon / Dienzephalon an der Schädelbasis mit Gesichtsskelett (Abbildung 1E). Dies führt zu einem Block Telencephalon, Mesencephalon und Diencephalon (TEL-DI-MES) (1F-H) enthält.
  8. Übertragen Sie die TEL-DI-MES-Block in Expansionsmedium auf Eis. Halten Sie es completely in Expansionsmedium in einem unbeschichteten Petrischale abgedeckt. Halten Sie den Block an der Hirns mit einer Pinzette berührt die Telenzephalon zu vermeiden, dass die kortikale SVZ mit NSCs enthält.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 5,5-5,8 mit allen Embryonen (1F-H).
  10. Übertragen einer TEL-DI-MES blockieren in frischem eiskaltem 1x PBS. Geschnitten entlang der gepunkteten Linie in der Vorderhirns (1F-H), das Mesencephalon von der Diencephalon trennen, wie in 1I gezeigt.
  11. Trennen Sie die DI aus dem TEL durch in 1F entlang der gestrichelten Linien schneiden. Siehe isoliert Telenzephalon in Abbildung 1J.
  12. Teilen Sie die zwei telencephalic Hemisphären, entlang der gepunkteten Linie in Figur 1J Schneiden. Dies führt zu zwei getrennten Halbkugeln , wie in Fig 1K veranschaulicht.
    Hinweis: Die linke Hemisphäre ist in Figur 1L vergrößert.
  13. Identifizieren Sie die mediale Bandelionic Eminenzen (MGE, 2A; *) und seitlichen ganglionären Eminenzen (LGE, 2A; +) sichtbar durch die Zukunft Foramen interventriculare.
    1. Mit einer Pinzette oder Nadel, sezieren entlang einer geraden Linie an der Kreuzung zwischen der MGE und LGE und der vorderen Kortex (ant-CTX, 2B). Schneiden Sie eine gerade Linie durch Kortex, Hippokampus (Hüfte) und Plexus (CP). Dies trennt den vorderen Kortex einschließlich des Riechkolbens (ob) von den ganglionic Erhabenheiten (GE, 2B, C).
  14. Schneiden Sie eine zweite gerade Linie an der Kreuzung der Schwanzganglienhügel (CGE, 2C, D) und dem posterioren Cortex (2C), wiederum durch Kortex Schneiden, Hippocampus und Plexus.
  15. Flatten Telenzephalon aus. Entfernen Sie vollständig den hinteren Pol und der Riechkolben (2D). Identifizierendie kortikale Saum des Hippocampus und des Plexus (2C) enthält, wie zuvor 6,7 definiert.
    Hinweis: Der Hippocampus eine dünnere Neuroepithel als die Kortikalis aufweist. Der CP enthält rote Gefäße.
    1. Trenne die kortikale hem aus der Rinde, die Größe des Kortex identisch mit der Größe der ganglionic Eminenzen (2D) zu verlassen. Dies führt zu einem Block von der Kortex (das Zielgewebe) und der ganglionic Eminenzen (GE, 2D).
  16. Klappen Sie den Cortex-GE-Block mit dem ventrikulären (inneren) Seite mit der Geschirroberfläche.
    Anmerkung: Die Außenfläche der Halbkugel den Experimentator (2E) gegenüber . Auf der Außenfläche sind die Blutgefäß enthaltenden Meningen (Figur 2E).
    1. Pin der GE mit der Geschirroberfläche mit der linken Hand und ziehen Sie die Meningen mit einer Pinzette in der rechten Seite (dominant) Hand aus (2F Hinweis: Dies ist die technisch anspruchsvollste Schritt, da die Hirnhaut stark an der Rinde haften. Die Trennung von Meningen aus der Rinde wird erleichtert durch eine völlig geraden Linie (nicht gezackt) in Schritten 5.13.1 und 5.14 Schneiden.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 5,12-5,16 für die andere Hemisphäre und alle Embryonen. Schneiden Sie die Rinde entlang der LGE in einem Abstand von der Hälfte der Hauptdurchmesser des LGE (2G, 2H). Die seziert Kortex erstreckt sich über eine Fläche von 1,2 mm x 2,4 mm (Abbildung 2H) und beinhaltet die SVZ / Keimschicht mit den NSCs.

6. Herstellung von Explantation Kulturen

  1. Schneiden Sie die Rinde in Explantaten von weniger als 400 & mgr; m Durchmesser (Abbildung 2i). Verwenden Sie ein 400 & mgr; m Raster (Supplementary Abbildung 1) unterhalb der Dissektion Petrischale positioniert Referenz (Abbildung 2H und 2I). Übertragen Sie alle Explantate in eine frische Petrischale mit Eis-cold Expansionsmedium.
  2. Entfernen Sie die Fibronektin aus einer Gewebekulturschale (Schritt 4.4). Trocknen lassen. 1 ml kaltem Expansionsmedium zu der Mitte des 35 mm - Schale mit Rastermaß von 10 mm x 10 mm (Figur 3). Das Medium einen kugelförmigen Tropfen (3) zu bilden.
  3. Legen Sie bis 8 Explantate in die Mitte des Tropfens auf. Die Explantate sollte idealerweise mit mindestens 3 mm Abstand zueinander für die Migration Analyse (siehe Abschnitt 8) auf dem Gitter befinden.
  4. Inkubieren der Schale für ca. 1 h in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 21% O 2, 5% CO 2) für die Befestigung der Explantate. Lassen Sie die Explantate absetzen und an den Fibronektin-beschichteten Oberfläche befestigen. Nicht das Gericht schütteln, da können die Explantate lösen und der optimalen Rastermitte ausrücken.
  5. Nach 1 Stunde Inkubation (37 ° C, 21% O 2, 5% CO 2), Füllen der Schale bis zu einem Gesamtvolumen von 2 ml Expansionsmedium bis plus Wachstums fAkteure oder Substanzen von Interesse zu testen und zu brüten.
    Hinweis: Weder enzymatischen Verdau, noch Serum oder Zentrifugation für Explantatherstellung notwendig sind. Dies ist optimal für Zellintegrität.

7. Herstellung von NSC Single Cell Culture

  1. Warm up, Expansion und Passagierung Medium bei 37 ° C.
  2. Übertragen Sie die seziert Kortex Stücke (aus Schritt 5.17) in einen 15-ml-Röhrchen mit kaltem Expansionsmedium (Rohr A). Zentrifugieren Sie die Rinde Stücke für 5 min bei 1200 x g. Den Überstand aspirieren. In 200 ul vorgewärmtes Expansionsmedium der Hirnrinde Stücke wieder zu suspendieren.
  3. In 700 ul vorgewärmtes Passagierbarkeit Medium auf die 15-ml-Röhrchen mit einer P1,000 Spitze (Rohr A). resuspendieren vorsichtig das Pellet. Setzen Sie die Spitze am Ende des 15-ml-Tube. Sanft und langsam die Gewebestücke durch Absaugen dreimal mit der P1,000 Spitze distanzieren.
    Anmerkung: Die Passage mittlere Zelltrennung fördert und benötigt die Verwendung von Enzymen zu vermeiden.
  4. Lassen Sie die Röhrchen für 30 bis 60 Sekunden für eine größere (schwerer) undissoziiertem Stücke zu sitzen am Boden absetzen. Einzelne dissoziierten Zellen werden im Überstand verbleiben. Übertragen etwa 700 & mgr; l des Überstands in ein frisches 15-ml-Tube (Röhre B).
  5. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 und 7.4, die größeren Stücke zu distanzieren.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 und 7.4 ein zweites Mal die größeren Stücke zu distanzieren. Übertragen Sie alle Überstand auf die frische 15-ml-Tube (Röhre B).
  7. Hinzufügen Expansionsmedium auf ein Gesamtvolumen von 5 ml. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Beurteilen Sie tote Zellen durch Trypan-Blau-Färbung.
    Hinweis: Kleine NSCs die Schritte tolerieren 7,2 bis 7,6 besser als größere Zellen. Etwa 4 x 10 6 Zellen mit 10% toten Zellen von 10 Embryonen erwarten.
  8. Zur Erweiterung von NSC, plättchen 1,5 x 10 6 Zellen pro 10 cm Fibronektin beschichteten Gewebekulturschale in einem Volumen von 8 ml Expansionsmedium. Für Standard-Erweiterung, fügen 8 ul 1,000x rhFGF2 Lager. In 8 ul rhFGF2 mich jeden Tag und änderndia jeden zweiten Tag.
    Hinweis: Die Rinde in diesem Entwicklungsstadium enthält eine Mehrheit von NSCs und nur eine Minderheit von differenzierten Zellen. Die differenzierten Minderheiten Zellen reagieren nicht auf die rhFGF2-Behandlung und sterben während der Expansionskultur.
  9. Passage erweitert NSC bei 60% Konfluenz.
    1. Um Passage NSCs, Expansionsmedium zu entfernen. Waschen Sie die Zellen schnell dreimal mit 5 ml Passagierbarkeit Medium. Warten Sie 2 bis 4 min. Ohne Ca 2+ und Mg 2+ die Zellen langsam von der Oberfläche abzulösen, Aufrundung. Stellen Sie sicher, Ablösung von Zellen unter dem Phasenkontrastmikroskop. Warten Sie noch ein paar Minuten, wenn nötig, bis die visuelle Ablösung von der Oberfläche beobachtet wird.
      Hinweis: Einzelne Zellen vollständig lösen, aber die meisten Zellen noch mit der Geschirroberfläche anhaften. Die Dauer für die Ablösung benötigt wird, ist abhängig von der Dauer der Fibronectin-Beschichtung. Eine kurze Fibronectinbeschichtung (12 h oder weniger) führt zu einer schnelleren Zellablösung. Für längere Experimente (>; 1 Woche) Fibronectin Beschichtung von mehr als 24 Stunden empfohlen.
  10. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette vorsichtig auf die Zellen von der Oberfläche lösen. Sammeln Sie die 5 ml Passagierbarkeit Medium mit Zellen und überträgt es auf ein frisches 15-ml-Tube. Wiederholen Sie mit weiteren 5 ml Passagierbarkeit Medium.
  11. Dissoziieren die Zellen in den 15-ml-Röhrchen durch Auf- und Abpipettieren dreimal, die 10 ml-Pipette am Boden des Röhrchens setzt. Drehen Sie das Röhrchen für 15 min bei 1200 × g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 2 ml Expansionsmedium. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Verwenden Sie Trypanblau toten Zellen zu beurteilen.
    Anmerkung: Nach der Expansion auf 60% Konfluenz erwarten 4 - 5 x 10 6 Zellen mit einer toten Zellzahl bei etwa 10%.
  12. Tafel 8 x 10 5 Zellen pro 10 cm Schale für weitere Passagen.

8. Bewertung der Migration

  1. Zur Bewertung der Migration, isolieren Explantaten gemäß Abschnitt 5. Seed die Explantate in35-mm-Raster Gerichte. Eine Stunde nach der Plattierung, fügen FGF2 (rhFGF2). Die Schalen werden in einem 37 ° C Inkubator für 2 Tage.
    Hinweis: Für eine optimale Explantation Befestigung, um das Geschirr zu bewegen.
  2. Entfernen Sie Medium von 1000 ul Spitze. 2 ml Expansionsmedium von 1000 ul Spitze am inneren Kreis beginnen (Abbildung 3). Dies reduziert die Oberflächenspannung auf Explantate.
  3. Hinzufügen, Wachstumsfaktoren einzeln oder in Kombination, wie für das Experiment erforderlich ist. Verwenden Sie FGF2 / BMP-4 / TGFβ1 als Positivkontrolle. Anmerkung: In diesem Experiment wurden 2 ul FGF2 pro 35 mm - Schale, 2 & mgr; l BMP4 und 4 ul TGFβ1 wurden allein und in Kombination (Figur 5) gegeben.
    1. Fügen Sie zusätzliche Faktoren und / oder testbare Substanzen. Halten Sie Gerichte wieder unangetastet für 2 Tage bei 37 ° C.
  4. Machen Sie Fotos von Explantaten auf einem inversen Mikroskop.
    Hinweis: Living Explantate bessere Phasenkontrastbilder als fixierte Zellen ergeben. Beide können verwendet werden.
  5. Für die MigrationBeurteilung, verwenden Sie eine Grafik - Software , die Pixel - Messungen (zB Fidschi 8) ermöglicht.
  6. Messen Sie die Schale Raster von 500 & mgr; m Abstand in Pixeln und es als interne Referenz verwendet werden.
  7. Definieren Sie die Mitte der Explantation als Migrationsstartpunkt. Den Abstand zwischen dem Zentrum des Explantats und der äußersten Gruppe von 10 Zellen.
    Anmerkung: Alle Zellen, die aus dem Explantat zentrifugal weg migrieren. Sie bilden sich spontan ein Blatt am Umfang unter den Bedingungen getestet (Abbildung 5).

9. Invasion Bewertung

  1. Bereiten Sie Fibronektin-beschichteten Gewebekultur 24-Well-Platten gemäß Protokoll Abschnitt 4.
  2. Legen Sie 300 ul warmen Expansionsmedium in die obere und der Zellinvasion Kammern. Inkubieren der Kammern für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
  3. Entfernen Sie das Expansionsmedium von oben gut und legen Sie die Boyden-Kammer in die beschichtete 24-Well-Platte.
  4. In 500 ul warmen Expansionsmedium mit 0,5 ul rhFGF2 und 0,5 ul rhBMP4 auf den Boden gut.
  5. Passage NSCs und zählen sind, wie in Abschnitt 7 Passages 1 bis 4 beschrieben geeignet.
  6. Platte 5 x 10 5 Zellen in einem Volumen von 300 & mgr; l warme Expansionsmedium mit 0,3 ul rhFGF2 und 0,3 ul rhBMP4 in der oberen Mulde der Boyden - Kammer.
  7. Kultur die ausgesäten NSCs für 24 Stunden.
  8. Fügen zusätzliche Faktoren und / oder prüfbare Substanzen in die Kammer und Kultur der Zellen für weitere 48 hr.
    Hinweis: Wenn die Zellen invasiv sind, sie von oben gut durch die Basalmembran Schicht auf den Boden gut passieren. Invasiver Zellen werden dem Boden der Boyden Kammer anhaften.
  9. Folgen Sie dem Protokoll vom Hersteller zur Verfügung gestellt. Verwenden Sie Wattestäbchen (bei der Invasion Assay-Kit enthalten) durch die Reinigung zweimal die nicht-invasive Zellen in der Spitze gut zu entfernen.
  10. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und fügen 500 ul Expansionsmedium miteine Plasmamembran-Färbung für Zellen und mit dem Kernfarbstoff DAPI in die Vertiefungen leben.
  11. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
    Anmerkung: Die Farbstoffe werden integriert in die Membran und der Kern der invasive Zellen, die jeweils für eine optimale Visualisierung 8. Option: Auslassen Plasmamembran Farbstoff, wenn mehrfarbige Immunzytochemie geplant.
  12. Entfernen Sie das Medium mit den Farbstoffen und waschen zweimal mit Expansionsmedium. Visualisieren und invasive Zellen mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zählen wie zuvor 8 gezeigt.
    Hinweis: Einige invasive Zellen vom Boden der Kammer abgelöst haben kann, und haben auf die Bohrlochoberfläche fallen gelassen unten, wo sie an der beschichteten Oberfläche haften. Für eine vollständige Analyse sind die Zellen an der Oberfläche gut.
  13. Entfernen Sie das Medium und befestigen Sie die Zellen in eiskaltem frisch 4% PFA für 10 min. Waschen 3x mit 1x PBS. Führen Sie Immunzytochemie auf invasive Zellen, wie zuvor 8-10 beschrieben.

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Representative Results

Dieses EMT Modellsystem auf die genormte Isolierung von NSC basierend sowohl als einzelne Zellen oder als Explantate aus einer bestimmten Region des Entwicklungs Neuralrohr, die zentrale cortex (1 und 2). Für die quantitative Beurteilung wurden Explantate direkt im Zentrum eines 500 & mgr; m Raster Kulturschale (Abbildung 3) ausgesät. Explantate von der zentralen Kortex wurden zunächst für zwei Tage ausgesetzt FGF2, durch zusätzliche 2 Tage in verschiedenen Kombinationen von Wachstumsfaktoren (Tabelle 1) gefolgt. Wir begannen mit der Hirnrinde, die größer ist als andere Bereiche der Entwicklungs Neuralrohr ist. Wir beobachteten , dass nur Explantate kultiviert in BMP4 eine Migrationsreaktion zeigten (Tabelle 1 und Ergänzungs Abbildung 2).

Weiter podoplanin (PDPN) Expression wurde unter definierten Bedingungen analysiert. PDPN ist ein Trans sialomucin-ähnliches Protein , das in mehreren Krebsarten mit einer Invasion assoziiert wurde 11,12 und auch in NSCs 8. Der Anteil der PDPN exprimierenden Zellen ist in hochgradigen Gliomen 13 erhöht. PDPN ist auch 14 mit schlechteren Überleben bei Patienten mit Glioblastom verbunden. Ferner wird in mehreren Tumoren , einschließlich Brust-, Lungen-, Kolon - Karzinome 15,16 ein Marker für maligne Progression erwiesen PDPN wurde. PDPN ausgedrückt sowohl in invasive als auch wandernde NSCs 8. Unter Verwendung des obigen Protokolls wurde PDPN Expression im Vergleich zur Kontrolle, FGF2 nur, ausgesetzt in Explantate auf TGFβ1 und BMP4 allein oder in Kombinationen. PDPN Expression wurde in allen BMP4 und TGFβ1 / BMP-4-behandelten Explantaten nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde keine PDPN in den Kontroll Explantate in FGF2 beobachtet allein oder in Explantate mit TGFβ1 allein (Tabelle 2 und 4). Zusätzlich Zellen mit Migrations Phänotyp wurden in BMP4 und TGFβ1 / BMP4- induziertausgesetzt Explantate, während die Steuer Explantate (nur FGF2) und TGFβ1 allein nicht zeigen wandernde Zellen (Tabelle 1). Die Beobachtung der wandernden Zellen bietet eine kostengünstige, straight-forward qualitative Bewertung.

Weiterhin testeten wir die Migrationsreaktion und EMT Induktion von verschiedenen Regionen der Entwicklungs Neuralrohrs zu BMP4 (Tabelle 2). 400 um Explantate wurden aus dem zentralen cortex, der posterior cortex (labeled hinteren Pol), die MGE und dem Mesencephalon hergestellt, wie in Figur 1 angedeutet. Die Explantate für zwei Tage FGF2 alle ausgesetzt waren, gefolgt von zwei Tagen im FGF2 mit BMP4 . Migration wurde durch das Auftreten von flachen wandernden Zellen mit einer Vorder- und Hinterkante (Abbildung 5 und Ergänzungs Abbildung 2) definiert. Eine starke Induktion der wandernden Zellen aus dem posterioren Cortex und eine Zwischenantwort aus dem MGE und die mesencephalon beobachtet wurde (Tabelle 2). 145 von 146 Explantate des zentralen Kortex zeigte eine Migrationsreaktion in FGF2 / BMP-4. Somit zeigte die zentrale cortex die robusteste Induktion von wandernd Zellen aller getesteten Explantate (Tabelle 2). Weglassen von BMP4 beseitigt jede Migrationsreaktion (Tabelle 1 und 2 und Daten nicht gezeigt).

Zur quantitativen Beurteilung der Wachstumsfaktor-Potenz wurde Wanderungsstrecke in Explantaten in mehreren Wachstumsfaktoren kultiviert gemessen. Explantate wurden kultiviert, wie oben für zwei Tage in FGF2, dann für weitere 2 Tage in FGF2 ohne Faktoren (Kontrolle) oder einzelne oder kombinierte BMP4 und TGFβ1. In den Kontroll Explantate wurde eine starke Proliferation in Reaktion auf FGF2 beobachtet, wie erwartet. Die Explantate werden aus der kortikalen SVZ abgeleitet und enthalten einen großen Teil NSC , die in Reaktion auf FGF2 17 proliferieren sind bekannt. Die Steuer cells erreichte 689 ± 14, die TGFβ1 Zellen 582 ± 49 & mgr; m (Abbildung 5). Die BMP-4-Gruppe zeigte eine mittlere Laufstrecke von 935 ± 91 & mgr; m. Im Vergleich wanderten die TGFβ1 / BMP4-Zellen signifikant weiter auf 1.150 ± 23 um (Abbildung 5). Die Ergebnisse zeigen, dass BMP4 eine Migration in FGF2-exponierten NSCs wird induziert. Diese Migration kann durch TGFβ1 verbessert werden. Die Kombination von FGF2, BMP-4 und TGFβ1 ist deshalb die wirksamste Migration zu induzieren. Zusammenfassend ermöglicht das Zellkulturmodellsystem sowohl qualitative als auch quantitative Bewertung der Migration.

EMT wurde 1.18 in verschiedenen Systemen einschließlich epithelialen Krebsarten, wie Brustkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs und auch bei Hirntumoren zu Transkriptionsfaktoren (TFS), wie snail1, Snail2, ZEB1, Zeb2, TWIST1, Twist2 verknüpft. Wir had zuvor gezeigt , dass FGF2 und BMP2 oder BMP4 können snail1 und Snail2 8,9 induzieren. Unter Verwendung des obigen Systems untersuchten wir die Expressionsniveaus der anderen EMT bezogenen TFs. Keine Änderungen in TWIST1 Expression nachgewiesen werden konnte; mit TWIST1 während FGF2 Exposition bei niedrigen Expressionsniveaus zu sein (Daten nicht gezeigt). In der Zellkultur - Modell eine Hochregulation von ZEB1 und Zeb2 während FGF2-Exposition und der Twist2 während FGF2 / BMP - 4-Exposition beobachtet wurde (Abbildung 6).

NSCs sind bekannt für die Bevölkerung von Oligodendrozyten - Vorläuferzellen (OPCs) 8,19,20 beizutragen. Mehrere Beweislinien zeigen an, dass NSC und insbesondere OPCs kann die Ursprungszelle für Gliome 21,22 sein. Um das obige Modell weiter zu charakterisieren, untersuchten wir die Expression von OPC-Marker. Wir beobachteten, dass FGF2 lichteten NSC gezeigt Coexpression Olig2 / Nestin einerd Sox10 / Nestin in mehr als 90% (Abbildung 7). Diese Beobachtung zeigt, dass die NSCs OPC-Funktionen in unserem System zeigen. Tatsächlich sind die OPC-Merkmalen korreliert mit Aufregulierung von Zeb'1 und Zeb'2 (6 und 7). Diese Ergebnisse legen nahe , dass FGF2-Expansion eine OPC Identität folgert, wie durch Olig2 und Sox10 beurteilt, während zur gleichen Zeit initiiert ersten Zeb Schritte EMT -Basis.

Abbildung 1
Abbildung 1: Standardisierte Embryo und Vorderhirns Dissection für NSC Isolation und EMT Induktion. (A) Linke forelimb der Ratte E14,5 Embryo nach der Kaiserschnitt. Jeder vordere Glied Ziffer wird mit einem schwarzen Pfeil Spitze markiert. Beachten Sie die Anfangs Ziffer Bildung typisch für E14.5. (B) Ratte E14,5 Embryo nach Rumpf Entfernung. Beachten Sie die Raute (#) an der dorsalen Dienzephalon which ist ideal Entfernung der Haut / Schädel anlage zu starten. (C) Die Haut / Schädel ist bereits zum größten Teil entfernt. Die Grenze zwischen entfernten und nicht entfernten Haut wird mit zwei dreieckigen Pfeilspitzen markiert. Die Haut kann nach vorne von der vorderen Pfeil und posterior vom hinteren Pfeil abgezogen werden. (D) Die Haut / Schädel ist jetzt vollständig entfernt. Beachten Sie die Kerbe des Mittelhirns-hindbrain Grenze (Pfeil) und der Schnitt nur kaudal es, mit einem Pfeil gekennzeichnet. (E) Telenzephalon-Dienzephalon-Hirns (TEL-DI-MES) Block ist vom Rest des Embryos entfernt Superior - Ansicht von TEL-DI-MES - ​​Block. (F). Cranial gelassen wird . (G) Schrägansicht von oben. (H) Inferior Ansicht von TEL-DI-MES - ​​Block. (I) Die Hirns und ein Teil des Zwischenhirns von Telenzephalon mit dem vorderen Teil des Zwischenhirns getrennt sind. Oben: Frontalansicht beider telencephalic Vesikeln. Unten: Right Seitenansicht Hirns, Oberseiten kranial (J) . Oben: beide telencephalic Vesikeln ohne Zwischenhirns. Inferior Ansicht vollständige Entfernung von Zwischenhirns zu illustrieren. Asterisk zeigt MGE. Unten:. Vorderen Teil Dienzephalon (K) nach oben: Beide Hemisphären sind in der Interhemisphärenspalt getrennt. Linken Hemisphäre auf der linken Seite. Asterisk zeigt MGE. Pluszeichen zeigt LGE. (L) Vergrößerung der linken Hemisphäre mit einer medianen Ansicht. Rechts steht kranial links kaudal, oben ist dorsalen, unten ventralen sind. Sternchen (*) an MGE entfernt. Pluszeichen (+) an LGE entfernt. ch, kortikale Saum; FL, forelimb; di, Dienzephalon; mes, Hirns; MHB, midbrain-hindbrain Grenze; HL, Hinterbein; LGE, seitlichen Ganglienhügel; MGE, medial Ganglienhügel; ob, Riechkolben; pc, posterioren Cortex; rho, rhombencephalon; tel, Telenzephalon. Das Raster für jedes Bild zeigt 2 mm dicke Linien mit vier Schnitt mit dünnen Linien jeder400 & mgr; m. Maßstabsbalken auf alle Bilder:. 2 mm Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Standardisierte Cortical SVZ Dissektion für NSC Isolierung und EMT Induktion. (A) Median Ansicht der linken Hemisphäre. Durch das Foramen Monro der MGE und LGE sichtbar sind, durch Sternchen markiert und Pluszeichen. (B) Die Riechkolben nur kranial des MGE-LGE entfernt wird. (C) Die hinteren Pol des Kortex direkt hinter dem CGE entfernt Top (D):. die kortikale Saum ist aus der Rinde getrennt. Links: hinteren Pol. Mitte: Komplex den zentralen Teil des Kortex und der CGE-LGE-MGE-Block enthält. MGE und LGE Gesicht nach rechts. Rechts: Riech bulb. (E) Die CGE-LGE-MGE-Cortex - Block wird horizontal gespiegelt. Nun ist die Außenfläche des Telenzephalon steht vor dem Mikroskop. MGE und LGE stehen nun auf der linken Seite. (F) Die rötliche Hirnhaut von der hellen durchscheinend Rinde entfernt werden. Die CGE-MGE-LGE-CTX - Block wird nun wieder horizontal für den nächsten Schritt gekippt. (G, H) Das gleiche Verfahren mit der rechten Hemisphäre wiederholt wird. Die zentrale Rinde getrennt von der CGE-MGE-LGE-Block. Beachten Sie, dass es eine Zwischen cortex Zone, die an der CGE-MGE-LGE-Block, die mit zwei Pfeilen gelassen wird. Diese Zwischen cortex Dicke entspricht der Hälfte des Durchmessers des LGE. Die gestrichelte Linie , die die Grenze zwischen LGE-CGE und der Rinde. (I) Die zentrale Cortex wird in Explantaten von getrennt von weniger als 400 & mgr; m Durchmesser. Maßstabsbalken: 2 mm; Gitter auf jedem Bild zeigt 2 mm dicke Linien mit vier Kreuzungen (dünne Linien) alle 400 & mgr; m. Sternchen (*) befindet sich eint MGE. Pluszeichen (+) an LGE entfernt. Abkürzungen: ant-CTX, anterioren Kortex; cen-CTX, zentrale Kortex; CGE, Schwanz- Ganglienhügel; ch, kortikale Saum; cp, Choroidplexus; CTX, Rinde; LGE, seitlichen Ganglienhügel; Männer, Meningen; MGE, medial Ganglienhügel; ob, Riechkolben; pc, posterioren Cortex. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3:. Explantation Seeding auf 35 mm Raster Zellkulturschalen Platz 1 ml Expansionsmedium in der Mitte des 500 & mgr; m Gitterschale. Der Tropfen wird durch den Netzrand (kleine Pfeile) enthalten ist. Platz Explantate rechts in der Mitte des 1 ml Tropfen. Wenn die Explantate außerhalb des Gitters verteilt sind, swirl das Gericht in einem langsamen kreisförmigen Bewegung und die Explantate in die Mitte von Zentripetalkraft bewegen. Hinweis: die Explantate mit dem Auge (schwarze Pfeilspitzen) nur kaum sichtbar sind. Maßstabsbalken: 35 mm.

Abbildung 4
Abb . 4: PDPN in Gegenwart von BMP 4 induziert wird Explantate wurden nach dem Protokoll Abschnitt kultiviert 8 (2 Tage in FGF2 nur dann gefolgt von FGF2 mit Faktoren wie angegeben). Control (A) (FGF2 allein) und TGFβ1 (C) Explantate enthielten keine PDPN-positiven Zellen (grün). Nuclei sind mit DAPI gefärbt (blau). BMP4 (B) und TGFβ1 / BMP4 (D) Explantate zeigten einen hohen Anteil an PDPN-positive Zellen. Das Explantat Zentrum ist auf der linken Seite der Peripherie auf der rechten Seite. Hinweis: Die PDPN-positiven Zellen waren meist found an der Peripherie und nicht in der Mitte des Explantat. Die TGFβ1 / BMP4 Explantate enthielten flacher, ausgearbeitet PDPN-positiven Zellen. (E) Der Prozentsatz der PDPN-positiven Zellen in Explantaten unter verschiedenen Bedingungen dargestellt wird. Steuerung und TGFβ1 sind beide signifikant verschieden von den Bedingungen mit BMP4. Es sind Mittel ± SEM gezeigt. Kontrolle vs. TGFβ1 ist nicht signifikant (ns). Steuerung und TGFβ1 vs. BMP4: p <0,0001 (***). TGFβ1 gegen TGFβ1 / BMP4: p <0,0001 (***). BMP4 gegen TGFβ1 + BMP4 ist nicht signifikant: p = 0,0981 (ns). Kontrolle vs. TGFβ1 + BMP4: p <0,0001 (***). Maßstabsbalken für alle Bilder, wie in (A) dargestellt ist . 50 & mgr; m Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5 Abbildung 5: Quantitative Bewertung der Migration. BMP 4 und TGF beta 1 zeigen additive Wirkung auf die Zellmigration. Explantate wurden kultiviert gemäß Protokoll Abschnitt 8 (A) Steuer Explantation. (B) Explantation in BMP4 allein. (C) Explantation in TGFβ1 allein. (D) Explantation in der Kombination von TGFβ1 und BMP - 4. (E) Migration Abstand in & mgr; m. Die 500 & mgr; m Raster wurde als Referenz verwendet. Die Steuerung und die TGFβ1 Explantaten zeigen eine starke Proliferation mit einem größeren Durchmesser als Explantat in den anderen Bedingungen. Es sind Mittel ± SEM gezeigt. Beachten Sie, dass die BMP-4 und TGFβ1 / BMP4 Explantate teilweise die Explantation Kern zerfallen und Zellen auswandern aus es zentrifugal entfernt. Kontrolle vs. TGFβ1 ist nicht signifikant (ns). TGFβ1 vs.BMP4: p = 0,0353 (*). Kontrolle vs. BMP4: p = 0,0351 (*). BMP4 gegen TGFβ1 + BMP4: p = 0,0372 (*). Kontrolle vs. TGFβ1 + BMP4: p <0,0001 (***). Maßstabsbalken: 500 & mgr; m. Center of Explantat wird durch ein Pluszeichen (+) gekennzeichnet. Außenkante wandernden Zellen mit dreieckigen Pfeil markiert ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6:.. Hochregulation von EMT bezogenen Transkriptionsfaktoren durch qRT-PCR EMT zu den wichtigsten Transkriptionsfaktoren der Zeb- und Twist-Familie verknüpft ist (A, B) Zeb'1 und Zeb'2 wurden in der ersten Phase nach oben reguliert von FGF2-Exposition. (C) Twist'2 wurde während der SECON upregulatedd Phase von FGF2 / BMP-4-Exposition. Relative Expressionsniveaus basierend auf qRT-PCR gezeigt (n = 2). Die mRNA-Spiegel waren normiert auf GAPDH. Es sind Mittel ± SEM gezeigt. Am Tag 0 der FGF2 Zeit mRNA geerntet wurde, wurde weiter mRNA nach vier Tagen in FGF2 geerntet, dann nach einem Tag in FGF2 / BMP4 Zeb'1. Steuerung vs. FGF2, p = 0,0002 Zeb'2. Kontrolle vs. FGF2, p = 0,0206 Twist'2. Kontrolle vs. FGF2 + BMP4, p = 0,003.

7
Abbildung 7:. NSCs zeigen OPC Merkmale im Modellsystem NSCs wurden aus dem zentralen Kortex und kultiviert als einzelne Zellen in Gegenwart von FGF2 (gemäß § 5) isoliert. Nach 8 d in Kultur (Durchgang nach 4 d gemäß Abschnitt 7.9) bildeten die Zellen kleine NSC Kolonien und wurden für Olig2 (rot, in B gebeizt, C), Sox10 (rot, in E, F) und Nestin (grün, A, C, D, F). Ein hoher Anteil der Zellen koexprimiert Olig2 / Nestin (AC) und Sox10 / Nestin (DF). (G) Co-expression von Olig2 / Nestin und Sox10 / Nestin wird in Prozent aller Zellen gezeigt. Es sind Mittel ± SEM gezeigt. Maßstabsbalken für alle Bilder , wie in (A) dargestellt und (D):. 20 & mgr; m Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bedingung Insgesamt Explantate (zentrale Cortex) Explantate mit Migrationsreaktion % Explantate mit Podoplanin Ausdruck %
Steuern 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

Tabelle 1. BMP 4 und die Kombination von TGF & bgr; 1 mit BMP 4 Induce eine robuste Migrationsreaktion. Explantate aus dem zentralen Kortex in Expansionsmedium und FGF2 für insgesamt vier Tage gehalten wurden. Nach dem erstenzwei Tagen die Explantate entweder fortgesetzt FGF2 allein erhalten (Kontrolle) oder FGF2 und zusätzlich TGFβ1, BMP4 oder TGFβ1 / BMP4 als Kombination. Control- und TGFβ1- Explantate zeigten weder eine Migrationsreaktion noch PDPN Ausdruck. BMP4 und TGFβ1 / BMP-4 induziert sowohl wandernde Zellen sowie PDPN Expression in allen Explantaten.

Region insgesamt Explantate Explantate mit Migrationsreaktion in FGF2 / BMP4 %
Zentral Kortex 146 145 99,3
posterioren Cortex 52 48 92.0
MGE 56 29 51.7
Mesencephalon 53 28 52.8

Tabelle 2. Die zentrale Cortex zeigt die robusteste Migration in Reaktion auf FGF 2 / BMP 4 Explantate wurden aus verschiedenen Regionen der Entwicklungs Ratte E14,5 Neuralrohr vorbereitet. Die zentrale Kortex, der posterioren Cortex, den medialen Ganglienhügel (MGE) und die Hirns. Alle Explantate wurden identisch in FGF2 / BMP-4 (§ 8) kultiviert. Explantate ohne BMP-4 behandelt zeigten keine Migrationsreaktion (Daten nicht gezeigt). Alle Explantate wurden für das Erscheinen von irgendwelchen wandernden Zellen pro Explantat gescreent. Alle Regionen konnten FGF2 mit BMP-4 mit der Migration zu reagieren. Die zentrale cortex zeigte jedoch die robusteste Reaktion. Beachten Sie, dass BMP4 erforderlich war, daß eine wandernde Zellen zu induzieren. Explantate in FGF2 zeigte allein die Proliferation, aber keineMigration; und keine flachen wandernden Zellen wurden in FGF2 allein (Tabelle 1 und Ergänzungs Abbildung 2) beobachtet.

Supp 1
Ergänzungs Abbildung 1. 400 & mgr; m Gitter Datei. Die Rasterdatei gedruckt und als Referenz kann in den oben dissection Schritte verwendet und wie in den 1 und 2 dargestellt. Die großen Kreuzungen repräsentieren 2 mm mit 400 & mgr; m Unterteilungen. Bitte klicken Sie hier um eine PDF - Version dieser Figur zum Download bereit .

Supp 2
Ergänzende Abbildung 2. BMP 4 -exposed Explantate Show Wohnung Wandernde Zellen. Vergrößerung der Zellen in 5 gezeigt. (A) Control- (FGF2 allein) und (C) TGFβ1-Explantate zeigte eine starke Zellteilung mit kleinen runden Zellen. (B) BMP4- und (D) TGFβ1 / BMP-4-Explantate zeigten durchweg flachen länglichen Zellen. Maßstabsbalken für alle Bilder, wie in (A) dargestellt. 100 & mgr; m Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 1
Ergänzende Abbildung 3. Zusammenfassung der In - vitro - Modellsystem für die Untersuchung EMT. E14,5 Ratte zentrale Kortex enthält den NSC-haltigen SVZ. Die zentrale Kortex ist entweder used als Explantation Stücke oder als einzelne Zellen. Explantation Stücke sind bequemer für die quantitative Analyse Migration (Abschnitt 8). Einzelne Zellen sind für die qualitative Analyse, wie Gen- oder Proteinanalyse (Abschnitt 9.13) geeignet.

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Discussion

In dieser Studie wurde ein standardisiertes System für die EMT - Analyse unter Verwendung von NSCs beschrieben wird (im Ergänzungs Abbildung 3 zusammengefasst). Die Standardisierung gewährleistet Reproduzierbarkeit (Tabelle 1 und 2). Die NSCs werden von der Entwicklung Cortex abgeleitet, ein Gewebe, das normalerweise nicht EMT unterziehen. Dies ist von Vorteil für die Analyse der frühen Schritte in EMT. Erste Schritte in EMT nicht ausreichend in Tumorzellen untersucht werden, die genetische Veränderungen angesammelt haben, und haben bereits EMT Funktionen übernommen. Außerdem sind primäre Tumorproben nicht ideal EMT zu verstehen, da die meisten bösartigen Tumoren heterogen sind sowohl invasive und nicht-invasive Zellen. Das vorgestellte Protokoll bietet EMT Forscher mit einem neuartigen Modell frühen Schritte der EMT Induktion zu studieren. Hier zeigen wir , dass die wichtigsten EMT Induktoren des Zeb und Twist Familie werden nacheinander aktiviert: In der ersten Phase ZEB1 und Zeb2 upregulated werden, während der zweiten Phase Twist2 (Figure 6). Zuvor hatten wir gezeigt , dass snail1 bereits mehrere Stunden nach BMP4-Exposition 8 hochreguliert wird. Wir hatten auch , dass die neuroepithelialen Stammzellen aus dem zentralen cortex auf BMP4-Exposition gezeigt differenzieren sich in mesenchymalen Zellen, positiv für smooth muscle actin (SMA) und Calponin 9. Die obigen Ergebnisse ergänzen die früheren Studie in die zeigen, dass alle drei bekannten Schlüssel EMT Regler im System beteiligt sind. Darüber hinaus beobachteten wir, dass TGFβ1 signifikant die Wanderungseffekt von FGF2 / BMP4 allein verbessern können. Diese Ergebnisse weisen auf ein Netzwerk zwischen FGF, BMP- und TGFß-Signalisierung während EMT Induktion.

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Isolierung von NSCs für EMT und Migrationsanalyse sind: richtig die embryonale Alter zu identifizieren, identifizieren anatomische Orientierungspunkte des sich entwickelnden Embryos, die Vorbereitung von frischen Kulturmedien und (zumindest über Nacht) beschichteten Platten, die Verwendung von Fein kippte Instrumente und propro Dissektion des zentralen Teils der Entwicklungs cortex kortikalen Explantate zu etablieren.

Die präsentierten Techniken können durch einige Modifikationen verbessert werden. Wie oben vorgeschlagen, werden mehrere Explantate auf einem Teller mit einem Raster ausplattiert. Zum Screening mehrerer Verbindungen kann es jedoch bequemer sein, einzelne Explantate in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte zu platzieren. Ferner kann das Modellsystem für große Wirkstoffforschung verfeinert werden. Wie oben beschrieben, ist PDPN eine wertvolle Marker für neu erworbene Migrations Funktionen seit PDPN in invasive NSCs 8 gefunden wird. Ein PDPN Reporter kann in normalen NSCs vor EMT Induktion transfiziert werden. Als Folge PDPN exprimierende Zellen können als interne Kontrolle für die Zelltransformation dienen , da PDPN nicht in normalen NSC (Abbildung 4 und Tabelle 1) ausgedrückt wird. Mehrere zusätzliche NSC - Marker sind verfügbar, wie Nestin, die nach EMT Induktions 8 verloren. Als Konsequenz,sowohl der Anfangszustand "nicht wandernde / nicht-invasive / Nestin +", und der Endzustand "wandernde / invasive / PDPN +" kann überwacht werden, die Arzneimittelforschung automatisiert ermöglicht. In großen Zellkulturplatten mit mehreren Vertiefungen (zB 96-Well - Platten und größer) Ausgangszellen können mit etablierten Medikamente oder Verbindungen ohne bekannte Funktion ausgesät und behandelt werden. Somit können Mikrotiterplatten automatisch für die Expression von PDPN oder andere Migration / Invasion Markierungen gescannt werden. Wenn ein Inhibitor das Hauptziel des Bildschirms ist, kann das Verschwinden von PDPN Ausdruck helfen mutmaßlich interessante neue hemmenden Verbindungen zu identifizieren.

Während der Prüfung einer neuartigen Substanz zeigen die Explantate nicht Migration und / oder die Explantate abrunden kann und von der Schale lösen. In dieser Situation ist es am besten, nur die Hälfte der Medien jeden Tag zu ändern (jeden zweiten Tag statt Vollmedienwechsel). Dadurch verringert sich durch die Oberflächenspannung Stress, wenn sie mit frischen Medien ersetzt. DasExplantate kann nach dem anfänglichen Plattierung nicht befestigen. In dieser Situation hat Fibronectin mit der Geschirroberfläche für mindestens 36 h in Kontakt zu sein. Fibronectin für die Beschichtung verwendet wird, sollte frisch für mehr als 10 min ohne Exposition gegenüber einem Kunststoffrohr hergestellt werden, da Fibronektin an den Kunststoff haften können. Ferner können die Explantate außerhalb des Netzes regeln. In dieser Situation ist es ratsam, die Schüssel in einem langsamen Kreisbewegung zu wirbeln. Auf diese Weise können die Explantate auf das Zentrum von Zentripetalkraft (siehe Abbildung 3) neu zu positionieren.

Es gibt starke Hinweise darauf , dass Gliome von NSCs abgeleitet sind und / oder OPCs abgeleitet von NSCs 23,24. Als Folge haben andere Gruppen Gliom Wachstumsmodellen auf der Basis von NSC etabliert. Sampetrean et al isoliert NSC von INK4 / ARF-defizienten Mäusen und Zwangsüberexpression von H-Ras 25. Hochwertige bösartigen Tumoren ergab , dass zeigten die Proliferation und Invasion nach der Transplantation 25. McNeill et al. auch isoliert NSCs aus genetisch veränderten Mäusen (floxed Rb1, Nf1, Kras, Pten allein und in Kombinationen) 26. Die Gene wurden durch Cre-Virus - Infektion inaktiviert und die NSCs wurden 26 transplantiert. Beide Modellsysteme haben den Vorteil , dass Invasion kann getestet werden in vivo und potenzielle neue Anti-Invasion Drogen überwacht werden. Ihr Hauptnachteil ist, dass der Beginn der Invasion ist nicht gut definiert und es ist unklar, ob die Zellen zeigen Gliom-typische EMT Invasion (EMT-Gene) oder nur lokale Migration. Weiterhin nur ein Medikament kann pro Tier und die Analyse erfordert mehrere Wochen getestet werden. Um eine neuartige Anti-Invasion Droge identifizieren, Pharmaunternehmen müssen (a) auf einmal mehrere tausend Verbindungen oder mehr zu screenen, (b), um die Tests zu replizieren und (c) verschiedene Arzneimittelkonzentrationen zu versuchen. Zur Herstellung von mehreren tausend transplantierten Tiere, behandeln sie mit verschiedenen Drogen und schließlich testen Effekte durch histochemische oder BiolumineszenzAnalyse ist sehr ressourcenintensiv. Hier ein neuartiges NSC-basierte Modellsystem für die EMT-bezogene Invasion beschrieben, das die kostengünstige Screening von Tausenden von Verbindungen ermöglicht.

Obwohl dieses Modell Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen ermöglicht, ist es eine primäre nur Screening-Plattform. Sobald Verbindungen von Interesse in diesem Modell identifiziert werden, werden sie zusätzliche Validierung erfordern. In - vivo - Tests für die Sicherheit und Wirksamkeitsparameter für jede Verbindung , identifiziert und Transplantationsmodellen notwendig ist , wie oben wichtig 25,26 werden beschrieben. Das Modell ist auch durch die Tatsache begrenzt, dass es auf Nagetierzellen beruht. Obwohl das Modell der Ratte oder Maus EMT zu untersuchen, verwendet werden kann, ist es unklar, ob die gleichen Mechanismen, die in menschlichen Zellen oder im menschlichen Patienten sind. Weitere Experimente sind erforderlich , um zu untersuchen , ob NSC in vitro nicht nur invasiv sind, aber auch nach der Transplantation. Mehrere Beweis die Rolle von NSCs unterstützenin Gliom-Bildung. Tenascin C, Hey1, SPARC, snail1 und Snail2, FGFR +, BMPR1A, EGFR, PDGFRβ, Sox2, Podoplanin, Gli3 und p75NGFR 8: Gliom Progression hat zu folgenden Genen in Verbindung gebracht worden. Alle diese Gene sind auch bei der Umwandlung von normalen , nicht-invasive NSC zu invasive Mesenchymzellen 8 ausgedrückt. Zu der Zeit ist, ist es unklar, ob NSCs nur in Tumoren durch externe Wachstumsfaktoren transformiert werden können.

Tumor-initiierenden Stammzellen (TICs) von verschiedenen Tumoren wurden isoliert und werden als Modelle verwendet , um die Tumorprogression 27 zu verstehen. TICs sind jedoch nicht gut geeignet für die EMT - Analyse, da EMT bereits in TICs 27 auftrat. Um zu verstehen, früh und auch späte Schritte der EMT Induktion, eine primäre nicht-neoplastischen Zellpopulation benötigt wird. Im Idealfall wurde diese Population nicht EMT in erster Linie zu unterziehen soll. Es war zuvor gezeigt worden, dass embryonale NSC geeignete Kandidaten für diesen Zweck waren9,28. Das heißt, könnte die Migration und Invasion in NSCs von FGF2 und BMP4 9,28 induziert werden. FGF2 / BMP - 4-induzierte Migration auf einzelne EMT-verwandten Genen verwandt war, jedoch vollständige Beweis fehlte , da die Schlüssel EMT Familien Zeb und Twist war nicht 8 untersucht worden. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass eine bestimmte Kombination von vier Faktoren, FGF2, BMP-4, TGFβ1 und Insulin eine sehr starke und komplette EMT Induktion verursachen, nicht vorher beobachtet. Die vorliegende Studie zeigt, dass die wichtigsten EMT Gene des Zeb- und Twist-Familien sind auch nach oben reguliert. Diese Studie liefert somit den ersten Beweis dafür, dass es nicht selektiv upregulation einzelner Gene ist, aber die Ergebnisse zeigen, dass alle Schlüssel EMT Familien in der vorgeschlagenen Zellkultursystem aktiv sind.

EMT hat auch in epithelialen Tumoren außerhalb des Gehirns, wie Lungen-, Brust-, Darm- und Magenkrebs 29 beobachtet worden. Mehrere Modelle EMT zu untersuchen sind für diese Tumoren bei Verwendung 30-32, Die kommen, aber mit erheblichen Einschränkungen: (a) Verwendung von Tumor - transformierten Zelllinien mehrere genetische und epigenetische Veränderungen 33 trägt; zu identifizieren Inhibitoren der EMT für Krebs im Frühstadium Stadien, sind im Spätstadium Krebszellen unzureichend; (B) Serum abhängigen Kulturen, die verschiedene undefinierten Wachstumsfaktoren enthalten; dies macht die Identifizierung kritischer Faktoren sehr schwierig. Ferner wird Experiment Reproduzierbarkeit beeinträchtigt, da Serum Qualität von Charge zu Charge variiert; (C) Serum enthält Inhibitoren und enzymatische Aktivitäten möglicherweise potentiell nützliche exogene Verbindungen inaktivierende; (D) Notwendigkeit von Enzymen für die Zell Passagierung, die Zelloberflächenmoleküle abbauen; (E) EMT-Agonisten zu identifizieren physiologischen EMT zu fördern, werden normale Zellen benötigt Induktion zu testen. Die Tumorzellmodelle sind unzureichend, Substanzen zu finden, die Regeneration in normalen Stammzellen zu fördern.

Migration ist auch für normale Prozesse erforderlich sind, wie die Wundheilung und regeneRation des verletzten Gehirns 18. Nach dem traumatischen Hirnverletzungen und Schlaganfall, NSCs sind notwendig , um die Läsion zu wandern in der Regenerations 4,34 teilzunehmen. Das derzeitige System kann auch Substanzen verwendet werden , zu identifizieren , die Migration und Invasion zu fördern. Wie oben gezeigt, wird die Migration beim Start mit BMP-4-Behandlung induziert. Wenn die Zellen nicht ausgesetzt BMPs sind, sondern neue Verbindungen, für die BMP-Aktion können diese wird dazu beitragen, neue BMP-Agonisten zu identifizieren ersetzen, die. Mit einem Reportersystem, das PDPN Ausdruck, in großem Maßstab Tests für neue Stoffe gibt machbar; wenn eine neue Verbindung kann für BMPs ersetzen können PDPN exprimierenden Zellen automatisch identifiziert werden.

Das vorgeschlagene System ist auch nützlich als zelluläre Signale Wechselwirkungen zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die BMP-Effekt auf die Migration von TGFβ1 Aktivierung verstärkt werden könnte. Die Ergebnisse enthüllen eine additive Wechselwirkung zwischen BMP- und TGFβ-Signalisierung. Jedoch zusätzliche Signalwege, wie Notch-, Wnt- oder EGFR / MAPK und andere Signalkaskaden beteiligt sein können. Daher sind weitere Untersuchungen über BMP / TGF-Interaktionen und Übersprechen auf andere Wege benötigt. Darüber hinaus kann das ansprechende zentralen Kortex aus genetisch veränderten Mäusen isoliert werden, die EMT Fahrzugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären helfen können. Zusammenfassend kann die EMT-Modell hier beschriebene System kann in den Bereichen Stammzell Biologie und Regeneration sowie in der Krebsforschung nützlich. Es kann für das Screening von Drogen-Bibliotheken für Substanzen verwendet werden, zu hemmen oder zu Migration und Invasion zu verbessern.

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Acknowledgments

Die Studie wurde von der Universität Basel Science Foundation und der Schweizerischen National Science Foundation unterstützt durch einen Zuschuss zu MHS und AG (SNF IZLIZ3_157230) unterstützt. Wir danken: Dr. Tania Rinaldi Burkat für Infrastruktur großzügig bereitstellt; alle Mitglieder der Gruppe Bettler für Diskussionen und Kommentare. Wir danken Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Schweiz) für professionelle und kompetente Installation des Full-HD-MC170 Videokamera (Leica Microsystems, Schweiz).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

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References

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Entwicklungsbiologie Heft 114 Neurale Stammzellen epitheliale zu mesenchymale Transition Migration, Gliom Krebs Invasion snail1 fötale Rinderserum frei FGF2 BMP-4 TGFß
Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery
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