Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

אפיתל המעבר mesenchymal (EMT) מתאר את התהליך של האפיתל transdifferentiating לתוך mesenchyme. EMT הוא תהליך בסיסי במהלך ההתפתחות העוברית כי גם מופיע לרוב גליובלסטומה, שסבלה מגידול ממאיר במוח השכיח ביותר. EMT גם נצפה קרצינומות מרובות מחוץ למוח כולל סרטן השד, סרטן הריאות, סרטן המעי גס, סרטן קיבה. EMT קשורה מרכזי לממאירות באמצעות קידום הגירה, הפלישה והיווצרות גרורות. המנגנונים של אינדוקציה EMT אינם מובנים במלואם. כאן אנו מתארים מערכת במבחנה לבידוד סטנדרטי של תאי גזע עצביים בקליפת מוח (NSCs) ו EMT-האינדוקציה הבאה. מערכת זו מספקת את הגמישות להשתמש גם תאים בודדים או תרבות explant. במערכת זו, חולדה או עכבר עובריים NSCs המוח הקדמי מתורבתים בתווך מוגדר, נטול בסרום ואנזימים. NSCs הביע Olig2 ו Sox10, שני גורמי שעתוק שנצפתה oligodendrocתאי מבשר YTE (OPCs). באמצעות מערכת זו, אינטראקציות בין FGF-, BMP- ו TGFβ-איתות מעורבים Zeb1, Zeb2, ו Twist2 נצפו שם TGFβ הפעלה משופרת באופן משמעותי נדידת תאים, דבר המצביע על BMP- / TGFβ אינטראקציה סינרגיסטית. התוצאות מצביעות על רשת של FGF-, BMP- ו TGFβ-איתות להיות מעורב אינדוקציה ותחזוקה EMT. מערכת מודל זה רלוונטי לחקור EMT במבחנה. זה וחסכוני ומראה שחזור גבוה. זה גם מאפשר את ההשוואה של תרכובות שונות ביחס לתגובות ההגירה שלהם (מדידת מרחק כמותי), והקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כדי לעכב או לשפר EMT (מדידה איכותית). המודל ולכן גם מתאים לבחון ספריות תרופה עבור חומרים המשפיעים EMT.

Introduction

במהלך מספר שלבים של התפתחות עוברית, תאי אפיתל לאבד הדבקות החזקה שלהם זה לזה (למשל, צומת הדוקים) ולרכוש פנוטיפ נודדת בתוך אפיתל תהליך שנקרא מעבר mesenchymal (EMT) 1. EMT נדרש להקמת סוגי תאים נוספים, כגון תאי הרכס העצבי mesenchymal, אוכלוסייה מבדלת מן neuroepithelium 2. EMT אינה הכרחית רק בשלבים עובריים אלא גם נדרש בשלבים מאוחרים יותר של החיים הבוגרים לקיים תהליכים פיזיולוגיים באורגניזם בוגר, כגון ריפוי פצעים 3 ומערכת העצבים המרכזית (CNS) התחדשות demyelinating נגעים 4.

גידולים אפיתל ידועים מחדש EMT כצעד חניכה הגירה, הפלישה גרורות, בסופו של דבר שמוביל להתפתחות הסרטן 1,3. EMT אכן קשור מרכזי כדי 1,3 הגירה חזקה. השלבים הסלולר של גonditioning, ייזום, עובר ושמירת EMT אינו מובנה במלוא וצריך לחקירה נוספת.

כאן, מערכת מודל EMT סטנדרטית במבחנה המבוססת על NSCs, עם גורמי גדילה מוגדרות ומדיה (לא בסרום ולא שימוש אנזים) מוצגת. מערכת מודל זה של רלוונטי עבור מדענים עובדים על EMT. משפחות חלבון החילזון, זב טוויסט הוכחו להיות קריטי עבור EMT הוא בפיתוח ומחלות 1. החילזון, משפחות זב טוויסט מעורבים גם במערכת הציג. המערכת מבוססת על אזור מסוים של המוח הקדמי שבדרך כלל אינו עובר מתן EMT יתרון מסוים לחקר אירועים ראשוניים במהלך אינדוקצית EMT.

מערכת המודל ניתן להחילו ללמוד EMT ב epithelia מחוץ CNS, מאז מעוררים EMT מפתח, כגון חילזון, זב וחלבונים טוויסט, מצויים גם במהלך EMT במערכות רקמות מחוץ למערכת העצבים המרכזית. במודל זהystem מאפשר בידוד סטנדרטי של NSCs מהקורטקס בפיתוח ללמוד תכונות תאי גזע בכלל EMT בפרט. באמצעות מערכת זו, אנו מבודדים EMT NSCs, מושרה ולומדים הגירה שלאחר מכן תחת השפעת FGF2 ו BMP4. הבחנו כי FGF- ו- BMP-איתות אינטראקציה עם TGFβ-איתות לקדם נדידת תאים, ובכך אימות מערכת מודל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הנהלים כל חיה בעקבות 'מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה "(פרסום NIH, 8 המהדורה ה 2011) ואושרו על ידי ועדת צער בעלי חיים של באזל (הנחיות שוויצרי עבור טיפול ושימוש בחיות). בהנחיות אלה פרוטוקול החיה נחשב של "דרגת חומרת החיה הנמוכה ביותר".

1. הכנת בינוני הרחבה

הערה: עבודה בתנאים ספטית כסטנדרט עבור בתרבית רקמה.

  1. קח שני 15 מ"ל צינורות, ולהוסיף 5 מ"ל של L- גלוטמין ללא DMEM / F12 (1: 1) מבקבוק בינוני 500 מ"ל לתוך כל אחד משני 15 מ"ל צינורות. כדי שפופרת 15 מ"ל הראשון, להוסיף 50 מ"ג apo-transferrin אדם, 50 μl של פוטרסין 1 M המניות (0.1 מ"מ ריכוז סופי) ו -30 μl של סלניום נתרן 500 מיקרומטר המניות (הריכוז הסופי 30 ננומטר).
    1. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק לתוך הבקבוק DMEM / F12 המקורי.
  2. כדי שפופרת 15 מ"ל השני, להוסיף 12.5 אינסולין מ"ג. לְהוֹסִיף6 - 9 טיפות של 1 M NaOH. וורטקס לפזר אינסולין לחלוטין. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק לתוך הבקבוק DMEM / F12 המקורי.
    הערה: NaOH הוא רעיל ומאכל. יש להשתמש בכפפות מגן, מעיל, ומשקפי בטיחות.
  3. הוסף 5 מ"ל פניצילין (10,000 יחידות / מ"ל) / סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם / מ"ל) / amphotericin B (25 מיקרוגרם / מ"ל) אל בקבוק בינוני DMEM / F12.
  4. הוסף 5 מ"ל של 200 מ"מ המניה L- גלוטמין מופשר טרי או oligopeptides המכילים גלוטמין (200 מ"מ dipeptide L-alanyl-L- גלוטמין) אל בקבוק בינוני DMEM / F12.
  5. נער היטב. כן 50 מיליליטר aliquots.
    הערה: בינוני הרחבה יכול להיות מאוחסן במשך 2 שבועות לפחות על 4 מעלות צלזיוס. צינורות aliquoted להראות שינויי pH פחות לעומת בינוני שמור על 500 מיליליטר בקבוקים.

2. הכנת Passaging בינוני

  1. עד 1 L Ca 2 + - ו Mg 2 + -חינם התקשורת HBSS, להוסיף 990.85 גלוקוז מ"ג (5 הריכוז הסופי מ"מ) 840.10 מ"ג NaHCO 3 הערה: בינוני passaging יכול להיות מאוחסן במשך 4 שבועות לפחות על 4 מעלות צלזיוס.

3. הכנת גורמי גדילה

  1. הכן PBS 1x סטרילי עם 1% BSA (PBS-BSA) לבד או עם חומצה הידרוכלורית (HCl) בשעה 4 מ"מ (PBS-BSA-HCl).
    זהירות: HCl הוא מאכל רעיל דורש אמצעי בטיחות מיוחד (מעיילים, משקפי מגן, כפפות, ברדס).
  2. ממיסים 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​צמיחה פיברובלסטים אנושי רקומביננטי 2 Factor (rhFGF2) ב- PBS-BSA (10 ng / הריכוז הסופי מ"ל), 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​חלבון המוךפו"גנטי שהולך עצם אנושי רקומביננטי 4 (rhBMP4) ב- PBS-BSA (10 ng / ml הסופי ריכוז), ו -20 מיקרוגרם / מיליליטר צמיחת Transforming אנושי רקומביננטי פקטור בטא 1 (rhTGFβ1) ב- PBS-BSA-HCl (40 ng / ריכוז סופי מיליליטר).
    1. אל תסנן לעקר. כן aliquots.
      הערה: aliquots גורם גדילה ניתן לאחסן-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 2 שנים.

4. ציפוי של צלחות תרבית תאים

  1. ממיסים 1,875 מ"ג פולי-L-ornithine (אש"ף) ב 500 מ"ל מזוקקים H 2 O להכין מלאי אש"ף 250x. סנן לעקר באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ולעשות 2 מ"ל aliquots.
    הערה: אלה aliquots ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 2 שנים לפחות.
  2. ממיסים 1 מ"ג פיברונקטין שור ב 1 מ"ל סטרילי-מזוקקים H 2 O להכין מלאי פיברונקטין 1,000x. לא מערבולת מכיוון שהדבר עלול להיקרש החלבון הדביק. לנער בעדינות ביד במשך 10 דקות.
    1. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר עם רעד מדי פעם. בדקו פירוק מוחלט. לחמם הפתרון פחות מ -37 מעלות צלזיוס במשך הפירוק המוחלט של פיברונקטין. אל תסנן לעקר.
      הערה: הפתרון עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  3. השתמש תרבות מנות תא פלסטיק פלזמה pretreated (100 מ"מ או בגדלים אחרים כנדרשהניסוי). כדי להעריך הגירה, השתמש 35 מ"מ צלחות עם רשת 500 מיקרומטר. דגירה מנות לילה עם 2 מ"ל 1x אש"ף במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממה בתרבית רקמה 5% CO 2. שטפו פעמיים עם 2 מ"ל 1x PBS.
  4. הוסף 2 מ"ל 1x פיברונקטין (1 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי) ו דגירה מנות למשך תקופה מינימלית של 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO. הסר פיברונקטין רק לפני ציפוי התאים.
    הערה: מנות מצופות פיברונקטין יכולות להיות מאוחסנות במשך 2 שבועות לפחות על 37 מעלות צלזיוס.

5. סטנדרטי Dissection והכנה של אזור קורטיקלי Subventricular (SVZ)

  1. השג עובר חולדת יום 14.5 (E14.5, ספראג-Dawley) ו E13.5 העכבר (C57BL / 6) העובר על ידי-הזדווגות מתוזמן. Mate חיות בין השעות 18:00 עד 08:00 למחרת בבוקר. בצהריים לאחר יום של ההזדווגות נחשב E0.5.
  2. להרדים את החיה בהריון עם 5% Isoflurane ו 0.8 L / זרימת חמצן דקה. בדוק תגובה על ידי דחיסה כפה עם diss חדהמלקחי שיקוף. לערוף את החיה. הימנע מחנק CO 2 כמו CO 2 משפיע גזע התאוששות התא.
  3. חזר העובר על ידי ניתוח קיסרי.
    1. מניחים חיה במצב שכיבה ולחטא פרווה עם אתנול 70%. שימוש במלקחיים כירורגיים מספריים לעשות חתך בעור בצורת V של כ -8 ס"מ בבטן התחתונה מעל הרחם. לחתוך עור רק עם פרווה, תוך שמירה על שלמות קירות שרירים.
    2. שימוש במלקחיים ומספריים טריים לחתוך את השרירים ואת הדופן השרירי בטן להיכנס הצפק.
    3. זהה את הרחם ב הצפק האחורי התחתון. הסר את הרחם ידי הפרדה חדה מן הרקמות הסובבות.
    4. שטפו את הרחם עם העוברים עם 1x PBS והמקום סטרילי ב PBS 1x קר כקרח.
    5. השתמש במספרי קנס שקצו כדי לפתוח את קירות הרחם לשחרר העוברים על ידי עובר תחת מיקרוסקופ לנתיחה (גדלת 3X, איור 1B). השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את הקליפות העובריות (
    6. בדוק את השלב ההתפתחותי הנכון על ידי אטלס של מערכת העצבים עכברוש פיתוח 5. גודל העובר הנכון מוצג באיור 1 ב.
    7. בדוק בגיל המתאים עוד יותר על ידי נוכחות של תחילת היווצרות ספרתית forelimb חולדה (פל) כפי שמודגם באיור 1 א.
      ההערה: הגפיים האחוריים (HL) עדיין לא להראות הפרדת ספרות (איור 1B).
  4. לנתיחה, להעביר עוברים מנות ללא ציפוי פטרי מלא PBS 1x קר כקרח. בצע לנתיחה תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו (3X כדי 20X הגדלה) באמצעות מלקחיים בסדר autoclaved.
    הערה: צלחות פטרי למנוע התקשרות של רקמה אל פני שטח הצלחת כפי שעלול לקרות עם מנות תרבית תאי פלזמה מצופית. מחטי תיל טונגסטן חדדו או דומה הם גם מועילות עבור צעדים מסוימים של לנתיחה.
  5. הסר את עור ראש הגולגולת החל על intersection של telencephalon מתפתחות (אביב) diencephalon (DI) (איור 1B) על ידי משיכת זמנית anteriorly ו בדיעבד עם שני מלקחיים כדי לקבל גישה הצינור העצבי פיתוח (איור 1 ג).
  6. זהה את גבולות המוח התיכון למוח האחורי (MHB, ראש החץ השחור באיור 1 ב- D), הפרדת mesencephalon (MES) מן rhombencephalon. חותכים את rhombencephalon פשוט או מתחת (1D איור, חץ משולש) MHB.
    הערה: השטח תת עורית הנוספת בבית MHB מקלת הסרת עור מבלי לפגוע בצינור העצבי.
  7. לנתק את הקשר בין telencephalon / diencephalon בבסיס הגולגולת עם שלד הפנים (איור 1E). התוצאה היא האזור שכולל את telencephalon, diencephalon ואת mesencephalon (תל-DI-MES) (דמויות 1F-H).
  8. מעביר את גוש התל-DI-MES לתוך מדיום הרחבה על קרח. שמור את זה completאיליי מכוסה בינוני התרחבות צלחת פטרי ללא ציפוי. החזק את הבלוק על mesencephalon עם זוג מלקחיים כדי להימנע מלגעת telencephalon המכיל את SVZ קליפת המוח עם NSCs.
  9. חזור על שלבים 5.5 כדי 5.8 עם כל העוברים (איור 1F-H).
  10. עבר אחד TEL-DI-MES לחסום לתוך PBS 1x קר כקרח טרי. גזור לאורך הקו המקווקו mesencephalon הקדמית (איור 1F-H), הפרדת mesencephalon מן diencephalon, כפי שמוצג באיור 1 ט.
  11. הפרד את DI מהתל ידי חיתוך לאורך קווים מקווקווים באיור 1F. ראה telencephalon מבודד באיור 1J.
  12. פיצול שתי ההמיספרות telencephalic, חיתוך לאורך הקו המקווקו באיור 1J. התוצאה היא שתי ההמיספרות מופרדים כפי שמודגם באיור 1 יא.
    הערה: מחצית המוח השמאלית מוגדל באיור 1 ליטר.
  13. זהה את הכנופיה המדיאלייואיל הוד lionic (MGE, איור 2 א; *) ו יואיל הוד ganglionic לרוחב (LGE, איור 2 א; +) גלוי דרך interventriculare foramen בעתיד.
    1. בעזרת מלקחיים או מחט, לנתח לאורך קו ישר בצומת בין MGE ו- LGE ואת הקליפה הקדמית (נמלי CTX, איור 2B). חותכים קו ישר דרך הקורטקס, ההיפוקמפוס (ירך) ואת מקלעת דמית (CP). זה מפריד את הקליפה הקדמית כולל נורת חוש הריח (OB) מן תואיל הוד ganglionic (GE, דמויות 2B, C).
  14. חותכי קו ישר שני בצומת של רוממות ganglionic הזנב (CGE, האיור 2C, ד) ואת הקליפה האחורית (איור 2 ג), שוב חיתוך דרך קליפת מוח, ההיפוקמפוס מקלעת דמתה.
  15. ומיישרים את telencephalon. להסיר לחלוטין את בקוטב האחורי ואת פקעת ההרחה (איור 2 ד). לזהותאמרת קליפת המוח המכילה את ההיפוקמפוס המקלעת דמתה (איור 2 ג), כהגדרתה למעלה 6,7.
    הערה: יש ההיפוקמפוס neuroepithelium רזה יותר בקליפת המוח. המחסום מכיל כלי אדום.
    1. הפרד את שולי קליפת מוח מהקורטקס, עוזב את גודל קליפת זהה לגודל של יואיל הוד ganglionic (איור 2 ד). התוצאה היא גוש של הקורטקס (רקמת היעד) ואת תואיל הוד ganglionic (GE, איור 2 ד).
  16. תהפוך את הגוש-GE הקליפה עם חדרית (פנימי) לצד אל פני שטח הצלחת.
    הערה: המשטח החיצוני של האונה יתמודד הנסיין (האיור 2E). על פני השטח החיצוניים הם קרומי מוח הדם המכיל כלי הדם (איור 2E).
    1. הצמד את GE אל פני השטח צלחת ביד שמאל ואת לקלף את קרומי המוח את עם זוג מלקחיים בפינה הימנית (הדומיננטית) יד (איור 2F הערה: זהו הצעד התובעני ביותר מהבחינה הטכנית בגלל קרומי המוח בחום לדבוק הקורטקס. הפרדת קרומי המוח מהקורטקס הוא הקל על ידי חיתוך בקו ישר לחלוטין (לא משוננת) ב 5.13.1 צעדים 5.14.
  17. חזור על שלבים 5.12 כדי 5.16 עבור חצי הכדור השני וכל העוברים. חותך את הקליפה לאורך LGE ב מרחק של מחצית הקוטר הראשי של LGE (האיור 2G, 2H). קליפת המוח הגזורה משתרעת על שטח של 1.2 מ"מ x 2.4 מ"מ (2H איור) וכוללת שכבת SVZ / נבטיה עם NSCs.

6. הכנת תרבויות explant

  1. חותך את הקליפה לתוך explants של פחות מ -400 מיקרומטר קוטר (איור 2I). להשתמש ברשת 400 מיקרומטר (משלים איור 1) ממוקם מתחת צלחת פטרי לנתיחה לעיון (איור 2H ו 2I). להעביר את כל explants לתוך צלחת פטרי טריה עם שיתוף קרחבינוני הרחבת ld.
  2. הסר את פיברונקטין מצלחת בתרבית רקמה (שלב 4.4). אפשר לו להתייבש. הוסף 1 מ"ל של מדיום הרחבת קר במרכז צלחת 35 מ"מ עם מימד רשת של 10 מ"מ x 10 מ"מ (איור 3). אפשר המדיום כדי ליצור טיפה כדורית (איור 3).
  3. הכנס עד 8 explants למרכז של ירידה. את explants צריך להיות ממוקם באופן אידיאלי על הרשת עם לפחות מרחק 3 מ"מ בין אחד לשני לניתוח ההגירה (ראה סעיף 8).
  4. דגירת הצלחת כ 1 hr חממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 21% O 2, CO 5% 2) עבור התקשרות של explants. אפשר explants להתיישב ולצרף אל פני השטח מצופה פיברונקטין. אין לטלטל את המנה, מאז explants יכול לנתק ולעבור מחוץ למרכז הרשת האופטימלית.
  5. לאחר 1 דגירת שעה (37 ° C, 21% O 2, 5% CO 2), למלא את המנה כדי בהיקף כולל של מדיום הרחבה 2 מיליליטר בתוספת f הצמיחהשחקנים או חומרים של עניין לבדוק דגירה.
    הערה: גם עיכול אנזימטי, ולא בסרום או צנטריפוגה נחוץ להכנת explant. זה הוא אופטימלי עבור שלמות התא.

הכנת 7. התרבות תא בודד המל"ל

  1. לחמם את הרחבה ובינוניים passaging על 37 מעלות צלזיוס.
  2. מעבירים את חתיכות קליפת גזור (משלב 5.17) לתוך צינור 15 מ"ל עם מדיום הרחבת קר (צינורית). צנטריפוגה חתיכות הקליפה במשך 5 דקות ב 1200 x גרם. לשאוב supernatant. הוספת 200 בינוני הרחבה מחוממת מראש μl כדי resuspend את חתיכות הקליפה.
  3. הוסף 700 μl של המדיום passaging מחומם מראש ל שפופרת 15 מ"ל עם קצה P1,000 (צינורית). בעדינות resuspend הגלולה. הניחו את קצה בתחתית הצינור 15 מ"ל. בעדינות ולאט לאט לנתק את פיסות הרקמה על ידי שאיבת שלוש פעמים עם קצה P1,000.
    הערה: passaging בינוני קדם הפרדת התא נדרש, כדי למנוע את השימוש של אנזימים.
  4. אפשר הצינור לשבת במשך 30 עד 60 שניות עבור גדול חתיכות undissociated (כבדות) כדי ליישב בתחתית. תאים ניתקים יחיד יישארו supernatant. העבר על 700 μl של supernatant לצינור 15 מיליליטר טרי (צינור B).
  5. חזור על שלבי 7.3 ו -7.4 לנתק את החתיכות הגדולות.
  6. חזור על שלבי 7.3 ו -7.4 בשנית כדי לנתק את החתיכות הגדולות. להעביר את כל supernatant אל צינור 15 מיליליטר הטרי (צינור B).
  7. הוסף בינוני הרחבה כדי בהיקף כולל של 5 מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. להעריך תאים מתים על ידי מכתים trypan הכחול.
    הערה: NSCs הקטן לסבול את הצעדים 7.2 כדי 7.6 טוב יותר מאשר תאים גדולים. מתוך 10 עוברים לצפות על 4 x 10 6 תאים עם 10 תאים מתים%.
  8. להרחבה של NSCs, צלחת 1.5 x 10 6 תאים לכל 10 ס"מ צלחת בתרבית רקמה מצופה פיברונקטין בנפח של מדיום הרחבת 8 מ"ל. להרחבה סטנדרטית, להוסיף 8 μl של מניית 1,000x rhFGF2. הוסף 8 μl rhFGF2 כל יום לשנות אותיdia פעם ביומיים.
    הערה: קליפת המוח בשלב התפתחותי זה מכיל רוב NSCs ורק מיעוט של תאים מובחנים. תאי המיעוט המובחנים אינם מגיבים לטיפול-rhFGF2 ולמות במהלך התרבות הרחבה.
  9. המעבר הרחיב NSCs ב 60% מפגש.
    1. כדי NSCs מעבר, להסיר בינוני הרחבה. לשטוף את התאים במהירות שלוש פעמים עם המדיום passaging 5 מ"ל. חכה 2 - 4 דקות. ללא Ca 2 + ו Mg 2 + התאים לנתק לאט מפני השטח, עיגול כלפי מעלה. ודא ניתוק של התאים תחת המיקרוסקופ שלב. חכו עוד כמה דקות, אם יש צורך, עד ניתוק חזותי מפני השטח הוא ציין.
      הערה: תאים בודדים תנתק לחלוטין, אבל רוב התאים עדיין ידבקו אל פני שטח הצלחת. משך דרושי ניתוק תלוי משך ציפוי פיברונקטין. ציפוי פיברונקטין קצר (12 שעות או פחות) התוצאה היא ניתוק התא מהר. בניסויים ארוכים יותר (>; 1 בשבוע) פיברונקטין ציפוי של יותר מ -24 שעות מומלץ.
  10. השתמש פיפטה 10 מ"ל כדי לנתק את התאים בעדינות מפני השטח. אסוף מדיום passaging 5 מיליליטר עם תאים ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר טרי. חזור עם מדיום 5 מיליליטר של passaging נוסף.
  11. לנתק את התאים בצינור 15 מ"ל על ידי pipetting למעלה ולמטה שלוש פעמים, הצבת 10 מ"ל pipet בתחתית של התחתית. לסובב את הצינור במשך 15 דקות ב 1200 XG בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו resuspend גלולה במדיום הרחבת 2 מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. השתמש כחול trypan להעריך תאים מתים.
    הערה: לאחר התרחבות 60 מפגש%, מצפה 4 - 5 x 10 6 תאים עם ספירת תאים מתה בסביבות 10%.
  12. פלייט 8 x 10 5 תאים לכל צלחת 10 ס"מ עבור פסקאות נוספות.

8. הערכת הגירה

  1. להערכת הגירה, לבודד explants פי זרע סעיף 5. את explantsמנות 35 לרשת מ"מ. שעה אחת לאחר ציפוי, להוסיף FGF2 (rhFGF2). מניחים את הכלים בתוך 37 ° C חממה עבור 2 ימים.
    הערה: מצורף explant אופטימלי, למנוע העברת המנות.
  2. הסר בינוני ב -1,000 טיפ μl. הוסף 2 מ"ל של מדיום הרחבת ב -1,000 טיפ μl החל המעגל הפנימי (איור 3). פעולה זו מפחיתה מתח הפנים על explants.
  3. הוסף גורמי גדילה לבד או בשילוב כנדרש לצורך הניסוי. השתמש FGF2 / BMP4 / TGFβ1 כביקורת חיובית. הערה: בניסוי זה, 2 FGF2 μl לכל צלחת 35 מ"מ, 2 μl BMP4 ו -4 μl TGFβ1 נוספו לבד או ביחד (איור 5).
    1. להוסיף גורמים נוספים ו / או חומרים לבדיקה. שמור מנות שוב ללא שינוי במשך 2 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. קח צילומי explants על מיקרוסקופ הפוכה.
    הערה: explants Living להניב תמונות בניגוד השלב טובות יותר מאשר תאים קבועים. שניהם יכולים לשמש.
  5. עבור הגירההערכה, להשתמש בתוכנת גרפיקה המאפשרת מדידות פיקסל (למשל, פיג'י 8).
  6. מדוד את רשת הצלחת של מרחק 500 מיקרומטר בפיקסלים ולהשתמש בו כנקודת התייחסות פנימית.
  7. הגדר את המרכז של explant כנקודת התחלת הגירה. למדוד את המרחק בין המרכז של explant והקבוצה החיצונית של 10 תאים.
    הערה: כל התאים נודדים centrifugally מן explant. הם ספונטני ליצור גיליון בשולי בנסיבות שנבדקו (איור 5).

9. הערכת פלישה

  1. כן בתרבית רקמה מצופה פיברונקטין 24 גם צלחות פי פרוטוקול סעיף 4.
  2. מניח 300 μl של מדיום הרחבה חם לתוך הבאר העליונה של תאי פלישת תא. דגירה לתאי למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. סור בינוני ההרחבה מהבאר העליונה ומקום הקאמרי בוידן לתוך צלחת 24 גם המצופית.
  4. הוסף 500 μl של מדיום הרחבה חם עם 0.5 μl של rhFGF2 ו -0.5 μl rhBMP4 לתחתי היטב.
  5. NSCs מעבר ולספור כמתואר בסעיף 7. מעברים 1 עד 4 מתאימים.
  6. פלייט 5 x 10 5 תאים בנפח של 300 μl של מדיום הרחבה חם עם 0.3 μl של rhFGF2 ו 0.3 μl של rhBMP4 בבאר העליונה של חדר בוידן.
  7. תרבות NSCs זרעה למשך 24 שעות.
  8. להוסיף גורמים נוספים ו / או חומרים לבדיקה לתא ותרבות התאים למשך 48 אחר שעה.
    הערה: אם התאים פולשניים, הם יעברו מלמעלה גם דרך שכבת קרום המרתף אל קרקעית הבאר. תאים פולשים ייצמדו התחתון של החדר בוידן.
  9. פעל על פי פרוטוקול שסיפק היצרן. השתמש צמר גפן (כלול בערכת assay פלישה) כדי להסיר את התאים הלא-פולשני בבאר העליונה על ידי ניקוי פעמים.
  10. הסר בינוני מבארות ולהוסיף 500 בינוני הרחבת μl עםכתם הממברנה עבור תאי חיים ועם DAPI לצבוע הגרעיני על הבארות.
  11. דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    הערה: הצבע ישתלב הממברנה הגרעין של התאים פולשניים, בהתאמה, אופטימלית עבור להדמיה 8. אפשרות: צבע קרום פלזמה השמט אם immunocytochemistry ססגוניות מתוכנן.
  12. סור הבינוני עם הצבעים ולשטוף פעמים עם מדיום רחב. דמיינו ולספור תאים פולשני עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כפי שהוכח בעבר 8.
    הערה: כמה תאי פולשני ייתכן מנותק מהחלק התחתון של החדר ואת ירדו אל פני השטח היטב מתחת למקום שבו הם מקלים על המשטח המצופה. עבור ניתוח מלא שכלל את התאים על פני השטח היטב.
  13. סור הבינוני ולתקן את תאי% PFA 4 טריים קר קרח למשך 10 דקות. לשטוף 3x עם 1x PBS. בצע immunocytochemistry על תאי פולשני, כפי שתואר לעיל 8-10.

    14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מערכת מודל EMT זה מבוסס על בידוד סטנדרטי של NSCs הן תאים בודדים או כמו explants מאזור מסוים של הצינור העצבי בפיתוח, הקורטקס (איורים 1 ו -2). לקבלת הערכה כמותית, explants היו זורעים ממש במרכז של צלחת תרבות הרשת 500 מיקרומטר (איור 3). Explants מהקורטקס המרכזי נחשף הראשון FGF2 במשך ימים, ואחריו ימים נוספים, שילובים שונים של גורמי גדילה (טבלה 1). התחלנו עם הקליפה אשר היא גדול יותר מאשר באזורים אחרים של הצינור העצבי המתפתח. הבחנו כי explants רק בתרבית BMP4 הראה תגובה נודדת (טבלת 1 משלים איור 2).

podoplanin הבא (PDPN) ביטוי נותח בתנאים מוגדרים. PDPN הוא הטרנסממברני שלחלבון ialomucin דמוי נקשר עם פלישת הסרטן מרובה 11,12 וגם NSCs 8. חלקם של תאי מבטאי PDPN מוגבר גליומות בדרגה גבוהה 13. PDPN קשורה גם הישרדות עניה בחולי גליובלסטומה 14. יתר על כן, PDPN הוכח להיות סמן של התקדמות ממאיר גידולים מרובים כולל סרטן השד, הריאות, המעי הגס קרצינומות 15,16. PDPN באה לידי ביטוי הוא פולשניות כמו גם נודד 8 NSCs. שימוש בפרוטוקול לעיל, ביטוי PDPN הושווה שליטה, FGF2 בלבד, explants חשוף TGFβ1 ו BMP4 לבד או בצירופים שונים ביניהם. ביטוי PDPN זוהה בכל BMP4 ו TGFβ1 / explants שטופלו BMP4. בניגוד לכך, לא PDPN נצפתה explants שליטה FGF2 לבד או explants עם TGFβ1 לבד (לוח 2 ואיור 4). בנוסף תאים עם פנוטיפ נודד היו מושרה BMP4 ו TGFβ1 / BMP4-explants החשוף, ואילו explants המלא (רק FGF2) ו TGFβ1 לבד לא להראות תאים נודדים (טבלה 1). התצפית של תאים נודדים מספקת עלות נמוכה, הערכה איכותנית ישר קדימה.

יתר על כן, בדקנו את אינדוקצית תגובת EMT נדידה של כמה אזורים של הצינור העצבי המתפתח BMP4 (טבלה 2). 400 מיקרומטר explants הוכן מ הקורטקס, הקליפה האחורית (בקוטב אחורי שכותרתו), את MGE ואת mesencephalon, כמצוין באיור 1. כל explants נחשף FGF2 במשך ימים, ואחריו ימי FGF2 עם BMP4 . גירה הוגדרה על ידי הופעתו של תאים נודדים שטוחים עם קצה מוביל ונגרר (איור 5 משלי איור 2). אינדוקציה חזקה של תאים נודדים מהקורטקס האחורי ומענה ביניים מן MGE ואת mesגזע המוח נצפה (טבלה 2). 145 מתוך 146 explants של המוח הישן המרכזי הראו תגובה נודדים FGF2 / BMP4. לפיכך, הקורטקס הפגינו אינדוקציה החזקה ביותר של תאי הנדידה של כל explants נבדק (טבלה 2). השמטה של BMP4 ולבטל כל תגובה נודדת (טבלה 1 ו -2, ו מידע לא מוצג).

לקבלת הערכה כמותית של עצמה גורמת גדילה, מרחק הגירה נמדד explants בתרבית גורמי גדילה מרובות. Explants היה בתרבית כנ"ל לימי FGF2, אז במשך ימים נוספים FGF2 ללא גורמים (שליטה) או BMP4 יחיד או בשילוב TGFβ1. ב explants המלא בריבוי חזק נצפה בתגובת FGF2, כצפוי. Explants הם נגזרים SVZ קליפת המוח ומכיל על NSCs חלק גדול אשר ידועים להתרבות בתגובת FGF2 17. השליטה ceLLS הגיע 689 ± 14, תאי TGFβ1 582 ± 49 מיקרומטר (איור 5.). BMP4-קבוצת מנהלי מרחק הגירה ממוצעת של 935 ± 91 מיקרומטר. בהשוואה את TGFβ1 / BMP4-התאים הגרו משמעותי נוסף, כדי 1,150 ± 23 מיקרומטר (איור 5). התוצאות מראות כי BMP4 הוא גרימת הגירה NSCs חשוף FGF2. הגירה זו יכולה להיות עוד יותר משופרת על ידי TGFβ1. השילוב של FGF2, BMP4 ו TGFβ1 לכן הדרך היעילה ביותר כדי לגרום הגירה. לסיכום, מערכת מודל תרבית תאים מאפשרת הן איכותית וכן הערכת הגירה כמותית.

EMT נקשר גורמי שעתוק (TFS), כגון Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, Twist1, Twist2 במערכות שונות כולל סרטן אפיתל, כגון סרטן השד, סרטן המעי הגס, סרטן הריאות וגם במוח גידולים 1,18. אנחנו שהמודעה בעבר הראו כי FGF2 ו BMP2 או BMP4 יכול לגרום Snail1 ו Snail2 8,9. שימוש במערכת מעל חקרנו את רמות הביטוי של TFS EMT האחר הקשורות. אין שינויים בביטוי Twist1 ניתן היה לזהות; עם Twist1 להיות ברמות ביטוי נמוכות במהלך חשיפת FGF2 (מידע לא מוצג). במודל תרבית תאים הגברת הביטוי של Zeb1 ו Zeb2 במהלך FGF2-חשיפה של Twist2 במהלך FGF2 / BMP4-חשיפה נצפתה (איור 6).

NSCs ידוע לתרום אוכלוסיית תאי מבשר oligodendrocyte (OPCs) 8,19,20. כמה שורות של ראיות מצביעות על כך NSCs וב OPCs מסוים עשוי להיות התא ממוצא עבור גליומות 21,22. כדי לאפיין את דגם הנ"ל נוסף, חקרנו את הביטוי של סמני OPC. הבחנו כי NSCs חשוף FGF2 הפגינו ביטוי שיתוף של Olig2 / Nestinד Sox10 / Nestin בלמעלה מ -90% (איור 7). תצפית זו ממחישה כי NSCs להראות OPC-תכונות במערכת שלנו. אכן, OPC-תכונות בקורלציה עם הגברת הביטוי של Zeb'1 ו Zeb'2 (איורים 6 ו -7). התוצאות מראות כי הרחבת FGF2 מסיק זהות OPC, כפי שניתן לראות ע"י Olig2 ו Sox10, בעוד באותו הזמן היוזם ראשון זב מבוסס מדרגות EMT.

איור 1
איור 1: העובר ציון תקן המוח הקדמי Dissection בידוד המל"ל אינדוקצית EMT. (א) שמאל forelimb של העובר E14.5 עכברוש לאחר ניתוח קיסרי. כל ספרת איבר הקדמית מסומנת עם קצה חץ שחור. הערת היווצרות הספרות החל אופיינית E14.5. (ב) העובר E14.5 עכברוש לאחר הסרת גוף. שימו לב סולמית (#) על הגב diencephalon which הוא אידיאלי להתחיל הסרת העור / הגולגולת Anlage. (ג) עור / הגולגולת כבר בעיקר הסיר. הגבול בין העור שהוסר unremoved מסומן עם שני ראשי חץ משולשים. העור יכול להיות קלופים anteriorly מהחץ הקדמי בדיעבד מהחץ האחורי. (ד) עור / הגולגולת עכשיו נמחק לחלוטין. הערת החריץ של גבול המוח התיכון למוח האחורי (חץ) ואת לחתוך רק caudally אליו, המסומנים ראש חץ. (E) בלוק telencephalon-diencephalon-mesencephalon (תל-DI-MES) מוסר מהשאר העובר . (F) נוף Superior של גוש תל-DI-MES. גולגולתי נותר. (G) נוף אלכסוני מלמעלה. (H) נוף הנחות של גוש תל-DI-MES. (ט) mesencephalon וחלק diencephalon מופרדים telencephalon עם החלק הקדמי של diencephalon. למעלה: מבט Anterior של שניהם שלפוחית ​​telencephalic. תחתון: Right לרוחב לאור mesencephalon, העליון פונה cranially (J) למעלה:. שניהם שלפוחית ​​telencephalic ללא diencephalon. נוף נח להמחיש הסרה מלאה של diencephalon. אסטריסק מתאר MGE. תחתון:. חלק קדמי של diencephalon (K) למעלה: שניהם ההמיספרות מופרדים בקע המיספרה. אונה שמאלית על צד שמאל. אסטריסק מתאר MGE. סימן פלוס מתאר LGE. (L) הגדלה של האונה השמאלית עם נוף החציוני. Right פונה cranially, עזב caudally, העליון הוא הגבי, בתחתית הגחון, בהתאמה. כוכבית (*) ממוקמת MGE. סימן פלוס (+) ממוקם LGE. ch, שולי קליפת המוח; FL, Forelimb; די, diencephalon; mes, mesencephalon; MHB, גבול מוח תיכון למוח אחורי; HL, גפיים אחוריים; LGE, רוממות ganglionic לרוחב; MGE, רוממות ganglionic המדיאלי; ob, נורת ריח; מחשב, קליפה אחורית; רו, rhombencephalon; טל, telencephalon. הרשת על כל תמונה מציגה 2 מ"מ קווים עבים עם ארבע לצומת עם קווים דקים מדי400 מיקרומטר. סרגל קנה מידה על כל התמונות:. 2 מ"מ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מתוקנן לנתיחה SVZ קורטיקלי בידוד המל"ל אינדוקציה EMT. (א) להציג חציון של ההמיספרה השמאלית. דרך הנקב של Monro MGE ו- LGE גלויים, בסימן כוכבית ואת הסימן פלוס. (ב) פקעת ההרחה יוסר רק cranially של-LGE MGE. (ג) בקוטב האחורי של קליפת מוסר ממש מאחורי CGE . (ד) למעלה: אמרת קליפת המוח מופרדת הקורטקס. משמאל: בקוטב אחורי. תיכון: מורכב המכיל את החלק המרכזי של הקורטקס ואת גוש CGE-LGE-MGE. MGE ו- LGE הפנים ימינה. מימין: bul הרחהב. (E) בלוק CGE-LGE-MGE-קורטקס הוא התהפך אופקי. עכשיו את המשטח החיצוני של telencephalon מתמודד עם מיקרוסקופ. MGE ו- LGE כעת פנים אל השמאל. (ו) קרומי המוח אדמדם יוסרו מן הקורטקס שקוף בהיר. בלוק CGE-MGE-LGE-CTX עכשיו הוא התהפך חזרה אופקי עבור לשלב הבא. (G, H) ההליך אותו חוזר על עצמו עם האונה הימנית. קליפת המוח המרכזי מופרד מן הבלוק CGE-MGE-LGE. שים לב שקיים אזור קליפת ביניים נותר בחזית בלוק CGE-MGE-LGE, מסומן עם שני חצים. עובי קליפת ביניים זו תואמת מחצית הקוטר של LGE. הקו המקווקו המייצג את הגבול בין LGE-CGE ואת קליפת המוח. (I) קליפת המוח המרכזי מתחלק explants של פחות מ -400 מיקרומטר קוטר. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ; הרשת על כל תמונה מציגה 2 מ"מ קווים עבים עם ארבעה צמתים (קווים דקים) כל 400 מיקרומטר. כוכבית (*) ממוקםt MGE. סימן פלוס (+) ממוקם LGE. קיצורים: נמלה-CTX, קליפה קדמית; CEN-CTX, קליפה מרכזית; CGE, רוממות ganglionic זנב; ch, שולי קליפת המוח; cp, מקלעת דמתה עין; CTX, קליפה; LGE, רוממות ganglionic לרוחב; גברים, קרומי המוח; MGE, רוממות ganglionic המדיאלי; ob, נורת ריח; מחשב, קליפה אחורית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. Explant מתזמן על 35 מ"מ Grid Cell תרבות מנות מקום 1 מ"ל של מדיום הרחבת במרכז צלחת רשת 500 מיקרומטר. הירידה מוכל על שפת הרשת (חיצים קטנים). explants מקום וממש במרכז של ירידה של 1 מ"ל. אם explants מפוזרים מחוץ לרשת, SWIRL המנה בתנועה איטית מעגלית ואת explants תעבור למרכז על ידי כוח צנטריפטלי. הערה: את explants הם רק בקושי נראה לפי העין (ראשי חץ שחור). סרגל קנה מידה: 35 מ"מ.

איור 4
איור 4:. PDPN מושרה נוכחות של 4 BMP Explants היו בתרבית פי סעיף פרוטוקול 8 (2 ימים FGF2 בלבד, לאחר מכן על ידי FGF2 עם גורמים כפי שצוין). בקרה (א) (FGF2 לבד) ו TGFβ1 (C) explants לא מכילים תאי PDPN חיוביים (ירוק). גרעיני מגואלות DAPI (כחול). BMP4 (ב ') TGFβ1 / BMP4 (D) explants הראו שיעור גבוה של תאים PDPN חיובי. מרכז explant הוא בצד שמאל, הפריפריה בצד ימין. הערה: תאי PDPN החיוביים היו בעיקר founד בפריפריה ולא במרכז של explant. את explants TGFβ1 / BMP4 הכלול להחמיא, יותר פירט תאים PDPN חיובי. (E) אחוז התאים PDPN-חיובי explants בתנאים שונים מיוצג. מלא TGFβ1 הן שונים באופן מהותי מן התנאים עם BMP4. אמצעים מוצגים ± SEM. שליטה לעומת TGFβ1 אינה משמעותית (NS). מלא TGFβ1 לעומת BMP4: p <0.0001 (***). TGFβ1 לעומת TGFβ1 / BMP4: p <0.0001 (***). BMP4 לעומת TGFβ1 + BMP4 אינו משמעותי: p = 0.0981 (NS). שליטה לעומת TGFβ1 + BMP4: p <0.0001 (***). סרגל קנה מידה עבור כל התמונות, כפי שמודגם (א):. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5 איור 5: הערכת הגירה כמוני. BMP 4 ו TGF בטא 1 התכנית השפעה נוספת על נדידת תאים. Explants היו בתרבית לפי סעיף פרוטוקול 8. (א) explant הבקרה. (ב) explant ב BMP4 לבד. (C) explant ב TGFβ1 לבד. (ד) explant ב שילוב של TGFβ1 ו BMP4. (E) מרחק הגירה מיקרומטר. הגריד 500 מיקרומטר שימש כנקודת התייחסות. השליטה ואת explants TGFβ1 מגלות התפשטות חזקה בקוטר explant גדול יותר בתנאים האחרים. אמצעים מוצגים ± SEM. ראוי לציין, כי explants BMP4 ו TGFβ1 / BMP4 חלקית לפורר את הליבה explant ותאי להגר ממנה centrifugally. שליטה לעומת TGFβ1 אינה משמעותית (NS). לעומת TGFβ1BMP4: p = 0.0353 (*). שליטה לעומת BMP4: p = 0.0351 (*). + BMP4 BMP4 לעומת TGFβ1: p = 0.0372 (*). שליטה לעומת TGFβ1 + BMP4: p <0.0001 (***). סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. מרכז explant מסומן בסימן פלוס (+). הקצה החיצוני של תאים נודדים מסומן בחץ משולש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6:.. Upregulation של גורמי שעתוק הקשורות EMT ידי qRT-PCR EMT צמודה גורמי שעתוק מפתח של Zeb- טוויסט-המשפחה (A, B) Zeb'1 ו Zeb'2 היו שהוגברו במהלך השלב הראשון של חשיפת FGF2. (C) Twist'2 היה שהוגבר במהלך sECONד שלב של FGF2 / BMP4-חשיפה. רמות הביטוי היחסי מבוסס על qRT-PCR מוצגים (n = 2). רמות ה- mRNA היו מנורמלות GAPDH. אמצעים מוצגים ± SEM. ביום 0 התקופה FGF2 mRNA היה לקצור, mRNA נוסף היה לקצור לאחר ארבעה ימים FGF2, אז אחרי יום אחד ב FGF2 / BMP4 Zeb'1:. שליטה מול FGF2, p = 0.0002 Zeb'2:. בקרת לעומת FGF2, p = 0.0206 Twist'2:. בקרת vs. FGF2 + BMP4, p = 0.003.

איור 7
איור 7:. להראות NSCs מאפייני OPC במערכת דגם NSCs נותקו מן המוח הישן המרכזי ותרבותיים כמו תאים בודדים בנוכחות FGF2 (לפי סעיף 5). לאחר 8 ד בתרבות (מעבר, לאחר 4 ד לפי סעיף 7.9) התאים יצרו מושבות המל"ל קטנות היו מוכתמים עבור Olig2 (אדום, בסי, C), Sox10 (אדום, ב E, F) Nestin (ירוק, A, C, D, F). שיעור גבוה של תאים שיתוף הביע Olig2 / Nestin (AC) ו Sox10 / Nestin (DF). (ז) Co-ביטוי Olig2 / Nestin ו Sox10 / Nestin מוצג באחוזים של כל התאים. אמצעים מוצגים ± SEM. סרגל קנה מידה עבור כל התמונות כפי שמודגם (א) ו- (ד):. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מַצָב Explants סה"כ (הקורטקס) Explants עם תגובה נודדת % Explants עם ביטוי Podoplanin %
לִשְׁלוֹט 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

טבלה 1. BMP 4 ואת שילוב של TGF בטא 1 עם BMP 4 מביא לתגובת נודדות יציבה. Explants מהקורטקס המרכזי היו מתוחזקים במדיום הרחבה FGF2 עבור סכום כולל של ארבעה ימים. אחרי הראשוןיומיים, explants או המשיכו לקבל FGF2 לבד (שליטה) או FGF2 ובנוסף TGFβ1, BMP4 או TGFβ1 / BMP4 כמו שילוב. explants בקרה ואת TGFβ1- עשה לא להראות תגובה נודדת ולא ביטוי PDPN. BMP4 ו TGFβ1 / BMP4 המושרה שני תאים נודדים כמו גם ביטוי PDPN בכל explants.

אזור explants סה"כ Explants עם תגובה נודדת FGF2 / BMP4 %
קליפה מרכזית 146 145 99.3
הקורטקס האחורי 52 48 92.0
MGE 56 29 51.7
mesencephalon 53 28 52.8

טבלה 2. הקורטקס מציג את ההגירה החזקה ביותר בתגובה FGF 2 / BMP 4 Explants הוכנו מאזורים שונים של הצינור העצבי E14.5 עכברוש פיתוח:. הקורטקס, קליפת האחורי, רוממות ganglionic המדיאלי (MGE) ואת mesencephalon. כל explants היו בתרבית זהה FGF2 / BMP4 (סעיף 8). Explants מטופלים ללא BMP4 לא הראה שום תגובה נודדת (מידע לא מוצג). כל explants הוקרן מראה של כל תאים נודדים לכל explant. כל האיזורים הצליחו להגיב FGF2 עם BMP4 עם הגירה. קליפת המוח המרכזית, לעומת זאת, הראתה את התגובה החזקה ביותר. שים לב BMP4 נדרשה תניע כל תאים נודדים. Explants בתרבית FGF2 לבד הראה התפשטות אבל לאהֲגִירָה; ואין תאים נודדים שטוח נצפו FGF2 לבד (טבלה 1 משלים איור 2).

Supp איור 1
איור 1. משלים 400 מיקרומטר רשת קובץ. הקובץ לרשת עשוי להיות מודפס ומשומש כהפניה במהלך השלבים לנתיחה לעיל כפי שמוצג איורי 1 ו -2. צומת הגדולים לייצג 2 מ"מ עם 400 מיקרומטר מחוזות. אנא לחץ כאן כדי להוריד גרסת PDF של נתון זה.

Supp איור 2
איור 2 משלים. BMP 4 -exposed Explants Show תאים נודדים שטוח. הגדלה של תאים שניתן לראות בתרשים 5. (א) ניתנת לשליטה (FGF2 לבד) ו- (ג) TGFβ1-explants הפגינו חלוקת התא חזק עם תאים מעוגלים קטנים. (ב) BMP4- ו (ד) TGFβ1 / BMP4-explants הראה תאי מאורכים שטוחים עקבי. סרגל קנה מידה עבור כל התמונות, כפי שמודגם (א):. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 3 משלים. סיכום של במבחנת מערכת מודל לחקירת EMT. הקורטקס עכברוש E14.5 מכיל את SVZ המל"ל המכיל. קליפת המוח המרכזי הוא או used כמו חתיכות explant או תאים בודדים. חתיכות explant יותר נוחות לניתוח הגירה כמותית (סעיף 8). תאים בודדים מתאימים לניתוח איכותי, כגון גן או ניתוח חלבון (סעיף 9.13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה מערכת סטנדרטית עבור NSCs ניצול ניתוח EMT מתואר (שהעיקריים בהם פורטו משלים איור 3). הסטנדרטיזציה מבטיח שחזור (טבלה 1 ו -2). NSCs נגזרת הקליפה בפיתוח, רקמה שבדרך כלל אינו עוברת EMT. זהו יתרון לניתוח צעדים מוקדם EMT. צעדים ראשוניים EMT לא ניתן ללמוד כראוי בתאי גידול שהצטברו שינויים גנטיים וייתכן שכבר אימצו תכונות EMT. יתר על כן, דגימות גידול ראשוניות אינן אידיאליות להבין EMT שכן רוב הגידולים הממאירים הטרוגנית הם המכיל שני תאים פולשנית ולא פולשנית. הפרוטוקול המובא מספק לחוקרי EMT עם מודל רומן ללמוד צעדים הסטאז 'ראשונים EMT. כאן אנו מראים כי מעוררי EMT מפתח של הזב טוויסט המשפחה מופעלים ברצף: בשלב הראשון Zeb1 ו Zeb2 הם שהוגברו, במהלך השלב השני Twist2 (Figurדואר 6). בעבר, היינו הראינו כי Snail1 כבר שהוגבר כמה שעות לאחר BMP4-חשיפת 8. גם אנחנו הראינו כי אפון-חשיפת BMP4 תאי גזע neuroepithelial מהקורטקס המרכזי להתמיין לתאי mesenchymal, חיוביים עבור יקטין שריר חלק (SMA) ו calponin 9. התוצאות הנ"ל להשלים את המחקר הקודם להוכיח כי כל שלושת רגולטורי EMT המפתח הידועים מעורבים במערכת. בנוסף, אנו ציינו כי TGFβ1 יכול להגביר את האפקט הנודד משמעותי של FGF2 / BMP4 לבד. תוצאות אלו מצביעות על הרשת בין FGF-, BMP- ו TGFβ-איתות במהלך אינדוקציה EMT.

השלבים הקריטיים ביותר עבור בידוד מוצלח של NSCs עבור EMT וניתוח הגירה הם: איתור נכון של הגיל העוברי, זיהוי ציוני דרך אנטומיים של העובר המתפתח, הכנה של תקשורת בתרבות הטריה (לפחות לילה) צלחות מצופות, שימוש במכשירי קנס שקצו ופרולכל דיסקציה של החלק המרכזי של קליפת המתפתחות יקיימו explants קליפת המוח.

הטכניקות המוצגות עשויות להיות מוגברת על ידי כמה שינויים. כפי שהוצע לעיל, explants המרובה הם מצופים על צלחת אחת עם רשת. להקרנה של תרכובות מרובות, לעומת זאת, זה יכול להיות יותר נוח למקם explants אחת בכל טוב של צלחת 96-היטב. יתר על כן, מערכת המודל יכולה להיות מעודנת לגילוי סמים בקנה מידה גדולה. כפי שתואר לעיל, PDPN הוא סמן ערך עבור תכונות נודדות החדשים שנרכשו מאז PDPN נמצא פולשנית NSCs 8. עיתונאי PDPN ניתן transfected ב NSCs נורמלי לפני הגיוס EMT. כתוצאה מכך PDPN לבטא בתאי יכול לשמש בקרה פנימית לטרנספורמציה התא מאז PDPN אינה מתבטאת NSCs נורמלי (איור 4 ולוח 1). מספר נוסף סמנים המל"ל זמינים, כגון Nestin, כי הם איבדו לאחר אינדוקציה EMT 8. כתוצאה מכך,הוא את המצב ההתחלתי, "הלא נודדות / לא פולשנית / Nestin +", ואת המצב הסופי, "נודדות / פולשנית / PDPN +", ניתן לנטר, המאפשרים גילוי תרופות אוטומטי. צלחות תרבית תאים גדולות עם בארות רבות (למשל, צלחות 96-היטב גדול) תא ראשוני ניתן זורע ומטופל בתרופות הוקמו או תרכובות ללא פונקציה ידועה. לפיכך, צלחות multiwell ניתן לסרוק באופן אוטומטי עבור ביטוי PDPN או סמני הגירה / פלישה אחרות. אם מעכב הוא המטרה העיקרית של המסך, היעלמותה של ביטוי PDPN יכולה לעזור לזהות תרכובות מעכבות רומן putatively מעניינות.

במהלך הבדיקה של חומר רומן explants לא יכול להראות הגירה ו / או explants עשויה לאסוף ולנתק מהצלחת. במצב זה, עדיף לשנות רק מחצית התקשורת בכל יום (במקום לשנות את פני תקשורת מלאות בכל יום אחר). פעולה זו מפחיתה את לחץ על ידי מתח פנים בעת החלפה עם תקשורת טריה. הexplants לא יכול לצרף לאחר הציפוי הראשוני. במצב זה, פיברונקטין צריך להיות במגע עם משטח הצלחת עבור h 36 לפחות. פיברונקטין המשמש לציפוי צריך להיות מוכן טרי ללא חשיפת צינורית פלסטיק במשך יותר מ -10 דקות מאז פיברונקטין עשויה להידבק הפלסטיק. יתר על כן, explants רשאית ליישב מחוץ לרשת. במצב זה, מומלץ לערבל את המנה בתנועה מעגלית איטית. זה מאפשר explants כדי למקם למרכז על ידי כוח צנטריפטלי (השווה איור 3).

יש עדויות מוצקות לכך גליומות נגזרות NSCs ו / או OPCs נגזר NSCs 23,24. כתוצאה מכך קבוצות אחרות הקימו מודלים של גידול גליומה על בסיס NSCs:. Sampetrean ואח NSCs מבודד Ink4 / ARF מחסר עכברים והכריחו ביטוי יתר של H-ראס 25. גידולים ממאירים בדרגה גבוהה הביאה שהראו התפשטות ופלישה לאחר ההשתלה 25. MCNeill et al. גם NSCs מבודד עכברים מהונדסים גנטית (RB1 floxed, NF1, קראס, PTEN לבד ובשילובים) 26. הגנים היו מומתים על ידי זיהום Cre-וירוס ואת NSCs הושתל 26. שני מערכות מודל אלה יש היתרון כי פלישה ניתן לנטר in vivo ותרופות אנטי-פלישה פוטנציאליות חדשות יכול להיבדק. החסרון העיקרי שלהם הוא כי תחילת הפלישה אינה מוגדרת היטב ולא ברור אם התאים מראים פלישת EMT-טיפוסי גליומה (גני EMT) או הגירה מקומית בלבד. בהמשך רק תרופה אחת יכולה להיבדק לכל בעל חיים ועל הניתוח דורש כמה שבועות. כדי לזהות תרופה אנטי-פלישת רומן, חברות תרופות צריכות (א) למסך כמה אלף תרכובות או יותר בו-זמנית, (ב) כדי לשכפל את הבדיקות ו- (ג) לנסות ריכוזי תרופה שונים. כדי להכין כמה אלפי חיות מושתלות, להתייחס אליהם עם תרופות שונות ולבסוף לבדוק תופעות ידי histochemical או פליטת אורניתוח הוא רב מאוד משאבים. הנה מערכת מודל NSC-רומן המבוסס על הפלישה הקשורות EMT מתואר המאפשר הקרנת יעילה וחסכונית של אלפי תרכובות.

למרות מודל זה מאפשר הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות, הוא פלטפורמת הקרנה ראשית בלבד. לאחר תרכובות של עניין מזוהים במודל זה, הם ידרשו אימות נוספת. בדיקות בשנת vivo הכרח פרמטרי בטיחות ויעילות עבור כל תרכובת זיהתה ומודלי השתלה כמתואר לעיל הופכים לחשובים 25,26. המודל מוגבל גם על ידי העובדה כי היא מבוססת על תאים מכרסמים. למרות המודל יכול לשמש כדי לחקור חולדה או עכבר EMT, לא ברור אם אותם המנגנונים נמצאים במקום בתאים אנושיים או אצל מטופל האדם. ניסויים נוספים נדרשים כדי לחקור אם NSCs אינם רק פולשני במבחנה, אך גם לאחר ההשתלה. כמה שורות של ראיות לתמוך את התפקיד של NSCsבמבנה גליומה. התקדמות גליומה נקשר הגנים הבאים: Tenascin C, Hey1, SPARC, Snail1 ו Snail2, FGFR +, BMPR1a, EGFR, PDGFRβ, Sox2, Podoplanin, Gli3 ו p75NGFR 8. כל הגנים האלה באים לידי ביטוי גם במהלך השינוי של NSCs נורמלי לא פולשנית לתאי mesenchymal פולשנית 8. בשעה ולעת עתה, לא ברור אם NSCs ניתן להפוך גידולים על ידי גורמי גדילה חיצוניים בלבד.

גידול-ייזום תאי גזע (טיקים) מגידולים שונים מבודדים ומשמשים כמודלים להבין התקדמות גידול 27. טיקים הם, לעומת זאת, אינם מתאימים להיות ניתוח EMT, מאז EMT עשה כבר להתרחש טיקים 27. כדי להבין מוקדם וכן צעדים מאוחר אינדוקצית EMT, אוכלוסייה של תאים הלא-ממאירה עיקרית היא זקוקות. באופן אידיאלי אוכלוסייה זו לא נועדה לעבור EMT מלכתחילה. זה היה הראה בעבר כי NSCs העוברי היו מועמדים מתאימים למטרה זו9,28. כלומר, הגירה ופלישה יכול להיגרם NSCs ידי FGF2 ו BMP4 9,28. הגירת FGF2 / הנגרמת BMP4 הייתה קשורה גני EMT הקשורות אחת, לעומת זאת, ראיות מלאות היו חסרות מאז זב טוויסט משפחות EMT מפתח לא נחקרו 8. התוצאות לעיל עולה כי שילוב ספציפי של ארבעה גורמים, FGF2, BMP4, TGFβ1 והאינסולין לגרום אינדוקצית EMT מאוד חזקה ומלאה, לא נצפו לפני. המחקר הנוכחי מדגים כי גני EMT מפתח של Zeb- טוויסט-משפחות גם הם שהוגברו. מחקר זה ולכן מספק את ההוכחה הראשונה לכך אין upregulation סלקטיבית של גנים בודדים, אבל התוצאות מראות כי כל משפחות EMT המפתח פעילות במערכת תרבית תאים המוצעת.

EMT גם נצפה סרטן אפיתל מחוץ למוח, כגון ריאות, שד, מעי גסים וסרטן קיבת 29. מספר דגמים ללמוד EMT נמצאים בשימוש עבור גידולים אלה 30-32, אשר מגיעים עם זאת, עם מגבלות משמעותיות: (א) השימוש של שורות תאים סרטניים שינו נושאת שינויים גנטיים אפיגנטיים מספר 33; לזיהוי מעכבים של EMT לשלבים מוקדמים של הסרטן, תאי סרטן בשלביו המאוחרים אינם מספיקים; (ב) תרבויות תלויות בסרום אשר מכילות גורמי גדילה מוגדרים שונים; זה הופך זיהוי של גורמים קריטיים מאוד קשה. יתר על כן, שחזור ניסוי נפגע מאז איכות סרום משתנית בין תצווה תצווה; (ג) הסרום מכיל מעכבי פעילות אנזימטית ואולי inactivating תרכובות אקסוגניים שימוש פוטנציאלי; (ד) הצורך של אנזימים עבור passaging התא שלו פוגעות מולקולות פני התא; (ה) כדי לזהות אגוניסטים EMT לקדם EMT פיזיולוגיים, תאים נורמליים יש צורך לבדוק אינדוקציה. מודלי תאים סרטניים אינם מספיקים כדי למצוא חומרים המקדמים התחדשות תאי גזע נורמלים.

הגירה נדרשה גם עבור תהליכים נורמלים, כגון ריפוי פצע regeneמנה של המוח נפגע 18. אחרי פציעה ושבץ מוח טראומטי, NSCs נחוץ להגר באתר הנגע להשתתף התחדשות 4,34. המערכת הנוכחית עשויה לשמש גם כדי לזהות חומרים המקדמים הגירה ופלישה. כפי שהראה, הגירה מושרה על התחלה עם טיפול BMP4. אם התאים אינם חשופים BMPs אלא כדי תרכובות חדשות, אלה עשויים להוות תחליף לפעולה BMP אשר יסייעו לזהות אגוניסטים BMP הרומן. עם מערכת כתב המציין ביטוי PDPN, בדיקות בקנה מידה גדולות עבור חומרי רומן הופכות ריאליות; אם תרכובת חדשה יכולה להוות תחליף BMPs, תאי מבטאי PDPN ניתן לזהות באופן אוטומטי.

המערכת המוצעת שימושית גם לחקור אינטראקציות איתות תא. התוצאות שלנו מראות כי השפעת BMP על הגירה יכולה להיות מוגברת על ידי הפעלת TGFβ1. התוצאות לחשוף אינטראקציה כתוסף בין BMP- ו TGFβ-איתות. עם זאת, מסלולי איתות נוספים, כגון Notch-, Wnt- או EGFR- / MAPK- ומפלה איתות אחרת עשויים להיות מעורב. לכן, חקירות נוספות על BMP / TGFβ-אינטראקציות צולבות לדבר אל מסלולים אחרים נדרשות. בנוסף, קליפת המוח המרכזית התגובה יכולה להיות מבודדת עכברים מהונדסים גנטי, אשר יכול לעזור כדי להבהיר מנגנוני נהיגת EMT. לסיכום, מערכת מודל EMT המתוארת כאן עשויה להיות מועילה בתחומי ביולוגיה של תאי גזע וההתחדשות, כמו גם בחקר הסרטן. זה יכול לשמש עבור הקרנה של ספריות תרופה עבור חומרי עיכוב או שיפור הגירה ופלישה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי האוניברסיטה של ​​הקרן הלאומית למדע באזל ואת השוויצרי הקרן הלאומית למדע ידי מענק MHS ו AG (SNF IZLIZ3_157230). אנו מודים: ד"ר טניה רינלדי Burkat למתן תשתית בנדיבות; כל חברי הקבוצה Bettler לדיונים והערות. אנו מודים גרהרד Dorne (Leica Microsystems, שוויץ) עבור התקנה מקצועית המוסמכת של מצלמת וידאו HD MC170 המלאה (Leica Microsystems, שוויץ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 114 תאי גזע עצביים אפיתל המעבר mesenchymal הגירה, גליומה פלישת הסרטן Snail1 העובר שור סרום ללא FGF2 BMP4 TGFβ
Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,… More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter