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Developmental Biology

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
* These authors contributed equally

Abstract

間葉移行(EMT)に上皮は、上皮が間葉への分化転換のプロセスについて説明します。 EMTはまた、一般的に最も頻度の高い悪性脳腫瘍、神経膠芽腫で発生胚発生時の基本的な過程です。 EMTは、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌などの脳外の複数の癌において観察されています。 EMTは中心部に移動、浸潤や転移形成を促進することにより、悪性腫瘍にリンクされています。 EMT誘導のメカニズムは完全には理解されていません。ここでは、皮質の神経幹細胞(NSC)の標準化された単離およびその後のEMT誘導のためのin vitroの系を記述しています。このシステムは、単一細胞または移植片培養のいずれかを使用するための柔軟性を提供します。このシステムでは、ラットまたはマウス胚前脳NSCは、定義された培地で培養し、血清酵素を欠いています。 NSCはOLIG2及びSOX10、oligodendrocで観察された2つの転写因子を発現しましたYTE前駆細胞(OPCの)。このシステムを使用して、ZEB1、ZEB2、およびTwist2を含むFGF-、BMP-とTGFβシグナル伝達の間の相互作用は相乗BMP-/TGFβ-相互作用を示唆し、TGFβ活性化大幅に強化された細胞遊走を観察しました。結果は、FGF-、BMP-のネットワークを指し、EMTの誘導および維持に関与することがTGFβシグナリング。このモデル系は、in vitroで EMTを調査するために適切です。これは、コスト効率で、高い再現性を示しています。また、それらの移動応答(定量的な距離測定)に対する異なる化合物の比較を可能にし、EMTを阻害または増強する化合物のハイスループットスクリーニング(定性的測定)。モデルは、したがって、EMTに影響を与える物質の薬物ライブラリをテストするのに適しています。

Introduction

胚発生のいくつかの段階では、上皮細胞は互いに( 例えば、タイトジャンクション)への強い接着性を失い、間葉移行(EMT)に上皮と呼ばれるプロセスで渡り鳥の表現型を獲得する1。 EMTは、間葉系、神経堤細胞のような追加の細胞型、神経上皮2から分離する集団の形成に必要とされます。 EMTは、胚の段階ではないだけに不可欠であるだけでなく、創傷治癒3および中枢神経系(CNS)病変4脱髄における再生などの成体生物における生理学的プロセスを、維持するために、成人期の後の段階で必要。

上皮性腫瘍は、最終的に癌の進行1,3につながる、移動、浸潤や転移の開始段階として、EMTを再活性化することが知られています。 EMTは確かに集中強いマイグレーション1,3にリンクされています。 Cのセルラーステップonditioning、開始受けるとEMTを維持することは十分に理解し、さらなる調査を必要としていません。

ここでは、定義された成長因子とメディア(無血清および無酵素の使用量)とのNSCに基づいて標準化されたin vitroで EMTモデル系は、提示されています。このモデル系は、EMTの作業科学者のための関連性です。カタツムリ、ゼブとツイストのタンパク質ファミリーは、両方の開発や病気1におけるEMTのために重要であることが示されています。カタツムリ、ゼブとツイスト家族も提示システムに関与しています。システムは、通常、EMTは、EMT誘導中の初期の事象の研究のために特別な利点を提供受けない前脳の特定の領域に基づいています。

このようなカタツムリ、ゼブとツイストタンパク質などのキーEMT誘導剤は、また、CNS外の組織・システムにおけるEMT中に発見されているので、モデルシステムは、潜在的に、CNS外の上皮にEMTを研究するために適用することができます。このモデルのystemは、一般、特にEMTにおける幹細胞の機能を研究するために開発皮質からNSCの標準化された単離を可能にします。このシステムを使用して、我々は、NSCを単離し、誘導されるEMTとFGF2及びBMP4の影響下で、その後の移行を検討しました。そこで我々は、モデル系の検証、FGF-およびBMPシグナリングは、細胞遊走を促進するTGFβシグナル伝達と相互作用することを観察しました。

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Protocol

すべての動物の手順は、「実験動物の管理と使用に関する指針」(NIH出版、 8版、2011年)に続き、バーゼルの動物福祉委員会(動物の管理と使用に関するスイスのガイドライン)によって承認されました。このガイドラインによって、動物プロトコルは「最低動物の重症度グレード」を考えられています。

拡大培地の調製

注:組織培養のための標準として、無菌状態での作業。

  1. 2 15ミリリットルのチューブに乗り、およびL-グルタミンを含まないDMEM / F12の5ミリリットルを追加(1:1)500ミリリットル中瓶から2 15ミリリットルのチューブのそれぞれに。最初の15 mlチューブに、50mgのヒトアポトランスフェリン、プトレシン1 Mストック(0.1mMの最終濃度)の50μlのナトリウムセレン、500μMストック(最終濃度30 nM)を30μlのを追加します。
    1. 元のDMEM / F12瓶に0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過。
  2. 第15ミリリットルチューブに、12.5 mgのインスリンを追加します。加えます6から1 M NaOHを9滴。渦は、完全にインスリンを溶解します。元のDMEM / F12瓶に0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過。
    注:NaOHが有毒で腐食性です。保護手袋、コート、および安全ゴーグルを使用してください。
  3. DMEM / F12培地ボトルに5ミリリットルのペニシリン(10,000単位/ ml)/ストレプトマイシン(万/ mlの)/アンホテリシンB(25μg/ ml)を追加します。
  4. 200 mMのL-グルタミン解凍したての株式またはDMEM / F12培地ボトルにグルタミン(200mMのL-アラニル-L-グルタミンジペプチド)を含むオリゴペプチドの5ミリリットルを追加します。
  5. よくまぜろ。 50ミリリットルのアリコートを準備します。
    注:増殖培地は4℃​​で少なくとも2週間保存することができます。等分し、チューブは500ミリリットル瓶に保管媒体に比べて少ないのpH変化を示します。

継代培地の調製

  1. 1 LのCa 2 +へ-およびMg 2+を含まないHBSSメディア、990.85 mgのグルコース(5mMの最終濃度)と840.10ミリグラムのNaHCO 3を追加注:継代培地を、4℃で少なくとも4週間保存することができます。

成長因子の調製

  1. 単独の1%BSA(PBS-BSA)または4 mMの(PBS-BSA-塩酸)での塩酸(HCl)で滅菌1×PBSを準備します。
    注意:HClは腐食性や毒性があり、特別な安全対策(コート、ゴーグル、手袋、フード)が必要です。
  2. ディゾルブPBS-​​BSA最終ミリリットル(10 ngの/でPBS-BSA(最終濃度10ng / ml)、10 / mlの組換えヒト骨形成タンパク質4(rhBMP4)中10μg/ mlの組換えヒト線維芽細胞増殖因子2(rhFGF2) PBS-BSA-HCl中1(rhTGFβ1をβ濃度)、および20μg/ mlの組換えヒトトランスフォーミング成長因子)(40 ngの/ mlの最終濃度)。
    1. 滅菌フィルターをかけません。アリコートを準備します。
      注:成長因子のアリコートで保存することができます-20°Cのために少なくとも2年。

細胞培養皿の4コーティング

  1. 250X PLOの株式を準備するために1875 mgのポリ-L-オルニチン500ミリリットル中(PLO)蒸留H 2 Oに溶解します。フィルタは、0.2μmシリンジフィルターを用いて滅菌し、2ミリリットルのアリコートを作ります。
    注:これらのアリコートは、少​​なくとも2年間、-20℃で保存することができます。
  2. 1,000倍フィブロネクチンの株式を準備するために1ミリリットルの滅菌蒸留H 2 O中に1mgのウシフィブロネクチンを溶解させます。これは粘着性のタンパク質を凝固することができるようにボルテックスしないでください。 10分間手で優しく振ります。
    1. 時々振盪しながら室温で1時間インキュベートします。完全な溶解を確認してください。フィブロネクチンの完全な溶解のため37℃未満への解決策を温めます。フィルターに滅菌しないでください。
      注:溶液を6ヶ月まで4℃で保存してもよいです。
  3. 必要なプラズマ前処理プラスチック細胞培養皿(100mm以下、他のサイズを使用します実験)。移行を評価するために、500ミクロンのグリッドに35mm皿を使用しています。 5%CO 2組織培養インキュベーター中で37℃で12時間、2ミリリットルの1x PLOで一晩皿をインキュベートします。 2ミリリットル1×PBSで2回洗浄します。
  4. 2ミリリットルの1xフィブロネクチン(1 / mlの最終濃度)を加え、5%CO 2インキュベーター内で37℃で12時間の最小値のために料理をインキュベートします。ちょうど細胞をプレーティングする前に、フィブロネクチンを削除してください。
    注:フィブロネクチンでコーティングされた皿を37℃で少なくとも2週間保存することができます。

5.標準化解剖と皮質脳室下帯の調製(SVZ)

  1. ラット胎生14.5(E14.5、スプラーグ - ドーリー)およびマウスE13.5(C57BL / 6)時限交配することにより胚を得ます。 8時00翌朝まで18時00分から動物をメイト。交尾の翌日正午はE0.5と考えられています。
  2. 5%イソフルランおよび0.8リットル/分の酸素流量で妊娠動物を麻酔。シャープディスと足の圧縮による応答を確認してくださいection鉗子。動物を首を切ります。 CO 2としてCO 2窒息を避ける細胞の回復を幹に影響します。
  3. 帝王切開により胚を取得します。
    1. 仰臥位で動物を置き、70%エタノールで毛皮を消毒します。子宮上記の下腹部に約8cmのV字状の皮膚切​​開を作るために手術用鉗子とハサミを使用してください。無傷の筋肉の壁を維持したまま毛皮を持つ唯一の皮膚を切開。
    2. 腹膜を入力して筋肉や腹部の筋肉壁を切開するために、新鮮な鉗子やハサミを使用してください。
    3. 下後方腹膜に子宮を識別します。周囲の組織からの鋭い分離により子宮を削除します。
    4. 氷冷1×PBS中の滅菌1×PBSで胚および場所で子宮を洗ってください。
    5. (3X倍率、 図1B)解剖顕微鏡下で胚によって胚を解放するために子宮壁を開くために、先の細いハサミを使用してください。 (胚性外皮を除去するために、ピンセットを使用してください
    6. 開発ラット神経系5のアトラスによって正しい発達段階を確認します。適切な胚のサイズは、 図1Bに示されています。
    7. 図1(a)に示すよう 、ラットの前肢(FL)で桁の形成を開始するの存在によって、さらに正確な年齢を確認してください。
      注:後肢(HL)はまだ桁の分離( 図1B)を表示しません。
  4. 解剖のために、氷冷1×PBSで満たされたコーティングされていないペトリ皿に胚を移します。オートクレーブ処理細かい鉗子を使用して(20X倍率3X)ステレオ解剖顕微鏡下で解剖を行います。
    注:ペトリ皿は、プラズマコーティングされた細胞培養皿で起こり得るように食器表面への組織の付着を防止します。先鋭化タングステン線の針または類似のも解剖の特定のステップのために有用です。
  5. INTEから始まる頭皮と頭蓋骨を削除します開発神経管( 図1C)へのアクセスを獲得するために、2つの鉗子で前方と後方に同時に引いて、開発終脳(TEL)と間脳(DI)( 図1B)のrsection。
  6. 菱脳から中脳(MES)を分離、中脳後脳境界(MHB、 図1B-Dの黒矢じり)を特定します。ちょうどMHB( 図1D、三角矢印)で、以下に菱脳をカット。
    注:MHBでの追加の皮下スペースが神経管を傷つけることなく皮膚の除去を容易にします。
  7. 顔面骨格( 図1E)と頭蓋底で終脳/間脳の間の接続を切断。これは、終脳、間脳と中脳(TEL-DI-MES)( 図1F-H)を含むブロックになります。
  8. 氷の上で増殖培地にTEL-DI-MESブロックを転送します。 completそれを保ちますエリーコーティングされていないペトリ皿に増殖培地でカバー。 NSCを持つ皮質SVZが含まれている終脳に触れないようにピンセットで脳のブロックを保持します。
  9. 繰り返して、すべての胚( 図1F-H)で5.5 5.8にステップ。
  10. 1 TEL-DI-MESを移し、新鮮な氷のように冷たい1×PBSにブロックします。 図1Iに示すように、間脳から脳を分離し、前脳( 図1F-H)の点線に沿って切断。
  11. 図1Fの点線に沿って切断することにより、TELからDIを区切ります。 図1Jで孤立した終脳を参照してください。
  12. 図1Jの点線に沿って切断し、2終脳半球を分割します。 図1Kに示すように、これは、2つの別々の半球になります。
    注:左半球は、図1Lに拡大されます。
  13. 内側ギャングを特定将来の孔のinterventriculareを通して見えるlionic隆起(MGE、 図2(a);; *)と横神経節隆起(+ LGE、 図2A)。
    1. 鉗子または針を使用して、MGE及びLGEと前部皮質(アリ-CTX、 図2B)との交差部分に直線に沿って詳細に分析。皮質、海馬(ヒップ)と脈絡叢(CP)を介して直線をカットします。これは、神経節隆起から嗅球(OB)を含む前部皮質分離(GEを、 2(b)、C )。
  14. 再び大脳皮質、海馬と脈絡叢を切断、尾側神経節隆起(CGE、 2C、D)と後部皮質( 図2C)の交差点で第2の直線をカットします。
  15. 終脳を平ら。完全に後極と嗅球( 図2D)を削除。識別する以前に6,7定義されるように、海馬と脈絡叢( 図2C)を含む皮質裾。
    注:海馬は大脳皮質よりも薄い神経上皮を持っています。 CPは赤い血管を含んでいます。
    1. 神経節隆起( 図2D)の大きさと同じ皮質の大きさを残して、皮質から皮質裾を区切ります。これは、皮質(標的組織)および神経節隆起(GE、 図2D)のブロックになります。
  16. 皿表面に心室(内側)側で皮質-GEブロックを反転します。
    注:半球の外側表面は、実験者( 図2E)が直面するだろう。外面に血管を含む髄膜( 図2E)です。
    1. 左手で皿表面にGEをピンと右(支配的)手( 図2Fにピンセットで髄膜をはがし注:髄膜が強く皮質に付着するので、これは技術的に最も要求の厳しいステップです。皮質からの髄膜の分離は、ステップ5.13.1および5.14で完全に直線(ギザギザではない)を切断することによって促進されます。
  17. 繰り返して、他の半球とすべての胚のために5.16に5.12を繰り返します。 LGE( 図2G、2H)の半分主直径の距離でLGEに沿って皮質をカット。解剖皮質1.2ミリメートル×2.4ミリメートル( 図2H)の領域にまたがり、NSCを持つSVZ /胚層を含みます。

体外培養物の6.準備

  1. 400μm未満の直径( 図2I)の外植片に皮質をカット。参照( 図2Hおよび2I)のための解剖ペトリ皿の下に配置さ400μmのグリッド( 補足図1)を使用ます。氷 - コ新鮮なペトリ皿にすべての外植片を移しLD増殖培地。
  2. 組織培養皿(ステップ4.4)からフィブロネクチンを削除します。それが乾燥することができます。 X 10ミリメートル10ミリメートル( 図3)の格子寸法の35mm皿の中央にコールド拡大培地の1ミリリットルを追加します。媒体は球状のドロップ( 図3)を形成することを可能にします。
  3. ドロップの中心に8外植まで挿入します。外植片は、理想的には、移行分析のために、互いの間に少なくとも3ミリメートルの距離(セクション8を参照)で、グリッド上に配置する必要があります。
  4. 外植片の付着のための細胞培養インキュベーター(37℃、21%O 2、5%CO 2)中で約1時間、皿をインキュベートします。外植片が沈降し、フィブロネクチンでコーティングされた表面に付着することを可能にします。外植片を切断し、最適なグリッド・センターの外に移動することができるので、料理を振らないでください。
  5. 1時間のインキュベーション後(37℃、21%O 2、5%CO 2)、2mLの膨張媒体の全体積プラス成長fに皿を埋めます俳優や興味のある物質がテストし、インキュベートします。
    注:どちらの酵素消化、また血清または遠心分離は、外植片の準備のために必要です。これは、細胞完全性のために最適です。

NSC単一細胞培養の7の準備

  1. 37℃での拡大と継代培地を温めます。
  2. 冷たい拡張媒体(チューブA)で15ミリリットルチューブに(ステップ5.17から)解剖皮質片を転送します。グラムのx 1200で5分間皮質片を遠心。上清を吸引除去します。皮質片を再懸濁するために、200μlの予め温めた増殖培地を追加します。
  3. P1,000チップ(チューブA)で15 mlチューブに予め温め継代培地700μlのを追加します。静かにペレットを再懸濁。 15ミリリットルチューブの底にチップを置きます。穏やかにゆっくりとP1,000チップで三回吸引することにより、組織片を解離します。
    注:培地を継代する細胞分離を促進し、酵素の使用を回避するために必要とされます。
  4. チューブが底に落ち着くまで大きい(重い)解離していない作品のために30〜60秒間静置します。シングル解離した細胞は、上清中に残ります。新鮮な15mlチューブ(チューブB)に上清の約700μLを移します。
  5. 繰り返しは、より大きな作品を解離するために7.3と7.4を繰り返します。
  6. 繰り返しは、7.3と7.4に、より大きな作品を解離するための第2の時間を繰り返します。新鮮な15mlチューブ(チューブB)にすべての上清を移します。
  7. 5ミリリットルの全体積に膨張媒体を追加します。血球計数器を用いて細胞を数えます。トリパンブルー染色により死細胞を評価します。
    注:小さなNSCは、より大きな細胞よりも7.2〜7.6、より良いステップに耐えます。 10胚から10%死んだ細胞で約4×10 6細胞を期待しています。
  8. NSCの拡張のために、8ミリリットルの増殖培地の体積で10センチ、フィブロネクチンでコーティングした組織培養皿あたり1.5×10 6細胞をプレー。標準的な拡張のために、1,000倍rhFGF2の株式の8μlを添加します。毎日8μlのrhFGF2を追加して、私を変更直径一日おきに。
    注:この発達段階での皮質は、NSCの大半と分化した細胞の少数のみが含まれています。分化した少数の細胞がrhFGF2、治療に反応し、増殖培養中に死ぬことはありません。
  9. 通路が60%コンフルエンスでのNSCを拡大しました。
    1. 通路のNSCに、拡大培地を除去します。 5ミリリットルの継代培地ですばやく3回細胞を洗浄。 4分 - 2を待ちます。 Ca 2+及びMg 2+細胞なしでゆっくり切り上げ、表面から切り離します。位相差顕微鏡下で細胞の脱離を確認してください。必要に応じて表面からの視覚的な剥離が観察されるまで、さらに数分待ちます。
      シングル細胞が完全に分離させますが、ほとんどの細胞がまだ皿表面に付着する:注意してください。剥離のために必要な期間は、フィブロネクチンコーティングの持続時間に依存しています。短いフィブロネクチンコーティング(12時間以下)がより速い細胞剥離をもたらします。長い実験のために(>; 1週間)以上24時間のフィブロネクチンコーティングが推奨されます。
  10. 軽く表面から細胞を分離するために10ミリリットルのピペットを使用してください。細胞と5ミリリットルの継代培地を収集し、新鮮な15mlチューブに移します。継代媒体の追加の5mlを繰り返します。
  11. チューブの底で10 mlのピ​​ペットを配置し、ピペッティングにより3回上下15mlチューブ中の細胞を解離します。室温で1200×gで15分間チューブをスピン。上清を除去し、2ミリリットルの増殖培地中でペレットを再懸濁します。血球計数器を用いて細胞を数えます。死細胞を評価するためにトリパンブルーを使用してください。
    注: -約10%で、死細胞数で5×10 6細胞の60%コンフルエンスに拡大した後、4を期待しています。
  12. プレートさらなる継代のため10cmディッシュあたり8×10 5細胞。

8.移行アセスメント

  1. 移行評価のために、外植片で第5シードに応じた外植片を分離35ミリメートルグリッド料理。一時間めっき後、FGF2(rhFGF2)を追加します。 2日間37℃のインキュベーターに皿を置きます。
    注:最適な植片の添付ファイルの場合は、お皿を移動せずに済みます。
  2. 千μlのヒントにメディアを削除します。千μlの先端内側の円で開始する( 図3)により拡大培地の2ミリリットルを追加します。これは、外植片での表面張力を低下させます。
  3. 実験のために、必要に応じて、単独または組み合わせでの成長因子を加えます。陽性対照としてFGF2 / BMP4 /TGFβ1を使用してください。注:この実験では、35ミリメートル皿当たり2μlのFGF2、2μlのBMP4および4μlのTGFβ1は、単独および組み合わせ( 図5)で追加されました。
    1. 追加の因子および/またはテスト可能な物質を追加します。 37℃で2日間再び手付かずの料理をしてください。
  4. 倒立顕微鏡で外植片の写真を撮ります。
    注意:リビング植片が固定された細胞よりも優れた位相コントラスト画像が得られます。両方を使用することができます。
  5. 移行のためのアセスメント、ピクセルの測定を可能にするグラフィックスソフトウェア( 例えば 、フィジー8)を使用ます。
  6. ピクセル単位で500μmの距離の皿のグリッドを測定し、内部基準として使用します。
  7. 移動開始点として植片の中心を定義します。外植片の中心部と10個の細胞の最も外側のグループ間の距離を測定します。
    注:すべての細胞は遠心離れて外植片から移行します。彼らは自発的に( 図5)は、試験した状況下で周囲にシートを形成します。

9.侵攻評価

  1. 議定書の第4節に従って、フィブロネクチンでコーティングされた組織培養24ウェルプレートを準備します。
  2. 細胞浸潤チャンバーの上部ウェルに暖かい増殖培地を300μlを置きます。 37℃で30分間、チャンバーをインキュベートし、5%CO 2。
  3. トップウェルから増殖培地を取り出して、コーティングした24ウェルプレートにBoydenチャンバーを配置。
  4. 50を追加します。ウェル底に0.5 rhFGF2μlの0.5μlのrhBMP4と暖かい増殖培地の0μlの。
  5. 通路のNSC 1〜4項7に通路を説明したようにカウントが適しています。
  6. プレートrhFGF2の0.3μlのボイデンチャンバーの上部ウェル内rhBMP4の0.3μlの温かい拡大培地300μlの容量で、5×10 5細胞。
  7. 文化24時間播種したNSC。
  8. 別の48時間室や文化に細胞をさらなる因子および/またはテスト可能な物質を追加します。
    注:細胞は侵襲性である場合、それらは十分に下に基底膜層を通ってウェル上から通過します。侵襲性の細胞はBoydenチャンバーの底に固執します。
  9. 製造業者によって提供されたプロトコルに従ってください。二回洗浄することにより、上部ウェル中の非侵襲性細胞を除去するために(浸潤アッセイキットに含まれる)綿棒を使用してください。
  10. ウェルから培地を除去し、と500μlの増殖培地を追加生きている細胞について、ウェルに核色素DAPIで形質膜染色。
  11. 37℃で10分間、5%CO 2インキュベートします。
    注:染料は、最適な可視化の8のために、それぞれ、膜および浸潤細胞の核内に統合されます。オプション:多色免疫細胞化学が計画されている場合は、原形質膜色素を省略します。
  12. 染料でメディアを取り外し、拡張培地で2回洗浄します。以前に8示されているように倒立蛍光顕微鏡を用いて、侵襲性細胞を可視化し、カウントされます。
    注:一部の侵襲性の細胞は、チャンバの底部から剥離している可能性があり、それらがコーティングされた表面に付着する場所の下ウェル表面に落ちてきました。完全な分析のためにウェル表面で細胞が含まれます。
  13. 培地を除去し、10分間氷冷新鮮な4%PFAで細胞を固定。 1×PBSで洗浄3倍。以前8-10に記載されているよう 、侵襲性細胞上の免疫組織化学を実行します。
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Representative Results

このEMTモデル系は、単一の細胞として、または開発神経管の特定の領域、中央の皮質( 図1および 2)からの外植片の両方NSCの標準化された単離に基づいています。定量的評価のために、外植片を、500μmの格子培養皿( 図3)の中央に右を播種しました。中央の皮質からの外植片は、第1の成長因子( 表1)の異なる組合せでさらに2日間、続いて二日間FGF2に暴露しました。私たちは、発展途上の神経管の他の領域よりも大きい皮質から始まりました。我々は、BMP4で培養唯一の外植片が移動応答( 表1補足図2)を示したことを観察しました。

次ポドプラニン(PDPN)式が定義された条件の下で分析しました。 PDPNは貫通sであります複数の癌11,12ともNSCの8内に侵入と関連していたialomucin様タンパク質。 PDPN発現する細胞の割合は、高悪性度の神経膠腫13に増加します。 PDPNはまた、神経膠芽腫患者14に貧しい生存率と関連しています。さらに、PDPNは、乳癌、肺癌、結腸癌15,16を含む複数の腫瘍における悪性進行のマーカーであることが示されています。 PDPNは、侵襲性だけでなく、渡り鳥のNSC 8の両方で発現しています。上記のプロトコルを使用して、PDPNの発現が制御と比較した、FGF2のみ、TGFβ1及び単独のBMP4に、または組み合わせにさらさ外植インチPDPN式は、すべてのBMP4およびTGFβ1/ BMP4処理外植片で検出されました。対照的に、PDPNは単独でFGF2に単独TGFβ1( 表2及び図4)を有する外植片に対照外植片において観察されませんでした。また遊走表現型を有する細胞は、BMP4およびTGFβ1/ BMP4-に誘起されました露出した外植片を、対照外植(のみFGF2)とTGFβ1のに対し、単独の遊走細胞( 表1)を示しませんでした。遊走細胞の観察は、低コスト、ストレートフォワード定性的な評価を提供します。

さらに、我々は、BMP4( 表2)に発達神経管のいくつかの領域の移動応答とEMT誘導を試験しました。 図1に示すように、400μmの外植片を、中央の皮質、後部皮質(標識後極)、MGE及び脳から調製した。外植片が全ての2日間、FGF2にさらされた、BMP4とFGF2 2日続きます。移行は、先頭と末尾のエッジ( 図5及び補足図2)を有する平坦な遊走細胞の出現によって定義されました。後部皮質からの遊走細胞の強力な誘導とMGEとMESからの中間応答脳は、( 表2)が観察されました。中央の皮質の146植片の145は、FGF2 / BMP4での渡り鳥の応答を示しました。したがって、中央の皮質は、試験したすべての外植片( 表2)の遊走細胞の最も強固な誘導を示しました。 BMP4の脱落は、任意の遊走応答を廃止た( 表1及び2を 、データは示していません)。

成長因子の効力の定量的評価のために、移動距離は、複数の増殖因子で培養した外植片で測定しました。外植片の要因(対照)または単一または複合BMP4およびTGFβ1せず、その後FGF2でさらに2日間、FGF2で2日間、上記のように培養しました。予想されるように、制御植片において強い増殖は、FGF2に応答して観察されました。外植片を皮質SVZ由来とFGF2 17に応答して増殖することが知られている大部分のNSCのに含まれています。制御CELLSは±14 689、TGFβ1の細胞582±49ミクロン( 図5)に達しました。 BMP4群は935±91ミクロンの平均移動距離を示しました。比較ではTGFβ1/ BMP4細胞は、1150±23ミクロン( 図5)に、さらに大幅に移行しました。結果は、BMP4は、FGF2に暴露されたNSCでの移動を誘導していることを示しています。この移行は、さらにTGFβ1によって増強することができます。 FGF2、BMP4及びTGFβ1の組み合わせは、遊走を誘導することが最も効果的です。要約すると、細胞培養モデル系は、定性的ならびに定量的な移行の評価を可能にします。

EMTは、乳癌、結腸癌、肺癌、また脳腫瘍における1,18などの上皮癌を含む様々なシステムでこのようなSnail1、Snail2、ZEB1、ZEB2、TWIST1、Twist2ような転写因子(TFS)に連結されています。私たちは時間広告は、以前FGF2およびBMP2またはBMP4はSnail1Snail2 8,9を誘導することができること示しました。上記のシステムを用いて、我々は、他のEMTに関連したTFの発現レベルを調べました。 TWIST1発現における変化は検出されませんでした。 TWIST1は FGF2の露光中に低い発現レベルであると(データは示さず)。細胞培養モデルにおいて、FGF2 / BMP4-露光中FGF2露光およびTwist2の中ZEB1ZEB2のアップレギュレーションは、( 図6)が観察されました。

NSCは、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPCの)8,19,20の集団に寄与することが知られています。いくつかの証拠は、NSCは、特にOPCの中には、神経膠腫21,22のための起源の細胞であり得ることを示しています。さらに、上記モデルを特徴付けるために、我々は、OPCマーカーの発現を調べました。私たちは、FGF2に露出したNSCはOLIG2 /ネスチンの同時発現を示したことを観察しましたD SOX10 90%以上で/ネスチン( 図7)。この観察は、NSCのは、我々のシステムでOPC-特徴を示すことを実証しています。実際、OPC-特徴はZeb'1Zeb'2( 図6および7)のアップレギュレーションと相関しました。これらの結果は、同時に最初のゼブは、EMTのステップをベース開始しながら、OLIG2及びSOX10によって判断されるようにFGF2-拡張は、OPCの同一性を推測することを示唆しています。

図1
1:NSC の単離とEMTの誘導のための標準化された胚および前脳解剖。 (A)帝王切開後のラットE14.5胚の左前肢。すべての前肢の桁が黒い矢印の先端でマークされています。 E14.5のための典型的な始まる桁の形成に注意してください。(B)ラットE14.5胚船体を除去した後。背間脳ワットでハッシュ(#)に注意してくださいHICHは、皮膚/頭蓋原基の除去を開始するのが理想的である。(C)皮膚/頭蓋骨が既に大部分が除去されます。除去し、除去されていない皮膚との間の境界は、2つの三角形の矢じりでマークされています。皮膚は後方矢印から前方に前方矢印からと後方に剥離することができる。(D)皮膚/頭蓋骨は今完全に除去されます。矢印でマークされ、それにちょうど尾側中脳後脳境界(矢印)とカットの切り欠きに注意してください。(E)終脳-間脳、中脳(TEL-DI-MES)ブロックは、胚の残りの部分から除去されますTEL-DI-MESブロックの。(F)スーペリアビュー。頭蓋は残されている。(G)斜めビューを上から。TEL-DI-MESブロックの(H)劣るビューを。(I)中脳と間脳の一部間脳の前部と終脳から分離されています。トップ:両方の終脳小胞の前方ビュー。下:RIGH脳の側面図をtは、トップは頭側直面している(J)トップ:。両方の終脳小胞を間脳なし。間脳の完全な除去を説明するための劣るビュー。アスタリスクは、MGEを示しています。下:間脳の前方部分(K)トップ:両半球は大脳縦裂に分離されています。左側の左半球。アスタリスクは、MGEを示しています。プラス記号は、中央値眺めの左半球のLGE。(L)倍率を示しています。右頭蓋直面し、トップがそれぞれ背側、下部腹、である、尾側に残しました。アスタリスク(*)は、MGEに位置しています。プラス記号(+)は、LGEに位置しています。 CH、皮質裾。 FL、前肢。ディ、間脳。 MES、中脳、 MHB、中脳、後脳境界; HL、後肢。 LGE、横方向の神経節隆起。 MGE、内側神経節隆起。 OB、嗅球。 PC、後部皮質; ρ、菱脳。 TEL、終脳。すべての画像上のグリッドには、細い線を持つ4つの交点で厚さ2mmの線を示しているすべての400ミクロン。すべての画像上のスケールバー:2ミリメートル、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
2:NSCの単離とEMTの誘導のための標準化された皮質SVZ郭清。 (A)左半球の中央見ます。モンローMGEとLGEの孔を通してアスタリスクとプラス記号でマークされ、表示されている。(B)嗅球がちょうど頭側MGE-LGEの除去される。(C)皮質の後極はちょうどCGE後ろに削除されます。(D)トップ:皮質裾は皮質から分離されています。左:後極。ミドル:皮質およびCGE-LGE-MGEブロックの中央部分を含む複合体。右にMGE及びLGE顔。右:嗅覚BULB。(E)CGE-LGE-MGE-皮質ブロックが左右反転されています。今、終脳の外表面は、顕微鏡に直面しています。 MGEとLG電子は現在、左に直面している。(F)赤みがかった髄膜は明るい半透明の皮質から削除されます。 CGE-MGE-LGE-CTXブロックは現在、同じ手順が右半球で繰り返される次のステップ。(G、H)のために戻って左右反転されています。中央の皮質は、CGE-MGE-LGEブロックから離れて分離されています。 2矢印で、CGE-MGE-LGEのブロックを左にマークされている中間皮質帯があることに注意してください。この中間体皮質の厚さは、LGEの直径の半分に相当します。 LGE-CGEと皮質の間の境界を表す点線。(I)中央皮質は400μm未満の直径の外植片に分離されます。スケールバー:2ミリメートル;すべての画像上のグリッドには4つの交点(細い線)ごとに400ミクロンで厚さ2mmの線を示しています。アスタリスク(*)が配置されていますトンMGE。プラス記号(+)は、LGEに位置しています。略語:アリ-CTX、前部皮質; CEN-CTX、中央皮質; CGE、尾側神経節隆起。 CH、皮質裾。 cpは、脈絡叢; CTX、皮質; LGE、横方向の神経節隆起。男性、髄膜。 MGE、内側神経節隆起。 OB、嗅球。 PC、後部皮質。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3: 外植播種 35ミリメートル グリッド細胞培養皿 の上に 500μmのグリッド皿の中央に拡大培地の1ミリリットルを置きます。ドロップは、グリッド・リム(小さな矢印)に含まれています。右の1ミリリットルドロップの中央に置き植。外植片は、グリッドの外に広がっている場合は、SWスロー円を描くように料理をIRLと外植片は求心力によって中央に移動します。注:外植片眼(黒矢頭)によってのみかろうじて見えます。スケールバー:35ミリメートル。

図4
4は:。PDPN はBMP 4 の存在下で誘導された外植片を、プロトコル部8(FGF2で2日間のみ、次に示すように、因子とFGF2が続く)に従って培養しました。コントロール(A)(単独FGF2)とTGFβ1(C)外植片はPDPN陽性細胞(緑色)が含まれていませんでした。核はDAPI(青)で染色します。 BMP4(B)およびTGFβ1/ BMP4(D)外植片はPDPN陽性細胞の割合が高いことを示しました。外植片の中心部には、左、右の周辺です。注:PDPN陽性細胞はほとんどフンました周辺ではなく、外植片の中央にD。平坦含まれるTGFβ1/ BMP4の外植片を、よりPDPN陽性細胞を詳しく述べた。(E)は、異なる条件での外植片でPDPN陽性細胞の割合が示されています。制御およびTGFβ1は、両方のBMP4との条件とは大きく異なっています。手段は±SEMで示されています。 TGFβ1 コントロールが(NS)重要ではありません。 BMP4 コントロールとTGFβ1:P <0.0001(***)。 TGFβ1/ BMP4 TGFβ1:P <0.0001(***)。 TGFβ1+ BMP4 BMP4は重要ではありません:P = 0.0981(NS)。 TGFβ1+ BMP4 コントロール:P <0.0001(***)。すべての画像のためのスケールバー、(A)に示すように:50μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5 5: 定量移行アセスメント。 BMP 4 およびTGFβ 細胞遊走に 1 ショー添加効果。外植片は、プロトコル部8(A)コントロール外植片。(B)外植単独のBMP4におけるに従って培養した。(C)単独のTGFβ1で外植片。(D)外植でμm単位TGFβ1及びBMP4の組合せ。(E)移動距離。 500μmのグリッドを基準として使用しました。制御およびTGFβ1植片は他の条件よりも大きく外植径との強力な増殖を示しています。手段は±SEMで示されています。 BMP4およびTGFβ1/ BMP4植片の一部が外植コアを崩壊し、細胞は遠心力、そこから離れて移住していることに注意してください。 TGFβ1 コントロールが(NS)重要ではありません。 TGFβ1対BMP4:P = 0.0353(*)。 BMP4 コントロール:P = 0.0351(*)。 TGFβ1+ BMP4 BMP4:P = 0.0372(*)。 TGFβ1+ BMP4 コントロール:P <0.0001(***)。スケールバー:500μmで。外植片の中心はプラス記号(+)でマークされています。移動細胞の外側のエッジは三角矢印でマークされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
6:定量RT-PCRによるEMT関連転写因子のアップレギュレーション EMTは、キーZeb-の転写因子およびツイスト・ファミリーにリンクされている(A、B)Zeb'1Zeb'2は、第一段階の間にアップレギュレートされましたFGF2-暴露。(C)Twist'2は seconの間にアップレギュレートされましたFGF2 / BMP4露光のd相。 QRT-PCRに基づいた相対的な発現レベルが示されている(N = 2)。 mRNAレベルは、GAPDHに対して正規化しました。手段は±SEMで示されています。 FGF2期間の0日目にmRNAが収穫し、さらにmRNAはその後、FGF2 / BMP4で1日後、FGF2で4日後に回収したZeb'1:コントロールFGF2 に、p = 0.0002 Zeb'2:コントロール FGF2に、p = 0.0206 Twist'2: コントロール。 FGF2 + BMP4、P = 0.003。

図7
7:NSCは、モデル系におけるOPC特性を示したNSCは、中央皮質から単離し、FGF2の存在下で単一細胞として培養した(第5節に従って)。培養中の8日後に(通路4 dは​​7.9節に従った後に)細胞は、小さなNSCコロニーを形成し、Bには、OLIG2(赤のために染色しました、C)、E、F)及びネスチン(におけるSOX10(赤、緑、A、C、D、F)。細胞の割合が高い共発現OLIG2 /ネスチン(AC)およびSOX10 /ネスチン(DF)。(G)OLIG2 /ネスチンおよびSOX10 /ネスチンの同時発現は、すべての細胞の割合で示されています。手段は±SEMで示されています。 (A)及び(D)に示すように、すべての画像のためのスケールバー:20μmのは、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

調子 総植片 (中央皮質) 移動応答と外植片 ポドプラニン発現と外植片
コントロール 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

1。 BMP 4および BMP 4 β1、TGF の組み合わせは、 堅牢な移動性応答を誘導する。中央の皮質からの外植は4日間の合計のための増殖培地とFGF2で維持しました。最初の後2日は、外植片を、単独で(対照)またはFGF2との組み合わせなどの他にTGFβ1、BMP4またはTGFβ1/ BMP4 FGF2を受け続けました。制御及びTGFβ1-植片はいずれも移動応答もPDPN発現を示さないでした。 BMP4およびTGFβ1/ BMP4は、すべての外植片に遊走細胞と同様にPDPNの発現の両方を誘導しました。

領域 総外植 FGF2 / BMP4での 移動応答と外植片
中央皮質 146 145 99.3
後部皮質 52 48 92.0
MGE 56 29 51.7
中脳 53 28 52.8

2。中央のCortexは、FGF 2 / BMP 4 への応答の中で最も堅牢な移行を示している外植片が開発したラットE14.5の神経管の異なる領域から調製した中央皮質、後部皮質、内側神経節隆起(MGE)と脳。すべての外植片をFGF2 / BMP4(8節)で同じ培養しました。 BMP4なしで処理した外植片は、任意の遊走応答(データは示していない)示しませんでした。すべての外植片を外植片当たりの任意の遊走細胞の出現についてスクリーニングしました。すべての地域移行をBMP4とFGF2に応答することができました。中央の皮質は、しかし、最も堅牢な応答を示しました。 BMP4は、任意の遊走細胞を誘導するために必要であったことに注意してください。 FGF2で培養した外植片だけでは増殖を示したが、ありません移行;そして、全くフラット遊走細胞は、単独で、FGF2( 表1補足図2)で観察されませんでした。

SUPP図1
補足図1400μmのグリッドファイルグリッドファイルは、上記の切開手順中に参照として、また図1および 2に示すように印刷して使用することができます。大きな交差点は400μmのサブディビジョンで2ミリメートルを表している。 この図のPDF版をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

SUPP図2
補足図 2。 BMP 4 -exposed外植片のShフラット遊走細胞。 図5に示す細胞の倍率OW。(A)コントロール- (FGF2単独)および(C)は、TGFβ1-外植片を、小さな丸い細胞との強力な細胞分裂を明らかにした。(B)BMP4-及び(D)TGFβ1/ BMP4-外植片を、一貫して平​​らな細長い細胞を示しました。 (A)に示すように、すべての画像のためのスケールバー、:100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図1
補足図 3。 EMTの調査のため のin vitro モデルシステム の概要 。E14.5ラット中央皮質は、NSC含有SVZが含まれています。中央の皮質は、いずれかのuです外植片として、または単一細胞としてのsed。外植片を、定量的なマイグレーション解析(セクシ​​ョン8)のためのより便利です。単一細胞は、遺伝子やタンパク質分析(セクシ​​ョン9.13)として、定性分析に適しています。

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Discussion

この研究でのNSCを用いたEMTの分析のための標準化されたシステムは、( 補足図3にまとめた)に記載されています。標準化は、再現性( 表1および2)を保証します。 NSCを現像皮質、通常はEMTを受けない組織に由来します。これは、EMTにおける初期段階の分析のために有利です。 EMTにおける最初のステップは、十分に遺伝的変化を蓄積してきたし、既にEMTの機能を採用していることが、腫瘍細胞で研究することはできません。ほとんどの悪性腫瘍が異種の侵襲性および非侵襲性細胞の両方を含有しているので、一次腫瘍サンプルは、EMTを理解することが理想的ではありません。提示されたプロトコルは、EMT誘導の初期段階を研究するための新規モデルとEMTの研究者を提供します。ここでは、ゼブとツイスト・ファミリーのキーEMT誘導因子が順次活性化されていることを示しています。最初の段階の間にZEB1とZEB2がアップレギュレートされ、第二段階Twist2中に(FigurE 6)。以前、我々はSnail1はすでにBMP4-暴露8の数時間後にアップレギュレートされていることを示していました。また、BMP4-暴露されると、中央皮質からの神経上皮幹細胞は平滑筋アクチン(SMA)およびカルポニン9に陽性で間葉系細胞に分化することを示していました。結果は、上記の3つの既知のキーEMTレギュレータのすべてがシステムに関与していることを実証するには、以前の研究を完了します。また、我々は、TGFβ1が有意単独FGF2 / BMP4の遊走作用を向上させることができることを観察しました。これらの結果は、EMT誘導中にFGF-、BMP-とTGFβシグナル伝達の間のネットワークを指します。

成功したEMTのためのNSCの単離および移行解析のための最も重要なステップは次のとおりです。正しく、胚の年齢を特定胚の解剖学的ランドマークを識別し、新鮮な培養培地の製造および(少なくとも一晩)でコーティングされたプレート、先の細い器具の使用プロ皮質外植片を確立するために開発皮質の中央部の解剖あたり。

提示された技術は、いくつかの変更によって高めることができます。上で示唆したように、複数の外植片は、グリッドを持つ単一の皿の上にメッキされています。複数の化合物のスクリーニングのために、しかし、96ウェルプレートの各ウェルに単一の外植片を配置することがより便利であり得ます。さらに、モデル系は、大規模な創薬のために改良することができます。前述したように、PDPNはPDPNは、侵襲性のNSC 8で発見されて以来、新たに取得した渡り鳥の機能のための貴重なマーカーです。 PDPNレポーターは、EMTの誘導の前に、通常のNSCにトランスフェクトすることができます。 PDPN通常のNSC( 図4および表1)で表現されていないので、その結果をPDPNとして発現している細胞は、細胞の形質転換のための内部対照として役立つことができます。いくつかの追加NSCマーカーは、EMT誘導8後に失われネスチン、として、ご利用いただけます。結果として、両方の初期状態」/非移行性、非侵襲性/ネスチン+」、および最終状態「遊走/侵襲/ PDPN +」は、自動化された薬剤の発見を可能にする、モニターすることができます。複数のウェル( 例えば 、96ウェルプレート及びより大きい)初期細胞と大細胞培養プレートに播種することができる、確立薬物または既知の機能を持たない化合物で処理しました。このように、マルチウェルプレートは、自動的にPDPNまたは他の移行/浸潤マーカーの発現のためにスキャンすることができます。阻害剤は、画面のメインターゲットである場合は、PDPN発現の消失が推定される面白い小説阻害化合物を識別するのに役立ちます。

新規物質のテスト中に外植片は、移行が表示されない場合があり、および/または外植片を切り上げや皿から切り離すことができます。このような状況では、それは(一日おきに代わり、完全な培地交換の)毎日メディアの半分だけを変更するのが最善です。新鮮な培地と交換するとき、これは表面張力によってストレスを軽減します。ザ外植片は最初のプレーティング後に添えない場合も。この状況では、フィブロネクチンは、少なくとも36時間にわたって食器表面と接触しなければなりません。フィブロネクチンは、プラスチックに付着する可能性があるため、コーティングに使用されるフ​​ィブロネクチンを新たに10分以上のためのプラスチック製チューブに触れることなく、準備する必要があります。さらに、外植片は、グリッドの外側を解決することがあります。このような状況では、スロー円を描くように料理を旋回することをお勧めします。これは、外植片が求心力(参照: 図3)により中央に再配置することができます。

神経膠腫は、NSCの23,24由来のNSCおよび/ ​​またはOPCに由来しているという強力な証拠があります。 。Sampetreanら INK4 / ARF欠損マウスから単離されたNSCをし、H-Rasの25の過剰発現を強制的に:結果として、他のグループは、NSCのもとに神経膠腫の成長モデルを確立しています。ハイグレードの悪性腫瘍は、移植25の後に増殖および浸潤を示したことをもたらしました。 MCNeill らは 、遺伝的に改変マウスから、単離されたNSC(フロックスRb1を、NF1、Krasの、のPten単独および組み合わせで)26。遺伝子は、Cre-ウイルス感染によって不活性化したとNSCは26を移植しました。これらの両方のモデル系は、侵入がインビボでモニターすることができ、潜在的な新たな抗浸潤薬を試験することができるという利点を有します。彼らの主な欠点は、侵略の発症が十分に定義されていないことであり、細胞が神経膠腫、典型的なEMT浸潤(EMT遺伝子)またはローカルのみの移行を示すかどうかは不明です。また、唯一の薬剤は、動物ごとにテストすることができると分析は数週間が必要です。新規抗浸潤薬を同定するために、製薬会社は、(a)は(b)の異なる薬物濃度をしようとするテストおよび(c)を複製するために、数千の化合物のスクリーニングや、一度に複数のする必要があります。 、数千移植動物を準備する別の薬とそれらを治療し、最終的には組織化学的または生物発光によって効果をテストするには分析は非常にリソースを浪費します。ここではEMT関連の侵略のための新規NSCベースのモデルシステムは、数千の化合物の費用効率的なスクリーニングを可能にすることが記載されています。

このモデルは、化合物のハイスループットスクリーニングを可能にするが、それは唯一の一次スクリーニングプラットフォームです。関心対象の化合物は、このモデルにおいて同定されると、それらは、さらなる検証が必要であろう。 インビボ 25,26重要になって上記のように試験が同定される任意の化合物の安全性及び有効性パラメータおよび移植モデルが必要です。モデルはまた、それが齧歯類細胞に基づいているという事実によって制限されます。モデルは、ラットまたはマウスEMTを調査するために使用することができるが、同じメカニズムが、ヒト細胞またはヒト患者の所定の位置にある場合、それは不明です。さらなる実験は、NSCは、 インビトロで 、また移植後だけでなく、侵襲性である場合に調べるために必要とされます。いくつかの証拠は、NSCの役割をサポート神経膠腫の形成インチテネイシンC、Hey1、SPARC、Snail1とSnail2、FGFR +、BMPR1A、EGFR、PDGFRβ、Sox2の、ポドプラニン、Gli3のとp75NGFR 8:神経膠腫の進行は、以下の遺伝子にリンクされています。これらの遺伝子の全てはまた、侵襲性間葉系細胞8に正常な非侵襲性のNSCの変換中に発現されます。当面では、NSCは、外部成長因子のみで腫瘍に変換することができるかどうかは不明です。

別の腫瘍由来の腫瘍開始幹細胞(のTIC)が単離されており、腫瘍の進行27を理解するためのモデルとして使用されます。 EMTは、すでにのTIC 27で発生しなかったためのTICは、EMTの分析のために、しかし、あまり適していません。早くもEMT誘導の後期のステップを理解するために、主要な非腫瘍性細胞集団が必要です。理想的には、この集団は、最初の場所でEMTを受けるものではありませんでした。以前に胚のNSCは、この目的のために適切な候補であったことが示されました9,28。すなわち、遊走および浸潤は、FGF2及びBMP4 9,28によってのNSCで誘導することができました。キーEMTの家族ゼブとツイストが8を検討されていなかったので、FGF2 / BMP4誘導性移動は、単一のEMT関連遺伝子に関連していた、しかし、完全な証拠が欠けていました。 4つの要因の特定の組み合わせは、FGF2、BMP4、TGFβ1とインスリンが非常に強く、完全なEMT誘導を引き起こすショー上記の結果は、以前に観察されません。本研究は、Zeb-とツイスト家族のキーEMT遺伝子はまた、アップレギュレートされていることを示しています。この研究は、したがって、単一の遺伝子の選択的な上方制御が存在しないという最初の証拠を提供し、その結果は、すべての主要なEMTファミリー提案細胞培養系において活性であることを示しています。

EMTはまた、肺癌、乳癌、結腸癌および胃癌29のように、脳の外側の上皮癌において観察されています。 EMTを研究するためのいくつかのモデルが、これらの腫瘍30-32のために使用されています、著しい制限が、しかし、来ている:(a)複数の遺伝子を保有する形質転換された腫瘍細胞株の使用およびエピジェネティック33を変更します 。早期癌の段階のためのEMTの阻害剤を同定するために、末期癌細胞は不十分です。 (b)は、未定義の成長因子を含む血清依存性の培養物。これは、重要な因子の同定は非常に困難にします。血清の品質はバッチごとに変化するので、実験の再現性が損なわれています。 (c)の血清は、おそらく潜在的に有用な外因性化合物を不活性化阻害剤および酵素活性が含まれています。 (D)細胞表面分子を分解する細胞継代のための酵素の必要性。生理学的なEMTを促進するためにEMTアゴニストを同定するための(e)は、正常な細胞は、誘導を試験するために必要とされます。腫瘍細胞モデルが、正常な幹細胞において再生を促進する物質を発見するには不十分です。

移行はまた、創傷治癒およびリジェネなどの通常のプロセスのために必要とされます負傷した脳18の比。外傷性脳損傷および脳卒中後、NSCは再生4,34に参加する病変部位に移行するために必要です。現在のシステムはまた、遊走および浸潤を促進する物質を同定するために使用することができます。上記のように、移行はBMP4処理との開始の際に誘導されます。細胞は、BMP類の代わりに新規な化合物に暴露されていない場合、これらは、新規BMPのアゴニストを同定するのに役立つBMPの作用を代替することができます。 PDPN発現を示すレポーターシステムと、新規物質のための大規模な試験が可能となります。新規化合物は、BMP類の代わりにすることができる場合、PDPN発現細胞を自動的に識別することができます。

提案されたシステムはまた、細胞シグナル伝達の相互作用を調査することが有用です。我々の結果は、マイグレーションのBMP効果がTGFβ1の活性化によって増強され得ることを示します。結果は、BMP-とTGFβ-間の添加剤の相互作用を明らかにシグナリング。しかしながら、このようなNotch-、Wnt-またはEGFR- / MAPK-および他のシグナル伝達カスケードのような付加的なシグナル伝達経路が関与している可能性があります。したがって、BMP /TGFβ-相互作用および他の経路へのクロストークに関するさらなる調査が必要とされています。また、応答中央の皮質はEMTを駆動する機序を解明するのに役立つことができ、遺伝的に改変されたマウスから単離され得ます。要約すると、ここで説明EMTモデル系は、幹細胞生物学および再生の分野において、ならびに癌研究に有用であり得ます。これは、遊走および浸潤を阻害または増強する物質のための薬剤のライブラリーのスクリーニングに使用することができます。

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Acknowledgments

研究は、MHSとAG(SNF IZLIZ3_157230)への助成金によってバーゼル科学財団の大学、スイス国立科学財団によってサポートされていました。私たちは感謝:博士タニアリナルディBurkatを寛大にインフラを提供するため。議論やコメントのBettlerグループのすべてのメンバー。我々は、フルHD MC170ビデオカメラ(ライカマイクロシステムズ、スイス)の専門的かつ有能なインストールのためのゲルハルトDorne(ライカマイクロシステムズ、スイス)をお願いいたします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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発生生物学、問題114、間葉への移行上皮神経幹細胞、移行、
創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル
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Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

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