Abstract
중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 상피 세포가 중간 엽에 transdifferentiating의 과정을 설명합니다. EMT는 또한 일반적으로, 아교 모세포종에서 가장 흔한 악성 뇌종양을 발생 배아 개발하는 동안 기본 과정이다. EMT는 유방암, 폐암, 대장 암, 위암을 포함하는 뇌 밖에 여러 암에서 관찰되었다. EMT 중앙 이동, 침윤 및 전이 형성을 촉진하여 악성 종양에 연결되어 있습니다. EMT 유도의 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 여기에서 우리는 대뇌 피질의 신경 줄기 세포 (NSCs을) 이후 EMT 유도의 표준화 분리에 대한 체외 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 하나의 세포 이식편의 배양을 사용하는 유연성을 제공한다. 이 시스템에서, 래트 또는 마우스 배아 NSCs의 전뇌는 한정 배지에서 배양하여 혈청 효소의 결여이다. NSCs의는 oligodendroc에서 관찰 Olig2 및 Sox10, 두 개의 전사 인자를 표현YTE 전구 세포 (개 OPC). 이 시스템을 사용하여, FGF-, BMP- 사이의 상호 작용 Zeb1, Zeb2을 포함하는 TGFβ는-신호 및 Twist2는 TGFβ 활성화가 크게 상승 BMP- / TGFβ 상호 작용을 제안, 세포 이동을 강화 여기서 관찰되었다. 결과 EMT 유도 및 유지에 관여하는 것으로 FGF-, BMP- 및 TGFβ-시그널링 네트워크 가리. 이 모델 시스템은 시험 관내에서 EMT를 조사 관련이있다. 그것은 비용 효율적이고 높은 재현성을 보여줍니다. 또한, 그 이전의 응답에 대한 (정량적 거리 측정)을 억제하거나 EMT (정량적 측정)을 향상시키기 위해 화합물의 높은 처리량 스크리닝과 상이한 화합물의 비교를 허용한다. 이 모델은 따라서 잘 EMT에 영향을 미치는 물질 약물 라이브러리를 테스트하는 데 적합합니다.
Introduction
배아 발달의 여러 단계 동안, 상피 세포가 서로 (예를 들어, 꽉 접합)에 강한 준수를 잃고 중간 엽 전이 (EMT) 1 과정이라고 상피의 철새 표현형을 획득. EMT는 같은 간엽 세포 신경 능선 부가적인 세포 유형의 형성 상기 (2)로부터 neuroepithelium 편석 인구 요구된다. EMT는 배아 단계 동안 만 중요하지만 병변 4 탈수 초성 이러한 상처 치유 (3) 및 중추 신경계 (CNS)와 재생 성인 유기체의 생리 학적 과정을 유지할 성인기 이후 단계에서 요구되지 않는다.
상피 종양은 궁극적으로 암의 진행 1,3로 이어지는, 이동, 침윤 및 전이에 대한 개시 단계로 EMT를 활성화하는 것으로 알려져있다. EMT는 참으로 중앙에서 강력한 마이그레이션 1,3에 연결되어 있습니다. C의 세포 단계onditioning, 시작 겪고 및 EMT를 유지 완전히 이해하고 추가 조사가 필요하지 않습니다.
여기서, 정의 된 성장 인자와 미디어 (NO 혈청 효소없이 사용)와 NSCs을 기반으로하는 표준 시험 관내 EMT 모델 시스템이 제공된다. 이 모델 시스템은 EMT 작업 과학자 관련이있다. 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 단백질 가족 모두 개발 및 질병 1 EMT에 중요한 것으로 나타났다. 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 가족도 제공 시스템에 참여하고 있습니다. 이 시스템은 일반적으로는 EMT EMT 유도시 초기 사건의 연구에 특정 이점을 제공받지 않는 전뇌의 특정 영역에 기초한다.
같은 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 단백질과 같은 키 EMT의 유도가, 또한 CNS 외부 조직 시스템에서 EMT에서 발견되기 때문에 모델 시스템은 잠재적으로, 중추 신경계 외부 상피 세포의 EMT 연구에 적용 할 수 있습니다. 이 모델의템은 특히 줄기 세포의 일반적 특징과 EMT을 연구 개발 피질에서 NSCs을의 표준화 분리 할 수 있습니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 NSCs의 절연 유도 EMT 및 FGF2 및 BMP4의 영향 하에서 후속 이동을 연구 하였다. 우리는 FGF-따라서 모델 시스템의 유효성을 검사, 세포의 이동을 촉진하는 TGFβ가-신호와 상호 작용을 BMP는-신호 관찰.
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Protocol
모든 동물의 절차는 '실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드'(NIH 간행물, 제 8 판, 2011) 다음과 바젤의 동물 복지위원회 (동물의 관리 및 사용에 대한 스위스 가이드 라인)에 의해 승인되었다. 이 가이드 라인에 의해 동물의 프로토콜은 "가장 낮은 동물 심각도 등급"으로 간주됩니다.
확장 중간 1. 준비
참고 : 조직 문화에 대한 표준으로 무균 상태에서 작업 할 수 있습니다.
- 두 15ml의 관을 가지고, 5 L 글루타민이없는 DMEM / F12 ㎖의 추가 (1 : 1) 500 ml의 배지 병에 15ml의 두 튜브를 각각. 처음 15 ML 튜브에 50 mg의 인간 아포 트랜스페린, 퓨 트레 신 1 M 재고 (0.1 mM의 최종 농도) 50 μl의 나트륨 셀레늄 500 μM 재고 (최종 농도 30 nM의) 30 μl를 추가합니다.
- 일본어 DMEM / F12 병에 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터.
- 제 15 ML 튜브에, 12.5 mg의 인슐린을 추가합니다. 더하다6-1 M의 NaOH 9 삭제합니다. 소용돌이는 완전히 인슐린을 용해한다. 일본어 DMEM / F12 병에 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터.
참고 : 수산화 나트륨은 독성과 부식성이다. 보호 장갑, 코트, 안전 고글을 사용합니다. - DMEM / F12 배지 병에 5 ml의 페니실린 (10,000 단위 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (10,000 μg의 / ㎖) / 암포 테리 신 B (25 μg의 / ㎖)를 추가합니다.
- 글루타민을 함유하는 5 갓 해동 200 mM의 L- 글루타민 재고 용액 또는 올리고 추가 (200 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민 디 펩티드)를 DMEM / F12 배지 병에 관한 것이다.
- 잘 흔들어. 50 ㎖ 분취 액을 준비합니다.
주 : 확장 배지는 4 ℃에서 약 2 주 동안 저장 될 수있다. 분주 튜브는 500ml의 병에 보관 매체에 비해 낮은 pH 변화를 보여줍니다.
과 Passaging 중간 2. 준비
- Mg를 2 + - 무료 HBSS 미디어, 990.85 mg의 포도당 (5 mM의 최종 농도) 및 840.10 mg의 추가의 NaHCO3 3 - 2 + 1 L 칼슘에 주 : 계대 배지를 4 ℃에서 최소 4 주 동안 저장 될 수있다.
성장 인자 3. 준비
- 1 % BSA (PBS-BSA) 단독 또는 4 mM의 (PBS-BSA 염산)의 염산 (HCL)을 멸균 PBS 1X 준비한다.
주의 : 염산 부식성 및 독성이 특별한 안전 대책 (코트, 고글, 장갑, 후드)가 필요합니다. - 녹여 10 μg의 / ㎖ 재조합 인간 섬유 아세포 성장 인자 2 PBS-BSA에서 (rhFGF2) (10 NG / ml의 최종 농도), 10 μg의 / ㎖ 재조합 인간 골 형태 형성 단백질 4 PBS-BSA에서 (rhBMP4) (최종 10 NG / ㎖ PBS-BSA 염산 1 (rhTGFβ1을 β 농도), 20 μg의 / ㎖ 재조합 인간 변형시키는 성장 인자) (40 NG / ml의 최종 농도).
- 소독을 필터링하지 마십시오. 분취 량을 준비합니다.
주 : 성장 인자 분취 량으로 저장 될 수있다-20 ° C에 대한 최소 2 년.
- 소독을 필터링하지 마십시오. 분취 량을 준비합니다.
세포 배양 접시의 4 코팅
- 250x PLO 주식을 준비하는 1875 mg의 폴리 - L - 오르니 틴 500 ml의의 (PLO) 증류수 H 2 O를 녹여. 필터는 0.2 ㎛의 주사기 필터를 이용하여 멸균, 2 ml의 분취 량을 만든다.
주 :이 분취 량을 최소 2 년 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. - 1000 배 피브로넥틴 주식을 준비하기 위해 1 ml의 멸균 증류수 H 2 O 1 mg의 소 피브로넥틴을 녹인다. 이 끈적 끈적한 단백질을 응고 수 있으므로 와동하지 마십시오. 10 분 동안 손으로 부드럽게 흔들어.
- 가끔 진탕 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 완전히 용해를 확인합니다. 피브로넥틴의 완전 용해 미만 37 ° C의 솔루션을 따뜻하게. 하지 마십시오 필터 - 소독.
주 : 용액 최대 6 개월 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
- 가끔 진탕 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 완전히 용해를 확인합니다. 피브로넥틴의 완전 용해 미만 37 ° C의 솔루션을 따뜻하게. 하지 마십시오 필터 - 소독.
- 필요로 플라즈마 전처리 플라스틱 세포 배양 접시 (100mm 또는 다른 크기를 사용할실험). 마이그레이션을 평가하기 위해, 500 μm의 그리드와 35mm 요리를 사용합니다. 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 12 시간 동안 2 ml의 1 배 PLO와 하룻밤 요리를 품어. PBS 1X 2 ㎖로 두 번 씻으십시오.
- 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 12 시간 이상 동안 음식을 2 ㎖의 1X 피브로넥틴 (1 μg의 / ㎖ 최종 농도)를 첨가하고, 배양한다. 그냥 세포를 도금하기 전에 피브로넥틴을 제거합니다.
주 : 피브로넥틴 피복 된 접시를 37 ℃에서 적어도 2 주 저장 될 수있다.
5. 표준화 해부과 두피 뇌실 영역의 준비 (SVZ)
- 쥐 배아 일 14.5 (E14.5, 스프 라그 - 돌리)와 마우스 E13.5 (C57BL / 6) 시간 제한-결합하여 배아를 가져옵니다. 8시 다음날 아침까지 18 : 00 ~ 동물 메이트. 상대의 날 후 정오 E0.5 간주됩니다.
- 5 % 아이소 플루 란과 0.8 L / 분 산소 흐름을 임신 동물을 마취. 날카로운 DISS와 발 압축에 의해 응답을 확인ection 집게. 동물의 목을 벨. CO 2 세포 복구 줄기에 영향을 미치는으로 CO 2 질식을 피하십시오.
- 제왕 절개에 의한 배아를 검색합니다.
- 부정사 위치에 동물을 배치하고 70 % 에탄올 모피를 소독. 자궁 위의 하복부에 약 8cm의 V 모양의 피부 절개를 만들기 위해 수술 집게와 가위를 사용합니다. 그대로 근육 벽을 유지하면서 모피 만 피부를 절개.
- 복막를 입력 근육과 복부 근육 벽을 절개하는 신선한 집게와 가위를 사용합니다.
- 낮은 후방 복막의 자궁을 확인합니다. 주변 조직에서 날카로운 분리하여 자궁을 제거합니다.
- 얼음처럼 차가운 1X PBS의 멸균 1X PBS와 배아와 장소 자궁을 씻으십시오.
- (배 확대, 그림 1B) 해부 현미경으로 배아에서 배아를 분리합니다 자궁 벽을 열 뾰족한 가위를 사용합니다. (배아 껍질을 제거하는 포셉 한 쌍을 사용하여
- 개발 쥐 신경계 5 아틀라스하여 올바른 발달 단계를 확인합니다. 올바른 배아 크기는도 1b에 도시된다.
- 도 1a에 도시 된 바와 같이 쥐의 앞다리 (FL)에 자리 형성을 시작의 존재에 의해 더 정확한 나이를 확인합니다.
참고 : 뒷다리 (HL)이 아직 자리 분리 (그림 1B)를 표시하지 않습니다.
- 해부를 들어, 얼음처럼 차가운 1X PBS로 가득 코팅 배양 접시에 배아를 전송합니다. 멸균 미세 집게를 사용 (20X 배율 3 배) 스테레오 해부 현미경 해부를 수행합니다.
참고 : 페트리 접시 플라즈마 코팅 된 세포 배양 접시 일어날 수 있으므로 접시 표면에 조직의 부착을 방지 할 수 있습니다. 날카롭게 텅스텐 와이어 바늘 또는 유사한 또한 해부의 특정 단계에 대한 도움이됩니다. - INTE에서 시작하여 두피와 두개골을 제거현상 신경관 (도 1C)에 액세스하기 위해 전방 및 후방 두 집게 동시에 당겨 현상 telencephalon (TEL)와 간뇌 (DI) (도 1b)의 rsection.
- rhombencephalon에서 중뇌 (MES)를 분리, 중뇌 - 후뇌 경계 (MHB, 그림 1B-D에서 검은 색 화살표 머리)를 확인합니다. 다만이나 MHB (그림 1D, 삼각형 화살표) 아래 rhombencephalon을 잘라.
참고 : MHB에서 추가 피하 공간은 신경관에 손상을주지 않고 피부의 제거를 용이하게한다. - 얼굴 골격 (그림 1E)와 두개골 기지에서 telencephalon / 간뇌 사이의 연결을 단절. 이 telencephalon, 간뇌와 중뇌 (TEL-DI-MES) (그림 1 층-H)를 포함하는 블록을 초래한다.
- 얼음에 확장 매체에 TEL-DI-MES 블록을 전송합니다. 이 COMPLET 유지엘리 코팅되지 않은 페트리 접시에서 확장 매체에 덮여. NSCs의와 대뇌 피질의 SVZ 들어있는 telencephalon에 손이 닿지 않도록 포셉 한 쌍의와 중뇌에서 블록을 잡으십시오.
- 반복 5.5 모든 배아 (그림 1 층-H)와 5.8 단계를.
- 한 이동 전화-DI-MES 신선한 얼음처럼 차가운 1X PBS에 차단합니다. 도 1I에 나타내는 바와 같이, 간뇌에서 중뇌 분리, 중뇌 전방 (도 1F-H)에서의 점선을 따라 절단.
- 그림 1 층에있는 점선을 따라 절단하여 TEL에서 DI를 분리합니다. 그림 1J에서 격리 telencephalon를 참조하십시오.
- 그림 1J의 점선을 따라 절단, 두 telencephalic 반구를 분할합니다. 도 1K에 도시 된 바와 같이이 두 분리 된 반구 초래한다.
참고 : 왼쪽 반구는 그림 1L로 확대됩니다. - 중간 갱을 확인lionic 예하 (MGE,도 2a *) 및 측면 신경절 예하 (LG 전자, 그림 2A +) 미래 난원 공의 interventriculare 통해 볼.
- 집게 나 바늘을 사용하고 MGE LGE와 전방 피질 (CTX 개미도 2B)과 교차하는 직선을 따라 절개. 피질, 해마 (엉덩이) 및 맥락막 총 (CP)을 통해 직선을 잘라. 이것은 (GE 2B, C 피규어)가 신경절 예하의 후각 망울 (OB)를 포함하여 전방 피질을 분리한다.
- 다시 피질, 해마 및 맥락막 신경총을 통해 절단, 꼬리 신경절 예하 (CGE, 그림 2C, D) 및 후방 피질 (그림 2C)의 교차로에 두 번째 직선을 잘라.
- telencephalon을 평평하게. 완전히 후방 극과 후각 망울 (그림 2D)를 제거합니다. 확인이전 -6,7- 정의 해마 및 맥락총 (도 2C)를 포함하는 외피 밑단.
참고 : 해마는 대뇌 피질보다 얇은 neuroepithelium 있습니다. 공산당은 붉은 혈관을 포함하고 있습니다.- 신경절 예하 (그림 2D)의 크기와 동일 피질의 크기를 떠나, 피질에서 대뇌 피질의 밑단을 분리합니다. 이 외피 (표적 조직) 및 신경절 예하 (GE,도 2d)의 블록을 초래한다.
- 접시 표면에 심실 (내부)면 피질-GE 블록을 뒤집습니다.
참고 : 반구의 외부 표면이 실험 (그림 2E)를 직면하게 될 것이다. 외면 혈관 함유 수막 (도 2e)가있다.- 왼쪽 손으로 접시 표면에 GE 핀과 (오른쪽 (지배) 손에 집게 한 쌍의 그림 2 층을 수막을 벗겨 참고 : 수막이 강하게 피질을 준수하기 때문에 이것은 기술적으로 가장 까다로운 단계이다. 피질에서 수막의 분리 단계 5.13.1 및 5.14에서 완전히 직선 (들쭉날쭉하지 않음) 절단에 의해 촉진된다.
- 반복 다른 반구 모든 배아에 대한 5.16로 5.12 단계를 반복합니다. LG 전자 (그림 2G, 2H)의 절반 주요 직경의 거리에서 LG 전자를 따라 피질을 잘라. 해부 피질은 1.2 mm X 2.4 mm (그림 2H)의 영역에 걸쳐 하 NSCs의와 SVZ / 새싹 층을 포함한다.
이식편 문화 6. 준비
- 이하 400 μm의 직경 (그림 2I)의 외식으로 피질을 잘라. 참조 (그림 2H 및 2I)에 대한 해부 페트리 접시 아래에 위치 400 μm의 그리드 (보충 그림 1)를 사용합니다. 얼음 공동으로 신선한 페트리 접시에 모든 외식 이동LD 확장 매체.
- 조직 배양 접시 (단계 4.4)에서 피브로넥틴를 제거합니다. 이 건조하도록 허용합니다. X 10mm 10mm (그림 3)의 격자 크기와 35mm 요리의 중심에 찬 확장 매체의 1 ML을 추가합니다. 매체가 구형 드롭 (그림 3)을 형성 할 수 있습니다.
- 드롭의 중심으로 8 외식까지 삽입합니다. 외식이 이상적으로 마이그레이션 분석을위한 서로 간의 최소 3 mm 거리에 그리드에 위치해야한다 (8 항 참조).
- 외식의 부착을위한 세포 배양 인큐베이터에서 약 1 시간 (37 ° C, 21 % O 2, 5 % CO 2)에 접시 부화. 외식 정착 및 피브로넥틴 코팅 표면에 부착 할 수 있습니다. 외식을 분리하고 최적의 그리드 센터의 이사 수 있기 때문에, 요리를 흔들지 마십시오.
- 1 시간 배양 후 (37 ° C, 21 % O 2, 5 % CO 2), 2 mL의 팽창 매체의 총 부피 플러스 성장 F에 접시를 채워배우 또는 관심의 물질 테스트하고 부화합니다.
참고 : 어느 효소 소화 않으며, 혈청 또는 원심은 이식편 준비를위한 필요하다. 이것은 세포의 무결성에 최적입니다.
NSC 단일 세포 배양 7. 준비
- 37 ° C의 확장 및 계대 매체를 따뜻하게.
- 차가운 확장 매체 (튜브 A)와 15 ML 튜브로 (단계 5.17)에서 해부 피질 조각을 전송합니다. g X 1,200에서 5 분 동안 피질 조각을 원심 분리기. 뜨는을 대기음. 피질 조각을 재현 탁 200 μL 사전 예열 확장 매체를 추가합니다.
- P1,000 팁 (튜브 A)와 15 ML 튜브에 미리 예열 계대 매체의 700 μl를 추가합니다. 조심스럽게 펠렛을 재현 탁. 15 ML 튜브의 하단에있는 팁을 놓습니다. 조심스럽게 천천히 P1,000 팁 3 회 흡입하여 조직편을 해리.
주 : 배지 계대하는 세포의 분리를 촉진하는 효소의 사용을 피하는 것이 요구된다. - 튜브 하단에 정착 큰 (무거운) 해리되지 않은 부분에 대한 30 ~ 60 초 동안 앉아 할 수 있습니다. 단일 해리 세포 상등액에 남아 있습니다. 신선한 15 ML 튜브 (튜브 B)에 상층 액 700 μl를 전송합니다.
- 반복 7.3과 7.4은 더 큰 조각을 해리 단계를 반복합니다.
- 반복 7.3과 7.4에게 더 큰 조각을 떼어 놓다하는 두 번째 단계를 반복합니다. 신선한 15 ML 튜브 (튜브 B) 모든 뜨는을 전송합니다.
- 5 ML의 총 부피로 팽창 매체를 추가합니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 트리 판 블루 염색에 의해 죽은 세포를 평가합니다.
참고 : 작은 NSCs의 큰 세포보다 7.2 7.6 단계를 용납. 10 배아에서 10 %의 죽은 세포와 약 4 × 10 6 세포를 기대합니다. - NSCs의 확대, 8 mL의 팽창 매체의 부피 10cm의 피브로넥틴 - 코팅 된 조직 배양 접시에 1.5 × 106 세포를 접시. 표준 확장을 위해, 1000 배 rhFGF2 주식의 8 μl를 추가합니다. 매일 rhFGF2 μL 8을 추가하고 나를 변화매일 디아.
참고 :이 발달 단계에서의 피질은 NSCs의 대부분과 분화 된 세포의 소수를 포함합니다. 차별화 된 소수의 세포는 rhFGF2 처리에 대응하고 확장 문화 동안 죽지 않습니다. - 항로는 60 %의 합류에 NSCs을 확장.
- 통로 NSCs을 위해 확장 매체를 제거합니다. 신속하게 세척 세포 5 ML의 계대 매체로 3 회. 4 분 - 2 기다립니다. 칼슘 + 마그네슘과 2 + 세포없이 천천히 반올림, 표면에서 분리합니다. 위상 현미경으로 세포의 분리를 확인합니다. 필요한 경우 표면에서 시각적으로 분리 관찰 될 때까지, 또 다른 몇 분 정도 기다립니다.
단일 세포가 완전히 분리되지만, 대부분의 세포는 여전히 접시 표면에 부착됩니다합니다. 분리에 필요한 시간은 피브로넥틴 피복의 길이에 의존한다. 짧은 피브로넥틴 코팅 (12 시간 이하) 빠른 세포 분리가 발생합니다. 더 이상 실험 (>; 일주) 이상 24 시간의 피브로넥틴 코팅을 권장합니다.
- 통로 NSCs을 위해 확장 매체를 제거합니다. 신속하게 세척 세포 5 ML의 계대 매체로 3 회. 4 분 - 2 기다립니다. 칼슘 + 마그네슘과 2 + 세포없이 천천히 반올림, 표면에서 분리합니다. 위상 현미경으로 세포의 분리를 확인합니다. 필요한 경우 표면에서 시각적으로 분리 관찰 될 때까지, 또 다른 몇 분 정도 기다립니다.
- 부드럽게 표면에서 세포를 분리하기 위해 10 ML의 피펫을 사용합니다. 세포 5 ML의 계대 매체를 수집하고 신선한 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 계대 매체에 추가로 5 ㎖의 반복.
- 상기 튜브의 하단에 10 ㎖ 피펫을 배치 최대 피펫 팅하여 3 회 다운 15ml를 튜브에 세포를 해리. 실온에서 1,200 × g으로 15 분 동안 튜브를 스핀. 상등액을 제거하고 2 ml의 확장 배지에서 펠렛을 재현 탁. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 죽은 세포를 평가하기 위해 트리 판 블루를 사용합니다.
참고 : 60 % 합류로 전개 후, 4 기대 - 10 %에서 죽은 세포 수 5 × 106 세포. - 판 더 구절에 대한 10cm 접시 당 8 × 10 5 세포.
8. 마이그레이션 평가
- 마이그레이션 평가를 들어, 외식에서 제 5 절 종자에 따라 외식을 분리35mm 그리드 요리. 한 시간 도금 후, FGF2 (rhFGF2)를 추가합니다. 2 일 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
참고 : 최적의 이식편 첨부를 들어, 요리를 이동하지 마십시오. - 1000 μL 팁으로 매체를 제거합니다. 1000 μL 팁 내부 원에서 시작한다 (그림 3)에 의해 확장 매체의 2 ML을 추가합니다. 이 외식에 표면 장력을 감소시킨다.
- 실험을 위해 필요에 따라 단독으로 또는 조합하여 성장 인자를 추가한다. FGF2 / BMP4 / TGFβ1 긍정적 컨트롤을 사용합니다. 참고 :이 실험에서, 35mm 접시 당 2 μL의 FGF2, 2 μL BMP4, 4 ㎕를 TGFβ1 단독 및 조합 (그림 5)에 추가되었습니다.
- 추가 요소 및 / 또는 검증 가능한 물질을 추가합니다. 37 ℃에서 2 일간 다시 손길이 닿지 않은 요리를 유지합니다.
- 거꾸로 현미경에 외식의 사진을 가져 가라.
참고 : 리빙 이식편 고정 세포보다 위상차 이미지를 얻었다. 모두 사용될 수있다. - 마이그레이션평가 화소 측정 할 수있게 해주는 그래픽 소프트웨어 (예, 피지 8)을 사용한다.
- 픽셀에서 500 μm의 거리의 요리 그리드를 측정하고 내부 레퍼런스로 사용합니다.
- 이동 시작점으로서 이식편의 중심을 정의한다. 이식편의 중심 (10) 셀의 최 군 사이의 거리를 측정한다.
참고 : 모든 세포는 원심 멀리 이식편에서 이동한다. 그들은 자발적으로 테스트 환경 (그림 5)에서 주변에있는 시트를 형성한다.
9. 침략 평가
- 프로토콜 제 4 항에있어서, 피브로넥틴 코팅 조직 배양 24 웰 플레이트를 준비합니다.
- 셀 침공 챔버의 상부 우물에 따뜻한 확장 매체의 300 μl를 놓습니다. 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2의 챔버를 부화.
- 상단 아니라에서 확장 매체를 제거하고 코팅 된 24 웰 플레이트에 보이든 챔버를 배치합니다.
- 50 추가잘 아래로 0.5 rhFGF2 ㎕의 0.5 μL의 rhBMP4 따뜻한 확장 매체의 0 μL.
- 통로 NSCs의 1 4 절에서 7 통행 설명 된대로 계산이 적합하다.
- 플레이트 rhFGF2 0.3 μL와 보이든 챔버의 상부 잘 rhBMP4 0.3 ㎕의 따뜻한 확장 매체의 300 μL의 볼륨에 5 × 10 5 세포.
- 문화 24 시간의 시드 NSCs을.
- 또 다른 48 시간 동안 챔버와 문화에 세포를 추가 요소 및 / 또는 검증 가능한 물질을 추가합니다.
주 : 세포가 침입하는 경우, 이들은 잘 바닥 기저막 층을 잘 상부로부터 전달된다. 침습성 세포 보이든 챔버의 바닥에 달라 붙는 것이다. - 제조업체가 제공하는 프로토콜을 따르십시오. 두 번 청소하여 상단 잘 비 침습적 세포를 제거하기 위해 (침공 분석 키트에 포함) 면봉을 사용합니다.
- 우물에서 매체를 제거하고 500 μl를 확장 매체를 추가살아있는 세포와 웰에 핵 염색 DAPI와 세포막 염색.
- 37 ° C에서 10 분, 5 % CO 2 부화.
주 : 염료 최적 시각화 8 각각 막과 침습 세포의 핵에 통합된다. 옵션 : 여러 가지 빛깔의 면역 세포가 계획되면 세포막의 염료를 생략합니다. - 염료와 매체를 제거하고 확장 매체로 두 번 씻는다. 시각화 및 이전 8 입증 된 바와 같이 거꾸로 형광 현미경으로 침입 세포를 계산합니다.
참고 : 일부 침략 세포가 챔버의 바닥으로부터 분리 수도 그들이 코팅 된 표면에 부착 위치를 아래의 웰 표면에 떨어졌다. 완벽한 분석 웰 표면에서 세포를 포함한다. - 배지를 제거하고 10 분 동안 빙냉 신선한 4 % PFA에 세포를 고정한다. 1X PBS로 세척 배. 이전에 8-10을 설명 된 바와 같이, 침입 세포에 면역 세포를 수행합니다.
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Representative Results
이 EMT 모델 시스템은 단일 셀이나 현상 신경관의 특정 영역에서 이식편으로서 NSCs의 양의 표준화 분리에 기반 중앙 피질 (도 1 및도 2). 정량적 평가를 위해, 절편을 500 μm의 격자 배양 접시 (도 3)의 중앙에 바로 시딩 하였다. 중앙 피질에서 이식편 먼저 성장 인자 (표 1)의 상이한 조합에 추가 이틀 후, 이틀 FGF2 노출시켰다. 우리는 개발 신경 튜브의 다른 지역보다 큰 피질에서 시작되었다. 우리는 BMP4에서 배양 만 외식은 철새 응답 (표 1 및 보충 그림 2)를 보여 관찰.
다음 podoplanin (PDPN) 표현은 정의 된 조건에서 분석 하였다. PDPN는 횡단 s입니다여러 암 (11, 12) 또한 NSCs의 8에 침공과 관련 된 ialomucin 같은 단백질. PDPN 발현 세포의 비율은 고급 교종 (13)에서 증가된다. PDPN은 아교 모세포종 환자 14 가난한 생존과 연관되어 있습니다. 또한, PDPN 유방암, 폐암, 대장 암 (15, 16)를 포함한 여러 종양에서의 악성 진행 마커 것으로 나타났다. PDPN는 침략과 철새 NSCs의 8에 모두 표시됩니다. 상기 프로토콜을 사용 PDPN 발현이 대조군과 비교하여, FGF2 만 TGFβ1 BMP4 단독으로 또는 이들의 조합에 노출 이식편이다. PDPN 발현은 모든 BMP4 및 TGFβ1 / BMP4 처리 외식 검출되었다. 대조적으로, 더 PDPN 단독 FGF2 또는 단독 TGFβ1 (표 2 및도 4)과 이식편의 제어 이식편에서 관찰되지 않았다. 또한 철새 표현형 세포는 BMP4 및 TGFβ1 / BMP4- 유도 하였다노출 외식, 제어 외식 (만 FGF2)와 TGFβ1 반면 단독 철새 세포 (표 1)을 보여주지 않았다. 철새 세포의 관찰은 저렴한 비용으로, 직선 앞으로 질적 평가를 제공합니다.
또한, 우리는 BMP4 (표 2)에 개발 신경 튜브의 여러 지역의 철새 응답 및 EMT 유도를 테스트했다. 도 1에 나타낸 바와 같이 400 μm의 이식편은 중앙 피질 후부 피질 (표지 극부)는 MGE 및 중뇌로부터 제조 하였다. 체외 이식편의 모든 BMP4와 FGF2 이틀하여 이틀 FGF2 노출 관찰 하였다 . 마이그레이션은 선행 및 후행 에지 (그림 5와 보충 그림 2)와 평면 철새 세포의 모양에 의해 정의되었다. 후방 피질에서 철새 세포의 강력한 유도 및 MGE와 MES에서 중간 응답encephalon (표 2)를 관찰 하였다. 중앙 피질의 146 절편의 145 FGF2 / BMP4의 철새 반응을 보였다. 따라서, 중앙 피질 테스트 모두 이식편 (표 2) 이동성 세포의 가장 강력한 유도를 보였다. BMP4의 생략은 이동성 응답 폐지 (표 1 및도 2를 참조하면, 데이터는 도시하지 않음).
성장 인자의 효능의 정량적 평가를 위해, 이동 거리가 다중 성장 인자에서 배양 된 체외 이식편에서 측정 하였다. 외식 요인 (제어) 또는 단일 또는 결합 BMP4 및 TGFβ1없이 다음 FGF2의 추가 이틀 동안, FGF2에서 이틀 동안 상기와 같이 배양 하였다. 예상대로 제어 이식편에 강한 증식, FGF2에 응답하여 관찰 하였다. 외식은 대뇌 피질의 SVZ에서 파생 FGF2 (17)에 대한 응답으로 증식하는 것으로 알려져있다 상당 부분의 NSCs의에 포함된다. 제어 가전LLS는 ± 14 689의 TGFβ1 세포를 582 ± 49 μm의 (그림 5)에 도달. BMP4 그룹은 935 ± 91 ㎛의 평균 이동 거리를 보였다. 비교에서 TGFβ1 / BMP4 세포는 크게 더 마이그레이션 1,150 ± 23 μm의 (그림 5)이다. 결과는 BMP4가 FGF2 노출 NSCs을의 이동을 유도하는 것을 보여줍니다. 이 마이그레이션 더 TGFβ1 의해 향상 될 수있다. FGF2, BMP4 및 TGFβ1의 결합은 따라서 이동을 유도하기에 가장 효과적이다. 요약하면, 세포 배양 모델 시스템 모두 정성과 정량 마이그레이션 평가를 허용한다.
EMT는 Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, Twist1, 유방암, 대장 암, 폐암 등의 상피 세포 암을 비롯한 다양한 시스템에 Twist2 같은 전사 인자 (TFS)에 연결되어 있고 또한 뇌는 1,18를 종양이. 우리 시간광고는 이전에 해당 FGF2를 표시하고 BMP2 또는 BMP4는 Snail1 및 Snail2 8,9를 유도 할 수있다. 상기 시스템을 사용하여, 우리는 다른 EMT 관련과 TF의 발현 수준을 조사 하였다. Twist1 식의 변경이 검출되지 않았다; Twist1 FGF2가 노광 중에 낮은 발현 수준 인 상태 (데이터는 보이지 않음). 세포 배양 모델에서 FGF2 / BMP4 노출 동안 FGF2 노출시 및 Twist2의 Zeb1 및 Zeb2의 상향 조절 (그림 6)이 관찰되었다.
NSCs의이 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (개 OPC) 8,19,20의 인구에 기여하는 것으로 알려져있다. 증거의 여러 라인 NSCs을 특히 개 OPC에서이 신경 교종 (21, 22)에 대한 기원의 세포 수 있음을 나타냅니다. 상기 상기 모델을 특성화하기 위해 OPC 마커의 발현을 조사 하였다. 우리는 FGF2 노출 NSCs의이 Olig2 / 네 스틴의 공동 발현을 입증 관찰D Sox10 90 % 이상에서 / 네 스틴 (그림 7). 이러한 관찰은 NSCs을 우리의 시스템에서 OPC-기능을 보여 있음을 보여줍니다. 실제로 Zeb'1 및 Zeb'2의 상향 조절과 상호 관련된 OPC-기능 (도 6 및도 7). 이러한 결과는 동시에 제 Hogan 박사가 EMT 단계 기반 시작하면서 Olig2 및 Sox10 판단으로 FGF2 팽창이 OPC 신원을 추론 제안.
NSC의 분리 및 EMT 유도를위한 표준화 된 배아와 Forebrain의 해부 : 그림 1. (A) 제왕 절개 후 쥐 E14.5 배아의 왼쪽 앞다리. 모든 선수 사지 자리는 검은 색 화살표의 끝 표시됩니다. E14.5에 대한 전형적인부터 자리 형성을합니다. 선체 제거 후 (B) 쥐 E14.5 배아를. 등쪽 간뇌 w에서 해시 (#)를 참고HICH 피부 / 두개골 anlage의 제거를 시작하는 데 이상적이다. 피부 / 두개골이 이미 대부분 (C)를 제거한다. 제거 및 제거되지 않은 피부 사이의 경계는 두 개의 삼각형 화살촉으로 표시됩니다. 피부는 후방 화살표에서 전방 전방 화살표에서와 후방 박리 할 수있다. (D) 피부 / 두개골은 이제 완전히 제거됩니다. 화살촉 표시, 여기에 바로 꼬리 쪽 중뇌 - 후뇌 경계 (화살표)과 컷의 노치를합니다. (마) telencephalon - 간뇌 - 중뇌는 (TEL-DI-MES) 블록은 배아의 나머지 부분에서 제거 . (F) TEL-DI-MES 블록의 우수한보기. 두개골이 남아 있습니다. (G) 오블 리크보기 위에서. TEL-DI-MES 블록 (H) 열등한보기를. (I)가 중뇌 및 간뇌의 일부 간뇌의 앞쪽 부분과 telencephalon에서 분리된다. 탑 : 모두 telencephalic 소포의 전방보기. 아래 : 맞. 중뇌의 측면보기를 T, 상단에는 두개쪽으로 향 (J) 최고 : 간뇌없이 telencephalic 소포 모두. 열등한보기는 간뇌의 완전한 제거를 설명합니다. 별표는 MGE를 보여줍니다. 아래 :. 간뇌의 앞쪽 부분 (K) 위쪽 : 두 반구는 반구 균열에서 분리된다. 왼쪽에 왼쪽 반구. 별표는 MGE를 보여줍니다. 플러스 기호는 LG 전자를 나타낸다. 중간 볼 수있는 왼쪽 반구의 (L) 확대. 오른쪽 얼굴 두개쪽으로, 상단은 각각 지느러미, 아래 복부,이다, 꼬리 쪽 떠났다. 별표 (*)는 MGE에 있습니다. 플러스 기호 (+)를 LG 전자에 있습니다. 채널, 대뇌 피질의 밑단; FL은 앞다리; 디, 간뇌; MES, 중뇌; MHB, 중뇌 - 후뇌 경계; HL, 뒷다리; LG 전자, 측면 신경절 예하; MGE, 중간 신경절 예하; 산부인과, 후각 망울; PC, 후방 피질; (ρ), rhombencephalon; 전화, telencephalon. 모든 이미지의 그리드는 얇은 선으로 네 개의 교차 2 mm 두께의 선을 보여줍니다 모든400 μm의. 모든 이미지에 스케일 바 :. 2mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : NSC 절연 및 EMT 유도를위한 표준화 두피 SVZ의 해부. (A) 왼쪽 반구의 중간 볼 수 있습니다. 먼로 MGE 전자와 LG 전자의 난원을 통해 별표와 더하기 기호로 표시, 볼 수 있습니다. (B) 후각 망울 단지 두개쪽으로 MGE - LG 전자의 제거된다. (C) 피질의 후방 기둥이 바로 CGE 뒤에 제거 . (D) 위쪽 : 대뇌 피질의 밑단은 피질에서 분리된다. 왼쪽 : 후방 극. 중간 : 피질 및 CGE-LGE-MGE 블록의 중앙부를 포함하는 복합체. 오른쪽 MGE 전자와 LG 전자의 얼굴. 오른쪽 : 후각 BUL나. (마) CGE-LG 전자-MGE - 피질 블록은 수평으로 반전된다. 이제 telencephalon의 외면 현미경에 직면하고있다. MGE 전자와 LG 전자는 이제 왼쪽에 직면하고있다. (F)를 붉은 수막 밝은 반투명 피질에서 제거됩니다. CGE-MGE - LG 전자 - CTX 블록은 지금 같은 방법으로 오른쪽 반구을 반복한다 다음 단계. (G, H) 다시 수평으로 반전된다. 중앙 피질은 멀리 CGE-MGE - LG 전자 블록에서 분리된다. 두 개의 화살표과 함께 CGE-MGE - LG 전자 블록에서 왼쪽으로 표시되는 중간 피질 영역이 있습니다. 이 중간 피질 두께는 LGE의 직경의 절반에 해당한다. LG 전자-CGE과 대뇌 피질 사이의 경계를 나타내는 점선. (I) 중앙 피질 미만 400 μm의 직경의 외식으로 분리된다. 스케일 바 : 2mm; 모든 이미지에 그리드는 네 개의 교차점 (가는 선)마다 400 μm의 2 mm 두께의 선을 보여줍니다. 별표 (*)가 위치하는t MGE. 플러스 기호 (+)를 LG 전자에 있습니다. 요약 : 개미-CTX, 전방 피질; CEN-CTX, 중앙 피질; CGE, 꼬리 신경절 예하; 채널, 대뇌 피질의 밑단; CP, 맥락막 총; CTX, 피질; LG 전자, 측면 신경절 예하; 남자, 수막; MGE, 중간 신경절 예하; 산부인과, 후각 망울; PC, 후방 피질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 이식편 시드 35mm 그리드 세포 배양 접시 위에는 500 μm의 그리드 요리의 중심에 확장 배지 1 ㎖를 놓습니다. 드롭은 격자 림 (작은 화살표)가 포함되어 있습니다. 바로 1 ml의 드롭의 중심에 배치 외식. 외식가 그리드 외부 확산되면 SW천천히 원을 그리 접시를 IRL과 외식은 구심력에 의해 중앙으로 이동합니다. 참고 : 외식은 거의 보이지 눈 (검은 색 화살표 머리)에 의해입니다. 스케일 바 : 35mm.
도 4 :. PDPN는 BMP (4)의 존재로 유도된다 체외 이식편 프로토콜 부 (8) (FGF2의 이일 만 다음 바와 같이 인자 FGF2 하였다)에 따라 배양 하였다. 경보 장치 (A) (혼자 FGF2) 및 TGFβ1 (C)는 이식편 PDPN 양성 세포 (녹색)가 포함되어 있지 않았다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색된다. BMP4 (B) 및 TGFβ1 / BMP4은 (D)는 이식편 PDPN 양성 세포를 높은 비율을 보였다. 이식편 센터는 왼쪽, 오른쪽 주변에있다. 참고 : PDPN 양성 세포는 대부분 foun이었다주변부 아닌 이식편의 중심 D. 아첨 포함 된 TGFβ1 / BMP4의 외식은 더 PDPN 양성 세포를 정교. (E) 다른 조건에서 외식에 PDPN 양성 세포의 비율을 표시됩니다. 제어 및 TGFβ1 모두 BMP4와 조건에서 크게 다르다. 수단은 SEM ± 표시됩니다. TGFβ1 대 관리는 중요하지 (NS)입니다. BMP4 대 제어 및 TGFβ1 : P <0.0001 (***). TGFβ1 / BMP4 대 TGFβ1 : P <0.0001 (***). TGFβ1 + BMP4 대 BMP4는 중요하지 않습니다 : P = 0.0981 (NS). TGFβ1 + BMP4 대 제어 : P <0.0001 (***). 모든 이미지 스케일 바 (A)에 도시 된 바와 같이 :. 50 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 정량적 마이그레이션 평가. 혼자 TGFβ1에서 BMP 4 TGF는 셀 마이그레이션에 1 쇼 첨가제 효과 β.의 Explants 프로토콜 섹션 혼자 BMP4 8. (A) 제어 이식편. (B) 이식편에 따라 배양 하였다. (C) 이식편. (라)에서 이식편 μm의에서 TGFβ1 및 BMP4의 조합. (E) 마이그레이션 거리. 500 μm의 그리드는 기준으로 사용 하였다. 대조군과 TGFβ1 이식편은 다른 조건에서보다 큰 직경 이식편 강한 증식을 도시한다. 수단은 SEM ± 표시됩니다. BMP4 및 TGFβ1 / BMP4 외식가 부분적으로 이식편 코어를 분해하고 세포를 원심 그것에서 멀리 이주합니다. TGFβ1 대 관리는 중요하지 (NS)입니다. TGFβ1 대BMP4 : P = 0.0353 (*). BMP4 대 제어 : P = 0.0351 (*). TGFβ1 + BMP4 대 BMP4 : P = 0.0372 (*). TGFβ1 + BMP4 대 제어 : P <0.0001 (***). 스케일 바 : 500 μm의. 이식편의 센터는 더하기 기호 (+)로 표시됩니다. 마이그레이션 세포의 바깥 쪽 가장자리가 삼각형 화살표로 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 :.. QRT-PCR에 의해 전사 인자를 EMT 관련 EMT는 Zeb-와 트위스트 - 가족의 핵심 전사 인자에 링크의 상향 조절 (A, B) Zeb'1 및 Zeb'2 첫 번째 단계 상향 조절했다 FGF2 노출의. (C) Twist'2는 SECON 동안 상향 조절했다FGF2 / BMP4 노출의 D 단계. QRT-PCR에 기초하여 상대적인 발현 수준을 나타내었다 (N = 2). mRNA 발현 수준은 GAPDH로 정상화 하였다. 수단은 SEM ± 표시됩니다. . FGF2, P 대 제어 = 0.0002 Zeb'2 : mRNA를 수확 된 FGF2 기간의 일 0시, 추가의 mRNA는 FGF2의 사일 후 다음 FGF2 한 날 이후 / BMP4 Zeb'1을 수확했다. 제어 대 FGF2, P = 0.0206 Twist'2 :. 대 제어. FGF2 + BMP4, P = 0.003.
그림 7 :. NSCs의이 모델 시스템에서 OPC 특성을 보여 NSCs의은 (제 5 항) 중앙 피질에서 분리 FGF2의 존재 단일 세포로 배양 하였다. 문화 8 D 후 (통로 (4) d는 7.9 절에 따른 후) 세포는 작은 NSC 식민지를 형성하고 B에, Olig2 (적색 염색 하였다, C), E, F) 및 네 스틴 (에 Sox10 (적색, 녹색, A, C, D, F). 세포의 높은 비율은 공동으로 표현 Olig2 / 네 스틴 (AC) 및 Sox10 / 네 스틴 (DF). (G) Olig2 / 네 스틴 및 Sox10 / 네 스틴의 공동 발현은 모든 세포의 백분율로 표시됩니다. 수단은 SEM ± 표시됩니다. 스케일 (A)에 도시 된 바와 같이 모든 이미지에 대한 바, (D) :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 조건 | 전체 외식 (중앙 피질) | 철새 응답 외식 | % | Podoplanin 식 외식 % | |
| 제어 | (33) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| TGFb1 | (21) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| BMP4 | (34) | (34) | (100) | (34) | (100) |
| TGFb1 + BMP4 | (22) | (22) | (100) | (22) | (100) |
표 1. BMP 4 및 BMP (4) (1) TGF β의 조합은 강력한 이동성 응답을 유도한다. 중앙 피질 나흘 총 확장 배지에 FGF2의 Explants에서 유지 하였다. 첫 번째 후이일은 외식은 단독 (대조군) 또는 FGF2와 조합 외에 TGFβ1, BMP4 또는 TGFβ1 / BMP4 FGF2를받을 수 계속했다. 제어 - 및 TGFβ1- 외식은 어느 쪽도 철새 응답도 PDPN 식을 표시하지 않았다. BMP4 및 TGFβ1 / BMP4 모든 외식에 철새 세포뿐만 아니라 PDPN 식 모두를 유도.
| 부위 | 전체 외식 | FGF2 / BMP4의 철새 응답 외식 | % |
| 중앙 피질 | (146) | (145) | 99.3 |
| 후방 피질 | (52) | (48) | 92.0 |
| MGE | (56) | (29) | 51.7 |
| 중뇌 | (5)삼 | (28) | 52.8 |
표 2. 중앙 코어 텍스는 FGF에 대한 응답으로 가장 강력한 마이그레이션을 보여줍니다 2 / BMP 4의 Explants는 개발 쥐 E14.5의 신경 튜브의 다른 지역에서 제조 하였다 :. 중앙 피질, 후방 피질, 내측 신경절 예하 (MGE)과을 중뇌. 모든 외식은 FGF2 / BMP4 (8 항)에 동일하게 배양 하였다. BMP4없이 처리 된 이식편은 이동성 응답 (데이터는 도시되지 않음)가 표시되지 않았다. 모든 절편은 절편 당 어떤 철새 세포의 모양에 대한 상영되었다. 모든 지역 이주 BMP4와 FGF2에 응답 할 수 있었다. 중앙 피질 그러나 가장 강력한 반응을 보였다. BMP4 어떤 철새 세포를 유도하는 데 필요한 것을 유의하십시오. FGF2에서 배양 외식 혼자 증식을 보였다 있지만이주; 더 편평 세포 이동성 단독 FGF2 (표 1 및도 2 부가)에서 관찰되지 않았다.
도 1 부가 400 ㎛의 그리드 파일. 그리드 파일이 인쇄되고, 상기 절개 단계에서 참조로 사용 된 바와 같이도 1 및도 2에 도시 될 수있다. 큰 교차로가 400 μm의 하부 조직으로 2mm를 나타냅니다. 이 그림의 PDF 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2. BMP 4 -exposed의 Explants 쉬플랫 이동성 세포를 포함한다.도 5에 도시 된 셀 배율 아우. (A) 조절 - (FGF2 형) 및 (C)는 TGFβ1 - 이식편 작고 둥근 세포 강한 세포 분열을 입증 하였다. (B) BMP4- 및 (D) TGFβ1 / BMP4 - 이식편 일관 평면 연장 된 셀을 보였다. (A)에 도시 된 바와 같이 모든 이미지 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3. EMT 조사. E14.5 쥐 중앙 피질을위한 체외 모델 시스템의 개요는 NSC 함유 SVZ가 포함되어 있습니다. 중앙 피질이 유 중 하나입니다이식편 조각 또는 단일 세포로 나오지. 이식편 조각 양적 마이그레이션 분석 (제 8 항)에 더 편리합니다. 단일 세포 등 유전자 또는 단백질 분석 (섹션 9.13)로, 정성 분석에 적합합니다.
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Discussion
EMT 분석을 활용 NSCs을위한 표준화 된 시스템이 설명이 연구에서 (보충 그림 3에 요약). 표준화 재현성 (표 1 및 2)을 보장한다. NSCs의는 개발 피질에서 일반적으로 EMT를 받아야하지 않는 조직을 파생됩니다. 이 EMT 초기 단계의 분석을 위해 유리하다. EMT의 초기 단계는 적절하게 유전 적 변화를 축적하고 이미 EMT 기능을 채택하고있다 종양 세포에서 공부 할 수 없습니다. 또한, 일차 종양 샘플은 대부분의 악성 종양 이종 침습 및 비파괴 세포를 모두 포함하고 있기 때문에 EMT 이해할 적합하지 않다. 제시된 프로토콜은 EMT 유도의 초기 단계를 연구하는 새로운 모델 EMT 연구자를 제공합니다. (첫 번째 단계 Zeb1 및 Zeb2 동안 제 2 단계 Twist2 동안, 상향 조절된다 Figur을 : 여기에서 우리는 Hogan 박사와 트위스트 가족의 키 EMT의 유도가 순차적으로 활성화되는 것을 보여전자 6). 이전에, 우리는 Snail1 이미 BMP4 노출 (8) 후 몇 시간을 상향 조절되는 것을 찾았습니다. 우리는 또한 그 BMP4 노출에 중앙 피질에서 neuroepithelial 줄기 세포는 평활근 액틴 (SMA)와 calponin 9 긍정적 인 중간 엽 세포로 분화 찾았습니다. 결과는 전술 한 세 가지 알려진 키 EMT 조절기 모두가 시스템에 포함되는 증명의 이전 연구를 완료. 또, TGFβ1 크게 단독 FGF2 / BMP4 이동성의 효과를 향상시킬 수 있음을 관찰 하였다. 이러한 결과는 EMT 유도하는 동안 FGF-, BMP- 및 TGFβ-신호 사이의 네트워크를 가리 킵니다.
EMT 및 마이그레이션 분석을위한 NSCs을 성공적으로 절연을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 올바르게 해부학 개발 배아의 랜드 마크, 신선한 문화 미디어의 준비와 (적어도 하룻밤) 코팅 된 플레이트, 뾰족한 도구의 사용을 식별, 배아 나이를 식별 및 프로개발 피질의 중앙 부분의 절개 당 피질 절편을 설정합니다.
제시된 기술은 일부 수정에 의해 향상 될 수있다. 위에 제시 한 바와 같이, 다수의 외식은 그리드와 하나의 접시에 도금되어있다. 여러 화합물의 스크리닝을 위해, 그러나, 96- 웰 플레이트의 각 웰에 단 이식편을 배치하는 것이 더 편리 할 수있다. 또한, 모델 시스템이 대규모 약물 발견을 위해 정제 될 수있다. 전술 한 바와 같이, PDPN는 PDPN이 침략 NSCs의 팔에서 발견되기 때문에 새로 인수 한 철새 기능에 대한 유용한 마커입니다. PDPN 기자는 EMT 유도 전에 정상적인 NSCs의에 형질 감염 될 수있다. 결과적으로는 PDPN PDPN 정상 NSCs을 (도 4 및 표 1)에 표시되지 않으므로 세포가 세포 형질 전환을위한 내부 대조군으로서 작용할 수 표현. 몇 가지 추가 NSC 마커는 EMT 유도 (8) 후 손실 된 네 스틴로 사용할 수 있습니다. 그 결과,모두 초기 상태 '/ 비 이동성 비 침습적 / 네 스틴 + "와 최종 상태"이동성 / 침습 / PDPN + "는 자동 약물 발견을 가능하게하는, 모니터링 할 수있다. 다중 웰 (예를 들어 96 웰 플레이트 및 그 이상)의 초기 세포 대 세포 배양 플레이트에 접종 될 수 있고 확립 된 약물 또는 공지 기능을 갖지 않는 화합물로 처리 하였다. 따라서, 멀티 웰 플레이트 자동 PDPN 또는 다른 마이그레이션 / 침공 마커의 발현을 스캔 할 수 있습니다. 억제제는 화면의 주요 대상이면 PDPN 발현의 소실이 추정되는 흥미로운 신규 억제 화합물을 식별 할 수있다.
새로운 물질의 테스트 동안 외식 마이그레이션 표시되지 않을 수 및 / 또는 외식은 반올림과 접시에서 분리 할 수 있습니다. 이 상황에서, 그것은 미디어의 절반을 (대신 전체 미디어의 변화 매일의) 매일 변경하는 것이 가장 좋습니다. 신선한 미디어를 교체 할 때, 표면 장력에 의해 스트레스를 감소시킨다. 그만큼외식은 초기 도금 후 첨부 할 수 있습니다. 이 상황에서는, 피브로넥틴, 적어도 36 시간 동안 접시 표면에 접촉한다. 피브로넥틴은 플라스틱에 충실 할 수 있기 때문에 코팅에 사용되는 피브로넥틴 갓 이상 10 분 동안 플라스틱 튜브에 노출없이 준비를해야합니다. 또한, 외식 그리드의 외부를 해결 할 수 있습니다. 이 상황에서, 천천히 원을 그리 접시를 소용돌이하는 것이 좋습니다. 이는 외식이 구심력 (참조 그림 3)에 의해 중앙으로 위치를 변경 할 수 있습니다.
NSCs의 신경 교종은 23,24로부터 유도 NSCs의 및 / 또는 OPC를으로부터 유래된다는 강력한 증거가있다. INK4 / ARF 결핍 생쥐 Sampetrean 등 NSCs의 절연 및 H-RAS (25)의 과발현을 강제 :. 결과적으로 다른 그룹의 NSCs의 기초 교종 성장 모델을 확립 하였다. 고급 악성 종양은 이식 25 후 증식과 침윤을 보였다 결과. MCNeill 등. 유전자 변형 생쥐에서 또한 격리 NSCs을 (floxed 사포닌 Rb1, NF1, Kras은, PTEN 혼자 조합) 26. 유전자는 Cre 호텔 바이러스 감염에 의해 불 활성화하고, NSCs의 26를 이식했다. 이 두 모델 시스템은 침공 생체 및 잠재적 인 새로운 안티 침공 약물 모니터링 할 수있는 이점이 테스트 할 수 있습니다. 그들의 주요 단점은 침략의 시작은 잘 정의되지 않고,이 세포가 신경 교종 전형적인 EMT 침공 (EMT 유전자) 또는 로컬 마이그레이션을 보여 불분명하다는 것이다. 또 하나의 약물이 동물에 따라 테스트 할 수 있고, 분석은 몇 주간을 필요로한다. 새로운 안티 침공 약물을 식별하기 위해 제약 회사의 (a) (b)에 다른 약물 농도를 시도하는 테스트 및 (c)에 복제, 수천 개의 화합물을 선별 또는 한 번 더해야합니다. , 수천 이식 동물을 준비하는 다른 약물로 치료하고 마지막으로 조직 화학 또는 생물 발광에 의한 효과를 테스트하려면분석은 매우 자원 소비이다. 여기 EMT 관련 침공 신규 NSC 기반 모델 시스템은 화합물의 수천의 비용 효율적인 스크리닝을 허용하는 기술된다.
이 모델 화합물의 높은 처리량의 선별을 가능하게되지만, 단지 차 스크리닝 플랫폼이다. 관심의 화합물은이 모델에서 식별되면, 그들은 추가 검증이 필요합니다. 위의 25, 26 중요하게 설명한 바와 같이 생체 내 시험이 확인 된 화합물에 대한 안전성과 유효성 매개 변수 및 이식 모델이 필요하다. 이 모델은 또한이 쥐 세포를 기반으로한다는 사실에 의해 제한된다. 모델은 랫트 또는 마우스 EMT를 조사하기 위해 사용될 수 있지만 동일한 메커니즘 인간 세포 또는 인간 환자의 위치에있는 경우는 불분명하다. 또한 실험 NSCs의가 체외에서 침입뿐만 아니라 이식 후뿐만 아니라 경우에 조사 할 필요가있다. 증거의 여러 라인 NSCs의 역할을 지원신경 교종 형성한다. 테네 스틴 C, Hey1, SPARC, Snail1 및 Snail2, FGFR +, BMPR1a, EGFR, PDGFRβ, Sox2이, Podoplanin, GLI3 및 p75NGFR 8 : 신경 교종의 진행은 다음과 같은 유전자에 연결되어 있습니다. 이들 유전자는 모두 또한 간엽 세포 침윤성 8 정상적인 비 침습적 NSCs의 변환시의 표현된다. 당분간, NSCs의 외부 성장 인자 의해서만 종양으로 형질 전환 될 수 있는지 불명확하다.
다른 종양에서 종양 개시 줄기 세포 (TICS)는 절연되어 있고 종양 진행 (27)을 이해하는 모델로서 사용된다. EMT 이미 틱 (27)에서 발생 않았기 때문에 틱은 EMT 분석에 적합하지 그러나,이다. EMT 유도 초기 및 늦은 단계를 이해하기 위해 기본 비 - 양성 세포 집단이 필요하다. 이상적으로는이 인구는 처음에 EMT를 받아야하는 것은 아닙니다했다. 이는 이전 배아 NSCs의 적합한 후보들이 용도 있다고 도시되었다9,28. 즉, 마이그레이션 및 침략 FGF2와 BMP4 9,28에 의해 NSCs을 유도 할 수있다. 키 EMT 가족 Hogan 박사와 트위스트 8 조사되지 않은 이후 FGF2 / BMP4 유도 마이그레이션이 하나의 EMT 관련 유전자와 관련되었다, 그러나 완전한 증거가 부족했다. 네 개의 요소의 특정 조합이, FGF2, BMP4, TGFβ1 인슐린은 매우 강하고 완전한 EMT 유도 발생할 쇼 상기 결과는 이전에 관찰되지 않는다. 본 연구는 Zeb-와 트위스트 - 가족의 주요 EMT 유전자도 상향 조절되어 있는지 보여줍니다. 따라서 본 연구는 단일 유전자의 선택적 상향 조절이없는 상기 제 1 증거를 제공하지만, 그 결과는 모든 주요 EMT 패밀리 제안 된 세포 배양 시스템에서 활성임을 보여준다.
EMT는 폐암, 유방암, 결장암 및 위암 (29)는 뇌 이외의 상피 암에서 관찰되었다. EMT을 연구하는 여러 모델이 종양 30-32에 대한 사용중인어느 상당한 한계 그러나 올 : 다수의 유전 및 후생 유전 학적 변화는 33 실시 형질 종양 세포주의 (a)의 사용; 초기 단계의 암에 대한 EMT의 억제제를 식별하는, 말기 암 세포에는 불충분하다; (b) 미정 다양한 성장 인자를 포함하는 혈청 - 의존성 배양; 이 중요한 요소의 식별이 어려운 렌더링합니다. 혈청 품질이 일괄 배치에 따라 다릅니다 때문에 또한, 실험의 재현성이 저하된다 (c)는 혈청 가능한 잠재적으로 유용한 외인성 화합물을 불 활성화 효소 활성 저해제를 포함 (d) 세포 표면 분자를 분해 세포 계대에 대한 효소의 필요성 생리 EMT EMT를 촉진 효능을 확인하는 (예)는, 정상 세포는 유도를 테스트 할 필요가있다. 종양 세포 모델 정상적인 간세포의 재생을 촉진 물질을 발견하는 것이 불충분하다.
마이그레이션은 또한 상처 치유와 리젠 정상 프로세스에 필요부상 뇌 (18)의 배급. 외상성 뇌 손상 및 뇌졸중 후 NSCs의 재생은 4,34에 참여 병변 부위에 마이그레이션 할 필요가있다. 현재의 시스템은 이동과 침윤을 촉진 물질을 식별하기 위해 사용될 수있다. 위와 같이, 마이그레이션 BMP4-치료 시작시에 유도된다. 세포가 BMPs에에 대신 신규 화합물에 노출되지 않은 경우,이 소설 BMP 작용제를 식별하는 데 도움이 될 것 BMP 작업을 대체 할 수 있습니다. PDPN 발현을 나타내는 리포터 시스템은, 새로운 물질에 대한 대규모 시험 가능해진다; 신규 화합물은 BMP를 대체 할 수 있다면, PDPN 발현 세포가 자동으로 식별 될 수있다.
제안 된 시스템은 세포 신호 상호 작용을 조사하는 데 유용합니다. 우리의 결과는 이전에 BMP 효과가 TGFβ1 활성화에 의해 강화 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 결과 BMP- 및 TGFβ- 간의 상호 첨가제를 발견신호. 그러나, Notch-, Wnt- 같은 추가 신호 경로, 또는 EGFR- / MAPK- 및 기타 신호 폭포가 관련 될 수있다. 따라서, BMP / TGFβ-상호 작용과 다른 경로에 크로스 토크에 대한 추가 조사가 필요하다. 또한, 반응의 중앙 피질 EMT 구동 기전을 규명하는 데 도움 유전자 변형 마우스로부터 분리 될 수있다. 요약하면, 여기서 설명한 EMT 모델 시스템은 줄기 세포 생물학 및 재생 분야에서 유용뿐만 아니라 암 연구 수있다. 이는 억제 또는 이주 및 침윤을 증강 물질 약물 라이브러리의 스크리닝에 사용될 수있다.
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Acknowledgments
이 연구는 MHS와 AG (SNF IZLIZ3_157230)에 부여하여 바젤 과학 재단의 대학과 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다. 우리는 감사 : 박사 타니아 리 날디 Burkat을 아낌없이 인프라를 제공하기 위해; 토론과 의견에 대한 Bettler 그룹의 모든 구성원. 우리는 게르하르트 Dorne (라이카, 스위스) 풀 HD MC170 비디오 카메라의 전문적이고 유능한 설치 (라이카, 스위스) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1,000. |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
