Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Et enzym og Serum-free Neural Stem Cell Culture Modell for EMT Investigation Egnet for Drug Discovery

Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54018
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 6, 3, 1, *2, *5
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich
* These authors contributed equally

Abstract

Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) beskriver prosessen med epitel transdifferentiating inn mesenchyme. EMT er en fundamental prosess under embryonal utvikling som også ofte forekommer i glioblastom, den hyppigste ondartet hjernesvulst. EMT har også blitt observert i flere karsinomer utenfor hjernen, inkludert brystkreft, lungekreft, tykktarmskreft, magekreft. EMT er sentralt knyttet til kreft ved å fremme migrasjon, invasjon og metastasedannelse. Mekanismene for EMT induksjon er ikke fullt ut forstått. Her beskriver vi et in vitro system for standardisert isolering av kortikale nevrale stamceller (NSC) og påfølgende EMT-induksjon. Dette systemet gir fleksibilitet til å bruke enten enkeltceller eller eksplantering kultur. I dette systemet, rotte eller mus embryonale forhjernen NSCs dyrkes i et definert medium, blottet for serum og enzymer. De NSCs uttrykt Olig2 og Sox10, to transkripsjonsfaktorer observert i oligodendrocYTE forløper celler (OPCs). Ved hjelp av dette systemet, interaksjoner mellom FGF-, BMP- og TGFfi-signalering som involverer Zeb1, Zeb2, og Twist2 ble observert der TGFB-aktivering betydelig forbedret celle migrasjon, noe som tyder på en synergistisk BMP- / TGFB-interaksjon. Resultatene peker til et nettverk av FGF-, BMP- og TGFfi-signalering for å være involvert i EMT induksjon og vedlikehold. Dette modellsystem er aktuelt å undersøke EMT in vitro. Det er kostnadseffektivt og viser høy reproduserbarhet. Det gir også mulighet for sammenligning av ulike forbindelser med hensyn til sine migrasjons svar (kvantitativ avstandsmåling), og high-throughput screening av forbindelser til hemmer eller forbedre EMT (kvalitativ måling). Modellen er derfor godt egnet til å teste narkotika biblioteker for stoffer som påvirker EMT.

Introduction

Under flere stadier av embryoutvikling, epitelceller mister sin sterke tilslutning til hverandre (for eksempel tett veikryss) og få en trekkfugl fenotype i en prosess som kalles epitelial til mesenchymale overgang (EMT) 1. EMT er nødvendig for dannelsen av flere celletyper, så som mesenchymale neural crest-celler, en populasjon som segregerer fra neuroepithelium 2. EMT er ikke bare viktig i embryonale stadier, men også nødvendig på senere stadier av voksenlivet for å opprettholde fysiologiske prosesser i organismen voksen, så som sårheling 3 og sentralnervesystemet (CNS) regenerering i demyeliniserende lesjoner 4.

Epiteltumorer er kjent for å aktivere EMT som en innvielse skritt for migrasjon, invasjon og metastasering, til slutt fører til kreft progresjon 1,3. EMT er faktisk sentralt knyttet til sterk migrasjon 1,3. De cellulære trinnene conditioning, initiere, gjennomgår og opprettholde EMT er ikke fullt ut forstått, og trenger videre etterforskning.

Her blir et standardisert in vitro EMT modellsystem basert på NSCs, med definerte vekstfaktorer og media (uten serum og uten enzym bruk) presentert. Denne modellen systemet er av relevans for forskere som arbeider på EMT. Sneglen, Zeb og Twist protein familier har vist seg å være avgjørende for EMT både i utvikling og sykdom 1. Sneglen Zeb og Twist familier er også involvert i den presenterte systemet. Systemet er basert på en spesifikk region av forhjernen som normalt ikke gjennomgår EMT som gir en spesiell fordel for studiet av innledende hendelser i løpet av EMT induksjon.

Modellsystemet kan potensielt brukes til å studere EMT i epithelia utenfor CNS, siden nøkkel EMT-indusere som sneglen, Zeb og Twist proteiner, er også funnet i løpet av EMT i vev systemer utenfor CNS. Denne modellen system tillater den standardiserte isolering av NSCs fra utviklings cortex å studere stamcelle funksjoner generelt og EMT spesielt. Ved hjelp av dette system, isolerte vi NSCs, indusert EMT og studert den etterfølgende vandring under virkningen av FGF2 og BMP4. Vi observerte at FGF- og BMP-signale samhandler med TGFB-signalering for å fremme cellemigrasjon, og dermed validere modellsystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer fulgt 'Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr' (NIH publikasjon, 8. utgave, 2011), og ble godkjent av Animal Welfare Committee of Basel (sveitsiske Retningslinjer for omsorg og bruk av dyr). Ved disse retningslinjene dyret protokollen anses av "laveste dyr alvorlighetsgrad".

1. Utarbeidelse av Expansion Medium

Merk: Arbeid i aseptiske betingelser som standard for vev kultur.

  1. Ta to 15 ml rør, og tilsett 5 ml L-glutamin-fritt DMEM / F12 (1: 1) fra en 500 ml flaske medium i hver av de to 15 ml-rør. Til den første 15 ml tube, tilsett 50 mg human apo-transferrin, 50 ul putrescin en M lager (0,1 mM sluttkonsentrasjon) og 30 pl av natrium selen 500 mikrometer lager (endelig konsentrasjon 30 nM).
    1. Filtrer gjennom et 0,2 um sprøytefilter inn i den opprinnelige DMEM / F12 flaske.
  2. Til andre 15 ml tube, tilsett 12,5 mg insulin. Legg til6 - 9 dråper av 1 M NaOH. Vortex å oppløse insulin helt. Filtrer gjennom et 0,2 um sprøytefilter inn i den opprinnelige DMEM / F12 flaske.
    Merk: NaOH er giftig og etsende. Bruk vernehansker, frakk og vernebriller.
  3. Tilsett 5 ml penicillin (10.000 enheter / ml) / streptomycin (10 000 ug / ml) / amfotericin B (25 pg / ml) til DMEM / F12 medium flaske.
  4. Tilsett 5 ml 200 mM L-glutamin lager ferskt tinte eller oligopeptider som inneholder glutamin (200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptidet) i DMEM / F12-medium flaske.
  5. Riste godt. Forbered 50 ml prøver.
    Merk: Utvidelse medium kan lagres i minst 2 uker ved 4 ° C. Porsjonert rør vise mindre pH-endringer i forhold til medium holdt i 500 ml flasker.

2. Utarbeidelse av aging Medium

  1. Til en L Ca 2 + - og Mg 2 + -fri HBSS media, legger 990,85 mg Glukose (5 mM endelig konsentrasjon) og 840,10 mg NaHCO3 Merk: kan lagres aging medium i minst 4 uker ved 4 ° C.

3. Utarbeidelse av vekstfaktorer

  1. Fremstille sterile 1x PBS med 1% BSA (PBS-BSA) alene eller sammen med saltsyre (HCl) ved 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Forsiktig: HCl er etsende og giftige og krever spesielle sikkerhetstiltak (jakker, briller, hansker, hette).
  2. Oppløs 10 ug / ml rekombinant human-fibroblast-vekstfaktor 2 (rhFGF2) i PBS-BSA (10 ng / ml sluttkonsentrasjon), 10 ug / ml rekombinant humant Bone Morfogenetisk protein 4 (rhBMP4) i PBS-BSA (10 ng / ml slutt konsentrasjon), og 20 pg / ml rekombinant human-transformerende vekstfaktor ß 1 (rhTGFβ1) i PBS-BSA-HCl (40 ng / ml sluttkonsentrasjon).
    1. Ikke filtrere sterilisere. Forbered porsjoner.
      Merk: vekstfaktor porsjoner kan oppbevares i-20 ° C i minst 2 år.

4. Coating av cellekultur Retter

  1. Oppløs 1875 mg Poly-L-ornithine (PLO) i 500 ml destillert H 2 O for å forberede en 250x PLO lager. Filter sterilisere ved hjelp av en 0,2 mikrometer sprøytefilter og gjøre 2 ml deler.
    Merk: Disse alikvoter kan oppbevares ved -20 ° C i minst 2 år.
  2. Løs opp 1 mg bovin fibronektin i 1 ml sterilt destillert H 2 O for å forberede 1,000x fibronektin lager. Ikke vortex da dette kan koagulere klebrig protein. Rist forsiktig for hånd i 10 min.
    1. Inkuber i 1 time ved romtemperatur med leilighetsvis risting. Sjekk for fullstendig oppløsning. Varm løsningen på mindre enn 37 ° C for fullstendig oppløsning av fibronektin. Ikke filtrere-sterilisere.
      Merk: Løsningen kan oppbevares ved 4 ° C i opp til 6 måneder.
  3. Bruk plasma-forbehandlet plast cellekultur retter (100 mm eller andre størrelser som kreves foreksperimentet). For å vurdere migrasjon, bruker 35 mm retter med 500 mikrometer rutenett. Inkuber retter natten over med 2 ml 1x PLO i 12 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 vevskultur-inkubator. Vask to ganger med 2 ml 1x PBS.
  4. Tilsett 2 ml 1x fibronektin (1 pg / ml endelig konsentrasjon) og inkuber retter for et minimum på 12 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Fjerne fibronektin like før utplating av cellene.
    Merk: Fibronektin-belagte retter kan lagres i minst 2 uker ved 37 ° C.

5. Standardiserte Dissection og klargjøring av kortikal subventricular Zone (SVZ)

  1. Skaff rotte embryonale dag 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) og mus E13.5 (C57BL / 6) embryoer ved tidsbestemt-parring. Mate dyr fra 18:00 til 08.00 neste morgen. Noon etter dagen for parring anses E0.5.
  2. Bedøve den gravide dyr med 5% isofluran og 0,8 l / min oksygen. Sjekk respons ved pote kompresjon med skarp dissEL tang. Halshogge dyret. Unngå CO 2 kvelning som CO 2 påvirker stamcelle utvinning.
  3. Hent embryoer ved keisersnitt.
    1. Plasser dyret i liggende stilling og desinfisere pels med 70% etanol. Bruk kirurgisk pinsett og saks for å lage V-formet snitt i huden på ca 8 cm i nedre del av magen over livmoren. Incise bare huden med pels samtidig som muskelveggene intakt.
    2. Bruk friske tenger og sakser til innsnittet muskler og abdominal muskel veggen for å komme inn i bukhinnen.
    3. Identifisere livmoren i den nedre bakre peritoneum. Fjern livmoren ved skarp atskillelse fra det omgivende vev.
    4. Vask livmoren med embryoer med steril 1x PBS og legg dem i iskaldt 1x PBS.
    5. Bruk fin-tipped saks for å åpne livmor vegger for å frigjøre embryo ved embryo under et disseksjon mikroskop (3X forstørrelse, figur 1B). Bruk en pinsett til å fjerne de embryonale skrog (
    6. Kontroller at riktig utviklingsstadiet av Atlas of Developing Rat nervesystemet fem. Den korrekte embryo størrelse er vist i figur 1B.
    7. Sjekk korrekt alder ytterligere ved nærvær av sifret begynner dannelse i rotte forbena (FL) som illustrert i figur 1A.
      Merk: bakben (HL) har ennå ikke viser sifret separasjon (Figur 1B).
  4. For disseksjon, overføre embryo til ubestrøket petriskåler fylt med iskald 1x PBS. Utfør disseksjon under et stereo disseksjon mikroskop (3X til 20X forstørrelse) bruker autoklaveres fin pinsett.
    Merk: petriskåler hindre feste av vev til parabolen overflaten som kan skje med plasma-belagt cellekultur retter. Skjerpet wolfram wire nåler eller lignende er også nyttig for visse skritt av disseksjon.
  5. Ta av hodet hud og skalle starter på intersection av utviklingen telencephalon (TEL) og diencephalon (DI) (figur 1B) ved å trekke samtidig anteriort og posteriort med to tang for å få adgang til det fremkallende neural røret (figur 1C).
  6. Identifiser midthjernen-hindbrain-grensen (MHB, svart pil hodet i Figur 1B-D), skiller mesencephalon (MES) fra rhombencephalon. Kutt rhombencephalon bare på eller under MHB (figur 1D, trekantet pil).
    Merk: Den ekstra subkutan plass på MHB letter fjerning hud uten å skade nevralrøret.
  7. Bryte forbindelsen mellom telencephalon / diencephalon ved skallebasis med ansikts skjelett (figur 1E). Dette resulterer i en blokk som inneholder telencephalon, diencephalon og mesencephalon (TEL-di-MES) (Fig 1 F-H).
  8. Overfør TEL-DI-MES blokk i ekspansjon medium på is. Hold det komplettely dekket i ekspansjon medium i et ubestrøket petriskål. Hold blokk på mesencephalon med en pinsett for å unngå å berøre telencephalon som inneholder cortical SVZ med NSC.
  9. Gjenta trinn 05.05 til 05.08 med alle embryoer (figur 1F-H).
  10. Overfør en TEL-di-MES blokkere ut i frisk iskald 1x PBS. Skjær langs den stiplede linjen i den fremre mesencephalon (figur 1F-H), separering av mesencephalon fra diencephalon, som vist i figur 1I.
  11. Separer DI fra TEL ved å skjære langs de stiplede linjer i figur 1F. Se isolert telencephalon i figur 1J.
  12. Splitte de to telencephalic halvkuler, klippe langs den stiplede linjen i figur 1J. Dette resulterer i to adskilte halvkuler som vist på fig 1K.
    Merk: Den venstre hjernehalvdelen er forstørret i Figur 1L.
  13. Identifisere den mediale gjengenlionic eminenser (MGE, figur 2A, *) og laterale ganglieblokkere eminenser (LGE, figur 2A; +) synlig gjennom fremtiden Foramen interventriculare.
    1. Bruk pinsett eller nål, dissekere langs en ​​rett linje i skjæringspunktet mellom MGE og LGE og anterior cortex (maur-CTX, figur 2B). Klipp en rett linje gjennom cortex, hippocampus (hofte) og årehinnen plexus (CP). Dette skiller den fremre cortex inkludert luktelappen (ob) fra ganglieblokkere eminenser (GE, figur 2B, C).
  14. Skjær en andre rett linje i skjæringspunktet mellom haleganglier eminense (CGE, figur 2C, D) og bakre cortex (figur 2C), igjen skjære gjennom cortex, hippocampus og choroid plexus.
  15. Flate ut telencephalon. Fjerne bakre pol og luktelappen (figur 2D). Identifiserekortikale hem inneholder hippocampus og årehinnen plexus (figur 2C), som tidligere 6,7 definert.
    Merk: hippocampus har en tynnere neuroepithelium enn hjernebarken. CP inneholder røde fartøy.
    1. Separer den kortikale hem fra hjernebarken, slik at størrelsen av hjernebarken identisk med størrelsen på ganglieblokkere eminences (figur 2D). Dette resulterer i en blokk av cortex (målvevet) og ganglieblokkere eminences (GE, figur 2D).
  16. Vend cortex-GE blokk med ventrikkel (indre) side til parabolen overflaten.
    Merk: Den ytre overflaten av halvkulen vil møte eksperimentator (figur 2E). På den ytre overflaten er de blodkarholdige meninges (figur 2E).
    1. Pin GE til parabolen overflaten med venstre hånd og skrelle hjernehinnene med en pinsett i høyre (dominerende) hånd (Figur 2F Merk: Dette er den teknisk mest krevende trinnet fordi hjernehinnene sterkt holder seg til hjernebarken. Utskillelsen av hjernehinnene fra hjernebarken lettes ved å kutte en helt rett linje (ikke taggete) i trinn 5.13.1 og 5.14.
  17. Gjenta trinn 05.12 til 05.16 for den andre halvkule og alle embryoer. Skjær cortex langs LGE i en avstand av halvparten av den største diameter av LGE (figur 2G, 2H). Den dissekert cortex strekker seg over et område på 1,2 mm x 2,4 mm (figur 2H) og omfatter SVZ / germinal lag med NSC.

6. Utarbeidelse av eksplantering kulturer

  1. Skjær cortex inn explants på mindre enn 400 mikrometer diameter (Figur 2I). Bruk en 400 mikrometer grid (Supplementary figur 1) plassert under disseksjon petriskål for referanse (figur 2 H og 2I). Overfør alle explants i en fersk petriskål med is-cold utvidelse medium.
  2. Fjern det fibronektin fra en vevskulturskål (trinn 4.4). La den tørke. Tilsett 1 ml kald utvidelse medium til midten av 35 mm skål med gitterdimensjon på 10 mm x 10 mm (figur 3). Tillat mediet for å danne en sfærisk dråpe (figur 3).
  3. Sett opp til 8 explants til sentrum av fallet. Eksplantatene bør ideelt plassert på nettet med minst 3 mm avstand mellom hverandre for migrasjon analyse (se kapittel 8).
  4. Inkuber fatet i ca. 1 time i en cellekulturinkubator (37 ° C, 21% O2, 5% CO2) for festing av eksplantater. Tillat explants å bosette og feste til fibronectin belagt overflate. Ikke rist fatet, siden explants kan løsne og flytte ut av optimal grid sentrum.
  5. Etter 1 time inkubering (37 ° C, 21% O2, 5% CO2), fylle opp formen til et totalt volum på 2 ml utvidelse medium pluss vekst fskuespillere eller stoffer av interesse å teste og ruge.
    Merk: Hverken enzymatisk fordøyelse eller serum eller sentrifugering er nødvendig for eksplantat fremstilling. Dette er optimalt for celleintegritet.

7. Utarbeidelse av NSC Enkelt Cell Culture

  1. Varm opp ekspansjon og aging medium ved 37 ° C.
  2. Overfør dissekert cortex stykkene (fra trinn 5.17) inn i et 15 ml rør med kald utvidelsesmedium (tube A). Sentrifuger cortex stykker i 5 min ved 1200 x g. Aspirer supernatanten. Tilsett 200 ul forvarmes utvidelse medium for å resuspendere cortex stykker.
  3. Legg 700 mL av forvarmes aging medium til 15 ml tube med en P1,000 tips (tube A). Forsiktig resuspender pelleten. Plassere spissen ved bunnen av 15 ml tube. Forsiktig og langsomt distansere vevet stykker ved suging tre ganger med P1,000 spissen.
    Merk: aging medium fremmer celleseparasjon, og er nødvendig for å unngå bruk av enzymer.
  4. La røret for å sitte i 30 til 60 sekunder for større (tyngre) dissosiert brikkene til å bosette nederst. Enkelt dissosierte celler forblir i supernatanten. Overfør 700 ul av supernatanten til en frisk 15 ml rør (rør B).
  5. Gjenta trinn 7.3 og 7.4 for å distansere de større stykker.
  6. Gjenta trinn 7.3 og 7.4 en gang til for å skille de større stykker. Overfør all supernatant til den friske 15 ml rør (rør B).
  7. Legg utvidelse medium til et totalt volum på 5 ml. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Vurdere døde celler ved trypan-blå flekker.
    Merk: Små NSCs tolerere trinnene 7,2 til 7,6 bedre enn større celler. Fra 10 embryoer forvente ca 4 x 10 6 celler med 10% døde celler.
  8. For utvidelse av NSC, plate 1,5 x 10 6 celler per 10 cm fibronektin belagt vev kultur tallerken i et volum på 8 ml ekspansjon medium. For standard utvidelse, legger 8 mL av 1,000x rhFGF2 lager. Tilsett 8 mL rhFGF2 hver dag og forandre megdia annenhver dag.
    Merk: cortex på dette utviklingsstadiet inneholder et flertall av NSC og bare et mindretall av differensierte celler. De differensierte minoritets cellene ikke reagerer på rhFGF2-behandling og dø under utvidelsen kultur.
  9. Passage utvidet NSCs på 60% samløpet.
    1. Å passasje NSCs, fjerne utvidelse medium. Vask cellene raskt tre ganger med 5 ml aging medium. Vent 2-4 min. Uten Ca + 2 og Mg + 2 cellene langsomt løsner fra overflaten, avrunding opp. Kontroller avløsning av celler under fase mikroskop. Vente et par minutter, om nødvendig, til visuell løsrivelse fra overflaten er observert.
      Merk: Enkeltceller vil helt løsne, men de fleste cellene vil fortsatt holder seg til parabolen overflaten. Varigheten som er nødvendig for løsgjøring er avhengig av varigheten av fibronektin belegg. En kort fibronektin belegg (12 timer eller mindre) resulterer i raskere celle løsrivelse. For lengre eksperimenter (>; 1 uke) fibronektin belegg på mer enn 24 timer er anbefalt.
  10. Bruke en 10 ml pipette for å forsiktig løsne cellene fra overflaten. Samle opp 5 ml aging medium med celler og overføre den til en frisk 15 ml tube. Gjenta med ytterligere 5 ml aging medium.
  11. Dissosiere cellene i 15 ml rør ved å pipettere opp og ned tre ganger, plassere 10 ml pipette ved bunnen av røret. Spinne røret i 15 minutter ved 1200 xg ved romtemperatur. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml ekspansjonsmedium. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Bruk trypanblått for å vurdere døde celler.
    Merk: Etter utvidelsen til 60% samløpet, forventer 4 - 5 x 10 6 celler med en død celletall på rundt 10%.
  12. Plate 8 x 10 5 celler per 10 cm tallerken for ytterligere passasjer.

8. Migration Assessment

  1. For migrasjon vurdering, isolere explants etter § 5. Seed explants i35 mm grid retter. En time etter plating, legger FGF2 (rhFGF2). Plasser oppvasken i en 37 ° C inkubator i 2 dager.
    Merk: For optimal explant vedlegg, unngå å flytte rettene.
  2. Fjern mediet ved 1000 mL tips. Tilsett 2 ml utvidelse medium av 1000 mL tips som starter på den indre sirkel (figur 3). Dette reduserer overflatespenningen på explants.
  3. Legg vekstfaktorer alene eller i kombinasjon, som er nødvendig for forsøket. Bruk FGF2 / BMP4 / TGFβ1 som positiv kontroll. Merk: I dette forsøk ble 2 ul FGF2 pr 35 mm skål, 2 ul BMP4 og 4 pl TGFβ1 tilsatt alene og i kombinasjon (figur 5).
    1. Legg til flere faktorer og / eller testbare stoffer. Hold retter igjen urørt i 2 dager ved 37 ° C.
  4. Ta bilder av explants på en invertert mikroskop.
    Merk: Levende explants gi bedre fase kontrast enn faste celler. Begge kan anvendes.
  5. for migrasjonvurdering, bruk en grafikk programvare som lar pixel målinger (f.eks Fiji 8).
  6. Mål tallerken rutenett på 500 mikrometer avstand i piksler, og bruke den som intern referanse.
  7. Definere midt av eksplantatet som migrasjon startpunkt. Mål avstanden mellom sentrum av eksplantatet og den ytterste gruppe av 10 celler.
    Merk: Alle celler migrerer sentrifugalkraften fra eksplantering. De spontant danne en bane ved omkretsen under omstendighetene som ble testet (figur 5).

9. Invasion Assessment

  1. Forbered fibronektin belagt vev kultur 24-brønners plater i henhold til protokoll § 4.
  2. Plasser 300 ul varm ekspansjon medium i toppen også i celle invasjon kamre. Inkuber kamrene i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
  3. Fjern utvidelsesmediet fra toppen brønnen og plassere Boyden kammer inn i det belagte 24-brønners plate.
  4. Tilsett 500 mL av varme utvidelse medium med 0,5 mL av rhFGF2 og 0,5 mL rhBMP4 til bunnen også.
  5. Passage NSCs og teller som beskrevet i punkt 7. Passages 1-4 er egnet.
  6. Plate 5 x 10 5 celler i et volum på 300 ul av varm utvidelse medium med 0,3 ul rhFGF2 og 0,3 ul av rhBMP4 i toppen brønn i Boyden kammer.
  7. Kultur seeded NSCs for 24 timer.
  8. Legge til ytterligere faktorer og / eller testbare substanser til kammeret og kulturen av cellene for en annen 48 timer.
    Merk: Hvis cellene er invasiv, vil de passere fra toppen brønnen gjennom basalmembranen sjiktet til bunnen brønnen. Invasive celler vil henge ved bunnen av Boyden kammer.
  9. Følg protokollen gitt av produsenten. Bruk bomullspinner (inkludert i invasjonen assay kit) for å fjerne ikke-invasive celler i toppen også ved å rense to ganger.
  10. Fjern mediet fra brønnene og tilsett 500 mL utvidelse medium meden plasmamembran flekk for levende celler og med atom fargestoff DAPI til brønnene.
  11. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
    Merk: De fargene vil integrere i membranen og kjernen av de invasive celler, henholdsvis for optimal visualisering 8. Alternativ: Utelat plasma membran fargestoff hvis flerfarget immunocytochemistry er planlagt.
  12. Fjern mediet sammen med fargestoffer og vask to ganger med ekspansjonsmedium. Visualiser og telle invasive celler med en omvendt fluorescens mikroskop som demonstrert tidligere åtte.
    Merk: Noen invasive celler kan ha løsnet fra bunnen av kammeret og har falt til brønnoverflaten nedenfor der de holde seg til den belagte overflaten. For fullstendig analyse omfatte cellene ved brønnoverflaten.
  13. Fjern medium og fiksere cellene i is-kald frisk 4% PFA i 10 min. Vask 3x med 1x PBS. Utføre immunocytokjemi på invasive-celler, som tidligere beskrevet 8-10.

    14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne EMT modellsystem er basert på standardiserte isolering av NSCs både som enkeltceller eller som eksplantater fra et bestemt område av det fremkallende neural røret, den sentrale cortex (figur 1 og 2). For kvantitativ vurdering, ble explants sådd rett ved sentrum av en 500 mikrometer rutenett kultur tallerken (figur 3). Eksplantater fra den sentrale cortex ble først utsatt for FGF2 i to dager, etterfulgt av ytterligere to dager i forskjellige kombinasjoner av vekstfaktorer (Tabell 1). Vi startet med cortex som er større enn andre deler av det fremkallende neural røret. Vi observerte at bare explants dyrket i BMP4 viste en trekkfugl respons (tabell 1 og analytiker figur 2).

Neste podoplanin (PDPN) uttrykk ble analysert under definerte forhold. PDPN er et trans sialomucin-lignende protein som har vært forbundet med invasjon i flere kreftformer 11,12 og også i NSCs 8. Andelen PDPN uttrykker celler økes i høyverdig gliomer 13. PDPN er også assosiert med dårligere overlevelse blant pasienter med glioblastom 14. Videre PDPN har vist seg å være en markør for ondartet progresjon i flere tumorer inkludert bryst, lunge, kolon karsinom 15,16. PDPN uttrykkes både i invasive samt trekkende NSCs 8. Ved hjelp av den ovenfor angitte protokoll, ble PDPN ekspresjon sammenlignet med kontrollen, FGF2 bare, i eksplantater utsatt for TGFβ1 og BMP4 alene eller i kombinasjoner. PDPN uttrykk ble påvist i alle BMP4 og TGFβ1 / BMP4 behandlet explants. I motsetning til dette ble ingen PDPN observert i kontroll eksplantater i FGF2 alene eller i eksplantater med TGFβ1 alene (tabell 2 og figur 4). I tillegg celler med en trekkfugl fenotype ble indusert i BMP4 og TGFβ1 / BMP4-eksponerte eksplantater, mens kontroll eksplantater (bare FGF2) og TGFβ1 alene ikke viste trekk-celler (tabell 1). Observasjonen av trekkende celler gir en lav kostnad, rett-frem kvalitativ vurdering.

Videre, testet vi den vandrende respons og EMT induksjon av flere deler av det fremkallende neural røret for å BMP4 (tabell 2). 400 um eksplantater ble fremstilt fra den sentrale cortex, den bakre cortex (merket bakre pol), MGE og mesencephalon, som vist i figur 1. Eksplantene ble alle utsatt for FGF2 i to dager, etterfulgt av to dager i FGF2 med BMP4 . Migrasjon ble definert av utseendet av flate trekkende celler med en ledende og bakkant (Figur 5 og analytiker figur 2). En sterk induksjon av trekkende celler fra bakre cortex og en mellom respons fra MGE og MESencephalon ble observert (tabell 2). 145 av 146 explants i sentral cortex viste en trekkfugl respons i FGF2 / BMP4. Således, den sentrale cortex demonstrerte det mest robuste induksjon av migrerende celler i alle eksplantater som ble testet (tabell 2). Utelatelse av BMP4 oppheves ethvert trekkende respons (tabell 1 og 2, og data ikke vist).

For kvantitativ vurdering av vekstfaktor potens, ble migrerings avstanden målt i eksplantater dyrket i flere vekstfaktorer. Eksplantater ble dyrket som beskrevet ovenfor i to dager i FGF2, deretter i ytterligere to dager i FGF2 uten faktorer (kontroll) eller enkelt eller kombinert BMP4 og TGFβ1. I kontroll eksplantater ble det observert en sterk proliferasjon i respons til FGF2, som forventet. Eksplantene er utledet fra kortikale SVZ og inneholder for en stor del NSCs som er kjent for å proliferere i respons til FGF2 17. Kontrollen cells nådd 689 ± 14, de TGFβ1 cellene 582 ± 49 mikrometer (figur 5.). Den BMP4-gruppen viste en gjennomsnittlig migrasjon avstand på 935 ± 91 mikrometer. Til sammenligning TGFβ1 / BMP4-celler migrert betydelig lenger, til 1150 ± 23 um (figur 5). Resultatene viser at BMP4 induserer en migrasjon i FGF2-eksponerte NSC. Denne vandringen kan bli ytterligere forbedret ved TGFβ1. Kombinasjonen av FGF2, BMP4 og TGFβ1 er derfor den mest effektive for å indusere migrering. I sammendrag, gjør det mulig for cellekulturmodellsystem for både kvalitativ og kvantitativ migrering vurdering.

EMT har vært knyttet til transkripsjonsfaktorer (TFS), for eksempel Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, Twist1, Twist2 i ulike systemer, inkludert epiteliale kreftformer, som brystkreft, tykktarmskreft, lungekreft og også i hjernesvulster 1,18. vi hAnnonsen tidligere vist at FGF2 og BNIP2 eller BMP4 kan indusere Snail1 og Snail2 8,9. Ved hjelp av ovennevnte system vi undersøkt uttrykket nivåer av de andre EMT-relaterte TFS. Ingen endringer i Twist1 uttrykk kunne påvises; med Twist1 være på lave nivåer i løpet FGF2 eksponering (data ikke vist). I cellekulturmodell ble det observert en oppregulering av Zeb1 og Zeb2 under FGF2-eksponering og av Twist2 under FGF2 / BMP4-eksponering (figur 6).

NSC er kjent for å bidra til befolkningen i oligodendrocyte forloperceller (OPCs) 8,19,20. Flere linjer av bevis indikerer at NSC og særlig OPCS kan være celle utstedt gliomer 21,22. For å karakterisere den ovennevnte modell ytterligere, undersøkte vi ekspresjonen av OPC-markører. Vi observerte at FGF2 utsatte NSCs demonstrerte co-uttrykk for Olig2 / nestin end Sox10 / nestin i mer enn 90% (figur 7). Denne observasjonen viser at de NSCs viser OPC-funksjoner i systemet vårt. Faktisk, OPC-funksjonene korrelerte med oppregulering av Zeb'1 og Zeb'2 (figur 6 og 7). Disse resultater antyder at FGF2-utvidelse utleder en OPC identitet, som bedømt ved Olig2 og Sox10, mens samtidig initierer første Zeb -baserte trinnene med EMT.

Figur 1
Figur 1: Standardiserte Embryo og forhjernen Dissection for NSC Isolering og EMT induksjon. (A) Venstre forbena av rotte E14.5 embryo etter keisersnitt. Hver forgrunnen lem siffer er merket med en svart pil spiss. Merk begynnelsen sifret dannelsen typisk for E14.5. (B) Rat E14.5 embryo etter skroget fjerning. Merk hash (#) på rygg diencephalon wjør det enkelt å starte fjerning av hud / skull anlage. (C) Huden / skallen er allerede for det meste fjernes. Grensen mellom fjernet og unremoved huden er merket med to trekantede pilspisser. Huden kan skrelles anteriorly fra fremre pil og bakover fra bakre pilen. (D) Huden / skull er nå helt fjernet. Legg merke til hakket i midthjernen-bakhjerne grense (pil) og kuttet bare kaudalt til den, som er merket med en pilspiss. (E) Den telencephalon-diencephalon-mesencephalon (TEL-di-MES) blokken er fjernet fra resten av embryoet . (F) Superior utsikt over TEL-DI-MES blokken. Kraniale blir startet. (G) på skrå ovenfra. (H) mindreverdig riss av TEL-DI-MES-blokk. (I) mesencephalon og en del av diencephalon separeres fra telencephalon med den fremre del av diencephalon. Øverst: Anterior syn på begge telencephalic vesikler. Bunn: Right lateral visning av mesencephalon, står øverst kranialt (J) Top:. begge telencephalic vesikler uten diencephalon. Dårligere syn å illustrere fullstendig fjerning av diencephalon. Asterisk viser MGE. Bunn:. Fremre del av diencephalon (K) Top: Begge halvkuler separeres i interhemispheric fissur. Venstre halvkule på venstre side. Asterisk viser MGE. Plusstegnet viser LGE. (L) Forstørrelse av venstre hemisfære med median utsikt. Høyre står overfor kranialt, venstre caudally, toppen er dorsal, bunn ventral, henholdsvis. Stjerne (*) er plassert på MGE. Plusstegn (+) ligger på LGE. lm, kortikal hem; FL, forbena; di, diencephalon; mes, mesencephalon; MHB, midthjernen-hindbrain grense; HL, bakben; LGE, lateral ganglier eminense; MGE, mediale ganglier eminense; ob, luktelappen; pc, posterior cortex; rho, rhombencephalon; tel, telencephalon. Rutenettet på hvert bilde viser 2 mm tykke linjer med fire kryss med tynne linjer hver400 um. Scale bar på alle bildene. 2 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Standardisert kortikal SVZ disseksjon for NSC Isolering og EMT induksjon. (A) Median visning av venstre hjernehalvdelen. Gjennom foramen av Monro MGE og LGE er synlige, preget av stjerne og plusstegn. (B) Den luktelappen fjernes bare kranialt for MGE-LGE. (C) Den bakre pol av hjernebarken fjernes like bak CGE . (D) Top: kortikale hem er skilt fra cortex. Venstre: bakre pol. Midten: kompleks som inneholder den sentrale del av cortex og CGE-LGE-MGE blokken. MGE og LGE ansikt til høyre. Høyre: olfactory bulb. (E) Den CGE-LGE-MGE-cortex blokk er snudd horisontalt. Nå den ytre overflate av telencephalon vender mot mikroskop. MGE og LGE nå ansikt til venstre. (F) De rødlige hjernehinnene er fjernet fra den lyse gjennomskinnelig cortex. CGE-MGE-LGE-ctx blokken blir nå vendes tilbake horisontalt for det neste trinn. (G, H) Den samme prosedyre ble gjentatt med den høyre hjernehalvdel. Den sentrale cortex er adskilt fra den CGE-MGE-LGE blokken. Merk at det er en mellomliggende cortex sone som er igjen på CGE-MGE-LGE blokk, merket med to piler. Dette mellom cortex tykkelse svarer til halvparten av diameteren av LGE. Stiplet linje som representerer grensen mellom LGE-CGE og cortex. (I) Den sentrale cortex er delt opp i eksplantater på mindre enn 400 um diameter. Skala: 2 mm; rutenett på hvert bilde viser 2 mm tykke linjer med fire kryssene (tynne linjer) hver 400 mikrometer. Stjerne (*) er plassertt MGE. Plusstegn (+) ligger på LGE. Forkortelser: maur-CTX, anterior cortex; CEN-CTX, sentral cortex; CGE, haleganglier eminense; lm, kortikal hem; cp, choroid plexus; CTX, cortex; LGE, lateral ganglier eminense; menn, meninges; MGE, mediale ganglier eminense; ob, luktelappen; pc, posterior cortex. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Eksplantering såing på 35 mm gittercelle kulturskåler Plasser 1 ml medium utvidelse ved midten av risten 500 um tallerken. Fallet inngår i rutenettet rim (små piler). Plasser explants rett ved sentrum av en ml dråpe. Dersom eksplantater er spredt utenfor nettet, swIRL fatet i en langsom sirkelbevegelser og explants vil flytte til sentrum av sentripetalkraften. Merk: explants er bare knapt synlig ved øyet (svart pil hoder). Skala: 35 mm.

Figur 4
Fig. 4: PDPN induseres i nærvær av BMP-4 eksplantater ble dyrket i henhold til protokollen del 8 (2 dager i FGF2 bare, deretter fulgt av FGF2 med faktorer som er anført). Kontroll (A) (FGF2 alene) og TGFβ1 (C) eksplantater ikke inneholdt PDPN-positive celler (grønt). Kjerner er farget med DAPI (blå). BMP4 (B) og TGFβ1 / BMP4 (D) eksplantater viste en høy andel av PDPN-positive celler. Eksplantering sentrum er på venstre side, periferien til høyre. Merk: PDPN-positive celler var for det meste symboliserted i periferien og ikke i midten av eksplantatet. De TGFβ1 / BMP4 explants finnes flatere, mer utdypet PDPN-positive celler. (E) Andelen PDPN-positive celler i explants på ulike forhold er representert. Kontroll og TGFβ1 begge er vesentlig forskjellig fra forholdene med BMP4. Midler vises ± SEM. Kontroll vs. TGFβ1 er ikke signifikant (ns). Kontroll og TGFβ1 vs. BMP4: p <0,0001 (***). TGFβ1 vs. TGFβ1 / BMP4: p <0,0001 (***). BMP4 vs. TGFβ1 + BMP4 er ikke signifikant: p = 0.0981 (ns). Kontroll vs. TGFβ1 + BMP4: p <0,0001 (***). Scale bar for alle bildene, som illustrert i (A). 50 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 Figur 5: Kvantitativ Migration Assessment. BMP 4 og TGF ß en additiv effekt på cellevandring. Explants ble dyrket i henhold til protokollen punkt 8. (A) Spenning eksplantering. (B) Eksplantering i BMP4 alene. (C) Eksplantering i TGFβ1 alene. (D) Eksplantering i kombinasjonen av TGFβ1 og BMP4. (E) Migrasjon avstand i mikrometer. 500 um gitter ble benyttet som referanse. Kontrollen og TGFβ1 explants viser en sterk spredning med en større explant diameter enn i de andre forholdene. Midler vises ± SEM. Merk at BMP4 og TGFβ1 / BMP4 explants delvis i oppløsning eksplantering kjernen og cellene emigrere vekk fra det sentrifugalkraften. Kontroll vs. TGFβ1 er ikke signifikant (ns). TGFβ1 vs.BMP4: p = 0,0353 (*). Kontroll vs. BMP4: p = 0,0351 (*). BMP4 vs. TGFβ1 + BMP4: p = 0,0372 (*). Kontroll vs. TGFβ1 + BMP4: p <0,0001 (***). Skala: 500 mikrometer. Center of eksplantering er preget av et plusstegn (+). Ytterkanten av trekkende celler er merket med trekantet pil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6:.. Oppregulering av EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer ved QRT-PCR EMT er knyttet til de sentrale transkripsjonsfaktorer i Zeb- og Twist-familien (A, B) Zeb'1 og Zeb'2 ble oppregulert i løpet av den første fasen av FGF2-eksponering. (C) Twist'2 ble oppregulert i løpet av second fase av FGF2 / BMP4-eksponering. Relative uttrykk nivåer basert på QRT-PCR er vist (n = 2). De mRNA-nivåer ble normalisert til GAPDH. Midler vises ± SEM. På dag 0 i FGF2 periode mRNA ble høstet, ble ytterligere mRNA høstet etter fire dager i FGF2, og deretter etter en dag i FGF2 / BMP4 Zeb'1.: Kontroll vs. FGF2, p = 0,0002 Zeb'2:. Kontroll vs. FGF2, p = 0,0206 Twist'2. kontroll vs. FGF2 + BMP4, p = 0,003.

Figur 7
Fig. 7: viser NSCs OPC Egenskaper i modellsystemet NSCs ble isolert fra den sentrale cortex og dyrket som enkeltceller i nærvær av FGF2 (i henhold til punkt 5). Etter åtte d i kultur (passering etter 4 d etter § 7.9) cellene dannet små NSC kolonier og ble farget for Olig2 (rød, i B, C), Sox10 (rød, i E, F) og nestin (grønn, A, C, D, F). En høy andel av celler ko-uttrykt Olig2 / nestin (AC) og Sox10 / nestin (DF). (G) Co-ekspresjon av Olig2 / nestin og Sox10 / nestin er vist i prosentandel av alle celler. Midler vises ± SEM. Scale bar for alle bilder som illustrert i (A) og (D). 20 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Betingelse Totalt explants (sentral cortex) Explants med vandrende svar % Explants med Podoplanin uttrykk %
Kontroll 33 0 0 0 0
TGFb1 21 0 0 0 0
BMP4 34 34 100 34 100
TGFb1 + BMP4 22 22 100 22 100

Tabell 1. BMP 4 og kombinasjonen av TGF ß en med BMP 4 Frem et Robust trekkende Response. Explants fra sentral cortex ble opprettholdt i ekspansjon medium og FGF2 for totalt fire dager. Etter den førsteto dager, explants enten fortsatte å motta FGF2 alene (kontroll) eller FGF2 og i tillegg TGFβ1, BMP4 eller TGFβ1 / BMP4 som kombinasjon. Kontroll- og TGFβ1- explants gjorde verken viser en trekkfugl respons eller PDPN uttrykk. BMP4 og TGFβ1 / BMP4 indusert både trekkende celler samt PDPN uttrykk i alle explants.

Region Totalt explants Explants med trekkfugl respons i FGF2 / BMP4 %
Central cortex 146 145 99.3
posterior cortex 52 48 92,0
MGE 56 29 51,7
mesencephalon 53 28 52.8

Tabell 2. Den sentrale Cortex viser mest Robust Migrasjon i Response til FGF 2 / BMP 4 explants ble fremstilt fra ulike regioner i utviklingsland rotte E14.5 nevralrøret. Sentral cortex, bakre cortex, den mediale ganglier eminense (MGE) og mesencephalon. Alle explants ble dyrket likt i FGF2 / BMP4 (§ 8). Explants behandlet uten BMP4 viste ingen trekkfugl respons (data ikke vist). Alle eksplantater ble screenet for utseendet av migrerende celler pr eksplantat. Alle regioner var i stand til å svare på FGF2 med BMP4 med migrasjon. Den sentrale cortex, viste imidlertid den mest robuste respons. Merk at BMP4 var nødvendig for å fremkalle noen trekkende celler. Explants dyrket i FGF2 alene viste spredning, men ingenmigrasjon; og ingen flate migrerende celler ble observert i FGF2 alene (tabell 1 og tilleggs figur 2).

Supp Figur 1
Supplerende Figur 1. 400 mikrometer Grid fil. Rutenettet filen kan skrives ut og brukes som referanse under de ovennevnte disseksjon trinnene og som vist i figur 1 og 2. De store kryss representerer 2 mm med 400 mikrometer inndelinger. Klikk her for å laste ned en PDF-versjon av denne figuren.

Supp Figur 2
Supplerende Figur 2. BMP 4 -exposed explants Show Flat Migratory Cells. Forstørrelse av celler som er vist i figur 5. (A) kontroll-(FGF2 alene) og (C) TGFβ1-explants vist en sterk celledeling med små runde celler. (B) BMP4- og (D) TGFβ1 / BMP4-explants viste konsekvent flate langstrakte celler. Scale bar for alle bildene, som illustrert i (A). 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Supplerende Figur 3. Oppsummering av in vitro modellsystem for EMT etterforskning. E14.5 rotte sentral cortex inneholder NSC holdige SVZ. Den sentrale cortex er enten used som eksplantering stykker eller som enkeltceller. Eksplantering brikkene er mer praktisk for kvantitativ migrasjon analyse (§ 8). Enkeltceller er egnet for kvalitativ analyse, slik som gen eller proteinanalyse (§ 9,13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien ble et standardisert system for EMT analyse som anvender NSCs er beskrevet (oppsummert i Supplementary figur 3). Standardiseringen sikrer reproduserbarhet (tabell 1 og 2). De NSCs er utledet fra å utvikle cortex, et vev som normalt ikke gjennomgår EMT. Dette er fordelaktig for analysering av tidlige trinn i EMT. Første skritt i EMT kan ikke tilstrekkelig undersøkt i kreftceller som har akkumulert genetiske forandringer og kan allerede vedtatt EMT funksjoner. Videre primærtumorprøver er ikke ideelt å forstå EMT siden de fleste ondartede svulster er heterogen som inneholder både invasive og ikke-invasive celler. Den presenterte protokollen gir EMT forskere med en ny modell for å studere tidlige trinn av EMT induksjon. Her viser vi at nøkkel EMT indusere av Zeb og Twist familie er sekvensielt aktivert: i den første fasen Zeb1 og Zeb2 er oppregulert, under den andre fasen Twist2 (Figure 6). Tidligere hadde vi vist at Snail1 allerede er oppregulert flere timer etter BMP4-eksponering 8. Vi hadde også vist at ved BMP4-eksponering de neuroepithelial stamceller fra det sentrale cortex differensiere i mesenchymalceller, positive for glatt muskulatur aktin (SMA) og calponin 9. Resultatene ovenfor fullføre den tidligere undersøkelse som viser at i alle de tre kjente nøkkel EMT regulatorer er involvert i systemet. I tillegg observerte vi at TGFβ1 kan betydelig forbedre den vandrende effekten av FGF2 / BMP4 alene. Disse resultatene peker til et nettverk mellom FGF-, BMP- og TGFfi-signalering under EMT induksjon.

De mest kritiske trinn for vellykket isolering av NSCs for EMT og migrasjon analyse er: korrekt identifisering av embryonale alder, identifisere anatomiske landemerkene i utvikling av embryo, utarbeidelse av ferske kulturmedier og (minst over natten) belagte plater, bruk av fine-tipped instrumenter og propr dissekering av det sentrale parti av det fremkallende cortex for å etablere kortikale eksplantater.

De presenterte teknikkene kan bli forsterket av noen endringer. Som antydet ovenfor, er flere explants sådd ut på en enkelt tallerken med et rutenett. For screening av multiple forbindelser, kan det imidlertid være mer praktisk å plassere enkelt eksplantater i hver brønn i en 96-brønns plate. Videre kan modellsystemet skal raffineres for storskala drug discovery. Som beskrevet ovenfor, er PDPN en verdifull markør for nyervervede trekkende funksjoner siden PDPN er funnet i invasiv NSCs 8. En PDPN reporter kan transfektert i normale NSCs før EMT induksjon. Som en konsekvens PDPN uttrykkende celler kan tjene som en intern kontroll for celletransformasjon siden PDPN ikke blir uttrykt i normale NSCs (figur 4 og tabell 1). Flere andre NSC markørene er tilgjengelige, for eksempel nestin, som er tapt etter EMT induksjon 8. Som en konsekvens,både den opprinnelige tilstanden, "ikke-vandrende / non-invasiv / nestin +", og den endelige tilstand, "vandrende / invasive / PDPN +", kan overvåkes, noe som gjør det mulig automatisert legemiddelforskning. I store cellekulturplater med flere brønner (for eksempel 96-brønns plater og større) innledende celler kan podet og behandlet med etablerte legemidler eller forbindelser uten kjent funksjon. Dermed kan multibrønnplater automatisk bli skannet for uttrykk av PDPN eller andre migrasjon / invasjon markører. Hvis en inhibitor er det viktigste målet på skjermen, kan forsvinningen av PDPN uttrykk bidra til å identifisere putatively interessante nye hemmende forbindelser.

Under testing av en roman stoff explants kan ikke vise migrasjon og / eller explants kan runde opp og løsne fra fatet. I denne situasjon, er det best å endre bare halvparten av media hver dag (istedenfor fullstendig endring av medium hver annen dag). Dette reduserer stress ved overflatespenning når du bytter ut med frisk media. Deexplants kan ikke legge etter den første platekledning. I denne situasjon, har fibronektin til å være i kontakt med fatet overflate i minst 36 timer. Fibronektin brukes for belegg skal tilberedes uten eksponering for et plastrør i mer enn 10 min siden fibronektin kan feste seg til plasten. Videre kan eksplantater avgjøre utsiden av nettet. I denne situasjonen er det tilrådelig å virvle fatet i en langsom sirkelbevegelse. Dette gjør explants å flytte til sentrum med sentripetalkraften (se figur 3).

Det er sterke bevis for at hjernesvulst er avledet fra NSC og / eller OPCs avledet fra NSC 23,24. Som en konsekvens av andre grupper har etablert gliom vekstmodeller på grunnlag av NSCs:. Sampetrean et al isolerte NSCs fra Ink4 / ARF-manglende mus og tvunget overekspresjon av H-Ras 25. Høy grad av ondartede svulster resulterte som viste spredning og invasjon etter transplantasjon 25. McNeill et al. også isolerte NSCs fra genmodifiserte mus (floxed Rb1, NF1, Kras, PTEN alene og i kombinasjoner) 26. Genene ble inaktivert av Cre-virus infeksjon og NSC ble transplantert 26. Begge disse modellsystemer har den fordel at invasjonen kan overvåkes in vivo og eventuelle nye anti-invasjons medikamenter kan testes. Deres største ulempe er at utbruddet av invasjonen ikke er godt definert og det er uklart om de cellene vise gliom-typisk EMT invasjon (EMT gener) eller bare lokal migrasjon. Ytterligere bare ett legemiddel kan testes pr dyr og analysen krever flere uker. For å identifisere en roman anti-invasjon narkotika, farmasøytiske selskaper trenger (a) å screene for flere tusen forbindelser eller flere på en gang, (b) å replikere testene og (c) å prøve forskjellige medikamentkonsentrasjoner. For å forberede flere tusen transplanterte dyr, behandle dem med ulike medikamenter og endelig teste for effekter ved histokjemisk eller bioluminesensanalyse er svært ressurskrevende. Her en roman NSC-basert modell system for EMT-relaterte invasjonen er beskrevet som gjør at kostnadseffektive screening av tusenvis av forbindelser.

Selv om denne modellen kan high throughput screening av forbindelser, er det en primær screening plattformen. Når forbindelser av interesse er identifisert i denne modellen, vil de kreve ytterligere kontroll. In vivo testing er nødvendig for sikkerhet og effekt parametre for enhver forbindelse identifisert og transplantasjons modeller som beskrevet ovenfor blir viktig 25,26. Modellen er også begrenset av det faktum at det er basert på gnagerceller. Selv om modellen kan brukes til å undersøke rotte eller mus EMT, er det uklart om de samme mekanismer er på plass i humane celler eller i den humane pasient. Ytterligere eksperimenter for å undersøke om NSCs er ikke bare invasiv in vitro, men også etter transplantasjon. Flere linjer av bevis støtter rollen til NSCsi glioma formasjon. Glioma progresjon har vært knyttet til følgende gener: tenascin C, Hey1, SPARC, Snail1 og Snail2, FGFR +, BMPR1a, EGFR, PDGFRp, Sox2, Podoplanin, Gli3 og p75OOFR 8. Alle disse genene er også uttrykt i transformasjonen av normale ikke-invasive NSCs til invasive mesenchymalceller 8. På den tiden, er det uklart om NSCs kan bli forvandlet til svulster fra eksterne vekstfaktorer bare.

Tumor-initiering av stamceller (tics) fra forskjellige tumorer er blitt isolert og blir brukt som modeller for å forstå tumorprogresjon 27. Tics er imidlertid ikke godt egnet for analyse EMT, siden EMT har allerede forekommer i tics 27. For å forstå tidlige og sene også trinnene med EMT induksjon, er en primær ikke-neoplastisk cellepopulasjon er nødvendig. Ideelt denne populasjonen var ikke ment å gjennomgå EMT i første omgang. Det hadde tidligere blitt vist at NSC embryonale var egnede kandidater for dette formål9,28. Nemlig, migrasjon og invasjon kan bli indusert i NSCs av FGF2 og BMP4 9,28. FGF2 / BMP4-indusert migrering var knyttet til enkelt EMT-relaterte gener, men ble fullstendig bevis mangler siden de viktigste EMT familier Zeb og Twist ikke hadde blitt undersøkt åtte. Resultatene ovenfor viser at en bestemt kombinasjon av fire faktorer, FGF2, BMP4, TGFβ1 og insulin forårsake en meget sterk og komplett EMT induksjon, ikke observert før. Denne studien viser at de viktigste EMT gener fra Zeb- og Twist-familier er også oppregulert. Denne undersøkelsen gir derfor det første bevis på at det ikke er selektiv oppregulering av enkeltgener, men resultatene viser at alle viktige EMT familier er aktive i det foreslåtte cellekultursystem.

EMT har også blitt observert i epiteliale cancere utenfor hjernen, slik som lunge, bryst, tykktarm og magekreft 29. Flere modeller for å studere EMT er i bruk for disse svulstene 30-32Og som kommer imidlertid betydelige begrensninger: (a) bruk av transformerte tumorcellelinjer som bærer multiple genetiske og epigenetisk endrer 33; å identifisere hemmere av EMT for tidlig kreft stadier, sent stadium kreftceller er utilstrekkelig; (B) serum-avhengige kulturer som inneholder forskjellige udefinerte vekstfaktorer; Dette gjør identifisering av kritiske faktorer svært vanskelig. Videre blir eksperiment reproduserbarhet nedsatt ettersom serum kvaliteten varierer fra parti til parti; (C) serum inneholder inhibitorer og enzymatiske aktiviteter eventuelt inaktive potensielt nyttige eksogene forbindelser; (D) behov for enzymer for celle aging som bryter ned celleoverflatemolekyler; (E) å identifisere agonister EMT for å fremme fysiologiske EMT, blir normale celler for å teste induksjon. Tumor cellemodeller er utilstrekkelige for å finne stoffer som fremmer regenerering i normale stamceller.

Migrasjon er også nødvendig for normale prosesser, så som sårheling og regenerasjon av den skadde hjernen 18. Etter traumatisk hjerneskade og slag, NSC er nødvendige for å migrere til lesjonen området for å delta i regenerering 4,34. Dagens system kan også anvendes til å identifisere stoffer som fremmer migrering og invasjon. Som vist ovenfor, er migrasjon indusert ved oppstart med BMP4-behandling. Dersom cellene ikke er utsatt for BMP, men i stedet til nye forbindelser, kan disse erstatte de BMP handling som vil bidra til å identifisere nye BMP-agonister. Med en reporter system som indikerer PDPN uttrykk, blir storskala testing for nye stoffer bart; hvis en ny forbindelse kan erstatte BMP, kan PDPN uttrykker celler automatisk bli identifisert.

Det foreslåtte system er også nyttig for å undersøke celle-signal interaksjoner. Våre resultater viser at BMP-virkning på migrering kan bli styrket ved TGFβ1 aktivering. Resultatene avdekker en additiv interaksjon mellom BMP- og TGFβ-signalering. Men flere signalveier, som hakk, Wnt- eller EGFR / MAPK- og andre signalkaskader kan være involvert. Derfor er ytterligere undersøkelser om BMP / TGFB-interaksjoner og krysstale til andre veier etter behov. I tillegg kan responsive sentrale cortex isoleres fra genmodifiserte mus, som kan bidra til å belyse de underliggende mekanismene som driver EMT. Oppsummert kan den EMT modellsystemet beskrevet her være nyttige innen stilk cellebiologi og regenerering, samt i kreftforskning. Det kan brukes til screening av biblioteker for legemiddelstoffer som hemmer eller fremmende migrering og invasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Studien ble støttet av Universitetet i Basel Science Foundation og den sveitsiske National Science Foundation av en bevilgning til MHS og AG (SNF IZLIZ3_157230). Vi takker: Dr. Tania Rinaldi Burkat for sjenerøst gi infrastruktur; alle medlemmer av Bettler gruppe for diskusjoner og kommentarer. Vi takker Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Sveits) for profesjonell og kompetent installasjon av Full HD MC170 videokamera (Leica Microsystems, Sveits).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMP4, rhBMP4 RnD Systems  314-BP-01M
Bovine pancreas insulin Sigma  I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay Cell Biolabs CBA-110 24 well plate system
Cell culture dish with grid Ibidi 500 mm dish, 35 mm 80156
CellMask Orange Life Technologies C10045 Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI LifeTechnologies D1306 Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle Gibco Invitrogen 21331-020
FGF2, rhFGF2 RnD Systems 233-FB-01M
Fibronectine, bovine Sigma  F4759
Glutamax supplement  Gibco Invitrogen  35050-061
Graphics software with pixel measurement feature Fiji fiji.sc/Fiji version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media Sigma  H9394
Human apo-Transferrin Sigma T1147 Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine Gibco Invitrogen  25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody Genetex GTX26142 Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody Provided by Hirohide Takebayash Personal stock Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone Gibco Invitrogen  15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody Acris DM3614P Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine Sigma  P3655
Putrescine Sigma  P5780 Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite Sigma  S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody Millipore Chemicon AB5774 Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1 RnD Systems 240-B-010
Uncoated Petri dishes Falcon Corning 351029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Tags

Developmental Biology Neural stamceller epitelceller til mesenchymale overgang migrasjon, gliom kreft invasjon Snail1 fetal bovine serum-fri FGF2 BMP4 TGFfi
Et enzym og Serum-free Neural Stem Cell Culture Modell for EMT Investigation Egnet for Drug Discovery
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D.,… More

Sailer, M. H. M., Sarvepalli, D., Brégère, C., Fisch, U., Guentchev, M., Weller, M., Guzman, R., Bettler, B., Ghosh, A., Hutter, G. An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (114), e54018, doi:10.3791/54018 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter