Summary
هذا البروتوكول توجه بكفاءة الماوس الجذعية الجنينية المستمدة من الخلايا الأديم الباطن نهائي لتنضج الهوائية الخلايا الظهارية. ويستخدم هذا الأسلوب التمايز 3-الأبعاد السقالات الرئة decellularized لتوجيه مواصفات النسب الرئة، في إطار ثقافة محددة، خالية من المصل.
Abstract
الرئة النسب التمايز يتطلب تكامل منبهات البيئية المعقدة التي تشمل عامل النمو الإشارات، والتفاعلات خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة. بسبب هذا التعقيد، خلاصة التنمية الرئة في المختبر لتعزيز تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا الظهارية الرئة قد التحدي. في هذا البروتوكول، وتستخدم السقالات الرئة decellularized لمحاكاة بيئة 3-الأبعاد في الرئة وتوليد الخلايا الجذعية الهوائية الظهارية المستمدة من الخلية. يتم التمييز الماوس الخلايا الجذعية الجنينية أول من سلالة الأديم باستخدام أسلوب الثقافة الجسم مضغي (EB) مع activin A. خلايا الأديم ثم تبذر على سقالات decellularized والمثقف في واجهة الهواء السائل لمدة تصل إلى 21 يوما. هذا الأسلوب يعزز تمايز الخلايا المصنف إلى الخلايا الظهارية مجرى الهواء وظيفي (خلايا مهدبة، وخلايا النادي، والخلايا القاعدية) دون إضافية مكملات عامل النمو. يتم تعريف الإعداد الثقافة هذه، سيرووغير مكلفة، وقابلة للتكرار خالية من م. بالرغم من وجود تلوث محدود من الأنساب الأديم غير الرئة في الثقافة، وهذا البروتوكول يولد سوى مجرى الهواء السكان الظهارية ولا تؤدي إلى الخلايا الظهارية السنخية. ظهائر الهوائية ولدت مع هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات خلية مصفوفة خلال توالد الرئتين والنمذجة المرض أو منصات اكتشاف المخدرات من الأمراض ذات الصلة الهوائية مثل التليف الكيسي.
Introduction
التمايز الموجهة من الخلايا المحفزة لنسب الرئة يعتمد على أحداث إشارات دقيقة في المكروية 1،2. ويرجع ذلك إلى الطبيعة الديناميكية لهذه العملية فقد كان تحدي لتقليد أحداث دقيقة من توالد الرئة في المختبر. وقد استخدمت التقارير الأخيرة استراتيجيات تقييد النسب تدريجي مع نمو قابل للذوبان عامل مكملات الثقافات ثنائية الأبعاد لتحقيق التمايز الرئة 3-8. في بروتوكولات التمايز خطوة حكيمة، الخلايا المحفزة، ما إذا كانت الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) أو التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة، ومتباينة أولا إلى طبقة الأديم الجرثومية نهائية. وقد دفعت خلايا الأديم الباطن في وقت لاحق إلى مصير الأديم الأمامي، وبعد ذلك إلى الخلايا الاولية الرئة، كما حددها التعبير المحتوية على homeodomain عامل النسخ NKX2-1. والتفرقة بين هذه الأسلاف الرئة أيضا على الأقرب (الهوائية) أو البعيدة (السنخية) خلايا الظهارية الرئة واياستمرت عشر عامل النمو مكملات. وكان هذه الاستراتيجيات 2-الأبعاد بعض النجاح في توليد خلايا الظهارية الرئة، ولكن هناك العديد من القيود بما في ذلك الكفاءة غير واضحة، وتلوث محتمل من الأنساب الأديم الباطن أخرى، عدم وجود (3D) هيكل 3-الأبعاد، وفي بعض الحالات تستخدم الثقافات غير محددة مع مكملات المصل. يستخدم ثقافة المحفزة أو خلايا متباينة على السقالات الرئة decellularized على نحو متزايد باعتبارها فحص لتقييم إمكانات التجدد الخلايا المزروعة في تشكيل الرئة الهياكل الظهارية 3،5،6،8،9. ثقافة هذه التقارير المصنفة الخلايا على السقالات مع استمرار عامل النمو أو مكملات المصل.
ينطوي نمو الرئة تقسيم، والهجرة، والتعبير الجيني وتمايز الخلايا الفردية في الاستجابة للمنبهات البيئية. في نسيج خارج الخلية (ECM) هو التشبيك من بروتينات سكرية أنه بالإضافة إلى توفير الدعم الهيكلي، يوجه TISSUالبريد التشكل من خلال دمج وتنظيم هذه العمليات 10،11. باستخدام سقالة ECM الرئة كمنصة الطبيعية للثقافة الأديم لتقليد أفضل في الجسم الحي الرئة الوسط التنموي، ونحن قد ولدت وقف الهوائية الخلايا الظهارية المشتقة من خلية في 3D ثقافة محددة مع وضع كفاءة عالية والتكاثر.
تم إنشاؤها الفئران الرئة السقالات ECM التي كتبها decellularization وكذلك خلايا الأديم الباطن المشتقة ESC الفأر تم إنشاؤها والمصنف في وقت لاحق على هذه الاطر. التعبير المزدوج للCXCR4 والبروتينات ج-KIT يشير إلى هوية محددة خلية الأديم الباطن وخلايا إيجابية لكلا SOX2 والتعبير NKX2-1 تم تعريفها على أنها خلايا الشعب الهوائية (الرئة الداني) السلف. كانت خلايا الأديم نهائية مثقف في واجهة الهواء السائل (علي) لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع لتوليد الخلايا الظهارية مجرى الهواء وظيفي في المختبر.
هذا البروتوكول يعزز الرئة النسب تمايز definiTIVE الأديم الباطن في وقت مبكر من 7 أيام، لاحظ مع ظهور NKX2-1 + / + SOX2 مبكرة الأسلاف الرئة القريبة. يوم 14 و 21 من ثقافة ناضجة السكان الخلية الهوائية الظهارية ستخرج بما مهدبة (TUBB4A +) ونادي (SCGB1A1 +)، والقاعدية (TRP63 +، KRT5 +) الخلايا مع تشابه الصرفي والوظيفي لشركة الخطوط الجوية الماوس الأم. يوضح هذا البروتوكول على أهمية المكروية 3D مصفوفة لتحقيق التمايز قوي لمجرى الهواء الخلايا الظهارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا لتعليمات لجنة رعاية الحيوان من مستشفى معهد بحوث المرضى الأطفال.
1. إعداد سقالة
- Decellularization من الرئتين
- الموت ببطء فئران ويستار الكبار باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 غرفة. وضع الحيوان في غرفة وبدأ 100٪ التعرض CO 2 بمعدل ملء من 10-30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة الواحدة.
- مراقبة الحيوانات لفقدان الوعي. هذا سيحدث بعد حوالي 2-3 دقائق. في حالة عدم حدوث فقدان الوعي في هذه الفترة الزمنية، تحقق معدل وختم غرفة ملء الفراغ. بعد فقدان الوعي، ومراقبة الحيوانات للون العين الباهتة وعدم وجود التنفس. إذا لوحظ على حد سواء، والحفاظ على CO 2 ملء لمدة 1-2 دقيقة ثم إزالة الحيوان من غرفة لإجراء.
- تأمين الحيوان تشريح سطح عن طريق تحديد الأرجل الأمامية ورجليه الخلفيتين، ورذاذ أسفل الصدر ومنطقة البطن مع الايثانول 70٪. الوصول إلى القلب ولوخ ع من خلال فتح التجويف الصدري باستخدام شق عمودي على طول القص.
- جعل شقوق صغيرة من خلال الحجاب الحاجز الأول للتسبب في الرئتين إلى التراجع، مما يقلل من فرصة من ثقب الرئتين. Ligate الوريد الأجوف السفلي مع خياطة ووضع شق صغير في الأذين الأيسر مع مقص تشريح الصغيرة.
- باستخدام مستعدة حقنة 10 مل مع إبرة 25 G مملوءة بمحلول ملح متوازن heparinized هانك (HBSS) (10 U / الهيبارين مل في HBSS)، بدء نضح الرئة عن طريق إدخال إبرة إلى البطين الأيمن لدفع المخزن المؤقت من خلال الدورة الدموية الرئوية (بمعدل 2 مل / دقيقة). يستمر هذا الإجراء حتى تتحول الرئتين البيضاء والسوائل المتدفقة من الأذين الأيسر يعمل اضح.
- بعد نضح، فضح القصبة الهوائية ويقني؛ يدخل القنية مع قسطرة بلاستيكية بالقرب من غضروف الغدة الدرقية وآمنة في مكان مع خياطة.
- إعداد نظام نضح الجاذبية عن طريق تحديد حقنة 10 مل إلى موقف معوجة والمشبك. إزالة ودiscard حقنة الغطاس. تأمين أقصى نقطة التعبئة على حقنة برميل في 20 سم فوق الرئتين. إرفاق اتجاهين محبس إلى نهاية الحقنة، وأنابيب بلاستيكية طويلة إلى الطرف الآخر من محبس لتقديم حل decellularization إلى القصبة الهوائية مقنى. صب الحل في حقنة والسماح حل لملء الأنابيب البلاستيكية المرفقة والقسطرة.
- غسيل الرئتين عن طريق ملء إلى إجمالي قدرة الرئة (حوالي 12 مل) لمدة 1 دقيقة، وإزالة القسطرة من البلاستيك من القصبة الهوائية للسماح للسائل بالتدفق خارج الرئتين. لا تملأ حقنة أكثر من 10 مل عندما lavaging الرئتين للحفاظ على ضغط أقل من 20 سم من H 2 O.
- تكرار غسل الرئتين ثماني مرات مع حل decellularization، تليها 10 يشطف مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- تشريح القصبة الهوائية والرئتين خالية من الرقبة والصدر تجويف وإزالة من الحيوان. إبقاء الأنسجة في برنامج تلفزيوني الباردة عند 4 درجات مئوية حتى إعداد لvibratome حد ذاتهاctioning.
- الموت ببطء فئران ويستار الكبار باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 غرفة. وضع الحيوان في غرفة وبدأ 100٪ التعرض CO 2 بمعدل ملء من 10-30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة الواحدة.
- جيل قسم سميكة
- إعداد حوالي 15 مل من 2٪ و 4٪ (ث / ت) الاغاروز، ويكفي 6٪ (ث / ت) الاغاروز لتضمين كل الفصوص إلى كتل صغيرة مستطيلة الشكل. حل منخفض مسحوق الاغاروز نقطة انصهار في برنامج تلفزيوني عن طريق الميكروويف. نقل الاغاروز إلى 50 مل أنابيب في كتلة الحرارة والحفاظ على درجة حرارة أعلى من 40 درجة مئوية إلى تجنب التبلور.
- تشريح الرئة decellularized في نهاية كل القصبات الهوائية فصي إلى فصل كل فص (الجمجمة، والمتوسطة، والإكسسوارات، وفصوص الحق الذيلية والفص الأيسر) باستخدام مقص صغير. ثم جففيها كل الفص باستخدام أوراق ماصة لإزالة الزائدة برنامج تلفزيوني وتضع داخل 2٪ (ث / ت) الاغاروز بينما على كتلة التدفئة.
- إزالة كل الفص بعد 5 دقائق من الطلاء في الاغاروز، وضع في طبق بتري والسماح للسطح لهلام لمدة 1 دقيقة على طبق من ذهب الباردة.
- وضع بلطف فصوص مرة أخرى إلى 4٪ (ث / ت) الاغاروز، باردة بعد 5 دقائق، وتكرار الطلاء مرة أخرى مع 6٪ (ث / ت) الاغاروز.
- بعد التعاون متسلسلating من كل شحمة الأذن، وتضمين كل فص على حدة في 6٪ (ث / ت) الاغاروز باستخدام قوالب قاعدة معدنية مع 3 مم على الأقل من الاغاروز المحيطة الأنسجة من الحواف. توجيه كل الفص باستخدام ملقط عن طريق وضع أكبر حافة مسطحة الفص من على سطح قالب معدني تواجه المجرب. وهذه الحافة يكون الجانب الثابت إلى لوحة عينة لvibratome باجتزاء.
- السماح للبنات لهلام على لوحة باردة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل باجتزاء مع vibratome. متجر بنات في غرفة ترطيب لمدة تصل إلى 12 ساعة عند 4 درجات مئوية قبل vibratome باجتزاء.
- إعداد vibratome عن طريق ملء غرفة باجتزاء مع البرد PBS 12. الحفاظ على درجة حرارة باردة طوال باجتزاء مع حمام الجليد المحيطة بها. إزالة كتل من القوالب المعدنية واستخدام شفرة حلاقة لخفض عدد الاغاروز الزائدة المحيطة فصوص، مع الحفاظ على ما يقرب من 3 ملم من على حافة النسيج.
- إصلاح الأنسجة إلى وسط لوحة العينة باستخدام لاصق، وغمر لوحة في رانه برنامج تلفزيوني مليئة غرفة باجتزاء. الإعداد باجتزاء الحدود على vibratome عن طريق تحديد القيم السرعة والسعة، وسمك التالية على التوالي: 0.2 ملم / ثانية، 1.85 مم، و 350 ميكرون.
ملاحظة: أقسام كل الطولي والعرضي للتوجه الفص مقبولة. - قسم كل الفص تماما. يدويا أقسام قطع مجانا باستخدام مقص صغير إذا لم يتم فصل قسم كامل من شفرة في نهاية المقطع تسلسل. جمع أقسام سقالة بلطف والاحتفاظ في برنامج تلفزيوني على الجليد حتى الخطوة التالية.
ملاحظة: سوف أقسام لدت تشمل كلا من المناطق القريبة والبعيدة الرئة وكل من المصادر يمكن استخدامها لrecellularization. ومع ذلك، فإن معظم سطح تشمل الرئة البعيدة.
- إزالة التلوث من أقسام سقالة
- نقل 350 ميكرون أقسام سقالة سميكة من برنامج تلفزيوني لأنابيب microcentrifuge (ما يصل إلى 30 أقسام / أنبوب) وعلاج مع نوكلياز (90 U / مل في برنامج تلفزيوني) (انظر قائمة من المواد) ل12-24 ساعة على RT، علىمحور دوار.
- بعد العلاج نوكلياز، أقسام النقل باستخدام ملقط لأنابيب microcentrifuge جديدة ومعالجة بمحلول مضاد للميكروبات (200 U / مل الستربتوميسين بنسلين و 25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B في برنامج تلفزيوني) تحت ظروف معقمة لمدة 6 ساعة على RT، على محور دوار.
ملاحظة: يمكن تخزين السقالات في حل المضادة للجراثيم لمدة تصل إلى أسبوع واحد في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. - بعد خطوة التطهير بمحلول مضاد للميكروبات، وشطف السقالات مرتين مع برنامج تلفزيوني تحت ظروف معقمة ونقل إلى المصل وسائل الإعلام التمايز مجانا (SFDM) قبل البذر مع الخلايا.
2. الأديم الباطن خلية التحضير
- نهائي الأديم التعريفي
- الحفاظ على خطوط الماوس ESC تحت، الثقافة الحرة في مصل الدم خالية من وحدة التغذية باستخدام الظروف 2I 13. بدء الأديم الاستقراء عن طريق إزالة الخلايا من الثقافة المحفزة ملتصقة بواسطة trypsinization.
- و resuspend الخلايا في SFDM والبذور في مناطق ذات كثافة من 20،000خلية / مل في انخفاض لوحات ملتصقة لمدة ثلاثة أيام دون تغيير وسائل الاعلام للسماح لتشكيل EB.
- بعد ثلاثة أيام من نقل بلطف EBS إلى 50 مل أنابيب مخروطية باستخدام ماصة 10 مل، وتمكينهم من جمع في أسفل لمدة 3 دقائق على RT.
- تستكمل بعناية وسائل الاعلام نضح وإضافة وسائط SFDM جديدة مع 50 نانوغرام / مل activin أ.
- خلايا البذور مرة أخرى إلى انخفاض الصفائح ملتصقة في 1: الكثافة 2 والثقافة لمدة ثلاثة أيام إضافية لتحقيق نهائي تمايز الأديم.
- تخصيب الأديم الباطن نهائي
- جمع يوم 6 EBS، فصل مع التربسين وتسمية لج-KIT والتعبير CXCR4 باستخدام الأجسام المضادة فلوري مترافق 14.
- خلايا النوع المسمى باستخدام مضان تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) للتعبير عن كلا علامات للحصول على المخصب نهائي السكان الأديم 15.
3. إعداد Recellularization
- واجهة الهواء السائلالإعداد الثقافة
- نقل كل قسم السقالة decellularized (الخطوة 1.2.9) من SFDM على غشاء العائمة مسعور (8 حجم ميكرون المسام) باستخدام ملقط معقم. وتنتشر ضمان سقالة أقسام بالتساوي على الغشاء.
- إعداد 6- أو 12-جيدا لوحات عن طريق ملء الآبار مع 1 أو 0.5 مل من SFDM، على التوالي. وضع بلطف الأغشية في الآبار، والسماح للغشاء لتطفو على السطح من وسائل الإعلام، وخلق ثقافة الإعداد الهواء السائل.
- بذر السقالات 3D
- بعد FACS لعلامات الأديم نهائية (الخطوة 2.2.2) عد خلايا فرزها باستخدام عدادة الكريات، وتدور باستمرار في 400 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend في SFDM. و resuspend الخلايا للحصول على حجم تحتوي على ما يقرب من 100،000 خلية / 10 ميكرولتر / سقالة.
- لrecellularize السقالات، ماصة 10 ميكرولتر من الخلايا مباشرة على كل قسم على استعداد من الخطوة 3.1.2.
- استبدال وسائل الإعلام SFDM في ثقافات كل 48 ساعة. نضح في وسائل الإعلام القديمة من خلال عقد لوحة في انحدر طفيفلتجنب تعطيل الثقافة. ببطء إضافة SFDM جديدة للثقافة على طول الجانب من البئر لمنع غرق غشاء العائمة.
- الحفاظ على الثقافات الهواء السائل لمدة تصل إلى 21 يوما لتحقيق تمايز الخلايا المصنفة في لظهائر الهوائية الناضجة.
ملاحظة: Recellularized أقسام يمكن معالجتها لتلطيخ الأنسجة ومناعي (IF) المجهري في أي نقطة زمنية خلال زراعة الخلايا 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما هو مبين في هذا البروتوكول، والتمايز قوي من الأديم الباطن نهائي لتنضج الهوائية الخلايا الظهارية يمكن تحقيقه باستخدام ثقافة ممتدة من خلايا المصنف على أقسام سقالة الرئة decellularized. فمن المستحسن أن تتميز السقالات decellularized لضمان (1) تتم إزالة الخلايا المضيفة تماما، و (2) يتم الاحتفاظ البروتينات المصفوفة خارج الخلية قبل استخدام السقالات للتمايز. ويمكن تقييم Decellularization باستخدام تلطيخ الأنسجة مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) و 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي)، كما هو موضح في الشكل 1A. عالية التكبير المجهر الالكتروني الماسح (SEM) تحليل السقالات يؤكد عدم وجود الخلايا المضيفة والهندسة المعمارية مصفوفة سليمة، كما هو موضح في الشكل 1B. يمكن أن يتم توصيف إضافية من السقالة المتبقية عن طريق اختبار الشد والمناعية للبروتينات المصفوفة خارج لضمان preservatأيون من ECM التالية decellularization 16.
ثقافة غير ملتصقة من المجالس في وسائل الإعلام SFDM لمدة ستة أيام النتائج في تشكيل المجاميع الخلية (EBS) كما هو موضح في الشكل 2A. ثلاثة أيام من activin ونتائج العلاج في الحث الأديم الباطن نهائي. ويمكن التأكد من تقييد نسب ESC إلى الأديم الباطن نهائي من قبل upregulation والتعبير عن الجينات والبروتينات 17 المصاحب النسب الأديم، ولا يمكن الجزم شكليا. تتراوح كفاءة الأديم الاستقراء 50-70٪ اعتمادا على خط ESC المستخدمة. أجريت تجارب في خطوط ESC الماوس: R1 (Nkx2-1 mCherry)، G4 (عن dsRed -MST)، و 129 / علا (بري-GFP / Foxa2-hCD4)، في حين أن جميع البيانات الموضحة في هذه المخطوطة يستخدم الخلية R1 خط. يتم فرز مزدوج إيجابي CXCR4 + / ج-KIT + السكان الأديم الباطن نهائي كما هو موضح في الشكل 2B، المصنفعلى سقالات الرئة 3D، وتربيتها لمدة تصل إلى 21 يوما في واجهة الهواء السائل في SFDM. ومن المهم لفرز وإثراء لالأديم الباطن نهائي كمنظمة محدودة ويتم تحقيق التمايز مع ثقافة خلايا فرزها من يوم غير متجانس 6 EBS كما هو موضح في الشكل 2C. الهياكل التي شكلتها خلايا فرزها على السقالات تذكرنا تطوير الرئة (اليوم الجنينية 13.5) كما هو موضح في الشكل 2C-D. في تجربتنا، وأسفرت عن كثافة البذر من 100،000 خلايا فرز / سقالة أفضل سقالة إعادة تعمير.
لوحظ التمايز إلى النسب الرئة في وقت مبكر من 7 أيام التالية الثقافة سقالة. تم الكشف عن مجرى الهواء الخلايا الاولية الظهارية إيجابية لNKX2-1 وSOX2 باستخدام IF تحليل متحد البؤر كما هو موضح في الشكل 3A. SOX2 إيجابي، وخلايا السلبية NKX2-1 من المرجح خلايا الأديم الباطن المحفزة التي لم متمايزة للى الرئةneage. مع ثقافة أطول قد تبدأ هذه الخلايا للتعبير عن NKX2-1 أو الخضوع لموت الخلايا المبرمج من دون الدعم الكافي في المكروية. إذا تحليل يوم 21 الثقافات يكشف ناضجة السكان الهوائية الظهارية التي تحتوي على TUBB4A + الخلايا المهدبة، SCGB1A1 + النادي الخلايا، وTRP63 + / + KRT5 الخلايا القاعدية كما هو موضح في الشكل 3B. تحليل SEM من سطح يوم 21 الثقافات يكشف تشابه الصرفي الجذعية الثقافات المستمدة من الخلية إلى المجاري التنفسية الماوس.
وكانت كل من البروتينات مصفوفة معزولة (أنا الكولاجين، الكولاجين الرابع، فبرونيكتين، laminin) وdecellularized السقالات الفئران الكلى غير قادرة على تعزيز الرئة النسب التمايز عندما المصنف مع الأديم الباطن نهائي والمثقف في ظل نفس الظروف على النحو المبين أعلاه 16. هذا يدل على أن المكروية 3D التي أنشأتها السقالات المستمدة الرئة تختلف عن السقالات المستمدة الكلى في قدرته على تعزيز التمايز الرئة نسب سيدىد خلايا الأديم الباطن.
الشكل 1. تقنية Decellularization يزيل المكونات الخلوية ويحفظ ECM. (A) H & E (أعلى لوحة) ودابي (اللوحة السفلى) تلطيخ من أنسجة الرئة الطبيعية وdecellularized تبين عدم وجود نواة التالية decellularization. وتظهر اللوحة اليمنى أمثلة على أقسام الأنسجة من الرئتين دون decellularization الأمثل. تظهر رؤوس سهام المتبقية نوى على السقالات بسبب decellularization غير مكتمل، وتسليط الضوء على أهمية تحسين تقنية قبل recellularization. شريط النطاق = 25 ميكرون. الصور (B) ووزارة شؤون المرأة من الرئة الطبيعية وdecellularized، وتبين عدم وجود الخلايا والحفاظ على هوية العمارة مصفوفة على السقالات decellularized. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التصنيف ESC المستمدة النتائج الأديم نهائية في recellularization الأمثل. الهيئات (A) يوم 6 مضغي (EBS) بعد ثلاثة أيام من activin علاج لتعزيز نهائي تمايز الأديم. (ب) يتم فرز EBS بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية للتعبير مزدوج من علامات سطح CXCR4 وج-KIT لعزل السكان الأديم الباطن نهائي. سيتم المصنف هذه الفئة من السكان على السقالات decellularized. (C) H & E تلطيخ السقالات recellularized في يوم 7 ويوم 21 من الثقافة. اللوحة اليسرى يمثل تنظيم هياكل تشبه مجرى الهواء بعد غرس البذور مع الخلايا التي تم فرزها، وتمثل اللوحة اليمنى غير منظمة، والخلايا التي لم يتم فرزها التكاثري للغاية على السقالات تسليط الضوء على أهمية فرز الخلايا قبل recellularization. مقياسبار = 30 ميكرون. (د) H & E تلطيخ الجنينية اليوم 13.5 الرئتين الماوس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم الكشف عن الشكل 3. ثقافة الموسعة من الأديم الباطن نهائي على السقالات الرئة الطبيعية توجه التمايز إلى مجرى الهواء الخلايا الظهارية. (أ) الخلايا الاصلية الرئة القريبة (NKX2-1 + / SOX2 +) بعد سبعة أيام من الثقافة على السقالات decellularized. شريط النطاق = 15 ميكرون. (ب) اليسار يظهر صورة ناضجة كاذب الخلايا الظهارية (CDH1 +) هياكل مبطنة الغشاء القاعدي البروتين laminin على الجانب القاعدي من الهياكل. مركز وإظهار الصورة الصحيحة ظهائر الهوائية ناضجة كاملة مع خلايا مهدبة (TUBB4A +)، CLUب الخلايا (SCGB1A1 +) والخلايا القاعدية (KRT5 + / TRP63 +). شريط الأيسر على نطاق وصورة = 30 ميكرون. مركز واليمين شريط مقياس صورة = 15 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يولد ناضجة ظهائر الهوائية المستمدة ESC باستخدام السقالات الرئة الطبيعية الوحيدة لتوجيه تمايز مع عدم وجود مكملات أخرى. يتم تعريف الإعداد الثقافة هذه، وغير مكلفة، وقابلة للتكرار خالية من المصل. لا يلزم عامل النمو مكملات من وسائل الاعلام قاعدة التمايز. وقد استخدمت أساليب نشرت سابقا لتوليد الخلايا الجذعية الظهارية الرئة المشتقة من خلية استراتيجيات 2-الأبعاد مع عامل النمو مكملات لتعزيز تقييد النسب 3،4،8،18،19. تقنية الموضحة هنا هو مفيد على هذه الطرق لعدة أسباب، منها: الظروف ثقافة المعرفة، والكفاءة العالية التمايز إلى خلايا الشعب الهوائية وظيفية، وتلوث محدود من السلالات الأخرى الأديم الباطن (الغدة الدرقية والكبد والبنكرياس)، والمكروية التمايز 3D. هذه التقنية تعطي نتائج مماثلة مع ECM المستمدة من الماوس، وبالتالي يمكن تعديلها لتوليد السقالات decellularized باستخدام الماوس الرئتين. متباينة المجالس الاقتصادية والاجتماعية المستمدة من الفئران إلى الأديم الباطن نهائي والمصنفة على السقالات باستخدام هذا البروتوكول يفرق أيضا إلى ظهائر مجرى الهواء.
السقالات Decellularized يمكن تخزينها في حل إزالة التلوث في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام قبل recellularization. أبقت السقالات لفترات أطول قد تكون وظيفية، ولكن نحن لم تختبر لتأكيد هذا. لتحقيق التنظيم والتمايز فعالة هو مطلوب منها لإثراء لالأديم الباطن نهائي من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية بعد الاستقراء مع activin A. خلايا غير الأديم الباطن في يوم 6 EBS في كثير من الأحيان التعبير عن تعدد القدرات علامة Oct4 وإذا المصنف على السقالات سوف تستمر في التكاثر دون تنظيم ومواصفات ل الرئة النسب. ويمكن أيضا أن كثافة البذر تعديلها بناء على خلية خط التحديد لتحقيق recellularization كاملة من السقالات.
وجود قيود على هذا البروتوكول هو في عدم قدرتها على تعزيز التمايز للخلايا الظهارية السنخية. على الرغم من أن NKXتم الكشف عن 2-1 + / + SOX9 الخلايا الاصلية البعيدة بعد سبعة أيام من الثقافة على السقالات، هذه الفئة من السكان غير موجود في يوم 14، ويوم 21. علامات من نوع ناضجة أنا السنخية الخلايا الظهارية (AQP5) والنوع الثاني الخلايا الظهارية السنخية لم يتم الكشف عن (SFTPB، SFTPC) في أي مرحلة خلال ثقافة سقالة. قد يكون هذا بسبب وجود شرط إضافي مكملات عامل نمو والظروف والثقافة المغمورة لتعزيز مواصفات النسب السنخية، في حين كما هو موضح هنا، البروتينات المصفوفة وعوامل النمو محدد مصفوفة المتبقية على السقالات decellularized كافية لتعزيز الهوائية النسب التمايز.
في خطوة حاسمة لتعزيز تمايز الأديم الباطن نهائي لمجرى الهواء الخلايا الظهارية استخدام السقالات الرئة هو تعظيم الاستفادة من عملية decellularization. يجب إزالة المكونات الخلوية تماما بينما يتم الحفاظ على مكونات المصفوفة. الأنسجة تلطيخ للمواد النووية باستخدام دابي، فائقة البنيةتحليل الاورال السقالات مع المسح الضوئي والمجهر الإلكتروني النافذ، وفحوصات الحمض النووي يمكن استخدامها لتأكيد إزالة جميع المكونات الخلوية. ويمكن تقييم ECM تكوين البروتين السقالات باستخدام IF تلطيخ وتحليل طخة مناعية لبروتينات المصفوفة: أنا الكولاجين، الكولاجين الرابع، الإيلاستين، فبرونيكتين، البروتيوغليكان الهيبارين كبريتات، و laminin 16.
هذه المشتقة الخلايا الجذعية ظهائر الرئة يمكن أن تستخدم في نماذج المرض واكتشاف المخدرات منصات من الأمراض ذات الصلة الهوائية مثل التليف الكيسي. إمكانات هذه التركيبات خلية مصفوفة في تطبيقات التجدد مثل إصلاح الأنسجة والعلاج بالخلايا يمكن فحص من قبل في الجسم الحي زرع يبني هندسيا في نماذج الماوس المختلفة. وعلاوة على ذلك، وهذا 3D في طريقة المختبر للتمايز مجرى الهواء يمكن أن تتكيف بسهولة لدراسة مختلف المعالم إحداث الرئة مواصفات النسب عن طريق التلاعب توافر عامل نمو وخلية مصفوفة الإشاراتمن الثقافات خلال مراحل مختلفة من التمايز على السقالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا توجد المصالح المالية المتنافسة إلى إعلان.
Acknowledgments
ونود أن نشكر الدكتور Rossant والدكتور Bilodeau لESC mcherry Nkx2-1 المستخدمة في التجارب يصور في أرقام 1-3. تم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية في مرفق SickKids-UHN التدفق الخلوي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة ومنحة البنية التحتية (CSCCD) من المؤسسة الكندية للابتكار التشغيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200 U/ml penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25 μg/ml amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
