Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con Istituzionale cura degli animali e le linee guida Comitato Usa (IACUC). Thy1-YFP, PLP-EGFP e PV-TdTomato topi sono stati utilizzati per questi esperimenti, ma qualsiasi topi che esprimono proteine fluorescenti possono essere cancellati e ripreso con successo.
1. Preparazione del tessuto
Attenzione: paraformaldeide (PFA) e acrilammide sono tossici e irritanti. Effettuare esperimenti che utilizzano questi reagenti in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi).
- Sacrificare l'animale in camera di eutanasia con ~ 1 ml di isoflurano fino respirazione cessa (~ 2 - 3 min).
- Utilizzare una pompa peristaltica impostato ~ 5 ml / min per defluire in intracardiaca il mouse con la soluzione di perfusione (Tabella 1) a 4 ° C fino a quando il sangue viene cancellato dai tessuti (5 - 10 min).
- Modificare il perfusato di soluzione fissativa (Tabella 1)a 4 ° C fino al collo e coda sono notevolmente irrigidito (5 - 10 min).
- Terminare la perfusione e decapitare il animali. Sezionare delicatamente il cervello dal cranio rimuovendo prima il tessuto connettivo circostante cranio e quindi la rimozione di osso dalla superficie ventrale del cranio e sollevando il cervello (figura 1a), come descritto in 20.
Nota: Prestare particolare attenzione alla rimozione di osso che circonda i lobi flocculonodular del cervelletto e dei bulbi olfattivi.- Sezionare il midollo spinale dalla colonna vertebrale, inserendo delicatamente la punta di una multa, tagliente forbice tra il midollo spinale e la colonna vertebrale e il taglio dei singoli segmenti della colonna vertebrale di distanza, come descritto in 21.
- Hemisect cervello ponendolo in una matrice plastica cervello di topo e tagliando lungo la linea mediana con una lama di matrice.
- Aggiungere ogni emisfero e del midollo spinale per separare 50 ml vasca centrifugaes con ~ 40 ml di soluzione di idrogel (Tabella 1). Da questa copertura in avanti punto le provette con un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori durante tutte le fasi successive.
- Incubare la provetta contenente il campione in idrogel a 4 ° C con agitando delicatamente (~ 30 rpm) per 7 giorni.
2. polimerizzazione
- Scartare ~ 25 ml di idrogel, mantenendo il campione e ~ 25 ml di idrogel nella provetta da centrifuga.
- Deoxygenate campione rimuovendo il tappo e posizionare il tubo da centrifuga in barattolo essiccatore e collega il vaso ad un vuoto. Applicare il vuoto per almeno 10 minuti per consentire gas disciolti venire dalla soluzione e formare bolle. Agitare delicatamente per rimuovere le bolle.
- Sostituire il vuoto nel vaso essiccatore 100% azoto oltre 2 - 3 min. Una volta che la pressione equalizza (una volta all'inizio della giara essiccatore può essere aperto), tappare rapidamente il tubo per impedire la reintroduzione di ossigeno.
- Polimeroizzare l'idrogel ponendo la provetta con il campione in un bagno d'acqua a 37 ° C per 3 ore fino polimerizzazione è completa. Idrogel polimerizzato assumerà una consistenza gelatinosa (Figura 1b). Nota: Una piccola quantità di idrogel non polimerizzato in alto è accettabile.
- Utilizzare una spatola per rimuovere il campione polimerizzato dalla provetta, poi tagliare via l'eccesso idrogel dal campione.
- Rimuovere l'idrogel restante ponendo il campione su un panno senza pulire e delicatamente sfregamento e rotolare il tessuto su di esso, lasciando solo un sottile strato di idrogel polimerizzato sul campione.
3. La rimozione dei lipidi
Nota: il tessuto lipidico-eliminato è fragile, maneggiare con cura. Utilizzare un filtro cella quando lo svuotamento del tubo per evitare di perdere del campione. Inoltre, il campione si gonfiano in tutto il processo di compensazione, tuttavia, gonfiore può essere invertito durante il processo di indice di rifrazione corrispondente.
Attenzione: Sodium solfato dodecil (SDS) e l'acido borico sono irritanti. Effettuare esperimenti li utilizzano in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi).
- Trasferire campione polimerizzato di clean 50 ml tubo di centrifuga, aggiungere 45 ml di compensazione tampone (Tabella 1). Incubare a 45 ° C con un leggero scuotimento (~ 30 rpm). Modificare il buffer al giorno per un periodo iniziale di 7 giorni versando fuori il buffer di compensazione utilizzato in rifiuti chimici e l'aggiunta di ~ 45 ml di tampone di compensazione fresco. Tenere le provette da centrifuga contenenti i campioni coperti in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori.
- Dopo i primi 7 giorni, incubare il campione a 40 ° C e lo scambio di compensazione tampone ogni 2 - 3 giorni. Continuare compensazione fino a quando tutti i lipidi sono solubilizzati e tessuti raggiunge la trasparenza (Figura 1c). Questo sarà il 4 - 6 settimane per un emisfero del cervello del mouse e 2 - 4 settimane per un midollo spinale.
- Una volta che il tessuto viene cancellato, il trasferimentocampione in un tubo da 50 ml centrifuga e lavare 4 volte in PBST (Tabella 1) a 40 ° C agitando delicatamente (~ 30 rpm) su 24 ore per rimuovere residui di SDS.
4. La colorazione molecolare
Attenzione: 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) è un irritante e gli esperimenti che utilizzano dovrebbe essere eseguita in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi).
- Trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 ml pulito e riempire con 1 mg / ml DAPI in 1x PBST, pH 7.5. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 24 ore. Tenere le provette da centrifuga contenenti i campioni coperti in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori.
- Lavare 3 volte in PBST a temperatura ambiente per almeno 6 ore / lavaggio.
5. indice di rifrazione di corrispondenza
Attenzione: 2,2'-tiodietanolo (TDE) è un irritante e gli eventuali esperimenti utilizzandolo should essere eseguita in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi).
- Trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 ml pulito e riempire con il 30% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubare a 40 ° C agitando delicatamente (~ 30 rpm) per 24 ore.
- Scambio 30% TDE con 63% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubare a 40 ° C con delicata agitazione per 24 ore.
Nota: Il campione si restringerà torna a dimensioni approssimative di originale. - Su una superficie piana e pulita rotolare un pezzo di adesivo riutilizzabile in un cilindro con diametro uniforme solo leggermente maggiore dello spessore del campione.
- Disporre il cilindro adesivo riutilizzabile in un cerchio aperto (~ diametro 25 mm interno con una piccola apertura nella parte superiore) su un piatto fondo di vetro 40mm. Se correzioni devono essere fatte, togliere il cilindro dal vetro e tagliato con una lama di rasoio.
- Utilizzare una punta P1000 pipetta per creare una tenuta tra l'adesivo riutilizzabile e vetro darotolare intorno al bordo esterno del cilindro.
- Luogo ~ 100 ml 63% TDE sul piatto di vetro e diffuso in tutto per coprire la superficie di vetro all'interno del cerchio di adesivo riutilizzabile.
- Utilizzando una spatola, posizionare accuratamente il campione al centro del cerchio, facendo attenzione a non formare bolle.
- Pipetta altri 100 ml di 63% TDE direttamente sul campione, quindi collocare immediatamente a 40 millimetri di vetro di copertura circolare su l'adesivo riutilizzabile.
- Utilizzando l'indice, medio e anulare di entrambe le mani, premere con attenzione intorno al perimetro del cerchio finché il vetro di copertura ha preso contatto con il campione.
- Portare lentamente il piatto fondo di vetro in posizione verticale di riposo contro una superficie, quindi aggiungere 63% TDE con una pipetta finché la soluzione raggiunge la piccola apertura nella parte superiore. Usare un panno senza pulire per asciugare la punta della pipetta in modo che la soluzione non cola sul vetro. Per evitare bolle nella camera, non svuotare la pipetta fino in fondo.
- Ala piccola apertura, aggiungere elastomero silicio per racchiudere il cerchio e creare una camera chiusa. Attendere 5 minuti che si asciughi prima di imaging.
6. Microscopia
Attenzione: I laser utilizzati in confocale, illuminazione piano singolo e la microscopia foglio di luce sono molto potente e può causare la cecità. Tutti gli esperimenti che utilizzano il laser deve essere eseguita dopo una formazione completa e con grande cautela e protezione per gli occhi adeguata.
- Posizionare la camera di imaging con il campione all'interno sul palco di un microscopio confocale a scansione laser.
- Aprire il software di imaging (vedi Tabella dei Materiali). Per accendere il laser ad argon di eccitazione, fare clic sulla scheda di configurazione nella parte superiore del programma quindi l'icona del laser. Seleziona la casella accanto a argon per alimentare il laser e spostare la scala slitta al 30%. Osservare il puntatore lentamente riscaldare nella posizione selezionata.
- Ritorna alla scheda acquisiscono in alto. Nella grande scatola "Impostazioni percorso del fascio &# 34; andare al carico / salva casella di impostazione e selezionare il menu a tendina per selezionare un canale di lunghezza d'onda appropriata per immagine YFP (527 nm).
- Selezionare obiettivi appropriati per l'imaging individuando il collegamento ipertestuale rosso con l'etichetta "Obiettivo: oggetto corrente" sotto la casella impostazioni del canale. Facendo clic sulla scheda si apre tutti gli obiettivi disponibili e una selezione ruoterà automaticamente la torretta.
- Utilizzare obiettivi (ad es., 10X) con una distanza grande lavoro (maggiore dello spessore del tessuto per creare l'immagine, ad esempio, 11 mm) e una apertura numerica (ad es., 0,3) per massimizzare risoluzione in piano dell'immagine e minimizzare lo spessore della sezione ottica.
- Sulla colonna di sinistra del menu a discesa, aprire il "XY: risoluzione" finestra per impostare matrice di acquisizione, chiamato "format", a 1.024 x 1.024 o un valore appropriato per il limite laterale risoluzione dell'obiettivo. Impostare il fattore di zoom più basso possibile (ad es., 1.7).
- Nella stessa finestra, impostare parametri medi 8 media di linea e 1 fotogramma facendo cadere giù i menu etichettate singolarmente di conseguenza. Utilizzare valori grandi per un alto rapporto segnale-rumore e piccoli valori per l'acquisizione rapida.
Nota: 8 medie di linea e 1 media struttura acquisiranno immagini di alta qualità di un emisfero del cervello del mouse in circa 4 ore. - Individuare il campione utilizzando i controlli di scena. Una volta che un campo rappresentativo è visibile, impostare il guadagno e offset.
Nota: Il guadagno e offset varia considerevolmente in base al tipo di tessuto, fluorofori, e / o caratteristica anatomica di essere ripreso. Per YFP, impostare i valori 760-780 per il guadagno e da -1,0 a -1,5 per l'offset. - Selezionare "scan tile" e selezionare i confini della regione di interesse. Impostare i limiti superiore e inferiore della z-stack da acquisire. Impostare lo spessore della sezione ottica basato su limite di risoluzione ottica sezione del oggettivo.
Nota: Un obiettivo dilimite di risoluzione ottica sezione è definita principalmente dalla sua apertura numerica. La maggior parte del software di controllo microscopio calcolerà automaticamente un valore appropriato per l'obiettivo in uso. Per un obiettivo 10X con una apertura numerica di 0,3 sarebbe di circa 11 micron. - Avviare l'acquisizione.
Nota: Questo può richiedere più ore. - Raccogliere immagini ad alta risoluzione usando obiettivi ingrandimento superiore di specifiche regioni di interesse.
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Representative Results
Visualizzare l'organizzazione strutturale del cervello è fondamentale per capire come la morfologia e la connettività influenzano la funzione del cervello in salute e malattia. tecniche di compensazione ottici permettono di popolazioni di cellule immagine in 3D nei tessuti intatti, che ci permette di studiare la morfologia e la connettività coeso.
I topi che esprimono proteine fluorescenti guidata da promotori specifici per sottopopolazioni di cellule permettono uno a prendere in giro a parte il complesso schema di connettività neuronale nel cervello. Thy1-YFP topi transgenici sono stati ampiamente utilizzati in letteratura compensazione ottica perché questi topi esprimono YFP in un sottogruppo di neuroni di proiezione che risiedono nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo, così come altre strutture del cervello (Figura 2a e b). Inoltre, YFP + neuroni corticali strato V proiettano attraverso il tratto corticospinale nelle scavo pinal (figura 2c e d), che li rende molto utile per valutare l'effetto di insulto assonale e / o lesioni del midollo spinale sui neuroni corticali 15. Attraverso l'uso della microscopia confocale e sezionamento ottico di tessuti otticamente eliminato si può facilmente valutare differenze di densità neuronale attraverso grandi strutture anatomiche.
Oltre a Thy1-YFP topi transgenici, qualsiasi numero di topi transgenici può essere ripreso. PLP-EGFP topi transgenici esprimono migliorate proteina fluorescente verde (EGFP) in oligodendrociti maturi che esprimono proteine proteolipid (PLP) in tutto il cervello e il midollo spinale (Figura 3a). PV-TdTomato topi transgenici esprimono TdTomato in un sottogruppo di parvalbumina (PV) che esprime interneuroni nel cervelletto, striato e nell'ippocampo (Figura 3b). Anche in topi che non esprimono transgeni fluorescenti, piccole coloranti fluorescenti peso molecolare, come DAPI, può facilmente diffondersi nei tessuti idrogel incorporato e consentire la valutazione dei nuclei cellulari nel cervello (Figura 4).
Figura 1:. Le diverse fasi di cervello Clearing Fotografia di Thy1-YFP + cervello di topo che è stato rimosso dal cranio (a). Fotografia di Thy1-YFP + topo emisfero cerebrale idrogel-embedded (b). Fotografia di Thy1-YFP + topo emisfero cerebrale dopo la rimozione dei lipidi (c). Barre di scala sono 5 mm in ogni pannello. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Thy1-YFP espressione nel cervello unND del midollo spinale. Thy1-YFP + neuroni della corteccia cerebrale e nell'ippocampo ripreso a ingrandimento 5X e ricostruita in 3D (a). Una proiezione massima intensità di un'immagine 10X pila di corteccia cerebrale dimostrando la arborization dendritica dei neuroni piramidali corticali strato V (b). espressione Thy1-YFP in un midollo spinale cervicale e toracico intatto ripreso a ingrandimento 5X e ricostruito in 3D (c). Una proiezione massima intensità di un'immagine 10X pila di midollo spinale dimostrando singoli assoni (d). Barre di scala sono 1 mm (a), 100 micron di (b), 2 mm (c), e 100 micron di (d). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: PLP-EGFP e PV-TdTomato espressione nel cervello. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: colorazione DAPI nell'espressione cervello DAPI nel cervelletto di un emisfero cerebrale intatto ripreso a 5X ingrandimento.. L'immagine è di circa 1 mm dal piano sagittale mediano. L'inserto mostra il livello di dettaglio visibile a questa profondità di imaging a 10X di ingrandimento. Scala bar unre 250 micron nel pannello principale e 50 micron nel riquadro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Buffer | chimico | concentrazione finale |
| soluzione di perfusione | ||
| 10x tampone fosfato | 1x | |
| Nitrato di sodio | 0,5% w / v | |
| eparina | 10 U / ml | |
| soluzione fissativa | ||
| 10x tampone fosfato | 1x | |
| Paraformaldehyde | 4% v / v | |
| soluzione idrogel | ||
| 10x tampone fosfato | 1x | |
| paraformaldeide | 4% v / v | |
| L'acrilamide | 4% v / v | |
| Bis-acrilammide | 0,05% v / v | |
| VA-044 iniziatore | 0.25% w / v | |
| buffer di Clearing | ||
| Acido borico | 200 mM | |
| Sodio dodecil solfato | 4% w / v | |
| PBST | ||
| 10x tampone fosfato | 1x | |
| Triton X-100 | 0,1% v / v | |
| Sodio azide | 0,1% w / v |
Tabella 1: lista dei buffer e soluzioni.
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Discussion
compensazione passiva di idrogel incorporato tessuti (chiarezza passivo) è un metodo semplice e poco costoso per la compensazione grandi pezzi di tessuto. Questo approccio non richiede attrezzature dedicate e può essere facilmente eseguita con un agitatore a temperatura controllata. Nell'arco di poche settimane, anche di grandi dimensioni, i tessuti altamente mieliniche, come ad esempio un intero cervello o del midollo spinale, diventeranno trasparenti e adatto per la microscopia. Anche se questo rapporto è concentrata sulla compensazione del tessuto cerebrale, CLARITY passivo può essere applicato a qualsiasi tessuto.
I punti di forza e di debolezza delle tecniche di compensazione ottica sono stati discussi in precedenza nella letteratura 13,17,22, ma sono più chiaramente disposti in 23. CHIAREZZA passivo è adatto per esperimenti in cui un gran numero di campioni vengono azzerati contemporaneamente e riproducibilità è di grande importanza. L'uso di un idrogel per fornire sostegno supplementare al tessuto facilita multiple sondare del tessuto. In questo rapporto, una piccola tintura peso molecolare, DAPI, è stato dimostrato, ma vari cicli di anticorpi sondaggio sono possibili anche con questo approccio.
L'approccio descritto in precedenza si discosta dal nostro protocollo precedentemente pubblicato 15 in un paio di modi significativi. In primo luogo, l'approccio corrente, i campioni sono stati non intracardiaca perfusi con idrogel. Ciò è dovuto al fatto che l'idrogel può prematuramente polimerizzare nel tubo ed aghi dell'apparato perfusione, portando a perfusioni incompleti e compensazione incoerente. Incubando tessuti paraformaldeide fissato in idrogel per 7 giorni è in linea con il protocollo di CHIAREZZA originale 14, anche se un incubazione 1 giorno viene utilizzato per 1 - sezioni di tessuto 3 mm di spessore nella tecnica CLARITY passivo (PACT) 17. In secondo luogo, questo approccio esegue la rimozione dei lipidi ad una temperatura leggermente superiore che precedentemente riportato 15-17. Higher temperature accelera la rimozione di lipidi, ma deve essere bilanciato con la possibilità di una catastrofica perdita di integrità del tessuto (fusione). Aumentando la temperatura di incubazione dell'8 ° C (45 ° C) per 7 giorni e poi di 3 ° C (40 ° C) per il resto del processo di rimozione di lipidi, compensazione tessuto viene accelerato, ma senza il rischio concomitante la perdita di integrità dei tessuti. Questo aumento della temperatura è coerente con temperature riportate durante elettroforetica Tissue compensazione (ETC) nel protocollo CLARITY originale (50 ° C) 14. Inoltre, è stata osservata alcuna diminuzione dell'intensità di fluorofori transgenically espresse né diminuzione della colorazione DAPI.
Deossigenazione è un passo importante nella creazione di idrogel. L'idrogel può polimerizzare in presenza di ossigeno disciolto nella soluzione idrogel, ma nelle nostre mani la velocità e la completezza della polimerizzazione era molto più variabile senza deossigenazione. Se la hydrogel non polimerizza, la ragione più comune è la presenza di ossigeno nel idrogel.
Il processo di compensazione ottica è notevolmente facile da implementare, tuttavia, la microscopia che segue può essere piuttosto complicato. Di fondamentale importanza sono gli obiettivi utilizzati all'immagine tessuto. La distanza di lavoro di un obiettivo definisce la profondità che può immagine in un campione di tessuto. Un obiettivo con una distanza di lavoro di 2 mm può solo image 2 mm nel campione, quindi la distanza di lavoro di un obiettivo deve essere maggiore dello spessore del campione per un'immagine completamente. Allo stesso modo, l'apertura numerica di un obiettivo pone un limite alla dimensione di caratteristiche che può risolvere sia in piano e lo spessore delle sezioni ottiche che può acquisire significato. Messa Aereo Illumination Microscopy (SPIM) e foglio leggero Microscopy (LSM) possono superare la limitazione dello spessore sezione ottica dalla natura dell'illuminazione, ma questi microsCopes non sono ampiamente disponibili. Alta apertura numerica, grandi obiettivi distanza di lavoro sono rari e costosi, ma sono necessari per l'imaging di alta qualità da grandi sezioni otticamente eliminato.
Una volta che le immagini sono state acquisite, sono spesso molto grandi, che vanno da alcune centinaia MB di bassa risoluzione (sia in piano e la direzione z) sull'immagine per alcuni TB per un'immagine di alta risoluzione raccolte su LSM. I computer utilizzati per l'analisi delle immagini richiedono non solo una grande quantità di spazio, ma grandi quantità di memoria ad accesso casuale (RAM) per l'elaborazione delle immagini. I pacchetti software adatti della analisi di grandi volumi di immagini otticamente eliminato includono Amira, Imaris, e ImageJ 14-16.
Tra i limiti di questo approccio, CHIAREZZA passivo richiede più tempo per cancellare tessuti, rispetto ad altri approcci di compensazione ottica. Diminuendo il volume del tessuto viene controllata da taglio o sezionamento in pezzi più piccoli possono Accelrano lipidi rimozione. Inoltre, riducendo la concentrazione di paraformaldeide in idrogel a sua volta diminuzione reticolazione e aumentare la dimensione dei pori idrogel, portando a più rapida compensazione 17, anche se questo può portare ad una maggiore espansione del tessuto, i singoli sperimentatori possono trovare che vale la pena la diminuzione della compensazione tempo. Inoltre, in combinazione con TDE come agente di compensazione, la quantità di espansione del tessuto complessivo può essere limitato.
Anche se questo rapporto descrive l'uso di piccole coloranti peso molecolare, anticorpi sondaggio è un passo molto naturale successivo. La presenza del idrogel non solo fornisce supporto fisico ai tessuti eliminato, ma serve anche come un impedimento per la penetrazione di anticorpi in profondità nei tessuti. Diminuendo la concentrazione di acrilamide o la concentrazione paraformaldeide aumenterà la dimensione dei pori in idrogel, facilitando (e quindi accelerazione) anticorpo penetrazione 17, ma questo ha un effetto deleterio sulla tissespansione ue. Tuttavia, anticorpi sondando di blocchi di tessuto può essere realizzato in pochi giorni e cervello intero in un paio di settimane con concentrazioni di acrilamide e paraformaldeide descritte nel rapporto originale 14.
tecniche di compensazione ottica permettono di guardare in profondità nel cervello, favorire la comprensione della sua struttura e funzione. Questi nuovi strumenti consentiranno ai ricercatori di visualizzare il cervello a risoluzioni cellulari e molecolari, aumentando la nostra comprensione di questa più complessa di organi.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato generosamente sostenuto dal National Institutes of Health / Istituto Nazionale di Malattie Neurologiche e Stroke (/ NINDS NIH) concessione 1R01NS086981 e l'Hilton Fondazione Conrad N.. Ringraziamo il Dr. Laurent Bentolila e il Dr. Matthew Schibler per la preziosa assistenza con microscopia confocale. Ringraziamo coloro che hanno contribuito al forum chiarezza (http://forum.claritytechniques.org). Ringraziamo in modo particolare il Dr. Karl Deisseroth per aprire il suo laboratorio per insegnare questa affascinante tecnica. Gli autori sono grati per il generoso sostegno da parte della Organizzazione Brain Mapping Medical Research, Cervello Fondazione supporta il mapping, Pierson-Lovelace Foundation, la Fondazione Ahmanson, Capital Group Aziende Charitable Foundation, William M. e Linda R. Dietel Fondo filantropico, e il Fondo Northstar . La ricerca riportato nella presente pubblicazione è anche parzialmente sostenuto dal Centro nazionale per le risorse di ricerca e dall'Ufficio del direttore della NazioneAl Institutes of Health ai numeri premio C06RR012169, C06RR015431, e S10OD011939. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
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