Introduction
En sık rastlanan primer intrakranial malign beyin tümörleri evre III astrositom ve Evre IV glioblastoma multiforme (glioblastoma veya GBM) bulunmaktadır. ABD 1-3 GBM için geçerli tedavilerle 15 ay - Bu tümörler 12 arasında ortalama bir yıllık sağkalım yoksul prognoz sunuyoruz. Çok modelli tedaviler temozolomid (TMZ) ve kinaz hedefli ajanlar da dahil olmak üzere cerrahi, radyasyon ve kemoterapi yer alıyor. Kinaz sinyal sık Epidermal Büyüme Faktörü reseptörü (EGFR), Trombosit Türevli Büyüme Faktörü Alıcısının (PDGFR) artışlar sinyal, artan Fosfatidil-inositol-3 kinaz (PI3K) ve amplifikasyon ile tümör alt-veya aktive mutasyonlar da dahil olmak üzere, GBM'de düzensiz olan Vasküler Endotel Büyüme Faktörü Alıcısının (VEGFR) hem de diğer kinaz tahrik yollar 4-6 ile anjiyojenik sinyal destekleyici tümörü. Vitro ve in vivo modelleri sık sık bu temsili değişiklikleri kaybetmek Güncel <sup> 7. Buna ek olarak, genetik profilleme genetik ve epigenetik değişiklikler her zaman hedefleme ajanları çoğu kinaz doğrudan hareket protein aktivite düzeyi, değişiklik tahmin yok ve eylem diğer mekanizmalar ile tedaviler nerede hareket edebilirler gerçeğini yansıtıyor olabilir beklenen faydalar teklif yok dolaylı olarak.
sonsuza pasajlandı edilebilir geleneksel ölümsüzleştirdi hücre hattı uzun nedeniyle bakım ve tekrarlanabilirlik kendi kolaylığı uyuşturucu testi için standart olmuştur. Ancak, bu model hızlı orijinal tümörden önemli ölçüde farklıdır hücrelerin büyümesi için seçer yüksek besin (ve yapay) bir büyüme ortamına muzdarip. Bunun gibi, hastanın mevcut olduğu gibi daha karmaşık tümör biyolojik sistemi yansıtacak daha gerçekçi bir model sistemlerinin geliştirilmesinde önemli bir ilgi olmuştur. Tümör ksenogrefleri farelerde yetişen bir primer tümörün ( "xenoline," hasta-türevi xenograftlarının veya PDX) yazarlara doğrudan geliştirilenOnlar daha güvenilir klinik başarısını tahmin etmek. 8 daha yansıtıcı biyoloji rağmen keçe gibi de özellikle kanser tedavi ortamında bir daha yansıtıcı bir model sistem, bu modeller pahalıdır ve kurmak ve sürdürmek zordur. Ayrıca, yüksek verimli çalışmalar için uygun değildir. Gerek daha daha doğru genetik belirteçleri vekil değil, birincil tümörlerde moleküler değişikliklerin yansıtmak ve profil ve kinaz aktivitesinin doğrudan önlemler kullanarak bu modelleri test biyolojik modellerin geliştirilmesi, açıktır.
Iki-boyutlu (2B) tek tabakalı kültürler farklı olarak, 3 boyutlu veya çok-hücreli deney modelleri daha fazla fizyolojik olarak ilgili son noktaları 9-11 sağlayabilir kabul edilmektedir. Ortak 3D kültür matris kaplı mikrotaşıyıcılar ve hücre sfero oluşumunu içeren yaklaşımlar. Tümör Sferoidler spinner şişesi, PHEMA plaka kullanarak ve bırak teknikleri asılı hücresel toplama yoluyla elde edilebilir. t Sınırlamalarhese yaklaşımlar şunlardır: bazı hücreler karışık hücre tipleri ile istikrarlı parçacıklarının, değişkenliği büyüme ve zorlukları oluşturmak için yetersizlik. Seçenek olarak ise, bir çok sentetik (hidrojel polimer) ve Engelbreth-Holm-Swarm matrisler 3D kültür için geliştirilmiş olan fare sarkom den (EHS) matris, bovin kolajen) 12-14 çalışmalar hayvan türevi. Farenin EHS matrisi yaygın olarak kullanılan, ancak in vitro ve in vivo 15 hücre büyümesini ve farklılaşmasını teşvik ettiği bilinir.
3D tümör biyolojisi çoğaltmak için, bir insan biyomatris sistemi Dr. Raj Singh ve ark., 16 tarafından geliştirilmiştir. Doğal, büyüme faktörü içermeyen insan BioGel birden fazla hücre tipleri uzun süreli yetiştirme destek 3D kültür iskeleleri (boncuklar, diskler) izin verir. 3D insan BioGel kültür tasarımları bir dizi tümör büyümesi, yapışma, anjiyogenez ve işgali özelliklerini incelemek için kurulmuştur. Avantajları ve insan BIOGEL özellikleri ortak karşılaştırıldığındafare EHS jeller Tablo 1 ve Tablo 2'de özetlenmiştir.
| Kaynak: | İnsan Amnions (toplanan doku) Patojen içermeyen, IRB muaf / onaylı |
| ECM doğa: | Sigara denatüre BIOGEL (GLP-üretim) |
| Anahtar bileşenleri: | Col-I (% 38), laminin (% 22), col-IV (% 20), col-III (% 7), entactin ve HSPG (<% 3) |
| GF-serbest: | Saptanamaz EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-anjiyogenik, toksik olmayan) |
Tablo 1: Ortak EHS Gels karşılaştırıldığında İnsan BIOGEL özellikleri.
| İnsan BIOGEL | EHS jeller |
| Doğal insan matris | Sulandırılarak fare matrisi |
| Kontrollü hücre büyümesi farklılaşma | hücre büyümesini ve farklılaşmasını teşvik edebilir |
| Fizyolojik gen ekspresyonu | Değişken gen sentezleme |
| 3D doku gibi kültür modeli | Plaka tabanlı kültürü modeli |
Tablo 2: Ortak EHS Gels karşılaştırıldığında İnsan BIOGEL avantajları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm ksenograft tedavi değerlendirmeler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokole glioblastoma için ortotopik tümör modeli kullanılarak yapılmıştır.
Hasta türetilen GBM Xenograftlarında Hücreleri 1. İzolasyon
- Reaktiflerin hazırlanması
- 5 mg / ml steril filtre bir konsantrasyona, steril su içinde kolajenaz-re-oluşturmaktadır. -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler halinde saklayın (nihai konsantrasyon 100 mi enzim çözeltisi içerisinde 50 ug / ml).
- 2 ml 100 ug Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) çözündürülür steril fosfat tamponlu tuz (PBS) bulunur. 100 ul (5 ug / 100 ul), 10 ng / ml'lik son bir konsantrasyon için, -20 ° C 'de parçalar halinde saklayın.
- 2 ml 100 ug FGF-P, steril PBS içinde çözülür. 100 ul (5 ug / 100 ul), 10 ng / ml'lik son bir konsantrasyon için, -20 ° C 'de parçalar halinde saklayın.
- Neurobasal Med aşağıdaki bir 500 ml şişe ekleIA (NBM) Tam NBM hazırlanması: 10 ml B-27 ek vitamin A olmadan 5 mi N2 takviyesi, 100 ul EGF 100 ul fibroblast büyüme faktörü (FGF) -Basic, 5 mi, amfoterisin B, 0.5 ml gentamisin, 5 mi L-glutamin.
- birleştirerek yeni enzim çözeltisinin hazırlanması: 98.5 ml PBS, 1 mi kolajenaz-1, 0.5 mi 10x tripsin / EDTA ile yıkandı ve 0.22 um gözenekli filtreden süzülerek sterilize edilir.
- Hazırlama ya da küçük bir hacmi, steril ve Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), kalsiyum veya magnezyum olmaksızın% 7 cenin sığır serumu (FBS) ile 1X PBS ile / F12 hücre kültür ortamı elde edin.
- tümör Ayrıştırma
Not: Daha önce ele gelen bir tümör kitlesi için sağ etek içinde tümör hücreleri enjekte edilmiş ve izin verilen Atimik nu / nu fare, bu prosedür gereklidir. Burada gösterilen örneklerde, hastanın türetilmiş ksenograft GBM hücrelerinin, JX10 ve JX12 17 kullanılır.- % 2 klorheksidin püskürtülerek çalışma alanını sterilize ve çalışma alanı zekâ kurmaktek kullanımlık mandren, forseps, neşter, cam Petri kabı, enzim çözeltisi, PBS ve klorheksidin (Şekil 2A bakınız) da dahil olmak üzere h gerekli aletleri / gereçler.
- bir kanadını tümör barındıran fare / fareler Euthanize. % 30 CO 2 kullanılarak CO 2% 20 / dk deplasman oranı hedefliyoruz. Fare solunum tutuklama gösterir sonra, yaklaşık 1 dakika (genellikle 3 dakika toplam) için CO 2 akışını sağlamak. Fareler bölmesinden çıkarılır ve servikal dislokasyon ikincil ötanazi teyidi olarak gerçekleştirilir. Cildi sterilize etmek için% 3 klorheksidin ile hayvan püskürtün.
- Fare sabit tutarken, yapmak yarı dairesel deri kesi ~ tümör kitlesi için kranial başlayan ve etrafında fare göbek doğru incising ve 11. bıçak ile steril tek kullanımlık neşter kullanılarak tümör kitlesi (yan implante tümör) 1.5 cm kaudal ucu.
- kesi kaudal ucunda hafif çekiş parmaklarını kullanarak tümör kitlesi üzerindeki deriyi yansıtır ve daha sonra cilt üzerinde itmektümör dokunmadan en iyi erişim için tümörün yükseltmesine yüzey (Şekil 2B bakınız).
- Yavaşça periton duvar ve deriden serbest tümör kütlesi (Şekil 2C bakınız) için forseps ile künt diseksiyon kullanın.
- steril cam Petri kabı ve düzgün karkas atmak ve bir kenara bu araçların koyun (kıyma esnasında kırılma önlemek için plastik yemekleri KULLANMAYIN) için forseps ile Aktarım tümör kitlesi.
- Steril araçların yeni bir dizi kullanın nekrotik doku ve membranöz konak bağ dokusu kapsayan tümör tümör dokusu debridman (11. bıçak, yarı kavisli forseps ile neşter).
- bir karıştırma çubuğuna sahip olan steril havalandırılmış-tripsinize şişede 15 mi enzim çözeltisi yerleştirin ve kaputu yavaş karıştırma başlatıldı.
- (Dökmek veya PBS ile durulayın için şırınga kullanabilirsiniz) aşırı kan çıkarmak için steril PBS ile 5 kez - steril bir cam Petri kabındaki, hasat tümörler 3 yıkayın. Yavaşça çanak ve pipetlemeyin eğin veya yıkama malzemesi aspire. kıyma finely iki # 11 neşter bıçak kullanarak (Şekil 2D bakınız).
- 3 kez - yavaşça yukarı ve aşağı kıyılmış tümör ve pipet 2 enzim çözeltisi 14 ml ekleyin. Aktarım şişede tripsinize-havalandırılmış ve 20 dakika boyunca yavaş yavaş karıştırılmıştır. Aşama 1.2.11 tripsin etkisiz hale getirmek için, her 1.5 ml FBS eklenerek 5 ila 50 ml konik tüp hazırlayın.
- 20 dakika sonra tripsinize şişeye hücre çözeltisi 14 ml toplar ve FBS ile bir tüp ekleyin. şişe ve karıştırmaya devam etmek için 14 ml taze enzim çözeltisi ekleyin.
- Santrifüj oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 150 x g'de hücreler toplandı ve süpernatan atılır. , Pelet tam NBM 45 ml ekleyin hafifçe karıştırın ve serum çalkalamak için santrifüj tekrarlayın. 5ml tam NBM pelet yeniden askıya ve buz üzerinde tutun.
- Buz üzerinde, tek bir konik bir tüp içinde Hasat hücreleri birleştiren 5 hasat toplam tekrar hücre hasat adım.
- 50 ml konik bir tüp üzerine 40 mikron hücre süzgeci yerleştirin. Hazırlık tO ile DMEM / F12 +% 7 FBS, 10 ml geçen ve daha sonra 10 ml PBS ile yıkanarak süzgeç hücre.
- Yavaş yavaş o (Şekil 2M bakınız) aracılığıyla damla izin süzgeç hücre süspansiyonu ekleyin. Yavaşça herhangi vakum kırmak ve asma hücreler serbestçe geçmesine izin vermek için her yeni ek arasında hücre süzgecinden sekmesini kaldırın (Şekil 2N bakınız).
- Yukarıda süzüldü hücre süspansiyonu santrifüj. tam NBM 10 ml yeniden askıya ve% 0.04 numuneler Tripan mavisini ve hemasitometre kullanarak canlı hücreler toplam sayısını belirlemek için sayım. microtumor nesil kadar buz üzerinde hücreleri tutun.
2. Alternatif Doku Ayrıştırma Protokolü
- Doku ayıracı ve parçalanma sistemi otomatik.
- Program "Tümör _02_02" basın başlangıç seçin ve 32 saniye çalıştırın, hücresel dissociator içine parçalanma tüp yerleştirin. Transfer borusu, 40 dakika için 37 ° C inkübatör, yer döndürücüye.
- Santrifüj oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 150 x g'de hücreleri süspanse edildi ve süpernatant atılır. hücreler santrifüj birlikte, hücre süspansiyonu işlemi için de reaktifler ayarlayın. 10 mi serumsuz NBM ve yavaşça çiğnemek süspansiyonu ekleyin.
- 30 x 10 6 canlı hücreleri (~ 0.3 mi) - Santrifüj işleminden sonra, ~ 10 ihtiva eden bir hücre pelletini elde edin. (Şekil 2O) 10 mi serumsuz NBM pelet yeniden kullanıma. dışlama testi ile canlı hücreler belirlenmesi (Adım 3.2.2 bakınız).
3. Microtumor Nesil
- Reaktiflerin hazırlanması
- 1.1.4 gibi tam NBM hazırlayın ve iç protokol uyarınca (3 mg / ml HDHG) nötralize Yüksek Yoğunluklu insan BIOGEL (HuBiogel) hazırlar. Benzer BioGel matrisler de kullanılabilir.
- Microtumor üretimi ve kültür
- buz üzerinde tam NBM tek bir hücre süspansiyonu gibi taze ayrışmış PDX hücre elde.
- hücreyi su Mixtripan mavisi çözeltisi (PBS içinde% 0.4) ve eşit hacimde spension tripan mavisiyle çıkarma 18 ile hücre sayısı ve yaşama kabiliyetinin saptanması için hemasitometre kullanarak analiz eder. 50.000 hücreleri üretmek için gerekli hacim / Kaldır microtumor hacim = (50,000 hücre / tümör * # tümörler) / (canlı hücre / 1 ml saymak) ve taze bir konik tüp içine koyun nerede.
- Oda sıcaklığında, 8 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj ile hücreler konsantre edilir. Süpernatant atılır ve FBS içinde 1 kısım hücreleri ve 4 parça HDHG bir oranı ile buz gibi soğuk çözelti ile HDHG hücre pelletini.
- microtumors (2 mm'lik boncuklar 50,000 hücre içeren) üretmek için (hidrofobik kaplama ile), 96-pin çelik plaka üzerine iğneli hücre HDHG karışımı başına 10 ul dağıtmak için bir elektronik çok kanallı pipet kullanın.
- Boncuk gelate 15 dakika boyunca doku kültür inkübatörü (37 ° C, nemlendirilmiş,% 5 CO2,) içinde 3B tümör boncuk yerleştirin.
- jelleşme sonra (10 u microtumors aktarmak, Elektronik çok kanallı pipet ve özel iğne cihazını kullanmak sureti ile NBM içeren özel bir süspansiyon kültürü odasının (50 mi) ya da büyük hacimli kültür kabı (10 cm L)).
- 1 sonra - doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 günlük, 50 ul NBM / oyuk pipet dağıtma geniş ağız kullanarak yerine çeşitli deney ve analiz protokolleri içeren 96-çukurlu kültür plakalarına microtumors aktarın.
- İlaç Tedavisi ve microtumors Bakım
- uyuşturucu testi için son konsantrasyonları seçin.
Not: İlaç 2B kültür etkinliği bilinen durumunda, seçme 2x orta dozu konsantrasyonu IC50 üzerinde ve altında 5 doz seviyesi toplam seri seyreltmeler 3 kat seçin. IC50 2B, kültürdeki ilaç 9 uM Örneğin, 54 uM, ve ilaç testleri için nihai konsantrasyon olarak 162 uM 2 uM, 6 uM, 18 uM seçin. - dimetil sulfoxi komple NBM 2x ilaç dozlama çözeltisi hazırlayınde (DMSO) stok. 5 doz, 3 kat seri seyreltme hazırlanması için% 1 DMSO ortam içinde dozlama çözeltisi ile seyreltilir.
- % 0.5 nihai bir DMSO konsantrasyonu elde etmek için iyi bir deney plakalarında 50 ul ihtiva eden microtumor Dozaj çözeltisi 50 ul ekle. 3.3.1 belirlenen her ilaç dozunda her tekrarında (örneğin, 4) için tekrarlayın.
- 37 ° C kültürleri bakımı,% 5 CO2, 1 nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörü - 14 gün. Yukarıdaki gibi medya ve ilaç çözeltisinin yenileyerek, haftada iki kez yem kültürleri.
- uyuşturucu testi için son konsantrasyonları seçin.
4. Morfolojik ve Microtumors Fenotipik Analizi
- Standart canlı hücre boyama kullanarak microtumors hücre morfolojisi belirleyin.
- DMSO Calcein-AM 1 mM stok hazırlayın. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
- İstenen kültür aralıklarında (1, 7 ve 14 gün) 'de, 1 uM nihai konsantrasyon 96 oyuklu plakaya (Ca / Mg) olmadan PBS içinde hazırlanmış Calcein-AM çözeltisi ilave edilir.
- tasarlamak2X, 4X bir floresans mikroskobu kullanılarak 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör ve görüntüdeki 20 dakika ve 10X (eksitasyon: 450-490 nm bant geçiş emisyon: 515 nm uzun geçiş, 500 nm dikroik) .
- Microtumor Büyüme / çoğalma deneyi
- 12 mM stok hazırlamak için (Ca / Mg) olmadan PBS içinde MTT toz eritilir. -20 ° C'de steril filtre, kısım ve depolamak.
- İstenen kültür aralıklarında (1, 7 ve 14 gün), 100 ul kültür hacmi başına 96 oyuklu plaka MTT çözeltisi 20 ul ekle. doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 saat inkübe edin.
- 0.01 M HCl içinde% 10 SDS taze lizis çözeltisi hazırlayın ve plakalar kültür hacmine eşit miktarda ekleyin. gece boyunca 37 ° C inkübatör kapalı inkübe edin.
- Çok-plaka okuyucusu kullanılarak 570 nm'de absorbansı okumak.
- Kinomic Analiz Microtumor hazırlanması
- Pro 100x her 100 oranı: 4 ° C'ye ön soğutma ve daha sonra, bir 1 ekleyerek liziz tamponutein Fosfataz İnhibitör (ÜFE) ve 100x Protein Proteaz inhibitörü (PI). İyice karıştırın ve buz üzerinde tutmak.
- Transferi üç 1.5 ml mikrosantrifüj tüp her birine 2 microtumors. Süpernatantı ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca, her bir tüp ve parçalanmasıyla ppi ve PI ihtiva eden liziz tamponu 40 ul ekle.
- Pipet örnekleri şiddetle tümör boncuk kırmak için. kinomic analize kadar -80 ° C 'de, 4 ° C ve mağaza örnekleri 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin.
Microtumors 5. Kinomic profil
- Protein Tirosin Kinaz (PTK) profil
- Çözülme reaktifler (10x Protein Kinaz (PK) tampon ve% 2 sığır serum albümini (BSA)) profil pozisyon # 2'de şırıngaya 4 ° C Yük PK tampon (300 ul 10x PK tampon hazır 2.7 mi DH 2 O) platformu.
- softw içinde örnekleri annotating, kinaz tahlil yazılım programını açın ve PTK protokol dosya ve basın 'BAŞLAT' yüktarama cips sonra program vardır. Daha sonra profil platformu ve yük% 2 Sığır Serum Albümin (BSA) 25 ul dizi başına ve üzerine yerleştirin cips adım engelleme yazılım kontrollü bir protokol başlamak için YÜK basın.
- 10 mM adenozin trifosfat (ATP) yapmak için 54 ul dH 2 O ile 100 mM ATP stokunun 6 mcM sulandırmak. Yazılım 3'üncü ve son yıkama adımı (ekranda görünür) başladığında, lizat 15 ug dH 2 O ile 28 ul kadar getirdi getirmek karıştırın ve diziye ekleyin.
- (En fazla 12 numuneler için) PTK ana karışımı (MM) hazırlayın. (Zaten 60 ul 10x BSA içerir) (DTT) ditiotreitol sulandırmak ve PTK-MM1 tüp, 6 ul DTT ve 60 ul 10x PK çözümü eklemek için 32.6 ul dH 2 O ekleyin.
- Daha sonra 126 PTK-MM1 ul, 60 ul PTK katkı ve eklemek görünür kinaz tahlil yazılımı 'Load' istemi kadar bekleyin 60 ul 10 mM MM2 ATP (4.5 ul PY20 FITC antikoru tümbölenleştirildi önceden içerir) ve karıştırın.Her bir numune lizat tüp ve pipet karışımı 5 kez bu PTK ana karışımı 16 ul ekleyin.
- kapak camının temiz olduğundan emin olun ve sonra 35 ul lizat / dizi, yakın atlıkarınca kapağının ve basın YÜK butonuna başına ana karışımı ekleyin.
- Serin / treonin kinaz (STK) profil:
- Çözülme Reaktifler 4 ° C'ye kadar (10 x PK tampon maddesi, 10 x STK tampon ve% 2 BSA). Yük PK tampon şırınga pozisyon # 1, 1:10 ve STK tampon şırınga pozisyon # 2'ye (2.7 ml dH 2 0 300 ul) içine (2.7 ml dH 2 0 300 ul).
- tarama cips sonra program dahilinde örnekleri annotating, kinaz tahlil bilgisayar yazılım programı açın ve STK protokol dosyasını ve START tuşuna basın yükleyin. profil platformu ve yük daha sonra 25 dizi başına% 2 BSA ul ve yazılım kontrollü protokol engelleme adımı başlamak için YÜK basın üzerine yerleştirin cips.
- 54 ul dH 2 O ile 100 mM ATP 6 mcM seyreltin Final (3.) yıkama adımı karışımı sırasındaLizat 2 mikrogram ve dH 2 O ile 32.6 ul getirmek, mix ve diziye ekleyin.
- STK-MM1 tüp 70 ul 10x PK ekle (7 ul 100x BSA içerir), ve daha sonra STK-MM1 tüp 42 ul dH 2 O ekleyin: STK master karışım yapın.
- sonra kinaz deneyi yazılımı 'Load' istemi kadar bekleyin: STK-MM1 18 ul 10 mM ATP ekleyin ve her bir örnek lizat 9 ul MM1 ekleyin. İyice karıştırın.
- cam kapak temiz olduğundan emin olun ve 35 ul lizat / dizi, yakın atlıkarınca kapağının ve basın YÜKÜ başına ana karışımı ekleyin.
- Final (3.) Yıkama Adım sırasında (3.03 ul STK primer antikor karışımı içerir) DMAB tüp 1.05 ul STK-FITC ikincil antikor ekleyin DMAB 39,6 ul AB Buffer ekleyin eklemek 356,0 ul dH DMAB 2 O, her diziye DMAB 30 ul ekleyin ve basın YÜK .
- Kinomic Veri 19,20 analizi
- Açık analiz yazılımı ve Görüntü Analizi App yükleyin. Select görüntü PTK veya STK verilerine seçeneğini makale numarası eşleşen dizi düzeni dosyası (STK PTK için 86312 ve 87102) için barkodlu ve zaman damgalı tüm dizi görüntüleri içeren klasör ve yük daha önce dizi açıklama dosyası oluşturulur.
- tüm görüntülerin doğru gridding doğrulayın ve App ölçeklendirme Poz Süresi çalıştırın. İstatistiksel pozlama / eğim log2 dönüştürülmüş değerleri karşılaştırmak ve ön yıkama kinetik eğrileri 19-21 ile onaylayın.
- Yukarı kinazlar 22,23 koşulları arasında değişmiş kinomic profilleri sorgulamak için yukarı kinaz tahmin yazılımı çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz 3D BioGel kültür sistemi birden fazla hücre tiplerinin uzun vadeli büyüme ve fonksiyonunu destekler olduğunu göstermiştir. Bu ortak bir proje, hasta türetilmiş GBM xenolines (PDX) microtumors yüzlerce üretmek için kullanılır. Ayrılan hücreler (3 x 10 5) ya da Neurospheres (40-50) BioGel boncuklar (2 mm) içine gömüldü ve hızlı jelleşme sonra bir NB-ortam dolu özel biyoreaktör kültürlenir. Hücresel canlılığı (Calcein-AM), büyüme profili (MTT) ve kinomic faaliyet dizisi tabanlı analiz belirlendi. PDX microtumors> 3 hafta boyunca çok hücreli organizasyon ve yüksek canlılığı (>% 80) yapılmaktadır. Biz bu in vivo benzeri biyoloji 3D hücre-matriks mimarisi bakımı (2D veya sfero kültürü ile mümkün değildir) nedeniyle olduğuna inanıyorum. Aynı zamanda 3D tümörler muhtemelen kollajen ben 14 eksikliği, kırılgan jelatinli protein iskele ile üretmek zor olduğu görülmektedir. mikrofon için bir çalışma planırotumor PDX hücreleri ve 3B BioGel sistemi kullanılarak üretimi Şekil 1 'de özetlenmiştir ve ayrılma işlemi, Şekil 2'de gösterilmektedir.
Hücre ölümünü işaret floresan bir azalma ile gösterildiği gibi Calcein-AM ile canlı hücre görüntüleme yoluyla, hücre büyümesini ve canlılığını hem de PDX tümör JX10 türetilen GBM hücreleri üzerinde ilaçların etkilerini tespit edilmiştir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, tümör büyümesi 0, 7 ve sürekli büyüme gösteren microtumors için 14 olarak ölçülmüştür. Bu microtumor, JX10, TMZ karşı dirençli olduğu bilinmektedir. 1 maruz kaldığında - 10 uM TMZ minimal büyüme geriliği (Şekil 3B) not edildi. Bununla birlikte, TMZ duyarlı olduğu bilinen test PDX tümör JX12, Kalsein-AM, görüntüleme (Şekil 4) ile teyit edilmiştir, 14 gün de MTT testi ile duyarlılık göstermiştir.
potansiyel ilaç direnci mekanizmalarını araştırmak amacıyla er.within-page = "1">, biz TMZ dirençli microtumors (JX10) 'de kinaz sinyalini ölçülür. 144 tirozin ve 144 serin Kinomic profilleri / treonin phosphopeptide hedefler DMSO için yakalanan ve 10 uM TMZ microtumors tedavi edildi. Tüm peptid hedefler için Kinomic fosforilasyon yoğunluğu, çoklu pozlama süreleri yakalanan çevrim başına ve başına (Veri gösterilmemiştir). Önemli ölçüde 10 uM TMZ tedavi ile yoğunluklarını değişmiş olan peptidler gösteren bir temsili ısı haritası (p <0.05, eşleşmemiş öğrenciler T-testi) Şekil 5A görüntülenir. TMZ olarak değiştirilmiş Kinomic profilleri JX10 microtumors DMSO (Şekil 5B) göre numune TMZ artan şekilde SYK, Lck ve CTK kinazlar tespit yukarı kinaz tahmini yazılım muamele edilen kullanılarak analiz edildi işlemden geçirildi. Serin / treonin kinome yukan kinaz analizi de (Şekil 5C) uygulandı.
içerik "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Şekil 1:. Microtumor Üretim GBM-PDX tümörler için Çalışma Programı fare konak ayrışmış olup, tek hücreler microtumors oluşturmak için BioGel matriks içinde gömülürler. Analizler sonra microtumors yapılmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. PDX Tümör Hücreleri ayrışma tümörleri ana farelerden çıkarıldı ve enzim solüsyonu (AG) ile karıştırılmadan önce kıyılır. Ayrışma 40 dakika boyunca (lH) sonra gösterilir. Tümör hücre ayıracı (I) gösterilir. Medya ve filtrasyon (JN) içinde öğütme bir son resu ile gösterilir24 saat (Q) 'de NBM 29,5 x 10 6 canlı hücreleri (P) form sferoidler içeren 0.3 ml pelet (O) lt. Ölçek çubuğu 20 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. 14 gün içinde MTT ve Örnek görüntüleri, optik yoğunlukta (OD) ile ölçülür Microtumors JX10 microtumor büyüme büyüme, bazal biçimde (A) ve 1-10 uM TMZ tedavisi (B) cevap olarak her iki. Görüntüler 4X büyütme (ölçek çubuğu = 500 mikron) gösterilmektedir. Standart sapma göstermiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 4:. 14 gün içinde MTT ve Örnek görüntü OD Microtumors JX12 microtumor büyüme büyüme, hem bazal biçimde (Gün 1) ve 0, 1, ya da 10 uM TMZ tedavisi (ölçek çubuğu = 500 um) yanıt olarak. Standart sapma göstermiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: TMZ Kinomic Profilleri Microtumors Tedavi İlgi haritası poz entegre değerlerin (log2 dönüştürülmüş yamaçlar (x 100) 10, 20, 50, 100, ve 200 ms medyan sinyal eksi arka plan maruz kalma değerleri) anlamlı TMZ-değişmiş için görüntülenir. değiştirilmiş peptitler (p <0.05). peptid başına ortalama Kırmızı artmış gösterir ve mavi DMSO göre azalmıştır gösterir. TMZ değişmiş profiller yukarı kinaz tahmin yazılım ve değişmiş kinazlar kullanılarak karşılaştırıldı. Normalize Kinaz İstatistik (NKS) skoru> 1.0 ve özgünlüğü skoru> 1.3 (kırmızı) çok değişmiş olarak kabul edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
protokolü içinde kritik adımlar ağırlıklı nesil yanı sıra ilaç dozajı ve bakım microtumor ilgilidir. microtumor boncuk kırılgan ve kolayca yırtılmış olduğu için, son derece dikkatli bir tahlil ve bakım gelişim evreleri, hem de ihtiyaç vardır. Bir hata Bu işlemlerden birini sırasında oluşursa, deneysel yorumlama uzantısı veya deneylerin gereksiz tekrarını hatta veri dışlanmasını neden tehlikeye girebilir.
Değişiklikler ve sorun giderme, özellikle microtumor geliştirme sürecinin, microtumor boncuk yapımı kullanımı için özel bir hidrofobik aracın tasarımını ve üretimini dahil. Bu araç, microtumors arasında daha hızlı ve daha doğru bir şekilde üretilmesini sağlamaktadır. Ayrıca, microtumors bakım küçük değişiklikler orta değişen ve hücreleri dozaj sürecini hızlandırmak için yardımcı oldu. Bu modifikasyonların birkaç dahil, ama çok kanallı kullanılarak, bununla sınırlı değilElektronik pipet çıkarın ve 96 oyuklu plakalar ve ortamın yerine taze ilaç dozaj çözümler önceden karıştırılması ve bir tekabül eden 2 mi, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 2x çözümler düzenlenmesi.
2B modelleme ve 3D modelleme arasında zayıf bir ilişki vardır 3D modelleme kültür koşulları için önemli bir optimizasyonlar, ilaç bileşikleri için uygun dozajları belirleme içerir. Bu nedenle, seri seyreltiler bir doz titrasyon eğrisi genellikle 3D microtumor modeli 2D modeli sistemi hareket ettirmek için gerekli olan kurmak.
Bir fare hasat xenoline tümör hücrelerinden microtumor nesil dikkate potansiyel sorunlar farelerde benzersiz büyüme özellikleri ayrı ayrışmalarda hücre verimleri hasat zamanında ve varyans farklılıkları üretebilir gibi bakteriyel veya mantar kontaminasyonu, birincil xenolines tutarsız kullanılabilirliğini içerir. her bir hücre hattı, alınan hücrelerin sayısı, ve benzer şekilde, ne kadar microtumors üretilebilir wi iledeğişiklik edeceğiz. Bu şekilde, deneyler gerekli ve hangilerinin microtumor verimi yeterli olmalıdır "isteğe bağlı" olan öncelik için bir ihtiyaç vardır. Numuneler BioGel bazlı proteinler (ECM proteinleri) ve bu ayırt olmayabilir BCA belirlenen protein düzeyleri, düzeltmek için bir şekilde yüklenir olarak microtumors ve kinomic profilleme ile potansiyel sınırlamalar, atıl proteinli malzeme yükleme için düzeltme güçlüğü sayılabilir amaçlanmıştır hücresel kinaz bileşeni, ölçülecek. tümörlerde oda temizliği protein seviyeleri ile ilgili sorunlar, bu karıştırıcı etki değiştirilmiş olan, ancak, Kalsein-AM ile brüt microtumor kütlesinin ölçümü veya bu hafifletebilir bir düzeltme faktörü olarak düzeni bir proteini kullanılarak. Kısa süre ders eşit büyüklükte (canlı hücre sayısını içeren kinaz) varsayarak, deneyler sinyalizasyon ve tedavi eşleştirilmiş ve işlenmemiş örnekleri için bu bir sorun daha azdır.
Bu araştırma ile, hedefi daha maliyet-e sağlamaktırortotopik hasta türevi xenogreftler göre doğru ilaç tedavisi testi için tk in kısım ve hastalık temsilcisi preklinik model GBM test için mevcut altın standart model. Son yıllarda, çeşitli gruplar uyuşturucu test amaçlı in vivo GBM ortamı modellemek için çalıştılar. Bazı gruplar sadece GBM kök hücreleri korumak için sigara ayırt koşullarda GBM tümör hücrelerini büyümeye çalıştı ya da en azından beyin tümörü başlatılması hücreleri (BTIC) 24,25 var. Bunlar tumorsphere veya neurosphere kültürleri uyuşturucu testi için kullanılan ve geleneksel modellere muhtemelen üstün olabilir. onlar hala bizim microtumor modelinde korunur tümör stroma etkileşimi eksikliği olduğundan Ancak, tumorsphere yaklaşım hala sınırlıdır. Diğer gruplar GBM modellerini 26-28 geliştirmek için mühendislik ilkelerini uygulamak için çalıştılar. Bu yaklaşımlar akış odaları, değişken ECM proteinleri ve tümör hücre / normal hücre karışımları dahil ettik. Bu repo, hemen hemen tüm vaat ederkenRTS daha önce bahsedilen uyarılar ile ölümsüzleştirdi hücrelerin çizgiler kullandık. Bu nedenle, burada açıklanan PDX-tabanlı microtumor modeli daha klinik olarak anlamlı olduğuna inanıyoruz.
Gelecekte, microtumor modeli gerçek tümör avatar ya da 'Proband' sistemi ya da kullanılabilir. proband sistemi ile PDX doğrudan tümör avatar sisteminde olduğu gibi, belirli hastanın tedavisi ile ilgili klinisyen haberdar olmayan belirli bir hasta geliştirilmiştir. Bunun yerine, bir hastanın tümör önceden varolan, iyi karakterize (moleküler hem de fenotipik) PDX 29 "eşleşti" dır. Nitekim, bu model bir 'git' avatar olarak hizmet ya da karşılaştırmalı bir profil olarak bir proband kütüphanede bulunan olabilir. Geleneksel avatarlar, hastanın tedaviye paralel olarak farelerde hastanın tümör hücrelerinin büyüyen d birkaç test olarak değil, sadece zaman birincil geçiş için birkaç ay sürebilir olarak, tüketen değil, aynı zamanda pahalıFarelerde halı tedavileri ezici bir fiyat etiketi üretir. Bu mücadele için, birincil hasta tümör BioGel matriks içine direkt olarak implante edilebilir. microtumors ile, sonuçlar hızlı ve daha düşük bir maliyetle oluşturulabilir.
Bir Proband modeli olarak, microtumor kinome veri profilleri ve ilaç tepkisi vitro modeller önceki 3D mevcut PDXs, hayvan çalışmaları, diğer hastaların, vb profil ve veri ile birlikte ', kütüphane' bir Proband ilave edilebilir. Teoride, hastanın tümör hücreleri daha sonra mümkün olan en iyi sonuç için doğru tedaviyi belirlemek için 'omically' (genomik, kinomically, transcriptomically, vb) benzer mevcut microtumor profiline uyumlu olabilir.
Özet Burada bu microtumor modelleri hem fenotipik büyüme ölçmek için kullanılabilir ve hem bazal hem de kinaz aktivitesi seviyesinde ve yararlı olabilir, ilaç tedavisine yanıt olarak sorgulanabilir olduğu tespitDaha fazla preklinik araştırma için bir öteleme aracı olarak. insan tümörleri için doğru ve moleküler geçerli denenebilir modelleri geliştirme etkili ilaç gelişimi için şarttır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
, Beyin Tümörü SPORE ödülü (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) ve SBIR sözleşmesi (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026): NIH R21 hibe (C. Willey, CA185712-01 PI) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/ml final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µg/ml final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10x BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100x BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100 mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 ml disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. , 7727550 B2 (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
