Introduction
最も一般的な原発頭蓋内悪性脳腫瘍は、グレードIII星状細胞腫およびグレードIVの多形性膠芽腫 （神経膠芽腫またはGBM）です。米国1-3でGBMに対する現在の治療と15ヶ月-これらの腫瘍は、12の間の中央値1年生存率と予後不良を提供しています。マルチモダリティ療法は、テモゾロミド（TMZ）およびキナーゼを標的とする薬剤を含む外科手術、放射線、および化学療法が含まれます。キナーゼシグナル伝達は、頻繁に上皮成長因子受容体（EGFR）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）の増加、シグナリング、増加したホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）とにおける増幅を有する腫瘍のサブセットまたは活性化変異を含む、GBMで調節不全されます血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、ならびに他のキ ナーゼ駆動経路4-6を介して血管新生シグナル伝達を支援する腫瘍。 in vitroおよびin vivoモデルで現在は頻繁にこれらの代表的な変化を失います<SUP> 7。さらに、遺伝的プロファイリングは、遺伝的およびエピジェネティックな変化は常に標的剤、ほとんどのキナーゼが直接作用するタンパク質活性のレベルで変化を予測せず、他の作用機序を持つ治療法がどこに作用することができるという事実を反映している可能性が予想される利益を提供していません間接的に。
無限に継代することができる伝統的な不死化細胞株は、長いによるメンテナンスや再現が容易に薬物検査のための標準となっています。しかし、このモデルは、高速、元の腫瘍から大きく異なる細胞を増殖させるための選択の高い栄養素（人工）成長環境に苦しんでいます。このように、患者に存在するように、より複雑な腫瘍生物系を反映する、より現実的なモデル系を開発することにかなりの関心が集まっています。腫瘍異種移植片は、マウスで増殖させた原発腫瘍（「xenoline、「患者由来の異種移植片またはPDX）専らから直接開発しますそれらは、より確実に臨床的成功を予測することが8以上の反射生物学にもかかわらず感じられるようにデは、特に癌治療の設定で複数の反射モデル系は、これらのモデルは、高価であり、確立し、維持するのが困難です。さらに、それらは、ハイスループット試験に適していません。より良い、より正確に原発腫瘍の分子変化を反映して、遺伝子マーカーの代理、キナーゼ活性の直接的尺度を使用して、これらのモデルをしないプロファイルおよびテストするために生物学的モデルを開発する必要性が、明らかです。
よく、二次元（2D）単層培養とは異なり、3次元または多分析モデルは、より生理学的に関連するエンドポイント9-11を提供することができることが認識されます。一般的な3D培養手法は、マトリックスコートしたマイクロキャリアおよび細胞スフェロイド形成を伴います。腫瘍スフェロイドは、スピナーフラスコのpHEMA板と懸滴技術を使用して細胞凝集を介して生成することができます。トンの制限事項HESEアプローチは、次のとおりです。安定したスフェロイドを形成するためにいくつかの細胞のための不能、混合細胞型と成長と課題の変動を。あるいは、合成（ハイドロゲル、ポリマー）およびマウス肉腫から動物由来エンゲル・ホルム-スウォーム（EHS）行列多く、ウシコラーゲン）行列は3D培養のために開発されてきた12-14を研究しています。マウスEHSマトリックスは、広く使用されるが、in vitroおよびin vivo 15細胞の増殖および分化を促進することが知られています。
3D腫瘍生物学を複製するためには、人間のバイオマトリックスシステムは、博士のRaj Singh氏らによって開発された。16。 天然の、成長因子を含まないヒトのバイオゲルは、複数の細胞型の長期培養をサポートする3D培養の足場（ビーズ、ディスク）を可能にします。 3Dヒトバイオゲル培養設計のシリーズは、腫瘍増殖、接着、血管新生および浸潤特性を研究するための確立されています。利点と人間のバイオゲルのプロパティ共通に比べて、マウスEHSゲルは、表1および表2にまとめます。
| ソース： | 人間Amnions（プールされた組織） 病原体を含まない、IRB-免除/承認 |
| ECMの性質： | 非変性バイオゲル （GLP-生産） |
| キー コンポーネント： | COL-I（38％）、ラミニン（22％）、COL-IV（20％）、COL-III（7％）、エンタクチンおよびHSPG（<3％） |
| GF-フリー： | 検出不可能 EGF、FGF、TGF、VEGF、PDGF（非血管新生性、非毒性） |
表1：一般的なEHSゲルと比較して、ヒトバイオゲルのプロパティ。
| 人間バイオゲル | EHSゲル |
| 人間の自然な行列 | 再構成されたマウスの行列 |
| 制御された細胞増殖＆分化 | 細胞増殖＆分化を促進することができます |
| 生理学的遺伝子発現 | 可変遺伝子発現 |
| 3D組織様培養モデル | プレートベース培養モデル |
表2：一般的なEHSゲルと比較して、ヒトバイオゲルの利点。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：すべての異種移植療法の評価は、施設内動物管理使用委員会により承認されたプロトコルに神経膠芽腫のための同所性腫瘍モデルを使用して行きました。
患者由来のGBM異種移植細胞の1の単離
- 試薬の調製
- 5 mg / mlとし、滅菌フィルターの濃度になるように滅菌水にコラゲナーゼIを再構成しています。 -20℃で1ミリリットルの分量を保存するには、（最終濃度は、100ミリリットルの酵素溶液中の50μg/ mlです）。
- 2mlの100μgの上皮成長因子（EGF）を溶解し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 100μlの（5μgの/100μl）を10ng / mlの最終濃度のために-20℃でアリコートで保管してください。
- 2ミリリットル滅菌PBS中の100μgのFGF-βを溶かします。 100μlの（5μgの/100μl）を10ng / mlの最終濃度のために-20℃でアリコートで保管してください。
- 神経基本メッドの1 500ミリリットルのボトルに以下を追加します。完全NBMを準備するIA（NBM）：ビタミンAなしの10ミリリットルのB-27サプリメント、5ミリリットルN2サプリメント、100μlのEGF、100μlの線維芽細胞増殖因子（FGF） - 基本、5ミリリットルアムホテリシンB、0.5ミリリットルゲンタマイシン、5ミリリットルL-グルタミン。
- 組み合わせることによって、新鮮な酵素溶液を準備します98.5ミリリットルのPBS、1ミリリットルのコラゲナーゼ-1、0.5ミリリットル10×トリプシン/ EDTAおよび0.22μmの細孔のフィルターで濾過滅菌します。
- 準備または少量の滅菌ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、カルシウムまたはマグネシウムなしで、7％ウシ胎児血清（FBS）および1×PBSで/ F12細胞培養培地を得ました。
- 腫瘍の脱凝集
注：以前に触知可能な腫瘍塊からに右脇腹に腫瘍細胞を注射し、許可された無胸腺NU / NUマウスは、この手順のために必要です。ここに示した例では、我々は、患者由来の異種移植GBM細胞、JX10とJX12 17を使用していました。- 2％クロルヘキシジンを噴霧することにより、作業領域を殺菌し、作業領域のウィットを設定使い捨てチャック、鉗子、メス、ガラスシャーレ、酵素液、PBS、およびクロルヘキシジンなどの時間に必要な機器/用品（ 図2Aを参照してください）。
- フランク腫瘍を保有するマウス/マウスを安楽死させます。 30％のCO 2を用いて、CO 2の20％/分の変位速度を目指します。マウスは呼吸停止を示した後、約1分（典型的には3分の合計）のためのCO 2流れを維持します。マウスをチャンバーから除去され、頸椎脱臼は、二次安楽死確認として実行されます。皮膚を消毒するために、3％クロルヘキシジンで動物をスプレーします。
- マウスは着実に保持しながら、作る半円形の皮膚切開〜腫瘍塊に頭蓋始めとする周りのマウスの腹に向かって切開し、＃11の刃で滅菌使い捨てメスを用いて腫瘍塊（脇腹移植した腫瘍）から1.5センチメートル尾方端。
- 切開の尾方端に優しい牽引して指を用いて腫瘍塊上の皮膚を反映した後、皮膚に押し腫瘍に触れることなく最適なアクセスを持っている腫瘍を上昇させる面 （ 図2Bを参照してください）。
- （ 図2Cを参照してください）腹膜壁からと皮膚からそっと無料腫瘍塊をピンセットで鈍的切開を使用してください。
- 滅菌ガラスシャーレ（ミンチ時の破壊を防止するためにプラスチック製の食器を使用しない）に鉗子を用いて腫瘍塊を移し、適切に死体を捨てて、脇にこれらの機器を配置します。
- 壊死組織と腫瘍をカバーする膜状のホスト結合組織の腫瘍組織を創面切除する（＃11ブレード、半湾曲した鉗子でメス）滅菌機器の新しいセットを使用してください。
- 攪拌棒を備えた無菌通気、トリプシン処理フラスコ中で15ミリリットル酵素溶液を置き、フード中でゆっくり攪拌し始めます。
- （注ぐまたはPBSでそれらを洗浄するために注射器を使用してもよい）、過剰な血液を除去するために滅菌PBSで5回 - 滅菌ガラスシャーレでは、3を収穫した腫瘍を洗います。ゆっくり料理やピペットを傾けたり、洗浄材料を吸引。ミンチFinely 2＃11手術用メスの刃を使用して（ 図2Dを参照してください）。
- 3回 - 優しく上下ミンチ腫瘍およびピペットに2を酵素液の14ミリリットルを追加します。転写混合物は、フラスコをトリプシン処理、ガス抜きし、20分間ゆっくり撹拌します。ステップ1.2.11でトリプシンを中和するために、それぞれに1.5ミリリットルのFBSを添加することにより、5 50mlコニカルチューブを準備します。
- 20分後、トリプシン処理フラスコから細胞溶液の14ミリリットルを収集し、FBSを1チューブに追加します。フラスコ、攪拌を継続する14ミリリットルの新鮮な酵素溶液を追加します。
- 遠心分離機は、室温で8分間、150×gで細胞を採取し、上清を捨てます。 、ペレットに完全NBMの45ミリリットルを加え穏やかに混合し、血清をすすぐために遠心分離を繰り返します。 5ミリリットル完全NBMでペレットを再懸濁し、氷上に保持します。
- 氷の上の単一のコニカルチューブ内のすべての収穫細胞を組み合わせ、5収穫の合計のための細胞収穫の手順を繰り返します。
- 50ミリリットルコニカルチューブの上に40μmのセルストレーナーを配置します。準備トン彼を通してDMEM / F12 + 7％FBSを10mlを通過した後、10mlのPBSで洗浄することにより、ストレーナを細胞。
- ゆっくりと、それは（ 図2Mを参照）を介して滴下することができ、ストレーナに細胞懸濁液を追加します。静かに任意の真空を破壊し、懸濁された細胞が自由に通過できるようにする新しい各添加の間にセルストレーナーのタブを持ち上げ（ 図2Nを参照してください）。
- 上記のように濾過した細胞懸濁液を遠心します。完全NBM 10mlに再懸濁し、0.04％トリパンブルーおよび血球計数器を用いて、生存細胞の総数を決定するためにカウントされます。 microtumor世代まで、氷上で細胞を保持します。
2.代替組織脱凝集プロトコル
- 自動化された組織の解離および分解システム。
- プログラム「腫瘍_02_02」と押してスタートを選択して、32秒間実行し、携帯解離に分解チューブを置きます。トランスファーチューブを40分間37℃のインキュベーター中で、場所をローテータします。
- 遠心分離は、室温で8分間、150×gで細胞を懸濁し、上清を捨てます。細胞を遠心分離しながら、細胞懸濁液を処理するための試薬を設定します。 10ミリリットルの無血清NBMと軽く粉砕物の懸濁液を追加します。
- 30×10 6生細胞（〜0.3ミリリットル） -遠心分離の後、〜10を含む細胞ペレットを得ました。 （ 図2Oを参照してください）10ミリリットルの無血清NBM中でペレットを再懸濁しました。 （ステップ3.2.2を参照）排除アッセイにより生存細胞を決定します。
3. Microtumorジェネレーション
- 試薬の調製
- 内部プロトコルごと（3 mg / mlとでHDHG）1.1.4のように完全なNBMを準備し、中和高密度人間バイオゲル（HuBiogel）を準備します。同様のバイオゲルマトリックスを使用することもできます。
- Microtumor生産と文化
- 氷の上で完全NBMにおける単一細胞懸濁液としてたて解離PDX細胞を得ます。
- セルのsuを混ぜますトリパンブルー溶液（PBS中0.4％）との等体積とspensionは、トリパンブルー排除18により、細胞数および生存率を決定するために、血球計を用いて分析します。 50,000個の細胞を生成するのに必要なボリュームを削除/ microtumorここで、体積=（50,000細胞/腫瘍*＃腫瘍）/（生存細胞は/ 1ミリリットルをカウント）し、新鮮なコニカルチューブに配置します。
- 室温で、8分間、150×gでの遠心分離により細胞を濃縮します。上清を捨て、FBSで1部の細胞と4部HDHGの最終比で氷冷HDHG溶液で細胞ペレットを再懸濁します。
- 微小腫瘍（2ミリメートルビーズ50,000個の細胞を含む各）を生成する（疎水性コーティング付き）96ピン鋼板上にピン細胞HDHG混合物あたり10μLを分配するために、電子マルチチャンネルピペットを使用してください。
- ビーズをゲル化するために15分間組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、加湿）の内部3D腫瘍ビーズを置きます。
- ゲル化した後、（10μを微小腫瘍を転送;電子マルチチャンネルピペットおよびカスタムピン・デバイスを使用して完全NBM含むカスタム懸濁培養チャンバー（50ml）で、または大量培養皿（10センチリットル））。
- 1後 - 組織培養インキュベーター中で2日間、50μlのNBM /を含む96ウェル培養プレートに伝達微小腫瘍は十分広口分注ピペットを使用して、様々なアッセイおよび分析プロトコルを実行します。
- 微小腫瘍の薬物治療とメンテナンス
- 薬物検査のための最終的な濃度を選択します。
注：薬は、2D培養で有効性を知られている中用量濃度として2倍のIC 50を選択し、5用量レベルの合計の上下に3倍連続希釈液を選択した場合。例えば、IC 50は、2D培養での薬物について9μMである場合、2μM、6μM、18μM、54μM、および薬物検査のための最終的な濃度として162μMを選択します。 - ジメチルsulfoxiから完全NBM中で2回薬物投与溶液を準備しますド（DMSO）ストック。 5用量、3倍連続希釈物を調製し、1％DMSO媒体に投薬溶液を希釈します。
- 0.5％の最終DMSO濃度を達成するために、ウェルアッセイプレート中で50μLを含むmicrotumorに投薬溶液50μlを加えます。 3.3.1で決定された各薬剤の投与量で各反復（ 例えば、4）のために繰り返します。
- 14日- 1、37℃、5％CO 2、加湿した組織培養インキュベーター中で培養を維持します。上記のようにメディアや薬液をリフレッシュすることにより、週二回フィードの文化。
- 薬物検査のための最終的な濃度を選択します。
4.形態および微小腫瘍の表現型分析
- 標準的な生細胞染色を用いて微小腫瘍における細胞形態を決定します。
- DMSOにカルセインAMの1 mMストックを準備します。 -20℃で小分けし、店舗。
- 希望の文化間隔（1、7、および14日）で、最終濃度1μMのために96ウェルプレートに（のCa / Mgを含まない）PBSで調製したカルセインAM溶液を添加。
- インキュベート37℃、2X、4Xの蛍光顕微鏡を用いて5％CO 2、加湿インキュベーター、そして画像、20分および10×（励起450 - 490nmのバンドパス、発光：515 nmのロングパスダイクロイック500 nm）を。
- Microtumor成長/増殖アッセイ
- 12 mMストックを準備する（カルシウム/マグネシウムなし）、PBS中のMTT粉末を溶かします。滅菌フィルター、アリコートし、-20℃で保存。
- 所望の培養間隔（1,7、および14日目）に、100μlの培養体積あたりの96ウェルプレートにMTT溶液20μlを加えます。組織培養インキュベーター中で2時間インキュベートします。
- 0.01 M HCl中10％SDSの新鮮な溶解液を調製し、プレートに培養体積に等しい量を追加します。一晩37℃のインキュベーター中で密封されたプレートをインキュベートします。
- マルチプレートリーダーを用いて570nmで吸光度を読み取ります。
- Kinomic分析のためのMicrotumor準備
- プロ100Xの各100比：4℃に予備冷却した後、1を加えることにより溶解緩衝液を調製しますテインホスファターゼ阻害剤（PPI）と100×タンパク質プロテアーゼ阻害剤（PI）。よく混合し、氷上に保ちます。
- 転送3 1.5ミリリットルマイクロチューブのそれぞれに2微小腫瘍。上清を除去し、4℃で30分間、各チューブおよび溶解にPPIとPIを含む溶解緩衝液40μlを添加します。
- ピペットサンプルを激しく腫瘍ビーズを破壊します。 kinomic分析まで-80℃で4℃、店舗のサンプルで10分間16,000×gで遠心分離します。
微小腫瘍の5 Kinomicプロファイリング
- タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）プロファイリング
- プロファイリング上の位置＃2のシリンジに4°C負荷PKバッファー（2.7ミリリットルのdH 2 Oで300μlの10倍PKバッファーストック）に解凍した試薬（10×プロテインキナーゼ（PK）緩衝液および2％ウシ血清アルブミン（BSA））プラットフォーム。
- キナーゼアッセイのソフトウェアプログラムを開き、PTKプロトコルファイルおよびプレスを読み込む「START」、SOFTW内のサンプルに注釈を付けますチップをスキャンした後のプログラムです。場所チップアレイあたり2％ウシ血清アルブミン（BSA）のプラットフォームと負荷25μLをプロファイリング上に、その後はステップを遮断するソフトウェア制御プロトコルを開始するためにLOADを押してください。
- 10mMのアデノシン三リン酸（ATP）を作るために54μlののdH 2 Oで100 mMのATPの株式の6μMに希釈します。ソフトウェアは3 番目 、および最終洗浄工程（画面に表示）開始すると、溶解液15μgのがのdH 2 Oで28μlに育て持参ミックスし、配列に追加します。
- （最大12サンプル用）PTKマスターミックス（MM）を準備します。 （すでに60μlの10倍のBSAを含む）のジチオスレイトール（DTT）を再構成し、PTK-MM1チューブに、6μlのDTT、および60μlの10倍PKソリューションを追加するために、32.6μlののdH 2 Oを追加します。
- その後、126 PTK-MM1のμlを、60μlのPTKの添加剤などを追加表示されキナーゼアッセイソフトウェアの「ロード」プロンプトになるまで待って60μlの10 mMのMM2へのATP（4.5μlのPY20 FITC抗体を等分し、以前に含まれています）と混ぜます。各サンプル溶解液チューブとピペットミックス5回にこのPTKマスターミックスの16μLを加えます。
- カバーガラスがきれいであることを確認し、その後、35μlの溶解液/アレイ、近いカルーセル蓋、プレスLOADボタンごとにマスターミックスを追加します。
- セリン/スレオニンキナーゼ（STK）プロファイリング：
- 融解試薬（10×PKバッファ、10×STK緩衝液、2％BSA）4℃です。シリンジ位置＃2にシリンジ位置＃1 1:10およびSTKバッファー（2.7ミリリットルのdH 2 0で300μlの）にロードPKバッファー（2.7ミリリットルのdH 2 0で300μl）を。
- キナーゼアッセイコンピュータソフトウェアプログラムを開き、STKプロトコルファイルとプレスSTARTを読み込み、チップをスキャンした後、プログラム内のサンプルに注釈を付けます。アレイあたり2％BSAのプラットフォームと負荷25μLをプロファイリングし、手順を遮断するソフトウェア制御プロトコルを開始するために、LOADを押して上に置きチップを。
- 54μlのをdH 2 Oで100 mMのATPの6μMを希釈最後の（ 第3）洗浄ステップミックスの間に溶解物を2μgのと、のdH 2 Oで32.6μlに持ち出す混合し、配列に追加します。
- STK-MM1チューブに70μlの10倍PKを追加します（7μlの100×BSAを含有する）、その後、STK-MM1チューブに42μlののdH 2 Oを追加：STKマスターミックスを作成します。
- その後、キナーゼアッセイソフトウェアの「ロード」プロンプトになるまで待ち：STK-MM1に18μlの10 mMのATPを追加し、各サンプル溶解液に9μlのMM1を追加します。よく混ぜます。
- カバーガラスがきれいであることを確認し、配列、近いカルーセル蓋、およびプレス荷重あたり35μlの溶解液/マスターミックスを追加します。
- ファイナル（ 第3）洗浄工程の間に DMAB管に1.05μlのSTK-FITC二次抗体を追加（3.03μlのSTK一次抗体ミックスが含まれている）、DMABに39.6μlのABバッファを追加し、DMABに356.0μlののdH 2 Oを追加し、各アレイにDMABに30μlを添加し、プレス荷重。
- Kinomicデータ19,20の分析
- 解析ソフトウェアを開き、画像解析アプリケーションをロードします。セ択画像PTKまたはSTKデータ、選択の資料番号マッチしたアレイレイアウトファイル（STKのためのPTKのための86312および87102）用のバーコードとタイムスタンプ付きの配列全体の画像を含むフォルダ、および負荷は、以前、アレイアノテーションファイルを生成しました。
- すべての画像の正しいグリッディングを確認し、アプリケーションをスケーリング露光時間を実行します。統計的に露出/スロープLOG2変換された値を比較し、予備洗浄運動曲線19-21で検証します。
- 上流のキナーゼ22,23のための条件との間に変更されたkinomicプロファイルを照会する上流キナーゼ予測ソフトウェアを実行します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我々は、3Dバイオゲル培養系は、複数の細胞型の長期的成長と機能をサポートしていることを示しています。この共同プロジェクトでは、患者由来のGBM xenolines（PDX）は微小腫瘍の数百を製造するために使用されています。解離した細胞（3×10 5）またはニューロスフェア（40 - 50）バイオゲルビーズ（2mm）に包埋し、迅速なゲル化した後、それらはNB-媒体充填カスタムバイオリアクター中で培養されます。細胞生存性（カルセインAM）、増殖プロフィール（MTT）、およびkinomicアクティビティアレイベースの分析を測定しました。 PDXの微小腫瘍は> 3週間の多細胞組織と高い生存性（> 80％）を維持しました。我々は、このin vivoでの様生物学は、3D細胞-マトリックスアーキテクチャのメンテナンス（2Dまたはスフェロイド文化を持つことはできません）が原因であると考えています。また、3D腫瘍はおそらく、コラーゲンI 14がないため、脆弱なゼラチン状タンパク質足場と製造が困難であることが観察されます。マイクのための作業計画rotumor PDX細胞と3Dバイオゲルシステムを使用して製造は、図1に要約され、解離工程は、図2に示されています。
細胞死シグナル伝達、蛍光の減少によって示されるようにCalcein-AMを介してライブセルイメージングを通じて、我々は、細胞増殖および生存率だけでなく、PDX腫瘍JX10由来GBM細胞に対する薬物の効果を決定しました。腫瘍増殖を図3Aに示すように、連続的な成長を表示微小腫瘍のために0日目、7および14で測定しました。このmicrotumor、JX10は、TMZに耐性であることが知られています。 1にさらされたときに- 10μMのTMZ、最少増殖抑制が（ 図3B）が認められました。しかし、TMZに対して敏感であることが知られている試験PDX腫瘍JX12は、カルセインAM画像（ 図 4）によって確認された14日目にMTTアッセイによって感度を示しました。
薬剤耐性の潜在的なメカニズムを探るために= "1">ページをer.within、我々は、TMZ耐性微小腫瘍（JX10）にキナーゼシグナル伝達を測定しました。 144チロシンおよび144セリン/スレオニンリン酸化ターゲットのKinomicプロファイルは、DMSOのために捕獲されたと10μMのTMZは、微小腫瘍を治療しました。サイクルごとに、複数の露光時間当たりの全ペプチドターゲットのKinomicリン酸化強度は、（データは示していない）捕捉しました。 10μMのTMZ処理した（p <0.05、不対学生T検定）で有意に変化した強度を持っていたペプチドを提示する代表的なヒートマップは、 図5Aに表示されます。 TMZに変更されたKinomicプロファイルはJX10の微小腫瘍がTMZに増加したようSYK、LCK、およびCTKキナーゼを同定し、上流のキナーゼ予測ソフトウェアは、DMSO（ 図5B）に比べ処理サンプルを用いて分析した処理しました。セリン/スレオニンキノーム上流キナーゼ分析は、また、（ 図5C）を行いました。
コンテンツ "FO：キープtogether.withinページ=" 1 ">
図1：Microtumor生産のためのワーキングスキーム GBM-PDX腫瘍はマウス宿主から分離され、そして単一細胞が微小腫瘍を形成するために、バイオゲルマトリックス中に埋め込 まれています。分析は、その後、微小腫瘍上で実行されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：PDX腫瘍細胞の解離腫瘍は、宿主マウスから取り出し、酵素溶液（AG）と混合する前にミンチしています。解離は、40分（H）の後に示されています。腫瘍細胞の解離は、（I）に示されています。メディアおよび濾過（JN）で粉砕してはエンドRESUで示されています24時間（Q）にNBMで29.5×10 6生細胞（P）そのフォームのスフェロイドを含む0.3ミリリットルペレット（O）のLT。スケールバーは20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3：14日間でMTTと代表画像の光学濃度（OD）で測定微小腫瘍 JX10 microtumor成長の成長 、両方の基底に（A）、および1〜10μMTMZ処理（B）に応じて。画像は4X倍率（スケールバー= 500μm）とで示されています。標準偏差を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図4：14日間でMTTと代表画像のODにより測定微小腫瘍 JX12 microtumor成長の成長 、両方の基底に（1日目）、および0、1、または10μMのTMZ処理（スケールバー= 500μm）とに応じて。標準偏差を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：TMZのKinomicプロファイルは、微小腫瘍を治療した露光積分値のヒートマップ（10、20、50、100、および200ミリ秒の中央値信号マイナス背景の露出値のLOG2変換された斜面が（×100））が大幅にTMZ-改変のために表示されます。改変されたペプチド（P <0.05）。ペプチドあたりの平均赤は増加を示す、青はDMSOに比べて減少と示されます。 TMZ変化したプロファイルは、上流キナーゼ予測ソフトウェアと変更されたキナーゼを用いて比較しました。正規化されたキナーゼ統計（NKS）スコア> 1.0と特異スコア> 1.3（赤）は、高度に変更と考えられている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
プロトコル内の重要なステップは、主に世代をmicrotumorに関連するだけでなく、薬剤投与とメンテナンス。 microtumorビーズが壊れやすく、簡単に引き裂かれたので、細心の注意をアッセイおよびメンテナンスの発達段階の両方で必要とされます。エラーがこれらのプロセスのいずれかの間に発生した場合は、実験的な解釈は、拡張機能や実験の不必要な繰り返しやデータのさえ排除を引き起こし、妥協することができます。
特にmicrotumor開発プロセスの修正およびトラブルシューティングは、microtumorビーズを作るのに使用するためのカスタム疎水性ツールの設計と製造が含まれていました。このツールは、微小腫瘍のより速く、より正確な製造を可能にします。さらに、微小腫瘍の維持に小さな修正は培地を交換し、細胞を投与するプロセスをスピードアップするのに役立ちました。これらの変更のいくつかが含まれるが、マルチチャネルを使用して、これらに限定されないました96ウェルプレートから培地を除去し、交換する電子ピペットと予備混合新鮮な薬剤ソリューションを投与し、対応する2ミリリットルの96ウェルプレートで2倍のソリューションを配置します。
2Dモデリングと3Dモデリングの間の悪い関係があるように3Dモデリングにおける培養条件の主な最適化は、薬剤化合物のための適切な用量を決定することを含みます。従って、用量漸増曲線を確立するために連続希釈は、多くの場合、3次元microtumorモデルを2次元モデル系を移動させる必要があります。
マウスから採取しxenoline腫瘍細胞からmicrotumor世代で考慮すべき潜在的な問題、細菌や真菌汚染を含む、主要なxenolinesの一貫性のない可用性、マウスでのユニークな成長特性が別々の解離から細胞収量で収穫時期と分散の違いを生み出すことができるように。各細胞株を用いて、細胞数を受け、同様に、どのように多くの微小腫瘍は、Wiを生成することができます変わるでしょう。このように、アッセイが必要とするものがmicrotumor収率が不十分であるべき「任意」ですされている優先順位を決定する必要があります。サンプルはバイオゲル基づくタンパク質（ECMタンパク質）とのものとを区別しない場合がありBCA決定タンパク質レベル、を補正するようにロードされる微小腫瘍のkinomicプロファイリングとの潜在的な限界は、不活性タンパク質性物質の負荷を補正することの困難を含めます測定されることが意図される細胞キナーゼコンポーネント。変更される腫瘍におけるハウスキーピングタンパク質レベルの問題がこれを混乱させるかもしれないがカルセインAMを経由して総microtumor質量の測定、または補正係数としてハウスキーピングタンパク質を使用しては、これを緩和することができます。短い時間経過のシグナル伝達実験、等しいサイズの（生細胞数を含むキナーゼ）を仮定し、治療対になっており、未処理のサンプルについては、これはそれほど問題です。
この研究では、目標は、よりコストの電子を提供することです同所患者由来の異種移植片と比較して、正確な薬物療法の試験のためのffectiveおよび疾患の代表的な前臨床モデル、GBM試験のための現在のゴールドスタンダードモデル。近年、いくつかのグループは、薬物試験のためにインビボで GBMの環境をモデル化することを試みてきました。いくつかのグループは、単にGBM幹細胞を維持するために、非分化条 件下でGBM腫瘍細胞を成長しようとしたか、または少なくとも脳腫瘍開始細胞（BTIC）24,25います。これらtumorsphereまたは神経球培養物は、薬物テストに使用し、伝統的なモデルへの可能性が優れていることができます。彼らはまだ私たちのmicrotumorモデルに保存されている腫瘍間質の相互作用を欠いているので、tumorsphereアプローチはまだ限られています。他のグループはGBMモデル26-28を改善するために、エンジニアリングの原則を適用しようとしました。これらのアプローチは、フローチャンバー、可変ECMタンパク質および腫瘍細胞/正常細胞の混合物を含んでいました。これらのレポの、ほとんどすべてを約束しながら、RTSは、前述の注意点と不死化細胞株を使用しています。このように、我々はここで説明PDXベースmicrotumorモデルは、より臨床的に関連性のあることを信じています。
将来的には、microtumorモデルが真の腫瘍アバターまたは「発端」システムのいずれかとして使用することができました。発端者のシステムでは、PDXは、直接腫瘍アバターシステムと同様に、その特定の患者の治療に関する臨床医に通知していない特定の患者から開発しました。その代わりに、患者の腫瘍は（表現型分子との両方）、よく特徴付けられた既存のPDX 29に「マッチ」されています。確かに、このモデルは「行く-に「アバターとして機能又は比較プロファイルとして発端者のライブラリに存在することもあります。従来のアバターと、患者の治療と平行に、マウスに、患者の腫瘍細胞を増殖させることは、いくつかのDのテストとして、それは一次通過のために数ヶ月かかることができるように、時間がかかるだけではなく、また高価なマウスでの敷物療法は圧倒的な価格のタグを生成します。これに対処するために、主要な患者の腫瘍はバイオゲルマトリックス中に直接注入することができます。微小腫瘍で、その結果、迅速かつ低コストで生成することができます。
発端者モデルとして、microtumorのキノームデータプロファイルと薬物反応は、in vitroモデルで以前の3D、既存のPDXs、動物実験、他の患者等からのプロファイルとデータとともに'、'ライブラリ発端者に追加することができました。理論的には、患者の腫瘍細胞は、その後、「omically '（ゲノム、kinomically、transcriptomically など ）可能な限り最高の結果に対する正確な治療法を決定するために、類似の既存microtumorプロファイルに一致させることができました。
概要：ここでは、これらのmicrotumorモデルは両方の表現型の増殖を測定するために使用することができ、両方の基礎キナーゼ活性のレベルで有用であり得る薬物処置に応答して照会することができることを識別しますさらに前臨床研究のための翻訳ツールとして。ヒト腫瘍の正確な、そして分子的に有効なテスト可能なモデルを開発することは有効な薬剤の開発のために不可欠です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
（：C.ウィリー、CA185712-01 PI）、脳腫瘍SPORE賞（PD：GYギレスピー、P20CA 151129から03）とSBIR契約（PI：R.シン、N43CO-2013から00026）NIH R21グラントによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/ml final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µg/ml final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10x BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100x BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100 mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 ml disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. , 7727550 B2 (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
