Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ahlâk
Tüm çalışmalar UK Home Office Animals onayı (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 ve Hijyen ve Tropikal Tıp Hayvan Refahı ve Etik Değerlendirme Kurulu London School of altında yürütülmüştür. kılavuz ARRIVE bu raporda takip edilmektedir.

Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei Vivo Passage 1.

  1. T. bir Kriyoprezerve stok (adlandırılır stabilate) çıkarın b. brucei suşu sıvı azot 9 (MTA aracılığıyla Hijyen ve Tropikal Tıp London School Profesörü John Kelly temin edilebilir) GVR35-VSL-2 ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Steril fosfat tamponlu glukoz tuz (PBS-G), pH 8.0 (1 L PBS + 15 g glukoz) 10, 2 x 10 4 tripanozomlar / ml stabilate seyreltilir.
    Not: T. b. brucei GVR35-VSL-2 insanlarda bulaşıcı olmayan ve SAPO deneyleri yürütmek için imkanları lisanslı gerektirir.
  2. enjvb 25 G iğne ile intraperitonal yoldan (İP) ile tripanozomlarına seyreltilmiş 0.2 ml 20-25 gram ağırlığında dişi CD1 fare. Bu "donör fare" dir. Belirli Patojen Free (SPF) -cage ve yem ad libitum içine enfekte fare yerleştirin.
    Not: CD1 fareler bir outbred zorlanma ve T. vardır b. brucei GVR35 enfeksiyonlar suşta iyi karakterize edilir. Ancak, bu protokol aynı zamanda doğal ya da genetiği değiştirilmiş suşları için geçerli olmakla birlikte, görüntüleme 6,9 hassasiyetine etkileyebilecek o kürk rengi dikkat etmek önemlidir.
  3. kan numunesi alarak periferik parasitemia izleyin. plastik süzgeç içine fare koyun ve 21 G iğne veya venesection ile venepunkturdan tarafından kuyruk kan 5 ul almak ve kırmızı kan hücreleri parçalanması ve daha kolay sayım sağlamak için% 0.85 steril amonyum klorür ile 1/10 karıştırın.
  4. Neubauer hemositometrede Seyreltilmiş Kan sayın.
    1. Her iki odalarına seyreltilmiş kan yükleyin. tüm merkez gr saymakbir odanın id n tripanozomlann vermek. Kan = n x 10 4 tripanozomlar / ml tripanozomlann konsantrasyonu, herhangi bir seyreltme faktörü ayarlamak ve iki odadan ortalamasını hesaplar.
      Not: Yaklaşık 5-7 gün sonra enfeksiyon, periferal parazitemi 2 x 10 4 tripanozomlar / ml'lik bir konsantrasyonda bir enfeksiyon gerçekleştirmek için yeterli artacaktır.
  5. tripanosom seviyeleri 1.6 adıma geçmek, gerekli farelerin sayısı için yeterince yüksek olduğunda. Bir verici bir fare 6 x 10 4 tripanozomlar / ml'lik bir parazit seviyesi 10 farelerin enfeksiyonu için yeterlidir.
    Not: istatistiksel olarak anlamlı bir grup boyutları için, n = 6 fare, her tedavi grubu için 8 ihtiyaç vardır. diğer enfeksiyon modeller için, güç hesapları uygun grup boyutlarını belirlemek için uygulanacak gerekir.
  6. (Yaklaşık 5-10 dakika 28-30 ° C'de) bir ısı kutusu içine yerleştirin fareler kuyruk damarları genişletmek için izin vermek.Terminal anestezi neden 20 mg / 25 G iğne ile kg pentobarbital iv yönetmek için. Onayla fare hafifçe hiçbir geri çekilme refleksi olmadığından emin olmak için, pedallar Sürüş Esnasında basılarak uyuşturulduktan.
  7. Bir Bijou tüpüne 5.000 USP birim / ml'de 5 mi heparin aliquoting ve bir 1 ml şırınga ucunda iğne üzerinden iki emerek, bir 21 G iğne Heparinize.
  8. heparinize 21 G iğne ile 1 ml şırınga alın ve göğüs kafesi altında merkezi iğne sokarak anestezi geçiş fare üzerinde kalp ponksiyon gerçekleştirin (kan boncuk iğne tabanında havuz olacak) ve yavaşça pistonu geri çekin böylece kalbin odasına daraltmak için değil. kan 0.7 ml az toplayın.
  9. Yukarıdaki adım 1.1 olarak PBS-G pH 8.0 içinde 2 x 10 4 tripanozomlar / ml'lik bir aşının üretilmesi için enfekte olmuş kan seyreltilir.
    Not: Bu noktada, geri kalan kan% 8 gliserol,% 20 ısıyla inaktive edilmiş cenin ca karıştırılarak stabilate üretilmesi için dondurularak saklanabilirEğer serumu (hi-FCS) ve% 72 enfekte kan. Yavaş yavaş sıvı azot aktarmadan önce, C / dk ° -1 soğutma hızını elde etmek için bir kap dondurma yavaş dondurma kullanılarak -80 ° C 'de dondurma.

Deneysel Fare 2. Enfeksiyon

  1. nazikçe ılık damarları genişletmek için bir ısıtma kutusu içine CD1 dişi fareler (~ 21-25 gr) yerleştirin. plastik kısıtlama içine ısıtılmış fareler yerleştirin ve fare başına 4.000 tripanozomlann eşdeğer kuyruk damar içine 25 G iğne ile damar 0.2 ml seyreltilmiş inokulum enjekte. Kanamayı durdurmak için daha sonra enjeksiyon yerinde basıncı yerleştirin.
    Karın içi enfeksiyon enfeksiyonun geçerli bir yol olduğunu ve daha önceki çalışmalarda 10 kullanılmıştır, ancak intravenöz yolla bu daha az tekrarlanabilir bulduk: edin.
  2. SPF-havalandırmalı kafeslerde 3'lü gruplar halinde enfekte fare ve kafesi Rastgele. Bir kontrol olarak, yabani tip olmayan biyolojik olarak ışık veren parazit, T ile CD1 dişi farelerin enjekte b. brucei GVR35 (n =3).
  3. Kan Film Mikroskopi sayesinde Enfeksiyon Monitör
    1. Noktası 5 ul bir cam lam üzerine venepunkturdan ya venesection kan ve (hafifçe ince bir film oluşturmak için bir slayt üzerinde kan damlayı ikinci cam slayt kullanılarak) kan yayma gerçekleştirin. kuru hava slaytlar bırakın.
    2. DH 2 O ile yıkamadan önce 10 dakika süreyle Giemsa ile% 100 metanol ve leke kan yayma düzeltmek ve kurumaya bırakın. 100X objektif altında görünümü (fov) 10 alanda tripanozomlann sayısını.
      Not: Kan çekim gibi erken bir gün sonrası enfeksiyon gibi bütün hayvan invaziv olmayan görüntüleme yanında yapılır. Hayvanlar, bir dizi işleme tabi tutarken numuneler, oda sıcaklığında saklanabilir ve daha sonra sayılabilir gibi, tripanosom kantitatif bu yöntem hemositometre sayımı tercih edilir.

3. Biyoparlaklık Görüntüleme Enfeksiyon iz

Not: enfeksiyon izlemek için, bütün animEl non-invaziv görüntüleme kullanılabilir.

  1. 30 mg / ml'de Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) D-lusiferin, ateşböceği lusiferaz alt-tabaka, bir stok çözelti hazırlayın. Filtre sterilize ve -20 ° C'de parçalar halinde dondurma.
    Not: D-luciferase duyarlı ışık, bu nedenle folyo alikotları sararak ışıktan korumak. Bu aktiviteyi 11 etkileyebilir olarak art arda luciferase-çözülme donma yok.
  2. Oda sıcaklığına kadar D-luciferase bir kısım ısıtın. (Nonbioluminescent vahşi tip parazit türü ile enfekte edilmiş kontrol farelerinde de dahil olmak üzere), kafesin her fare çıkarın ve intraperitonal 25 G iğne ile 150 mg / (DPBS içinde seyreltilmiş) ısıtıldı, D-luciferase kg enjekte edilir. / Dakika 2.5 L% 2 izofloran / O 2 karışımı ile anestezi sağlamak için yaklaşık 5 dakika boyunca, bir izofloran odasına fareler yerleştirin.
    Not: Onlar anestezi altında olduğunda Fareler hareketsiz hale gelir. Burada kullanılan kamera için, 3 fare, bir anda işlenebilir. farenin anesthet isedaha uzun bir süre 30 dakika yanıstarak, oftalmik merhem, yapay gözyaşı kurumasını farelerinin gözleri önlemek için uygulanabilir.
  3. Burada anlatılan görüntüleyici için Yazılımı açmak ve üreticinin talimatlarına göre yazılımı kullanarak makineyi başlat. Kamera ve ısıtmalı plaka sıcaklığı ulaştığında görüntü kazanır.
    Not: Bu cihaz, genellikle bir gecede arka plan kalibrasyonları yapmak için makinenin sağlayan kapalı değil. yeniden başlatmak gerekiyor durumunda, öncelikle bir kalibrasyon kontrolü çalıştırmanız gerekir.
  4. (3.5 bakınız) kamera içine anestezi fareler yerleştirin. herhangi bir parlak bioluminescent sinyal yoluyla kanama en aza indirmek için fareler arasında büyük siyah ayırıcılar kullanın. pozlama süreleri bir dizi kullanarak görüntü fareler; Görünüm E orta binning, 1 f / durdurma ve açık filtre ve alanla 1, 3, 10, 30, 60 ve 180 saniye, (12.5 x 12.5 cm 2).
    Not: vahşi tip nonbioluminescent GVR35 parazit ile enfekte kontrol fareleri bir backgr sağlamakound biyoparlaklık değer. Bu model ile, bir lusiferin kinetik deney (Şekil 6), biz 10 dakika biyoışıldama sinyal tepe Uygulamayı takip ve görüntüleme yaklaşık 3 fareler için 5 dakika sürer bulmuşlardır. anestezi ve fareler görüntüleme dikkate bu zaman ölçeği alın.
  5. Farelerin tam görüntüleme sağlamak için, ventral, dorsal ve lateral görünüm elde etmek için döndürün. ardışık hayvanlar arasındaki görüntüleme için oryantasyon sırayla tutarlılığı korumak.
  6. görüntüleme sonra fareler SPF-kafes dönmeden önce gözlem altında anestezi kurtarmak için izin verir.
  7. gün 21 sonrası enfeksiyon kadar her 7 gün fareler görüntüleme devam edin. tüm hayvan üzerinde biyoparlaklık sinyali istikrarlı bir artış olmalıdır.
  8. D21, görüntü ve kan filmi / kg diminazene aceturate intraperitonal 40 mg fareler, yukarıda tarif edilen ve bir doz olarak fareler. Bu ilaç periferik parasitemia silecektir ancak kan Brai geçmeyeceğimn bariyer ve bu nedenle MSS enfeksiyonu daha iyi görselleştirme sağlar.
    Not: Diminazene aceturate erken evre, hayvan trypanosomiasis tedavisi için kullanılan iyi bilinen bir ilaçtır.
  9. D28 ve D35 de görüntüleme ve izleme devam edin.

4. MSS Enfeksiyon Onaylama

  1. D35 'de, yukarıda açıklandığı gibi resim fareleri (3.1-3.4 adım).
  2. görüntüleme sonra, daha fazla analiz için kan toplama aşamasında 1.6-1.8 detaylı olarak farenin anestezi ve asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​farelerden kurtarmak için izin verir.
  3. kardiyak delme ardından, 20 ml PBS ile fareler serpmek (isteğe bağlı: 3 mg / perfüzyon çözüm luciferase ml ekleyin) organlara kan temizlemek ve zaman aralığındaki beyin bölgesi temizlenir olabilir luciferin etiketi reintroduce kalp yoluyla adım 4.1.
  4. Yavaşça beyin izin, kavisli makas kullanılarak kafatası çevresi etrafında tabanından kesme ve kafatasının üst kısmı kapalı kaldırarak beyin kaldırmakhafifçe kavisli bir forseps ile kaldırılması gerekir.
  5. Yeterli luciferase Kesilerek çıkarılan beynin eklendi sağlamak için, siyah plastik pipet önce görüntüleme organ üzerindeki 15 mg / ml lusiferin 50 ul bir bölümü üzerine Kesilerek çıkarılan beynin yerleştirin. Yukarıdaki ayarları kullanarak görüntü. Bu beyin hemisfer enfeksiyon lokalizasyonu gösterecektir.
    Not: Daha önce 8 açıklandığı gibi kesilmiştir beyin üzerinde parazitemi Mansap miktar qPCR yapılabilir. Diğer alternatif aşağı uygulamalar tespit sonucu beyin dokusunda parazitleri tespit etmek histoloji veya immünohistokimyasal içerebilir.

Biyoparlaklık Görüntüleme 5. kantitasyonu

Not: Biyoparlaklık görüntüleme yazılımı ile ilgi alanları (ROI) bölgesini kullanarak sayısal ve arka plan biyoparlaklık için düzeltilebilir.

  1. ROI aracını kullanarak, bütün hayvan kantitatif a için bir dikdörtgen ROI oluşturmaknd fare kuyruk tabanına burnunun ucunu kapatmak için fare resmin üzerine getirin. Her hayvan ve her zaman noktası için aynı boyutta kutusunu kullanın. beyin için ROI bakarken, görüntüdeki fare kafası bölge üzerinde konumlandırma, aynı şekilde dairesel ROI kullanın.
  2. İstenirse, enfeksiyon görsel gösterimi için aynı spektrum görüntülenmesini ayarlayın.
    Not: Burada kullanılan yazılım otomatik olarak minimum ve maksimum foton sayıları için ayarlanmış her bir görüntü için bir renk haritası oluşturur. görüntülerin bir dizi arasındaki görsel karşılaştırma etkinleştirmek için, renk skalası, tüm görüntüler için aynı değerlere ayarlanmalıdır.
    1. En yüksek biyolüminesans ve araç paleti üzerinde 'Görüntü ayarlamak' sekmesi ile görüntüyü kullanarak, logaritmik ölçek ve uygun bir renk skalası minimum ve maksimum (ampirik olarak tespit edilmesi) seçin. deney boyunca tüm görüntüleri bu ölçek uygulayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol T. ile farelerin enfeksiyonu takiben hastalığın ilerlemesini takip etmek nasıl gösterir b. brucei, insan Afrika trypanosomiasis için bir model. Şekil 1 tedavi ve görüntüleme aşamaları için takvimi gösteren deneysel protokol çizelgesini gösterir. 2 periferik parasitemia ölçmek için kullanılan sabit bir Giemsa lekeli kan yayması bakış tipik bir alanı gösterir Şekil, tripanozomlar ve kırmızı kan hücreleri ile mevcut. Hayvanlarda enfeksiyon gelişimi, her bir zaman noktasında görüntülü aynı hayvanlar ile bir deney boyunca enfekte hayvanlar gösteren Şekil 3 'deki gibi ışıldaması ölçülerek takip edilebilir. enfeksiyon sinyali daha dissemine ve yoğun hale geldikçe biyolüminesans bir artış BLI yüksek bölgeleri ile, ilk 21 gün içinde tüm hayvanlarda görülebilir seyri boyunca (kırmızı olarak temsildalak alanında) ısı haritası ölçeği. Şekil 1, post-görüntüleme ayrıntılı olarak D21 fareler diminazene aceturate ile tedavi edilir, ve periferik enfeksiyon temizlenir olarak biyolüminesans bir damla sinyalinin düşük düzeylerde farelerin baş bölgesinde mevcut olması ile, D28 de görülebilir at. D35 sinyal hala kafa bölgesinde kalır ve olası bir beyin enfeksiyonu gösteren daha yoğun hale gelmiştir. Beyin sinyali, beyin dokusu içinde mevcut olan ve daha sonra qPCR nicelendirilebilir onaylamak için eksize edilir.

Geleneksel olarak, kan lekeleri enfeksiyon gelişimi, ve tedavi etkileri miktarını belirlemek için kullanılır. Bununla birlikte, bu, sadece periferal parasitemia ölçebilir ve beyinde parazit seviyelerini değerlendirmek için kullanılamaz. 4 periferal parazitemya ve hastalık kinetiklerini göstermek için biyolüminesans hem kantitatif bir araya Şekil. D7 yüksek bir BLI sinyal 10 8 mevcut Şekil 3'te görüldüğü kafa bölgesinde biyolüminesans bir ölçüde devam . Bu geleneksel kan filmi sayma üzerine biyoparlaklık yaklaşımının daha fazla hassasiyet göstermektedir.

kafa bölgesinde biyolüminesans gerçekten beyinleri eksize deney ve biolumines sonunda, beyin dokusu lokalize olduğunu doğrulamak içinartmasına neden olmuştur, ex vivo (Şekil 5) ölçüldü. beyinleri arasındaki enfeksiyon yükü bir fark sık görülen ve sinyal enfekte hayvanların arasında değişebilir yoğun BLI sinyal dağıtımı gibi belirli anatomik bölgelerde lokalize görünmüyor. Fare 1 beyin beyinde üzerinde BLI sinyal genel dağılımını göstermektedir Örneğin, güçlü BLI sinyal, fare 2 ve 3'de ve fare 3 serebellum koku ampul bulunur. Beyinleri fareler itlaf hemen sonra görüntülü gibi, daha fazla analiz dokusu ex vivo görüntüleme işlemi hasar görmemiş olarak beyin dokusu üzerinde gerçekleştirilebilir.

Şekil 1
Şekil 1:. Görüntüleme, Örnekleme ve Tedavi dahil Deney Timeline nedeniyle biyoparlaklık görüntüleme non-invaziv doğası nedeniyle, enfeksiyon izleme mo oluşabilirşemada ayrıntılı genellikle daha yeniden. Numune alma ve görüntüleme her 7 günde bir ilerleme enfeksiyonun belirlenmesini mümkün kılmaktadır. diminazene aceturate ile D21 de tedavi baş ve beyin enfeksiyonu daha iyi görselleştirme izin periferik parasitemia kaldırır. Diminazene aceturate erken evre ilaçtır ve geç evre enfeksiyonu temizlemek için yeterli miktarda kan-beyin bariyerini geçmek mümkün değildir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:. Giemsa Lekeli tripanozomlann sabit kan filmde, Giemsa lekeli tripanozomlar (mavi, açık ok lekeli) kırmızı kan hücrelerine karşı saptanabilir kolayca ve hızlı bir şekilde sayısını elde etmek için sayılabilir (pembe çekirdekleri ile mor, ok kapalı) tripanozomlar / 10Bir 100X objektif altında görüş alanları. Ölçek çubuğu 10 mikron ifade eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: enfekte edilmiş farelerin Biyoparlaklık Görüntüleme VSL-2 (M = fare) ve (vahşi tip nonbioluminescent parazit hattı ile enfekte) vahşi tiple enfekte olmuş kontrol ile enfekte 6 bir grup farenin üç Örnek hayvanlar.. Luciferase Ayrıca, arka plan ölçümü sağlar görüntüleme öncesi kontrol fare uygulanmıştır. Bir ısı haritası ölçeği kırmızı, biyolüminesans yüksek seviyelerini gösteren parazitlerin yüksek sayılara denk ve mavi biyoparlaklık düşük seviyelerde (D = gün) göstermesi ile gösterilir. Kontrol fare hiçbir lusiferaz ifade parazitler ile beklendiği gibi hiçbir biyoparlaklık vardır. görüntü f rom Burrell-Saward ve ark., 8 Oxford University Press izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. Bölüm 5 ve kan smear parazitleri sayılarak hesaplanır periferal parazitemi tarif edildiği gibi biyolüminesans ve kan filmi parazitemi karşılaştırması her bir tam toplam hayvan biyoluminesans nicelendirildi. Hata çubukları, ortalamanın standart sapmayı belirtir. Burrell-Saward ve ark. 8 Oxford University Press izni ile görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54032 / 54032fig5.jpg "/>
Şekil 5:. 4.5 de tarif edildiği gibi Kesilerek çıkarılan beynin Ex vivo görüntüleme Şekil 3'de görüntülenmiştir farelerin perfüze beyinleri çıkarıldı ve görüntülenmiştir. Bio-ışıldama, Şekil 3, yabani tip nonbioluminescent parazitler ile enfekte olmuş bir fare kontrol beyin için bir ısı haritası ölçekte ölçülür de lusiferin ile muamele edildi ve hiçbir biyoışıldama gözlenebilir. Ölçek çubuğu 1 cm gösterir. Bu rakam, Oxford University Press izni ile Burrell-Saward ark. 8 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: VSL-2 ile enfekte olmuş farelerde Luciferase biyolüminesans kinetiği.Üç VSL-2 ile enfekte CD1 fareleri luciferase 150 mg / kg IP ile enjekte edilmiş ve görüntüleyici içinde hemen yerleştirilmiştir. Fareler 60 dakika boyunca görüntülendi ve onların biyolüminesans yönetimini luciferase sonra optimum görüntüleme penceresini belirlemek için hesaplandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir biyolojik olarak ışık veren T gelişimi b. brucei GVR35 suşu geç dönemde erken bir tripanozom enfeksiyon görselleştirme sağlar. Önceki enfeksiyon modelleri parazitler beyin olduğunda kan filmi mikroskopi gerçek zamanlı olarak, geç evre tespit koyamadık ve parazit yükünün 12 belirlemek için enfekte farelerin beyinleri seçilmesini ve çıkarılması gerekti. tek bir fare enfeksiyon bütünlükleri içinde ve herhangi bir aşamada gözlemlenebilir enfeksiyonun hızlı bir nicel değerlendirme süresi boyunca takip edilebilir biyoışıldama arası fare değişkenliği azaltır. Biyoparlaklık görüntüleme son derece hassas bir yöntem düşük seviyeli enfeksiyon mikroskobu ile 9 arasındaki ml saptanabilir 5 x 10 3 tripanozomlann / kıyasla görüntüleme yoluyla saptanabilir olduğunca az 100 olarak tripanozomlann ile kan film mikroskopi daha önce tespit edilmesini sağlar. Buna ek olarak, deney boyunca aynı hayvanlar, aşağıdaki ortadanbüyük ölçüde hayvan kullanımını azaltma her zaman noktası için ayrı hayvan grupları için ihtiyaç s.

Burada açıklanan görüntüleme protokolü non-invaziv doğası ek ve daha sık görüntüleme (uygun hayvan etiği onayı ile) yapılabilir anlamına gelir gibi bilimsel ihtiyaca uygun şekilde adapte, ama beyin enfeksiyonu D21 değerlendirilmesi için erken bir zaman olabilir puan. Bu noktada, erken evre ilaçlar artık geç aşama parazitleri temizlemek etkilidir. Fareler, her zaman noktasında, aynı koşullar altında görüntülenmiş olduğu da zorunludur. Örneğin, aynı pozlama süreleri ve (ventral veya dorsal) aynı görünüm enfeksiyonu elbette doğru ölçümü sağlamak için kullanılmalıdır.

(Modelin bir enfeksiyon olması gerektiği bilindiği zaman) hiçbir sinyal görüntüleme mevcut sırasında, sorunun kaynağını belirlemek için takip edilebilir adımlar bir dizi vardır. Öncelikle, pozlama süresi artabilirÇok düşük biyoparlaklık sinyali tespit etmek mümkün olmalıdır 5 dakika maksimum. Sinyal hala tespit ve kan filmler parazit için pozitif değilse, bir sonraki adım parazit hala bioluminescent olup olmadığını teyit etmek olacaktır. Bu, ticari bir in vitro lusiferaz aktivitesi tahlili kullanılarak ve biyoışıldama bir luminometre kullanılarak tespit edilecektir tarafından gerçekleştirilebilir. Bu noktada parazit artık biyolojik olarak ışık veren ise, parazit olarak yapının stabilitesi ele alınması gerekir.

Yayılan biyolüminesans koyu kürk ve deri 6,9 ile zayıflatılmış olarak farelerin renk görüntüleme duyarlılığı fark yaratıyor. Böyle beyaz fareler ya da çıplak fareler olarak fare suşu seçimi, bu nedenle sonuçları artırabilir. Fare rengi engelleniyorsa, bir transgenik hattın kullanımı ile, örneğin, daha sonra tıraş ya da büyük ölçüde duyarlılığı 6 artırabilir ilgilenilen bir bölgesinden fareler tüylerini giderildikten.

denispet geliştirilmiş duyarlılık ve (Şekil 4'te gösterilen günler 7-21) biyolüminesans doğrudan kan filmlerde gözlenen periferik parasitemia için ilişkili değildir, bu bioluminescent modeli üretiyor sinyal. Literatür, trypanosomiasis erken aşamasında enfeksiyon hemolymphatic sistemi 1 enfekte olduğunu belgelemiştir ve yalnızca kan sistemi ile sınırlı değildir ve periferik parazitemi damla kan zorlukla saptanabilir, bu, periferal organların enfeksiyonu ile birlikte açıklayabilir Şekil 3 ve 4 gün 7 verilerinden özel olarak görüldüğü gibi biyoışıldama görülebilir. Ancak bu, biyoışıldama görüntüleme sadece enfeksiyon niteliksel ölçümü olarak kullanılabilir ve daha fazla analiz mutlak parazit yükünü belirlemek için gerekli olduğu anlamına gelir.

Biyoparlaklık görüntüleme mo zor olan diğer bulaşıcı patojenlerle kullanılan yeteneğine sahiptirNITOR, Chagas hastalığı, sıtma ve toksoplazmoz kemirgen modelleriyle daha önce 13-16 kurulmuştur. biyolüminesans yüksek sinyal-gürültü oranı o değerli bir araç yapma, daha hassas, non-invaziv ilaç değerlendirmesini yanı sıra MSS enfeksiyonu kinetik daha iyi bir anlayış elde edebilirsiniz gerçek zamanlı enfeksiyonları izlemek için yeteneği ile birleştiğinde bulaşıcı hastalık araştırması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz T. sağlamak için John Kelly ve Martin Taylor (Hijyen ve Tropikal Tıp London School) teşekkür ederim b. brucei GVR35-VSL-2 ve in vivo görüntüleme tavsiye için Dr. Andrea Zelmer (LSHTM). Bu çalışma Bill ve Melinda Gates Vakfı Küresel Sağlık Programı (hibe sayısı OPPGH5337) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375, (9709), 148-159 (2010).
  2. Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137, (14), 1995-2006 (2010).
  3. Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152, (8), 1155-1171 (2007).
  4. Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6, (9), 1037-1047 (2011).
  5. Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75, (2), 143-153 (1977).
  6. Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35, (2), 360-394 (2011).
  7. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, (6), 537-540 (2005).
  8. Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70, (2), 510-517 (2015).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, (11), e2571 (2013).
  10. Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51, (4), 381-388 (2002).
  11. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
  12. Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56, (4), 321-324 (2007).
  13. Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295 (2012).
  14. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (32), 11468-11473 (2005).
  15. Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7, (6), 837-848 (2005).
  16. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16, (9), 1285-1300 (2014).
Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter