Protocol
أخلاق
ونفذت كل عمل خارج بموجب موافقة من المملكة المتحدة وزارة الداخلية الحيوانات (الإجراءات العلمية) لسنة 1986 ومدرسة لندن للصحة والطب الاستوائي رعاية الحيوان ومجلس مراجعة الأخلاق. صلوا اليها التوجيهي المتبعة في هذا التقرير.
1. في فيفو مرور إضاءة الحيوية المثقبية البروسية البروسية
- إزالة الأسهم cryopreserved (وهو ما يسمى stabilate) ت. ب. البروسية سلالة GVR35-VSL-2 (متوفر من البروفيسور جون كيلي في مدرسة لندن للصحة والطب الاستوائي من خلال MTA) 9 من النيتروجين السائل وتسمح للتوازن في درجة حرارة الغرفة. تمييع stabilate إلى 2 × 10 4 المثقبيات / مل في العقيمة الفوسفات الجلوكوز المالحة (PBS-G) ودرجة الحموضة 8.0 (1 لتر برنامج تلفزيوني + 15 جرام جلوكوز) 10.
ملاحظة: T. ب. البروسية GVR35-VSL-2 هو غير معد للإنسان ويتطلب سابو المرخص التسهيلات لإجراء التجارب. - ينجإلخ 20-25 غ أنثى CD1 الفأر مع 0.2 مل مخففة المثقبيات عبر الطريق داخل الصفاق (IP) مع إبرة 25 G. هذا هو "الماوس المانحة". ضع الماوس المصاب الى المحددة الممرض الحرة (SPF) -cage والأعلاف الإرضاع بحسب الرغبة.
ملاحظة: الفئران CD1 هي سلالة الأباعد وT. ب. تتميز جيدا العدوى البروسية GVR35 في هذه السلالة. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول ينطبق أيضا على السلالات الفطرية أو المعدلة وراثيا، ولكن من المهم أن نلاحظ أن لون الفراء قد تؤثر على حساسية التصوير 6،9. - رصد الطفيل الطرفية عن طريق اخذ عينات الدم. ضع الماوس إلى رادع البلاستيك واتخاذ 5 ميكرولتر من الدم من الذيل بواسطة بزل الوريد مع 21 G إبرة أو فصد ومزيج 10/01 مع 0.85٪ كلوريد الأمونيوم العقيمة إلى ليز خلايا الدم الحمراء والسماح أسهل العد.
- عد الدم المخفض في نويباور عدادة الكريات.
- تحميل الدم المخفف في كلا المجلسين. عدد غرام المركزي بأكملهمعرف غرفة واحدة لإعطاء المثقبيات ن. تركيز المثقبيات في الدم = ن × 10 4 المثقبيات / مل، وضبط أي عامل التخفيف وحساب متوسط الغرفتين.
ملاحظة: بعد ما يقرب من 5-7 أيام بعد الإصابة، يجب أن ترتفع الطفيل الطرفية بما فيه الكفاية لإجراء العدوى بتركيز 2 × 10 4 المثقبيات / مل.
- تحميل الدم المخفف في كلا المجلسين. عدد غرام المركزي بأكملهمعرف غرفة واحدة لإعطاء المثقبيات ن. تركيز المثقبيات في الدم = ن × 10 4 المثقبيات / مل، وضبط أي عامل التخفيف وحساب متوسط الغرفتين.
- عندما تكون مستويات المثقبيات مرتفعة بما فيه الكفاية لعدد من الفئران المطلوبة، والانتقال إلى الخطوة 1.6. مستوى الطفيل من 6 × 10 4 المثقبيات / مل في الماوس مانح واحد يكفي لإصابة 10 الفئران.
ملاحظة: للحصول على أحجام مجموعة ذات دلالة إحصائية، ن = 6 لكل مجموعة العلاج من الفئران هناك حاجة إلى 8. لنماذج أخرى من العدوى، وسوف تحتاج ليتم تطبيقها لتحديد أحجام المجموعة المناسبة حسابات السلطة. - مكان الفئران في مربع الحرارة (في 28-30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 5-10 دقيقة) للسماح للأوردة الذيل لتمدد.للحث على تخدير المحطة وإدارة 20 ملغ / كغ في الوريد بنتوباربيتال مع إبرة 25 G. هو تخدير تأكيد الماوس عن طريق بلطف الضغط على قطاع الطرق لضمان عدم وجود رد فعل الانسحاب.
- يعالج بالهيبارين 21 G الإبرة aliquoting 5 مل الهيبارين في 5000 USP وحدة / مل في أنبوب بيجو وامتصاص مرتين في والخروج من إبرة تعلق على حقنة 1 مل.
- خذ heparinized 21 G إبرة وحقنة 1 مل، وإجراء ثقب في القلب على الماوس مرور تخدير عن طريق إدخال إبرة مركزيا تحت القفص الصدري (سوف حبة من الدم يتجمع في قاعدة الإبرة) وسحب بلطف مرة أخرى على المكبس حتى لا تنهار الغرفة من القلب. جمع ما لا يقل عن 0.7 مل من الدم.
- تمييع الدم الملوث لإنتاج اللقاح من 2 × 10 4 المثقبيات / مل في برنامج تلفزيوني-G 8.0 درجة الحموضة كخطوة 1.1 أعلاه.
ملاحظة: عند هذه النقطة، والدم المتبقية يمكن cryopreserved لإنتاج stabilate عن طريق خلط مع 8٪ الجلسرين، و 20٪ الحرارة المعطل كاليفورنيا الجنينمصل LF (مرحبا FCS) و 72٪ دم المصاب. تجميد ببطء في -80 درجة مئوية باستخدام بطء تجميد تجميد حاوية لتحقيق معدل تبريد -1 ° C / دقيقة، قبل ان ينتقل الى النيتروجين السائل.
2. إصابة فئران التجارب
- وضع CD1 الفئران الإناث (~ 21-25 ز) في مربع التدفئة إلى الحارة بلطف لتمدد الأوردة. وضع الفئران تحسنت الى ضبط النفس البلاستيك وحقن 0.2 مل اللقاح المخفف عن طريق الوريد مع إبرة G 25 إلى الوريد الذيل، أي ما يعادل 4000 المثقبيات في الماوس. وضع الضغط في موقع الحقن بعد ذلك لوقف النزيف.
ملاحظة: العدوى داخل الصفاق هو طريق صحيح للعدوى، واستخدمت في الدراسات السابقة 10، ولكن وجدنا هذا أقل استنساخه من طريق الوريد. - بطريقة عشوائية الفئران المصابة وقفص في مجموعات من 3 في أقفاص تنفيس SPF. كعنصر تحكم، وضخ CD1 إناث الفئران مع نوع البرية الطفيلي غير إضاءة الحيوية، T. ب. البروسية GVR35 (ن =3).
- مراقبة العدوى عن طريق الدم السينمائي المجهر
- بقعة 5 الدم ميكرولتر من بزل الوريد أو فصد على شريحة زجاجية وإجراء المسحة الدم (باستخدام شريحة زجاجية الثانية دفع بلطف قطرة من الدم عبر الشريحة لإنتاج طبقة رقيقة). تسمح الشرائح للهواء الجاف.
- إصلاح مسحة الدم مع الميثانول بنسبة 100٪ وصمة عار مع بالغيمزا لمدة 10 دقيقة قبل الشطف مع DH 2 O والسماح للهواء الجاف. تحت الهدف 100X حساب عدد من المثقبيات في 10 مجالات (فوف) الرأي.
ملاحظة: يتم تصوير الدم خارج جنبا إلى جنب مع كل الحيوانات التصوير موسع في وقت مبكر من يوم واحد بعد الإصابة. عند معالجة عدد من الحيوانات، ويفضل هذا الأسلوب من الكميات المثقبيات على العد عدادة الكريات كما يمكن تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة، وعدها في وقت لاحق.
3. ضوء بارد التصوير لتتبع العدوى
ملاحظة: لمراقبة العدوى، أنيم كلهآل التصوير غير الغازية يمكن استخدامها.
- إعداد محلول المخزون من D-وسيفيرين، ووسيفيراز الركيزة يراعة، في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) في 30 ملغ / مل. فلتر تعقيم وتجميد في aliquots في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: D-وسيفيرين غير الحساسة للضوء، وبالتالي حمايته من الضوء من خلال التفاف قسامات في احباط. لا تجميد ذوبان الجليد بشكل متكرر وسيفيرين لأنها يمكن أن تؤثر على النشاط 11. - تدفئة قسامة من D-وسيفيرين إلى درجة حرارة الغرفة. إزالة كل فأر من القفص (بما في ذلك السيطرة على الفئران المصابة مع nonbioluminescent نوع السلالة البرية الطفيلي) وحقن 150 ملغ / كغ من حرارة D-وسيفيرين (المخفف في DPBS) البريتونى مع إبرة 25 G. وضع الفئران الى غرفة آيزوفلوران لحوالي 5 دقائق للحث على التخدير مع 2٪ آيزوفلوران / O مزيج 2 في 2.5 لتر / دقيقة.
ملاحظة: الفئران تصبح قادرة على الحركة عندما تكون تحت التخدير. لتصوير المستخدمة هنا، 3 الفئران يمكن معالجتها في وقت واحد. إذا الفئران هي anesthetأوتوماتيكية لمدة أطول من 30 دقيقة، ويمكن تطبيقها في طب العيون مرهم المسيل للدموع اصطناعية لمنع أعين الفئران من الجفاف. - لتصوير الموصوفة هنا، افتح البرنامج وتهيئة الجهاز باستخدام البرنامج حسب تعليمات الشركة الصانعة. الحصول على صور مرة واحدة الكاميرا ولوحة ساخنة وصلت درجة الحرارة.
ملاحظة: هذا الصك لا تحول عادة خارج، مما يتيح للجهاز لأداء المعايرة الخلفية بين عشية وضحاها. في حال أنه يحتاج إلى إعادة تشغيل، فإنه يجب إجراء فحص معايرة لأول مرة. - وضع الفئران تخدير في تصوير (انظر 3.5). استخدام فواصل سوداء كبيرة بين الفئران لتقليل النزف من خلال من أي إشارة للإضاءة الحيوية مشرق. الفئران صورة باستخدام مجموعة من التعرض مرات. 1، 3، 10، 30، 60 و 180 ثانية، مع binning المتوسطة (1)، و / إيقاف وعامل تصفية مفتوحة، ومجال الرؤية E (12.5 X 12.5 سم 2).
ملاحظة: السيطرة على الفئران المصابة مع النوع البري طفيليات GVR35 nonbioluminescent توفر backgrالقيمة تلألؤ بيولوجي س اوند. من تجربة حركية وسيفيرين (الشكل 6) مع هذا النموذج، وجدنا أن القمم إشارة تلألؤ بيولوجي في 10 دقيقة بعد إدارة والتصوير يستغرق حوالي 5 دقائق لمدة 3 الفئران. خذ هذا الجدول الزمني في الاعتبار عند التخدير والتصوير الفئران. - لضمان تصوير دقيق للفئران، وتناوب على الحصول على بطني، ظهري وجهة النظر الجانبي. المحافظة على تناسق في ترتيب التوجه للتصوير بين الحيوانات متتابعة.
- بعد التصوير، والسماح الفئران للتعافي من التخدير تحت المراقبة قبل ان يعود الى SPF-القفص.
- مواصلة التصوير الفئران كل 7 أيام حتى يوم 21 بعد الإصابة. يجب أن تكون هناك زيادة مطردة في إشارة تلألؤ بيولوجي على الحيوانات بأكمله.
- في D21، صورة وفيلم دم الفئران كما هو موضح أعلاه، وجرعة الفئران مع 40 ملغ / كغ diminazene aceturate البريتونى. وهذا الدواء مسح الطفيل الطرفية ولكن لن تعبر الدم المخن الحاجز، وبالتالي يمكن تصور أفضل للإصابة الجهاز العصبي المركزي.
ملاحظة: Diminazene aceturate دواء راسخة يستخدم لعلاج المرحلة المبكرة من داء المثقبيات الحيوانية. - تواصل التصوير والمراقبة في D28 و D35.
4. تأكيد الجهاز العصبي المركزي العدوى
- في D35، الفئران الصورة على النحو المفصل أعلاه (خطوات 3،1-3،4).
- بعد التصوير، والسماح الفئران للتعافي من التخدير ويستنزف الفئران كما هو موضح في الخطوة 1،6-1،8، وجمع الدم لمزيد من التحليل.
- بعد ثقب في القلب، يروي الفئران مع 20 مل PBS (اختياري: إضافة 3 ملغ / مل من وسيفيرين إلى حل التروية) عن طريق القلب لمسح الدم من الأجهزة ولإعادة تسمية وسيفيرين التي قد مسح من منطقة في الدماغ خلال فترة زمنية من الخطوة 4.1.
- إزالة بلطف الدماغ، وذلك باستخدام مقص منحنية، وقطع من القاعدة حول محيط الجمجمة، ورفع قبالة الجزء العلوي من الجمجمة، للسماح للدماغمن المقرر أن يرفع برفق مع ملقط المنحنية.
- وضع الدماغ رفعه على جزء من البلاستيك الأسود وماصة 50 ميكرولتر من 15 ملغ / مل وسيفيرين على الجهاز قبل التصوير، لضمان تمت إضافة وسيفيرين كافية إلى الدماغ رفعه. الصورة باستخدام الإعدادات على النحو الوارد أعلاه. هذا وسوف تظهر توطين العدوى إلى نصفي الدماغ.
ملاحظة: الكمي المصب من الطفيل على الدماغ رفعه يمكن أن تقوم بها QPCR كما هو موضح سابقا 8. ويمكن أن تشمل التطبيقات المصب بديلة أخرى الأنسجة أو المناعية للتعرف على الطفيليات في أنسجة المخ بعد التثبيت.
5. الكميات من تلألؤ بيولوجي التصوير
ملاحظة: تلألؤ بيولوجي يمكن قياسها كميا باستخدام المنطقة ذات الاهتمام (ROI) مع برنامج التصوير وتصحيح للتلألؤ بيولوجي الخلفية.
- باستخدام أداة العائد على الاستثمار، وخلق العائد على الاستثمار مستطيلة للحيوان كامل الكميات لالثانية وضعه فوق الصورة الماوس لتغطية طرف الأنف إلى قاعدة الذيل من الفأرة. استخدام نفس مربع حجم كل حيوان وكل نقطة زمنية. عند النظر إلى العائد على الاستثمار للدماغ، واستخدام العائد على الاستثمار دائرية في نفس الطريق، وذلك لتحديد المواقع على الماوس منطقة الرأس في الصورة.
- إذا رغبت في ذلك، وضبط الصور لتظهر على نفس الطيف لتمثيل مرئي للعدوى.
ملاحظة: البرامج المستخدمة هنا يولد خريطة ملونة لكل صورة تعديله تلقائيا عن التهم الحد الأدنى والحد الأقصى الفوتون. لتمكين المقارنة البصرية بين سلسلة من الصور، لا بد من وضع جدول اللون لنفس القيم لجميع الصور.- باستخدام صورة مع أعلى تلألؤ بيولوجي وعلامة التبويب "صورة ضبط" على لوحة الأداة، حدد مقياس لوغاريتمي والحد الأدنى مقياس اللون المناسب والحد الأقصى (يتم تحديدها تجريبيا). تطبيق هذا المقياس على جميع الصور في كافة مراحل التجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح هذا البروتوكول كيفية متابعة تطور المرض بعد الإصابة من الفئران مع T. ب. البروسية، نموذجا لداء المثقبيات الأفريقي البشري. ويبين الشكل (1) والجدول الزمني للبروتوكول تجريبي، مما يدل على جدول زمني للعلاج والتصوير الخطوات الشكل 2 يوضح حقل نموذجي نظر في بقعة من الدم ملطخة بالغيمزا الثابتة المستخدمة ل quantitate الطفيل الطرفية، مع المثقبيات وخلايا الدم الحمراء الحاضر. تطور العدوى في الحيوانات يمكن اتباعها عن طريق قياس تلألؤ بيولوجي كما في الشكل (3)، مما يدل على الحيوانات المصابة على مدار تجربة مع الحيوانات نفسها تصويرها في كل نقطة زمنية. من خلال مسار العدوى زيادة في تلألؤ بيولوجي يمكن ملاحظتها في جميع الحيوانات على مدى 21 يوما الأولى عندما تصبح إشارة أكثر نشرها ومكثفة، مع مناطق عالية من BLI (ممثلة بالحمرةمن على الخريطة مقياس الحرارة) في منطقة الطحال. في تعامل الفئران D21 مع diminazene aceturate كما هو موضح في الشكل رقم 1، في مرحلة ما بعد التصوير، وانخفاض في تلألؤ بيولوجي يمكن ملاحظتها في D28 أن يتم مسح العدوى الطرفية، مع مستويات منخفضة من إشارة التواجد في منطقة الرأس من الفئران. في D35 إشارة لا يزال في منطقة الرأس وأصبح أكثر كثافة مما يدل على إصابة الدماغ ممكن. يتم استئصاله الدماغ لتأكيد إشارة موجودة داخل أنسجة المخ ويمكن بعد ذلك quantitated التي كتبها QPCR.
تقليديا، يتم استخدام مسحات الدم ل quantitate تطور العدوى وآثار العلاج. ومع ذلك، هذه فقط قياس الطفيل الطرفية، والتي لا يمكن استخدامها لتقييم مستويات الطفيليات في الدماغ. الشكل 4 يجمع بين الكميات من كل من الطفيل الطرفية وتلألؤ بيولوجي لإظهار حركية المرض. في D7 إشارة BLI عالية موجودة من 10 8 الشكل (3) وهذا يدل على حساسية أكبر للنهج تلألؤ بيولوجي على العد فيلم الدم التقليدية.
للتحقق من أن تلألؤ بيولوجي في منطقة الرأس وأنك تؤسس حقا لأنسجة المخ، في نهاية التجربة يتم استئصال العقول وbioluminesقياس cence خارج الجسم الحي (الشكل 5). وهناك فرق في عبء العدوى بين أدمغة غالبا ما ينظر ولا تظهر إشارة إلى توطين في مناطق تشريحية معينة وتوزيع إشارة BLI الشديدة يمكن أن تختلف بين الحيوانات المصابة. على سبيل المثال، إشارة BLI قوية موجودة في البصلة الشمية في الماوس 2 و 3 و في المخيخ في الماوس 3، في حين أن الدماغ من الماوس 1 يبين التوزيع العمومي للإشارة BLI في جميع أنحاء الدماغ. كما يمكن تصوير أدمغة مباشرة بعد اعدام الفئران، يمكن إجراء مزيد من التحليلات لأنسجة المخ، ما لم تلف الأنسجة في الجسم الحي عملية التصوير السابقين.
الشكل 1: الجدول الزمني للتجربة بما في ذلك التصوير، أخذ العينات والعلاج نظرا لطبيعة غير الغازية التصوير تلألؤ بيولوجي، ومراقبة العدوى يمكن أن يحدث موإعادة كثير من الأحيان من المفصل في الرسم البياني. أخذ العينات والتصوير كل 7 أيام تمكن التعرف على عدوى التقدم. العلاج في D21 مع aceturate diminazene يزيل الطفيل الطرفية للسماح التصور أفضل للإصابة الرأس والدماغ. aceturate Diminazene هي مرحلة المخدرات في وقت مبكر وغير قادرة على اجتياز حاجز الدم في الدماغ بكميات كافية لمسح العدوى مرحلة متأخرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المثقبيات بالغيمزا الملون المثقبيات على الفيلم الدم ثابتة، بالغيمزا الملون (اللون الأرجواني مع نوى الوردي، وأغلق السهم) هي بسهولة كشفها ضد خلايا الدم الحمراء (الملون الأزرق، وفتح السهم) ويمكن عدها بسرعة للحصول على عدد من المثقبيات / 10الحقول نظر تحت الهدف 100X. شريط مقياس يدل 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): ضوء بارد التصوير من الفئران المصابة ثلاثة الحيوانات ممثل عن مجموعة من 6 الفئران المصابة VSL-2 (M = الماوس) والتحكم المصابة النوع البري (المصابين النوع البري خط الطفيلي nonbioluminescent). كانت تدار وسيفيرين أيضا على الماوس السيطرة قبل التصوير، والتي تنص على قياس الخلفية. ويرد مقياس الخريطة الحرارة مع الأحمر يشير إلى مستويات عالية من تلألؤ بيولوجي، ما يعادل أعداد كبيرة من الطفيليات، واللون الأزرق يدل على مستويات منخفضة من تلألؤ بيولوجي (D = اليوم). الماوس التحكم لديه أي تلألؤ بيولوجي كما هو متوقع مع عدم وجود طفيليات، معربا عن وسيفيراز. صورة و مدمج بوريل-Saward وآخرون. 8 بإذن من مطبعة جامعة أكسفورد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كان quantitated مقارنة ضوء بارد والدم السينمائي الطفيل تلألؤ بيولوجي مجموع كل حيوان كله على النحو المبين في المادة 5 والطفيل الطرفية quantitated عن طريق عد الطفيليات في مسحات الدم: الرقم 4. أشرطة الخطأ دلالة على الانحراف المعياري عن المتوسط. صورة من بوريل-Saward وآخرون. 8 بإذن من مطبعة جامعة أكسفورد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54032 / 54032fig5.jpg "/>
الرقم 5: فيفو السابقين التصوير من رفعه الدماغ وإزالة العقول perfused الفئران تصويرها في الشكل (3) وتصوير كما هو موضح في 4.5. يتم قياس تلألؤ بيولوجي على مقياس الخريطة الحرارة وعن الشكل 3. الدماغ السيطرة من ماوس المصابين النوع البري طفيليات nonbioluminescent كان يعالج أيضا مع وسيفيرين ولا تلألؤ بيولوجي يمكن ملاحظتها. شريط مقياس يدل على 1 سم. تم تعديل هذا الرقم من بوريل-Saward وآخرون. 8 بإذن من مطبعة جامعة أكسفورد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: حركية وسيفيرين ضوء بارد في الفئران المصابة VSL-2.تم حقن الفئران ثلاثة CD1 المصابة VSL-2 مع 150 ملغ الملكية الفكرية / كغ من وسيفيرين ووضعها مباشرة داخل تصوير. تم تصوير الفئران أكثر من 60 دقيقة ومحسوبة تلألؤ بيولوجي لتحديد نافذة التصوير الأمثل بعد وسيفيرين الإدارة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تطوير T. إضاءة الحيوية ب. البروسية GVR35 سلالة يسمح التصور من عدوى المثقبيات من أوائل وأواخر المرحلة. وكانت النماذج عدوى سابقة لم تكتشف مرحلة متأخرة، عندما الطفيليات في الدماغ، في الوقت الحقيقي من المجهري فيلم الدم، وتتطلب عملية الاعدام وإزالة العقول من الفئران المصابة لتحديد عبء طفيلي 12. تلألؤ بيولوجي يقلل من التباين بين الماوس كما يمكن تتبع ماوس واحدة طوال مجمل العدوى وتقييم نوعي سريع العدوى يمكن ملاحظتها في أي مرحلة. طريقة حساسة للغاية من التصوير تلألؤ بيولوجي يمكن العدوى ذات المستوى المنخفض الكشف عن هويته في وقت سابق من المجهري الدم الفيلم، مع عدد قليل من 100 المثقبيات اكتشافها من خلال التصوير بالمقارنة مع 5 × 10 3 المثقبيات / كشف مل من خلال الفحص المجهري 9. وبالإضافة إلى ذلك، في أعقاب الحيوانات نفسها في كافة مراحل التجربة القضاءق الحاجة إلى المجموعات الحيوانية منفصلة عن كل نقطة زمنية، والحد بشكل كبير من استخدام الحيوان.
بروتوكول التصوير الموصوفة هنا يمكن تكييفها لتتناسب مع الحاجة العلمية حيث أن طبيعة غير الغازية يعني أن التصوير إضافية وأكثر تواترا يمكن القيام بها (مع موافقة أخلاقيات الحيوان المناسب)، ولكن لتقييم D21 إصابة الدماغ هو اقرب وقت نقطة. في هذه المرحلة، والمخدرات مرحلة مبكرة لم تعد فعالة في إزالة الطفيليات مرحلة متأخرة. ومن الضروري أيضا أن يتم تصوير الفئران في ظل نفس الظروف في كل نقطة زمنية. على سبيل المثال، مرات التعرض نفس وجهة النظر نفسها (بطني أو ظهري) يجب أن تستخدم لضمان القياس الدقيق لمسار العدوى.
إذا أثناء تصوير أي إشارة موجود (عندما يعرف أن هذا النموذج يجب أن يكون وجود عدوى)، وهناك عدد من الخطوات التي يمكن اتباعها لتحديد مصدر المشكلة. أولا، وقت التعرض يمكن زيادةإلى حد أقصى قدره 5 دقائق والتي ينبغي أن تكون قادرة على الكشف منخفضة للغاية إشارة تلألؤ بيولوجي. إذا لم يتم الكشف عن إشارة والأفلام الدم إيجابية للطفيل، فإن الخطوة التالية هي لتأكيد ما إذا كان طفيلي لا يزال إضاءة الحيوية. يمكن أن يتم ذلك عن طريق استخدام في المختبر وسيفيراز النشاط فحص التجاري، وسوف يتم الكشف عن تلألؤ بيولوجي باستخدام luminometer. إذا في هذه المرحلة الطفيل لم يعد للإضاءة الحيوية، سوف تحتاج إلى أن تعالج الاستقرار للبناء في الطفيل.
لون الفئران فرقا لحساسية التصوير كما هو الموهن تلألؤ بيولوجي المنبعثة من الفراء الداكن والجلد 6،9. اختيار سلالة الماوس، مثل الفئران البيضاء أو الفئران عارية، وبالتالي، يمكن تحسين النتائج. إذا تم تقييد لون الماوس، على سبيل المثال عن طريق استخدام خط المعدلة وراثيا، ثم حلق أو السماط الفئران في المنطقة من الفائدة يمكن أن تحسن كثيرا من حساسية 6.
ديرغم تحسن الحساسية وإشارة هذا النموذج للإضاءة الحيوية التي تنتج، وتلألؤ بيولوجي لا ترتبط مباشرة إلى الطفيل الطرفية لوحظ في الأفلام الدم (أيام 7-21 هو مبين في الشكل 4). وقد وثقت الأدب أن العدوى مرحلة مبكرة من داء المثقبيات يصيب نظام hemolymphatic 1، ولا يقتصر فقط على نظام الدم وهذا، جنبا إلى جنب مع إصابة الأجهزة الطرفية، قد يفسر لماذا عندما الطفيل الطرفية هو اكتشاف بالكاد في أفلام الدم، تلألؤ بيولوجي واضح كما هو واضح بشكل خاص من البيانات ليوم 7 في الشكل 3 و 4. هذا، ومع ذلك، لا يعني أن التصوير تلألؤ بيولوجي يمكن استخدامها فقط كمقياس النوعي للعدوى، وهناك حاجة إلى مزيد من التحليل لتحديد عبء طفيلي المطلق.
التصوير تلألؤ بيولوجي لديه القدرة على أن تستخدم مع مسببات الأمراض المعدية الأخرى التي يصعب موnitor، مع نماذج من القوارض من مرض شاغاس والملاريا وداء المقوسات التي أنشئت بالفعل 13-16. ارتفاع نسبة تلألؤ بيولوجي الإشارة إلى الضوضاء يقترن مع قدرته على تتبع العدوى في الوقت الحقيقي يمكن تقديم تقييم المخدرات أكثر حساسية غير الغازية، وكذلك الحصول على فهم أفضل للحركية عدوى الجهاز العصبي المركزي، مما يجعلها أداة قيمة في بحوث الأمراض المعدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر جون كيلي ومارتن تايلور (مدرسة لندن للصحة والطب الاستوائي) لتوفير T. ب. البروسية GVR35-VSL-2 والدكتور أندريا Zelmer (LSHTM) لتقديم المشورة بشأن تصوير في الجسم الحي. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بيل وميليندا غيتس المؤسسة العالمية الصحة (عدد المنح OPPGH5337).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma, UK | P4417 | tablets pH 7.4 |
| Glucose | Sigma, UK | G8270 | 99.5% (molecular) grade |
| Ammonium chloride | Sigma, UK | A9434 | 99.5% (molecular) grade |
| Heparin (lithium salt) | Sigma, UK | H0878 | |
| Hi-FCS | Gibco, Life Technologies, UK | 10500-064 | 500 ml |
| DPBS | Sigma, UK | D4031 | Sterile filtered |
| Mr. Frosty | Nalgene, UK | ||
| Giemsa | Sigma, UK | G5637 | |
| D-Luciferin | Perkin Elmer, UK | ||
| Sigma, UK | 115144-35-9 | ||
| Diminazene aceturate | Sigma, UK | D7770 | Analytical grade |
| IVIS Lumina II | Perkin Elmer, UK | other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak | |
| Living Image v. 4.2 | Perkin Elmer, UK | proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own | |
| 1 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10142104 | |
| 20 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10743785 | |
| 25 G Needles | Greiner Bio-one | N2516 | |
| 21 G Needles | Greiner Bio-one | N2138 | |
| Twin-frosted microscope slide | VWR, UK | 631-0117 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | StarLab, UK | I1415-1000 | |
| 7 ml Bijou tube | StarLab, UK | E1412-0710 | |
| Mouse restrainer | Sigma, UK | Z756903 | our restrainer was made in-house, this is a similar model |
References
- Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).
- Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).
- Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152 (8), 1155-1171 (2007).
- Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6 (9), 1037-1047 (2011).
- Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75 (2), 143-153 (1977).
- Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35 (2), 360-394 (2011).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (6), 537-540 (2005).
- Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70 (2), 510-517 (2015).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (11), e2571 (2013).
- Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51 (4), 381-388 (2002).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
- Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56 (4), 321-324 (2007).
- Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295 (2012).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).
- Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).
- Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).
