Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bioluminescens Imaging Detect Late Stage Infektion af afrikansk trypanosomiasis

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik
Alt arbejde blev udført under godkendelsen af ​​det britiske indenrigsministerium Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 og London School of Hygiene & Tropical Medicine dyrevelfærd og etik Review Board. Ankommer retningslinje følges i denne rapport.

1. In Vivo Passage af Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

  1. Fjern en kryokonserveret lager (betegnet stabilate) af T. b. brucei stammen GVR35-VSL-2 (tilgængelig fra professor John Kelly ved London School of Hygiene & Tropical Medicine gennem MTA) 9 fra flydende nitrogen og lad afbalancere til stuetemperatur. Fortynd stabilate til 2 x 10 4 trypanosomer / ml i sterilt phosphatpufret glucose saltvand (PBS-G), pH 8,0 (1 liter PBS + 15 g glucose) 10.
    Bemærk: T. b. brucei GVR35-VSL-2 er ikke-sygdomsfremkaldende for mennesker og kræver SAPO licenseret faciliteter til at udføre eksperimenter.
  2. inject en 20-25 g kvindelige CD1 mus med 0,2 ml fortyndet trypanosomer via intraperitoneal vej (ip) med en 25 G nål. Dette er den "donor mus". Placer den inficerede mus i en SPF (SPF) -cage og foder ad libitum.
    Bemærk: CD1 mus er en udavlet stamme og T. b. brucei GVR35 infektioner er velkarakteriserede i denne stamme. Men denne protokol gælder også for indavlede eller genetisk modificerede stammer, men det er vigtigt at bemærke, at pels farve kan have indflydelse på følsomheden af imaging 6,9.
  3. Overvåg perifert parasitæmi ved blodprøvetagning. Placer musen i en plastik fastholdelsesanlæg og tage 5 pi af blod fra halen ved venepunktur med 21 G nål eller venesection og blandes 1/10 med 0,85% sterilt ammoniumchlorid at lysere røde blodlegemer og tillade lettere optælling.
  4. Tæl Fortyndet Blod i et Neubauer hæmocytometer.
    1. Læg det fortyndede blod i begge kamre. Tæl hele den centrale grid af et kammer for at give N trypanosomer. Koncentration af trypanosomer i blod = n x 10 4 trypanosomer / ml, justere for enhver fortyndingsfaktoren og beregne gennemsnittet af de to kamre.
      Bemærk: Efter ca. 5-7 dage efter infektion, bør perifer parasitæmi stige tilstrækkeligt til at foretage en infektion i en koncentration på 2 x 10 4 trypanosomer / ml.
  5. Når trypanosominfektion niveauet er højt nok til antallet af mus, der kræves, gå videre til trin 1.6. En parasitæmi niveau på 6 x 10 4 trypanosomer / ml i én donor mus er tilstrækkelig til infektion af 10 mus.
    Bemærk: Til statistisk signifikante gruppe størrelser, n = 6 for hver behandlingsgruppe af mus er behov 8. For andre modeller af infektion, ville power beregninger skal anvendes til at bestemme passende gruppestørrelser.
  6. Placer mus i en varmeveksler kasse (ved 28-30 ° C i ca. 5-10 minutter) for at tillade halevenerne at spile.For at inducere terminal anæstesi, administrere 20 mg / kg pentobarbital iv med en 25 G nål. Bekræft musen er bedøvet ved at trykke forsigtigt trædepuder for at sikre, er der ingen tilbagetrækning refleks.
  7. Heparinize en 21 G nål ved alikvotere 5 ml heparin ved 5.000 USP enheder / ml i et Bijou rør og sutte to gange ind og ud af nålen fastgjort til en 1 ml sprøjte.
  8. Tag den hepariniserede 21 G kanyle og 1 ml sprøjte, og udfør hjertepunktur på bedøvede passage musen ved at indsætte nålen centralt under brystkassen (en vulst af blod vil samle sig i bunden af ​​nålen) og træk forsigtigt tilbage i stemplet for ikke at skjule hjertekammer. Indsamle mindst 0,7 ml blod.
  9. Fortynd inficeret blod til at producere et inokulum på 2 x 10 4 trypanosomer / ml i PBS-G pH 8,0 som trin 1.1 ovenfor.
    Bemærk: På dette tidspunkt den resterende blod kan kryopræserveres at producere stabilate ved blanding med 8% glycerol, 20% varmeinaktiveret føtalt caLF serum (hi-FCS) og 72% inficeret blod. fryse langsomt ved -80 ° C ved anvendelse af en langsom-freeze frysning beholder for at opnå en afkølingshastighed på 1 ° C / min, før overførsel til flydende nitrogen.

2. Infektion for Eksperimentel mus

  1. Placer CD1 hunmus (~ 21-25 g) i en opvarmning boks til forsigtigt varmt at spile vener. Placer opvarmede mus i en plastik tilbageholdenhed og injicere 0,2 ml fortyndet podestof intravenøst ​​med en 25 G nål i halevenen, svarende til 4.000 trypanosomer per mus. Placer pres på injektionsstedet bagefter at dæmme op for blødning.
    Bemærk: Intraperitoneal infektion er en gyldig rute for infektion og har været anvendt i tidligere undersøgelser 10, men vi har fundet dette mindre reproducerbar end den intravenøse rute.
  2. Tilfældig inficerede mus og bur i grupper på 3 i SPF-ventilerede bure. Som en kontrol, injicere CD1 hunmus med vildtype ikke-bioluminescerende parasit, T. b. brucei GVR35 (n =3).
  3. Overvåg Infektion gennem blod Film Microscopy
    1. Spot 5 pi blod fra venepunktur eller venesection på en glasplade og udføre en blod smear (ved hjælp af en anden glasplade skub forsigtigt dråbe blod på tværs af dias til at producere en tynd film). Lad dias lufttørre.
    2. Fastgør blodudstrygninger med 100% methanol og pletten med Giemsa i 10 minutter, før skylning med dH 2 O og lad det lufttørre. Under 100X mål tælle antallet af trypanosomer i 10 synsfelter (FOV).
      Bemærk: Blood filme udføres sideløbende hele dyret invasiv billeddannelse så tidligt som én dag efter infektion. Ved behandling af et antal dyr, er denne metode til trypanosominfektion kvantificering foretrækkes frem hæmocytometertælling som prøverne kan opbevares ved stuetemperatur og tælles senere.

3. Bioluminescens Imaging til Track Infektion

Bemærk: For at overvåge infektion, hele animal ikke-invasiv billeddannelse kan anvendes.

  1. Der fremstilles en stamopløsning af D-luciferin, ildflue luciferase substrat, i Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS) ved 30 mg / ml. Filtersteriliser og fryse i alikvoter ved -20 ° C.
    Bemærk: D-Luciferin er lysfølsomt, derfor beskytte mod lys ved indpakning portioner i folie. Må ikke gentagne gange fryse-tø luciferin, da det kan påvirke aktiviteten 11.
  2. Varm en portion af D-luciferin til stuetemperatur. Fjern hver mus fra buret (herunder kontrolmus inficeret med nonbioluminescent vildtype parasit stamme) og injicere 150 mg / kg af det opvarmede D-luciferin (fortyndet i DPBS) intraperitonealt med en 25 G nål. Placer mus ind i en isofluoran kammer til ca 5 min at fremkalde anæstesi med 2% isofluoran / O 2 mix på 2,5 l / min.
    Bemærk: Mus bliver immobile når de er under anæstesi. For billeddanneren anvendes her, kan 3 mus behandles ad gangen. Hvis mus er anesthetliseret i mere end 30 min, kan oftalmisk kunstig tåre salve påføres forhindre øjnene af mus mod udtørring.
  3. For Imager beskrives her, åbne softwaren og initialisere maskinen ved hjælp af softwaren i henhold til producentens anvisninger. Anskaf billeder, når kameraet og opvarmet plade har nået temperatur.
    Bemærk: Dette instrument er ikke normalt slukket, så maskinen kan udføre baggrund kalibreringer natten over. I tilfælde af at det skal genstartes, skal det køre en kalibrering kontrol først.
  4. Placer bedøvede mus ind i imager (se 3.5). Bruger store sorte separatorer mellem musene at minimere gennemblødning af enhver lyse bioluminescerende signal. Billede mus ved hjælp af et sæt af eksponeringstider; 1, 3, 10, 30, 60 og 180 sekunder, med medium Binning, en f / stop og et åbent filter, og synsfelt E (12,5 x 12,5 cm 2).
    Bemærk: De kontrol mus inficeret med vildtype nonbioluminescent GVR35 parasitter giver en background bioluminescens værdi. Fra et luciferin kinetik eksperiment (figur 6) med denne model, har vi fundet, at bioluminescens signal toppe ved 10 minutter efter administration og billeddannelse tager ca. 5 min i 3 mus. Tag denne tidshorisont i betragtning, når bedøve og billeddannelse musene.
  5. For at sikre en grundig scanning af musene, rotere at opnå en ventral, ryg og lateral udsigt. Bevar konsistens i størrelsesordenen orienteringen til billeddannelse mellem sekventielle dyr.
  6. Efter billeddannelse, tillader mus til at komme sig anæstesi under observation før han vendte tilbage til SPF-bur.
  7. Fortsæt imaging mus hver 7. dag indtil dag 21 efter infektion. Der bør være en støt stigning i bioluminescens signal over hele dyret.
  8. På D21, billede og blodfilm musene som beskrevet ovenfor, og dosis mus med 40 mg / kg diminazene aceturate intraperitonealt. Dette stof vil rydde perifere parasitæmi men vil ikke krydse blod-brain barriere, og gør det dermed lettere visualisering af CNS-infektion.
    Bemærk: Diminazene aceturate er en veletableret lægemiddel til behandling af tidlige fase dyr trypanosomiasis.
  9. Fortsæt billedbehandling og overvågning på D28 og D35.

4. Bekræftelse CNS infektion

  1. På D35, billed mus som beskrevet ovenfor (trin 3,1-3,4).
  2. Efter billeddannelse, tillade mus at komme sig efter anæstesi og exsanguinate mus som beskrevet i trin 1,6-1,8, indsamling af blod til yderligere analyse.
  3. Efter hjertepunktur, perfundere mus med 20 ml PBS (valgfrit: tilsættes 3 mg / ml luciferin til perfusion opløsning) via hjertet for at fjerne blod fra organer og at genindføre luciferin label, der kunne have ryddet fra hjernen region over tidsinterval fra trin 4.1.
  4. Fjern forsigtigt hjernen, ved hjælp krum saks, skæring fra bunden rundt om omkredsen af ​​kraniet, og afløftning den øverste del af kraniet, at tillade hjernenskal forsigtigt løftes ud med buede pincet.
  5. Placer udskårne hjerne på en sektion af sort plast og pipette 50 pi 15 mg / ml luciferin over organet før billeddannelse, for at sikre tilstrækkelig luciferin er tilføjet til den udskårne hjerne. Billede med indstillingerne som ovenfor. Dette vil vise lokalisering af infektionen til hjernehalvdele.
    Bemærk: Downstream kvantificering af parasitæmi på den udskårne hjerne kan udføres ved qPCR som tidligere beskrevet 8. Andre alternative efterfølgende anvendelser kan omfatte histologi eller immunohistokemi at identificere parasitter i hjernevævet efter fiksering.

5. Kvantificering af Bioluminescens Imaging

Bemærk: Bioluminescens kan kvantificeres ved hjælp af området af interesse (ROI) med imaging software og korrigeret for baggrund bioluminescens.

  1. Ved hjælp af værktøjet ROI, oprette en rektangulær ROI for hele dyret kvantificering ennd placere den over muse billedet for at dække spidsen af ​​næsen til basen af ​​halen af ​​musen. Bruger samme størrelse kasse til hvert dyr og hver gang punkt. Når man ser på ROI for hjernen, brug en cirkulær ROI på samme måde, placere den over musen hovedet område i billedet.
  2. Hvis det ønskes, justere billeder skal vises på samme frekvenser til en visuel repræsentation af infektion.
    Bemærk: Den bruges her software genererer et farvekort for hvert billede justeres automatisk for minimum og maksimum fotontællinger. For at aktivere visuel sammenligning mellem en serie af billeder, skal farveskalaen indstilles til de samme værdier for alle billeder.
    1. Brug af billedet med den højeste bioluminescens og 'Image justere' fane på værktøjspaletten, skal du vælge en logaritmisk skala, og et passende minimum og maksimum farveskala (skal bestemmes empirisk). Anvend denne skala til alle billeder i hele eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol viser, hvordan at følge sygdomsprogression efter infektion af mus med T. b. brucei, en model for menneskelig afrikansk trypanosomiasis. Figur 1 viser tidslinjen af forsøgsprotokollen, viser tidsplanen for behandling og billedbehandling trin. Figur 2 viser et typisk synsfelt i en fast Giemsa-farvede blod smear bruges til at kvantificere perifer parasitæmi, med trypanosomer og røde blodlegemer til stede. Udvikling af infektionen hos dyr kan følges ved at måle bioluminescens som i Figur 3, der viser de inficerede dyr i løbet af et eksperiment med de samme dyr afbildet på hvert tidspunkt. Gennem forløbet af infektion kan observeres en stigning i bioluminescens i alle dyrene i løbet af de første 21 dage som signalet bliver mere udbredt og intens, med høje regioner af BLI (repræsenteret som rødfra zonekort skala) i milten området. Ved D21 mus behandles med diminazene aceturate som beskrevet i figur 1, post-billeddannelse, og kan iagttages et fald i bioluminescens ved D28 som den perifere infektion er ryddet, med lave niveauer af signal er til stede i hovedområdet af musene. Ved D35 signalet forbliver stadig i hovedområdet og er blevet mere intens indikerer en mulig hjerne infektion. Hjernen udskæres at bekræfte signal er til stede i hjernevæv og kan derefter kvantificeres ved qPCR.

Traditionelt er blodudstrygninger anvendes til kvantificering infektion progression og behandlingseffekt. Men disse kun måle perifer parasitæmi, og kan ikke anvendes til at evaluere parasit niveauet i hjernen. Figur 4 kombinerer kvantificering af både den perifere parasitæmi og bioluminescens at demonstrere sygdomstilstande kinetik. På D7 en høj BLI signal er til stede på 10 8 figur 3 . Dette viser større følsomhed af bioluminescens tilgang i forhold til traditionelle blod film optælling.

At kontrollere, at bioluminescens i hovedet regionen er virkelig lokalisere på hjernevævet, ved afslutningen af ​​forsøget hjernerne skåret ud og bioluminesblomsterstand målt ex vivo (figur 5). En forskel i infektion byrden mellem hjerner ses ofte, og signalet ikke synes at lokalisere til specifikke anatomiske regioner som distribution af intens BLI signal kan variere mellem inficerede dyr. For eksempel stærk BLI signal er til stede i lugtekolben i mus 2 og 3 og i cerebellum i mus 3, mens hjernen fra mus 1 viser generelle fordeling af BLI signal over hele hjernen. Som hjerner kan afbildes umiddelbart efter aflivning af musene, kan yderligere analyse udføres på hjernevævet som vævet ikke beskadiges i ex vivo-billeddannelse proces.

figur 1
Figur 1:. Tidslinje for Experiment herunder Imaging, Sampling og behandling på grund af den ikke-invasive karakter af bioluminescens imaging, kan overvågning af infektion forekomme more ofte end beskrevet i diagrammet. De prøveudtagnings- og billedbehandling hver 7 dage muliggøre identifikation af den forløber infektionen. Behandlingen på D21 med diminazene aceturate fjerner perifer parasitæmi at muliggøre bedre visualisering af hovedet og hjernen infektion. Diminazene aceturate er et tidligt stadium narkotika og er ikke i stand til at passere blod-hjerne-barrieren i mængder tilstrækkelige til at rydde sent infektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Giemsa Stained Trypanosomer På en fast film blod, Giemsa farvede trypanosomer (lilla med pink kerner, lukket pil) er let påviselige mod de røde blodlegemer (farvet blå, åben pil) og kan hurtigt tælles for at opnå det antal trypanosomer / 10synsfelter under en 100X mål. Skalaen bar betegner 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Bioluminescens Imaging af inficerede mus Tre repræsentative dyr af en gruppe af 6 mus inficeret med VSL-2 (M = mus) og en vildtype inficeret kontrol (inficeret med vildtype nonbioluminescent parasit linje).. Luciferin blev også administreret til kontrolmusen før billeddannelse, som tilvejebringer målingen baggrund. Et zonekort skala er vist med rødt indikerer høje niveauer af bioluminescens, svarende til høje antal parasitter, og blå indikerer lave niveauer af bioluminescens (D = dag). Styringen mus har ingen bioluminescens som forventet uden luciferase-udtrykkende parasitter. Billede f rom Burrell-Saward et al. 8 med tilladelse fra Oxford University Press. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Sammenligning af Bioluminescens og Blood Film parasitæmi Samlet bioluminescens hvert hele dyr blev kvantificeret som beskrevet i afsnit 5 og perifer parasitæmi kvantificeres ved at tælle parasitter i blodudstrygninger. Fejl barer betegner standardafvigelse fra middelværdien. Billede fra Burrell-Saward et al. 8 med tilladelse fra Oxford University Press. Klik her for at se en større version af dette tal.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54.032 / 54032fig5.jpg "/>
Figur 5:. Ex Vivo Imaging of udskåret Brain den perfunderede hjerner fra musene afbildes i figur 3 blev fjernet og afbildes som beskrevet i 4.5. Bioluminescens måles på en varme kortets målestok som for figur 3. kontrol hjernen fra en mus inficeret med vildtype nonbioluminescent parasitter blev også behandlet med luciferin og ingen bioluminescens kan observeres. Skalalinjen betegner 1 cm. Dette tal er blevet ændret fra Burrell-Saward et al. 8 med tilladelse fra Oxford University Press. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Kinetik af Luciferin Bioluminescens i VSL-2-inficerede mus.Tre VSL-2-inficerede CD1 mus blev injiceret med 150 mg / kg ip af luciferin og anbringes umiddelbart inden billeddanneren. Musene blev afbildet over 60 minutter, og deres bioluminescens blev beregnet til at bestemme den optimale billedbehandling vinduet efter luciferin administration. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Udviklingen af et bioluminescerende T. b. brucei GVR35 stammen tillader visualisering af en trypanosominfektion fra den tidlige til den sene fase. Tidligere infektion modeller var ude af stand til at opdage det sene tidspunkt, når parasitter er i hjernen, i realtid fra blod film mikroskopi, og krævede, at aflivning og fjernelse af hjerner fra den inficerede mus til at bestemme parasit byrde 12. Den bioluminescens reducerer inter-muse variabilitet som en enkelt mus kan spores hele hele infektionen og en hurtig kvalitativ vurdering af infektion kan observeres på noget tidspunkt. Den meget følsomme metode til bioluminescens billeddannelse muliggør lav-niveau-infektion, der skal identificeres tidligere end blod-film mikroskopi, med så få som 100 trypanosomer detekterbare gennem billeddannelse sammenlignet med 5 x 10 3 trypanosomer / ml detekterbare gennem mikroskopi 9. Desuden følger de samme dyr under hele forsøget elimineres behovet for separate dyregrupper for hvert tidspunkt, hvilket reducerer brugen dyr.

Den her beskrevne imaging protokol kan tilpasses den videnskabelige behov som den ikke-invasive natur betyder, at yderligere og hyppigere billedbehandling kan udføres (med passende dyreetik godkendelse), men for vurderingen af ​​hjernen infektion D21 er det tidligste tidspunkt punkt. På dette tidspunkt, stage narkotika tidlige ikke længere effektive til at rydde de sene stadie parasitter. Det er også nødvendigt, at musene afbildes under de samme betingelser ved hvert tidspunkt. For eksempel bør de samme eksponeringstider og samme visning (ventral eller dorsal) bruges til at sikre nøjagtig måling af forløbet af infektionen.

Hvis der under billeddannelse noget signal er til stede (når det er kendt, at modellen bør have en infektion), er der en række trin, der kan følges for at bestemme kilden til problemet. For det første kan eksponeringstiden øgestil et maksimum på 5 min, som bør være i stand til at detektere meget lave bioluminescens signal. Hvis signalet stadig ikke opdages og blod film er positive for parasit, vil det næste skridt være at bekræfte, om parasitten er stadig selvlysende. Dette kan udføres ved anvendelse af et kommercielt in vitro luciferaseaktivitet assay og bioluminescens ville blive detekteret under anvendelse af et luminometer. Hvis parasitten på dette tidspunkt ikke længere bioluminescerende, ville stabiliteten af ​​konstruktionen i parasitten skal løses.

Farven af musene gør en forskel for følsomhed billedbehandling som den udsendte bioluminescens dæmpes ved mørk pels og hud 6,9. Valg af muse-stamme, såsom hvide mus eller nøgne mus, kan derfor forbedre resultaterne. Hvis mus farve er begrænset, for eksempel ved anvendelse af en transgen linje, så barbering eller depilating musene i et område af interesse kan i høj grad forbedre følsomheden 6.

deTrods den forbedrede følsomhed og signalere, at bioluminescerende model frembringer den bioluminescens ikke direkte korrelerer til den perifere parasitæmi observeret i blodfilm (dage 7-21 vist i figur 4). Litteratur har dokumenteret, at den tidlige fase infektion af trypanosomiasis inficerer hemolymphatic systemet 1, og er ikke kun begrænset til blodsystemet og dette, sammen med infektion af perifere organer, kan forklare, hvorfor når perifer parasitæmi er knap påviselig i blod film, bioluminescens er synlig som er særligt fremgår af data for dag 7 i figur 3 og 4. Dette er dog betyder, at bioluminescens billeddannelse kun kan anvendes som en kvalitativ måling af infektion, og der kræves yderligere analyse for at bestemme absolut parasitbelastning.

Bioluminescens billeddannelse har evnen til at blive brugt med andre infektiøse patogener, som er vanskelige at monitor, med gnavermodeller for Chagas sygdom, malaria og toxoplasmose allerede etableret 13-16. Det høje signal-til-støj-forhold på bioluminescens kombineret med dets evne til at spore realtid infektioner kan give en mere følsom, ikke-invasiv lægemiddel vurdering, samt opnå en bedre forståelse af CNS infektion kinetik, hvilket gør det til et værdifuldt redskab i infektionssygdom forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker John Kelly og Martin Taylor (London School of Hygiene & Tropical Medicine) for at give T. b. brucei GVR35-VSL-2 og Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) for rådgivning om in vivo-billeddannelse. Dette arbejde blev støttet af Bill og Melinda Gates Foundation Global Health Program (tilskud nummer OPPGH5337).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375, (9709), 148-159 (2010).
  2. Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137, (14), 1995-2006 (2010).
  3. Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152, (8), 1155-1171 (2007).
  4. Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6, (9), 1037-1047 (2011).
  5. Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75, (2), 143-153 (1977).
  6. Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35, (2), 360-394 (2011).
  7. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, (6), 537-540 (2005).
  8. Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70, (2), 510-517 (2015).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, (11), e2571 (2013).
  10. Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51, (4), 381-388 (2002).
  11. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
  12. Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56, (4), 321-324 (2007).
  13. Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295 (2012).
  14. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (32), 11468-11473 (2005).
  15. Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7, (6), 837-848 (2005).
  16. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16, (9), 1285-1300 (2014).
Bioluminescens Imaging Detect Late Stage Infektion af afrikansk trypanosomiasis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter