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Immunology and Infection

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

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Éthique
Tous les travaux ont été effectués en vertu de l'approbation du Royaume-Uni Home Office Animaux (Procédures scientifiques) de la Loi de 1986 et la London School of Hygiene and Tropical Medicine Bien-être des animaux et Comité d'éthique. ARRIVÉE directive sont suivies dans le présent rapport.

1. In Vivo Passage de Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

  1. Retirer un stock cryoconservés (stabilat appelé) de T. b. souche brucei GVR35-VSL-2 (disponible chez le professeur John Kelly à la London School of Hygiene & Tropical Medicine par MTA) 9 à partir de l' azote liquide et laisser équilibrer à la température ambiante. Diluer stabilat à 2 x 10 4 trypanosomes / ml dans du tampon phosphate stérile de glucose (PBS-G) pH 8,0 (1 litre de PBS + 15 g de glucose) 10.
    Note: T. b. brucei GVR35-VSL-2 est non-infectieux pour l' homme et exige SAPO autorisé des installations pour mener à bien des expériences.
  2. Inject 20-25 g femelle CD1 souris avec 0,2 ml dilué trypanosomes par voie intrapéritonéale (IP) avec une aiguille de 25 G. Ceci est la "souris donneuse". Placez la souris infectée dans un spécifique Pathogen gratuit (SPF) -cage et alimentation ad libitum.
    Remarque: les souris CD1 sont une souche consanguine et T. b. infections brucei GVR35 sont bien caractérisés dans cette souche. Cependant, ce protocole est également applicable aux souches consanguines ou génétiquement modifiés, mais il est important de noter que la couleur de la fourrure peut avoir un impact sur ​​la sensibilité de l' imagerie 6,9.
  3. Surveiller parasitémie périphérique par prélèvement de sang. Placez la souris dans un restrainer plastique et prendre 5 pi de sang de la queue par ponction veineuse avec 21 aiguilles G ou saignées et mélanger 1/10 avec 0,85% de chlorure d'ammonium stérile pour lyser les globules rouges et de permettre un meilleur comptage.
  4. Comptez le sang dilué dans un Neubauer hémocytomètre.
    1. Chargez le sang dilué dans les deux chambres. Comptez tout le gr centralid d'une chambre pour donner n trypanosomes. Concentration de trypanosomes dans le sang = n x 10 4 trypanosomes / ml, ajuster pour tout facteur de dilution et de calculer la moyenne des deux chambres.
      Remarque: Après environ 5-7 jours après l'infection, la parasitémie périphérique devrait augmenter suffisamment pour mener à bien une infection à une concentration de 2 x 10 4 trypanosomes / ml.
  5. Lorsque les niveaux de trypanosomes sont suffisants pour le nombre de souris nécessaires élevé, passer à l'étape 1.6. Un niveau de parasitémie de 6 x 10 4 trypanosomes / ml dans une souris donneuse est suffisante pour l' infection de 10 souris.
    Remarque: Pour des tailles de groupes statistiquement significatifs, n = 6 pour chaque groupe de souris de traitement sont nécessaires 8. Pour les autres modèles d'infection, il faudrait appliquer pour déterminer la taille des groupes appropriés calculs de puissance.
  6. Placez la souris dans une boîte de chaleur (à 28-30 ° C pendant environ 5-10 min) pour permettre aux veines de la queue à se dilater.Pour induire une anesthésie terminale, administrer 20 mg / kg iv pentobarbital avec une aiguille 25 G. Confirmer la souris est anesthésiée en appuyant doucement les coussinets pour assurer qu'il n'y a aucun retrait réflexe.
  7. Hépariner une aiguille 21 G par aliquotage 5 ml d'héparine à 5000 unités USP / ml dans un tube bijou et sucer deux fois dans et hors de l'aiguille reliée à une seringue de 1 ml.
  8. Prenez le héparinisé 21 G aiguille et seringue de 1 ml, et d'effectuer une ponction cardiaque sur la souris de passage anesthésié par l'insertion de l'aiguille centrale en dessous de la cage thoracique (un cordon de sang commun dans la base de l'aiguille) et tirez doucement sur le piston afin de ne pas replier l'enceinte du coeur. Recueillir un minimum de 0,7 ml de sang.
  9. Diluer sang infecté pour produire un inoculum de 2 x 10 4 trypanosomes / ml dans du PBS-G pH 8,0 que l' étape 1.1 ci - dessus.
    Remarque: À ce stade, le sang restant peut être cryoconservés pour produire stabilat par mélange avec 8% de glycérol, 20% inactivé par la chaleur foetal casérum lf (salut-FCS) et du sang infecté 72%. geler lentement à -80 ° C en utilisant un lent gel gel récipient pour atteindre une vitesse de refroidissement de -1 ° C / min, avant le transfert à l'azote liquide.

2. L'infection des souris expérimentales

  1. Placez CD1 souris femelles (~ 21-25 g) dans une boîte de chauffage pour réchauffer doucement pour dilater les veines. Placez les souris réchauffés dans un dispositif de retenue en plastique et injecter 0,2 ml inoculum dilué par voie intraveineuse avec une aiguille G 25 dans la veine de la queue, ce qui équivaut à 4.000 trypanosomes par souris. Placez la pression au niveau du site d'injection après pour endiguer l'hémorragie.
    Remarque: l' infection intrapéritonéale est un itinéraire valide de l' infection et a été utilisé dans les études précédentes 10, mais nous avons trouvé cela moins reproductible que la voie intraveineuse.
  2. Randomize souris et cage infectées par groupes de 3 dans des cages SPF-ventilés. En tant que témoin, injecter CD1 souris femelles de type sauvage parasite non bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3).
  3. Surveiller l'infection par le biais du sang Film Microscopie
    1. Spot 5 ul sang de venepuncture ou saignées sur une lame de verre et d'effectuer un frottis sanguin (en utilisant une deuxième lame de verre pousser doucement la goutte de sang à travers la diapositive pour produire un film mince). Autoriser les diapositives à l'air sec.
    2. Fixer le frottis sanguin avec 100% de méthanol et tache avec Giemsa pendant 10 min avant de rincer avec dH 2 O et laisser sécher à l' air. Sous l'objectif 100X compter le nombre de trypanosomes dans 10 champs de vision (FOV).
      Remarque: le tournage de sang est effectué aux côtés de l'animal entier imagerie non invasive dès après l'infection d'un jour. Lors du traitement d'un certain nombre d'animaux, cette méthode de détermination quantitative du trypanosome est préféré au comptage hémocytomètre que les échantillons peuvent être conservés à la température ambiante et on les compte plus tard.

3. bioluminescence Imaging to Track Infection

Remarque: Pour surveiller l'infection, toute animal imagerie non invasive peut être utilisée.

  1. Préparer une solution mère de D-luciférine, le substrat de la luciférase de luciole, dans Phosphate Buffered Saline de Dulbecco (DPBS) à 30 mg / ml. Filtre stériliser et congeler à -20 ° C.
    Remarque: D-luciférine est sensible à la lumière, donc la protéger de la lumière en enveloppant aliquotes dans du papier. Ne pas la congélation-décongélation répétée luciférine car il peut affecter l' activité 11.
  2. Chauffer une partie aliquote de la D-luciférine à la température ambiante. Retirez chaque souris de la cage (y compris les souris témoins infectées par la souche nonbioluminescent parasite de type sauvage) et injecter 150 mg / kg de la D-luciférine réchauffé (dilué dans du DPBS) intrapéritonéale avec une aiguille 25 G. Placer la souris dans une chambre isofluorane pendant environ 5 min pour induire une anesthésie avec 2% d' isofluorane / O 2 au mélange de 2,5 L / min.
    Note: Les souris deviennent immobiles quand ils sont sous anesthésie. Pour l'imageur utilisé ici, 3 souris peuvent être traitées à la fois. Si les souris sont anesthettérisé pendant plus de 30 min, une pommade ophtalmique artificielle déchirure peut être appliquée pour prévenir les yeux des souris contre le dessèchement.
  3. Pour l'imageur décrit ici, ouvrez le logiciel et initialiser la machine en utilisant le logiciel selon les instructions du fabricant. Acquérir les images une fois caméra et plaque chauffante ont atteint la température.
    Remarque: Cet instrument est généralement pas éteint, permettant à la machine d'effectuer des étalonnages de fond pendant la nuit. Dans le cas où il a besoin de redémarrer, il doit exécuter une vérification d'étalonnage en premier.
  4. Placer les souris anesthésiés dans l'imageur (voir 3.5). Utilisez de grands séparateurs noirs entre les souris pour minimiser saigner à travers de tout signal bioluminescent lumineux. souris de l'image en utilisant un ensemble de temps d'exposition; 1, 3, 10, 30, 60 et 180 secondes, avec binning moyenne, 1 f / arrêt et un filtre ouvert, et le champ de vision E (12,5 x 12,5 cm 2).
    Remarque: Les souris témoins infectées par le type sauvage parasites GVR35 nonbioluminescent fournissent un backgrvaleur de bioluminescence ound. À partir d' un essai de cinétique de luciférine (figure 6) avec ce modèle, nous avons constaté que les crêtes du signal de bioluminescence à 10 minutes après l' administration et de l' imagerie dure environ 5 minutes pour 3 souris. Prenez ce délai en considération lors de l'anesthésie et l'imagerie des souris.
  5. Pour assurer l'imagerie approfondie des souris, tourner pour obtenir une ventrale, dorsale et vue latérale. Maintenir la cohérence dans l'ordre d'orientation pour l'imagerie entre les animaux séquentielles.
  6. Après l'imagerie, permettent la souris pour récupérer de l'anesthésie sous observation avant de revenir au SPF-cage.
  7. Continuer imagerie souris tous les 7 jours jusqu'au jour 21 post-infection. Il devrait y avoir une augmentation constante du signal de bioluminescence sur l'animal entier.
  8. A D21, l'image et le film de sang des souris comme décrit ci-dessus et la dose souris avec 40 mg / kg par voie intrapéritonéale acéturate de diminazène. Ce médicament va effacer la parasitémie périphérique, mais ne sera pas traverser la barrière hémato-brain barrière, et permet donc une meilleure visualisation de l'infection du système nerveux central.
    Remarque: Diminazène diminazène est un médicament bien établie utilisée pour traiter la trypanosomiase animale à un stade précoce.
  9. Continuer l'imagerie et la surveillance à J28 et J35.

4. Confirmation CNS Infection

  1. A D35, les souris d'image indiqués ci-dessus (étapes 3.1-3.4).
  2. Après l'exposition, les souris permettent de récupérer à partir de souris d'anesthésie et exsangue comme décrit à l'étape de 1,6 à 1,8, la collecte de sang pour une analyse ultérieure.
  3. Suite à une ponction cardiaque, perfuse des souris avec 20 ml de PBS (en option: ajouter 3 mg / ml de luciférine à une solution de perfusion), par l'intermédiaire du coeur pour effacer le sang provenant des organes et à réintroduire l'étiquette de luciférine qui aurait effacé de la région du cerveau au cours de l'intervalle de temps de l'étape 4.1.
  4. Retirez délicatement le cerveau, en utilisant des ciseaux courbes, coupe de la base autour de la circonférence du crâne, et soulevant la partie supérieure du crâne, pour permettre au cerveauà soulever délicatement avec une pince incurvées.
  5. Placer excisés du cerveau sur une section de matière plastique noire et la pipette 50 ul de 15 mg / ml de luciférine sur l'organe avant l'imagerie, afin d'assurer la luciférine adéquate a été ajoutée au cerveau excisée. L'image en utilisant les paramètres ci-dessus. Cela démontrera la localisation de l'infection aux hémisphères cérébraux.
    Remarque: la quantification de la parasitémie en aval sur le cerveau excisé peut être effectuée par qPCR 8 comme décrit précédemment. D'autres applications en aval alternatives peuvent inclure histologie ou immuno-histochimie afin d'identifier des parasites dans le tissu cérébral après fixation.

5. Quantification de la bioluminescence Imaging

Note: bioluminescence peut être quantifiée en utilisant la région d'intérêt (ROI) avec le logiciel d'imagerie et corrigé pour le fond bioluminescence.

  1. Utilisation de l'outil de retour sur investissement, créer un ROI rectangulaire pour l'animal entier une quantificationnd positionner sur l'image de la souris pour couvrir la pointe du nez à la base de la queue de la souris. Utilisez la même boîte de taille pour chaque animal et chaque point de temps. Lorsque l'on regarde le retour sur investissement pour le cerveau, utilisez un ROI circulaire de la même manière, en le positionnant sur la région de la tête de la souris dans l'image.
  2. Si vous le souhaitez, d'ajuster les images apparaissent sur le même spectre pour une représentation visuelle de l'infection.
    Remarque: Le logiciel utilisé ici génère une carte de couleur pour chaque image réglée automatiquement pour le comptage de photons minimum et maximum. Pour permettre une comparaison visuelle entre une série d'images, l'échelle de couleurs doit être réglé sur les mêmes valeurs pour toutes les images.
    1. Utilisation de l'image la plus bioluminescence et l'onglet «Réglage d'image» sur la palette d'outils, sélectionnez une échelle logarithmique et une échelle minimale de couleur appropriée et maximale (à déterminer empiriquement). Appliquer cette échelle à toutes les images tout au long de l'expérience.

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Representative Results

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Ce protocole démontre comment suivre la progression de la maladie après infection de souris avec T. b. brucei, un modèle pour la trypanosomiase humaine africaine. La figure 1 montre la chronologie du protocole expérimental, ce qui démontre le calendrier de traitement et d' imagerie étapes. La figure 2 montre un champ de vue typique dans un Giemsa teinté frottis sanguin fixe utilisé pour quantifier la parasitémie périphérique, avec des trypanosomes et des globules rouges présents. Le développement de l'infection chez des animaux peut être suivie en mesurant la bioluminescence comme sur la figure 3, qui montre les animaux infectés au cours d'une expérience avec les mêmes animaux imagées à chaque point de temps. Grâce à l'évolution de l'infection une augmentation de bioluminescence peut être observée chez tous les animaux au cours des 21 premiers jours que le signal devient plus disséminée et intense, avec des régions élevées de BLI (représenté en rougede la carte échelle de chaleur) dans la région de la rate. Chez les souris D21 sont traités avec l' acéturate de diminazène comme indiqué sur la Figure 1, post-imagerie, et une baisse de bioluminescence peuvent être observés à J28 que l'infection périphérique est effacée, avec de faibles niveaux de signal étant présent dans la région de la tête des souris. A D35 le signal reste toujours dans la région de la tête et est devenue plus intense indiquant une éventuelle infection du cerveau. Le cerveau est excisé pour confirmer le signal est présent dans le tissu du cerveau et peut ensuite être quantifié par PCR quantitative.

Traditionnellement, les frottis sanguins sont utilisés pour quantifier la progression de l'infection et les effets du traitement. Cependant, ceux - ci ne mesurent que la parasitémie périphérique et ne peuvent pas être utilisées pour évaluer les niveaux de parasites dans le cerveau. La figure 4 combine à la fois la quantification de la parasitémie périphérique et la bioluminescence pour démontrer la cinétique de la maladie. A D7 un signal haute BLI est présent de 10 8 figure 3 . Cela démontre la grande sensibilité de l'approche de bioluminescence sur le comptage traditionnel frottis sanguin.

Pour vérifier que la bioluminescence dans la région de la tête est vraiment localisante aux tissus du cerveau, à la fin de l'expérience, les cerveaux sont excisées et bioluminescence mesurée ex vivo (figure 5). Une différence de charge de l'infection entre les cerveaux est souvent vu et le signal ne semble pas se localiser au niveau des régions anatomiques spécifiques comme la diffusion du signal BLI intense peut varier entre les animaux infectés. Par exemple, le signal BLI fort est présent dans le bulbe olfactif de souris en 2 et 3 et dans le cervelet de souris en 3, tandis que le cerveau de la souris 1 montre la distribution générale des signaux BLI partout dans le cerveau. Comme le cerveau peut être imagée immédiatement après l' abattage des souris, une analyse plus approfondie peut être effectuée sur le tissu cérébral que le tissu ne soit pas endommagé par le procédé ex vivo d'imagerie.

Figure 1
Figure 1:. Chronologie de l' expérience , y compris l' imagerie, l' échantillonnage et le traitement en raison de la nature non-invasive de l' imagerie par bioluminescence, la surveillance de l' infection peut se produire more souvent que détaillé dans le schéma. L'échantillonnage et d'imagerie tous les 7 jours permettent l'identification de l'infection progresse. Le traitement à J21 avec acéturate de diminazène supprime parasitémie périphérique pour permettre une meilleure visualisation de la tête et du cerveau infection. Acéturate Diminazène est un médicament de stade précoce et ne parvient pas à passer la barrière hémato-encéphalique en quantité suffisante pour éliminer l'infection à un stade avancé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Trypanosomes Giemsa Stained trypanosomes Sur un film de sang fixe, Giemsa colorés (violet avec des noyaux roses, fermés flèche) sont facilement détectables contre les globules rouges (couleur bleue, flèche ouverte) et peut être compté rapidement pour obtenir le nombre de Les trypanosomes / 10champs de vision sous un objectif 100X. La barre d'échelle représente 10 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: bioluminescence Imagerie des souris infectées Trois animaux représentatifs d'un groupe de 6 souris infectées par VSL-2 (M = souris) et un contrôle de type sauvage infecté (infecté par la ligne de parasite nonbioluminescent de type sauvage).. Luciférine a également été administré à la souris avant l'image de commande, qui fournit la mesure de fond. Une échelle de la carte de chaleur est représenté avec rouge indiquant des niveaux élevés de bioluminescence, ce qui équivaut à un nombre élevé de parasites, et en indiquant le bleu de faibles niveaux de bioluminescence (D = jour). La souris de contrôle n'a pas bioluminescence comme prévu sans parasites luciférase exprimant. image f rom Burrell-Saward et al. , 8 avec la permission de Oxford University Press. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Comparaison des bioluminescence et du Sang Film parasitémie bioluminescence total de chaque animal entier a été quantifiée comme décrit dans la section 5 et parasitémie périphérique quantifiée par comptage des parasites dans les frottis sanguins. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de la moyenne. Image de Burrell-Saward et al. , 8 avec la permission de Oxford University Press. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5:. Ex Vivo Imaging de excisés cerveau Les cerveaux perfusés des souris imagées sur la figure 3 ont été enlevés et imagé comme décrit dans 4.5. La bioluminescence est mesurée sur une échelle de la carte de chaleur que pour la figure 3. Le cerveau de contrôle d'une souris infectée par le type sauvage parasites nonbioluminescent a également été traitée avec luciférine et aucun bioluminescence peut être observé. La barre d'échelle représente 1 cm. Ce chiffre a été modifié depuis Burrell-Saward et al. , 8 avec la permission de Oxford University Press. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Cinétique de Luciferin bioluminescence chez la souris VSL-2-infectées.Trois souris CD1 LAV-2 infectées ont reçu une injection de 150 mg / kg par voie intraperitoneale de la luciférine et placés immédiatement à l'intérieur de l'imageur. Les souris ont été imagées plus de 60 min et de leur bioluminescence a été calculé pour déterminer la fenêtre d'imagerie optimale après luciférine administration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Le développement d'un T. bioluminescente b. souche brucei GVR35 permet la visualisation d'une infection trypanosomienne du début à la fin de l' étape. Modèles d'infection antérieurs ont été incapables de détecter la phase tardive, lorsque les parasites sont dans le cerveau, en temps réel de la microscopie de frottis sanguin, et nécessitaient l'abattage et l' élimination des cerveaux de souris infectées afin de déterminer la charge parasitaire 12. La bioluminescence réduit la variabilité inter-souris comme une seule souris peut être suivi tout au long de la totalité de l'infection et une évaluation qualitative rapide de l'infection peut être observé à tout moment. La méthode très sensible de l' imagerie par bioluminescence permet l' infection de bas niveau pour être identifié plus tôt que la microscopie sang-film, avec aussi peu que 100 trypanosomes détectables par imagerie par rapport aux 5 x 10 3 trypanosomes / ml détectables par microscopie 9. En outre, en suivant les mêmes animaux tout au long de l'expérience à éliminerest la nécessité pour les groupes d'animaux séparés pour chaque point de temps, ce qui réduit grandement l'utilisation de l'animal.

Le protocole d'imagerie décrit ici peut être adaptée en fonction de la nécessité scientifique signifie la nature non-invasive que l'imagerie supplémentaire et plus fréquente peut être effectuée (avec l'approbation de l'éthique animale appropriée), mais pour l'évaluation de l'infection du cerveau D21 est le plus tôt point. À ce stade, les médicaments à un stade précoce ne sont plus efficaces pour effacer les parasites au stade tardif. Il est également impératif que les souris sont imagés dans les mêmes conditions à chaque point de temps. Par exemple, les mêmes temps d'exposition et même vue (ventrale ou dorsale) devraient être utilisés pour assurer une mesure précise de l'évolution de l'infection.

Si au cours de l'imagerie aucun signal est présent (quand on sait que le modèle devrait avoir une infection), il y a un certain nombre d'étapes qui peuvent être suivies pour déterminer la source du problème. Tout d'abord, le temps d'exposition peut être augmentéejusqu'à un maximum de 5 min, ce qui devrait être capable de détecter de très faible signal de bioluminescence. Si le signal est toujours pas détecté et films de sang sont positifs pour parasite, la prochaine étape serait de confirmer si le parasite est encore bioluminescente. Ceci peut être réalisé en utilisant un test in vitro dans le commerce de luciférase et l' activité de bioluminescence serait détecté à l' aide d' un luminomètre. Si, à ce stade, le parasite est plus bioluminescente, aurait besoin d'être traités de la stabilité de la construction dans le parasite.

La couleur de la souris fait une différence à la sensibilité de l' imagerie comme la bioluminescence émise est atténuée par la fourrure sombre et 6,9 de la peau. Choix de la souche de souris, tels que des souris blanches ou des souris nues, peut donc améliorer les résultats. Si la couleur de la souris est limitée, par exemple par l' utilisation d'une lignée transgénique, puis le rasage ou épilation les souris dans une région d'intérêt peut grandement améliorer la sensibilité à 6.

deMalgré l'amélioration de la sensibilité et le signal que le modèle de bioluminescente produit, la bioluminescence ne correspond pas directement à la parasitémie périphérique observée dans les films de sang (7-21 jours indiqués sur la figure 4). La littérature a démontré que l'infection à un stade précoce de la trypanosomiase infecte le système de hémolymphatique 1, et pas seulement limité au système sanguin et ce, avec l'infection des organes périphériques, peut expliquer pourquoi , lorsque la parasitémie périphérique est à peine détectable dans les films de sang, la bioluminescence est visible comme cela est particulièrement évident à partir des données pour le jour 7 de la Figure 3 et 4. Toutefois, cela ne signifie pas que l'imagerie par bioluminescence peut être utilisée uniquement comme une mesure qualitative de l'infection, et une analyse plus poussée est nécessaire pour déterminer la charge parasitaire absolue.

l'imagerie par bioluminescence a la capacité d'être utilisé avec d'autres agents infectieux qui sont difficiles à monitor, avec des modèles de rongeurs de la maladie de Chagas, le paludisme et la toxoplasmose déjà établie 13-16. Le rapport signal-bruit de bioluminescence couplé avec sa capacité à suivre les infections en temps réel peut fournir une évaluation de la drogue non-invasive plus sensible, ainsi que gagner une meilleure compréhension de SNC cinétique de l'infection, ce qui en fait un outil précieux la recherche sur les maladies infectieuses.

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Acknowledgments

Nous remercions John Kelly et Martin Taylor (London School of Hygiene and Tropical Medicine) pour fournir T. b. brucei GVR35-VSL-2 et le Dr Andrea Zelmer (LSHTM) pour obtenir des conseils sur l' imagerie in vivo. Ce travail a été soutenu par le Programme Bill et Melinda Gates Fondation mondiale de la santé (nombre subvention OPPGH5337).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

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References

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Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine
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Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

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