Protocol
Etica
Tutto il lavoro è stato realizzato sotto l'approvazione del Regno Unito per la casa Ufficio Animali (procedure scientifiche) Act 1986 e la London School of Hygiene & Tropical Medicine Animal Welfare and Ethics Review Board. ARRIVARE linee guida sono seguite in questo rapporto.
1. In Vivo Passaggio di Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei
- Rimuovere uno stock crioconservati (stabilate definito) di T. b. brucei ceppo GVR35-VSL-2 (disponibile dal professor John Kelly presso la London School of Hygiene & Tropical Medicine attraverso MTA) 9 da azoto liquido e permettono di equilibrare a temperatura ambiente. Diluire stabilate a 2 x 10 4 trypanosomes / ml in sterile tampone fosfato glucosio (PBS-G) pH 8,0 (1 L PBS + 15 g di glucosio) 10.
Nota: T. b. brucei GVR35-VSL-2 non è contagioso per gli esseri umani e richiede SAPO licenza strutture per effettuare esperimenti. - inject 20-25 g femminile del mouse CD1 con 0,2 ml trypanosomes diluiti per via intraperitoneale (ip) con un ago da 25 G. Questo è il "mouse donatore". Posizionare il mouse infetto in uno specifico patogeno libero (SPF) -cage e mangimi ad libitum.
Nota: i topi CD1 sono un ceppo outbred e T. b. infezioni brucei GVR35 sono ben caratterizzati in questo ceppo. Tuttavia, questo protocollo è applicabile anche a ceppi inbred o geneticamente modificati, ma è importante notare che il colore della pelliccia possono influire sulla sensibilità dell'imaging 6,9. - Monitorare parassitemia periferica dal prelievo di sangue. Posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione di plastica e prendere 5 ml di sangue dalla coda per via venosa con 21 G ago o venesection e mescolare 1/10 con cloruro di ammonio sterile 0,85% per la lisi dei globuli rossi e consentire una più facile conteggio.
- Contare il sangue diluito in un Neubauer emocitometro.
- Caricare il sangue diluito in entrambe le camere. Conta l'intero gr centraleid di una camera per dare n trypanosomes. Concentrazione di trypanosomes nel sangue = n x 10 4 trypanosomes / ml, regolare per qualsiasi fattore di diluizione e calcolare la media delle due camere.
Nota: Dopo circa 5-7 giorni dopo l'infezione, parassitemia periferica dovrebbe aumentare in misura sufficiente a svolgere una infezione ad una concentrazione di 2 x 10 4 tripanosomi / ml.
- Caricare il sangue diluito in entrambe le camere. Conta l'intero gr centraleid di una camera per dare n trypanosomes. Concentrazione di trypanosomes nel sangue = n x 10 4 trypanosomes / ml, regolare per qualsiasi fattore di diluizione e calcolare la media delle due camere.
- Quando i livelli di trypanosome sono sufficienti per il numero di topi richiesti alta, passare al punto 1.6. Un livello parassitemia di 6 x 10 4 trypanosomes / ml in un topo donatore è sufficiente per infezione di 10 topi.
Nota: Per le dimensioni statisticamente significative del gruppo, n = 6 per ogni gruppo di trattamento di topi sono necessari 8. Per gli altri modelli di infezione, calcoli di potenza dovrebbero essere applicati per determinare le dimensioni dei gruppi appropriati. - Topi posto in una scatola di calore (a 28-30 ° C per circa 5-10 minuti) per consentire le vene coda di dilatarsi.Per indurre anestesia terminale, somministrare 20 mg / kg ev pentobarbital con un ago 25 G. Conferma del mouse è anestetizzato premendo delicatamente i cuscinetti plantari per garantire che non vi è alcun riflesso di ritiro.
- Eparinizzare un ago G 21 aliquotandolo 5 ml eparina a 5.000 USP unità / ml in un tubo Bijou e succhiare due volte dentro e fuori l'ago di una siringa da 1 ml.
- Prendere la eparinizzato 21 G ago e siringa da 1 ml, ed eseguire puntura cardiaca sul mouse passaggio anestetizzato inserendo l'ago centralmente sotto la gabbia toracica (una goccia di sangue piscina nella base dell'ago) e tirare delicatamente lo stantuffo in modo da non comprimere la camera del cuore. Raccogliere un minimo di 0,7 ml di sangue.
- Diluire sangue infetto per produrre un inoculo di 2 x 10 4 trypanosomes / ml in PBS-G pH 8,0 come al punto 1.1.
Nota: A questo punto, il sangue rimanente può essere crioconservati per produrre stabilate miscelando con 8% glicerolo, 20% inattivato al calore ca fetalesiero lf (hi-FCS) e il 72% di sangue infetto. Lentamente congelare a -80 ° C usando un lento congelamento contenitore congelamento per ottenere una velocità di raffreddamento di -1 ° C / min, prima del trasferimento a azoto liquido.
2. L'infezione di topi sperimentale
- Posizionare CD1 topi di sesso femminile (~ 21-25 g) in una scatola di riscaldamento a delicatamente calda per dilatare le vene. Posizionare i topi riscaldati in un sistema di ritenuta di plastica e iniettare 0,2 ml inoculo diluito per via endovenosa con un ago G 25 nella vena della coda, pari a 4.000 trypanosomes per topo. Mettere pressione al sito di iniezione in seguito per fermare l'emorragia.
Nota: infezione intraperitoneale è un percorso valida di infezione ed è stato utilizzato in studi precedenti 10, ma abbiamo trovato questo meno riproducibile rispetto alla via endovenosa. - Randomize topi infetti e la gabbia in gruppi di 3 in gabbie SPF-ventilati. Come controllo, iniettare CD1 topi femmina con wild type parassita non bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3).
- Monitorare l'infezione attraverso il sangue Film Microscopia
- Spot 5 ml di sangue da prelievo venoso o salasso su un vetrino ed eseguire uno striscio di sangue (utilizzando un secondo vetrino spingere delicatamente la goccia di sangue in tutto il vetrino per produrre un film sottile). Lasciare le diapositive asciugare all'aria.
- Fissare lo striscio di sangue con il 100% di metanolo e macchia con Giemsa per 10 minuti prima di risciacquare con dH 2 O e lasciare asciugare all'aria. Sotto obiettivo 100X contare il numero di tripanosomi in 10 campi di vista (FOV).
Nota: le riprese sangue viene eseguita insieme a tutto l'animale di imaging non invasivo più presto dopo l'infezione di un giorno. Durante l'elaborazione di un numero di animali, questo metodo di quantificazione tripanosoma è preferito rispetto conteggio emocitometro come i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente e successivamente contati.
3. bioluminescenza Imaging per tenere traccia delle infezioni
Nota: Per monitorare l'infezione, tutto animAl imaging non invasivo può essere utilizzato.
- Preparare una soluzione stock di D-luciferina, il substrato luciferasi di lucciola, in Dulbecco tampone fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro sterilizzare e congelare in aliquote a -20 ° C.
Nota: D-Luciferin è sensibile alla luce, quindi proteggerlo dalla luce avvolgendo aliquote in un foglio. Non più volte di gelo-disgelo luciferina in quanto può influenzare l'attività 11. - Scaldare una aliquota di D-luciferina a temperatura ambiente. Rimuovere ogni mouse dalla gabbia (compresi topi di controllo infettate con nonbioluminescent ceppo wild type parassita) e iniettare 150 mg / kg di D-luciferina riscaldato (diluito in DPBS) per via intraperitoneale con un ago 25 G. Posizionare il mouse in una camera isofluorane per circa 5 minuti per indurre l'anestesia con il 2% isofluorane / O 2 miscela a 2,5 L / min.
Nota: I topi diventano immobile quando sono sotto anestesia. Per l'imager qui utilizzato, 3 topi possono essere elaborati in un momento. Se i topi sono anesthetzato per più di 30 minuti, unguento oftalmico lacrima artificiale può essere applicato per prevenire gli occhi dei topi si secchi. - Per l'imager qui descritto, aprire il software e inizializzare la macchina utilizzando il software secondo le istruzioni del produttore. Acquisire le immagini una volta fotocamera e la piastra riscaldata hanno raggiunto la temperatura.
Nota: questo strumento non è di solito spento, consentendo alla macchina di eseguire calibrazioni di fondo durante la notte. Nel caso in cui deve essere riavviata o deve eseguire un controllo di calibrazione prima. - Mettere i topi anestetizzati nella termocamera (cfr 3,5). Utilizzare grandi separatori neri tra i topi per ridurre al minimo sanguinare attraverso di qualsiasi segnale bioluminescente luminoso. topi immagine utilizzando una serie di tempi di esposizione; 1, 3, 10, 30, 60 e 180 secondi, con medie discretizzazione, 1 f / stop e un filtro aperto, e il campo visivo E (12.5 x 12.5 cm 2).
Nota: I topi di controllo infettati con il tipo selvatico parassiti GVR35 nonbioluminescent forniscono un backgrvalore di bioluminescenza ound. Da un esperimento di cinetica di luciferina (Figura 6), con questo modello, abbiamo trovato che i picchi di segnale bioluminescenza a 10 minuti dopo la somministrazione e l'imaging dura circa 5 minuti per 3 topi. Prendete questo lasso di tempo in considerazione quando anestetizzare e di imaging i topi. - Per garantire l'imaging approfondito dei topi, ruotare per ottenere una ventrale, dorsale e vista laterale. Mantenere la coerenza dell'ordine di orientamento per l'imaging tra animali sequenziali.
- Dopo l'imaging, permettono topi per recuperare da anestesia sotto osservazione prima di tornare a SPF-gabbia.
- Continuare l'imaging topi ogni 7 giorni fino al giorno 21 dopo l'infezione. Ci dovrebbe essere un costante aumento del segnale bioluminescenza sull'intera animale.
- Al D21, immagini e striscio di sangue dei topi come descritto in precedenza, e la dose topi con 40 mg / kg per via intraperitoneale Diminazene aceturato. Questo farmaco cancellerà il parasitemia periferico, ma non attraverserà la barriera emato-Brain barriera, e permette quindi una migliore visualizzazione dell'infezione CNS.
Nota: Diminazene aceturato è un farmaco comunemente utilizzate per il trattamento di tripanosomiasi animale fase iniziale. - Continuare l'imaging e il monitoraggio a D28 e D35.
4. Conferma CNS infezione
- Al D35, topi immagine sopra descritto (passi 3,1-3,4).
- Dopo l'imaging, permettono di recuperare i topi da topi anestesia e Exsanguinate come dettagliato nella fase 1,6-1,8, raccolta di sangue per ulteriori analisi.
- Dopo puntura cardiaca, perfusione topi con 20 ml di PBS (opzionale: aggiungere 3 mg / ml di luciferina alla soluzione di perfusione) attraverso il cuore per cancellare il sangue dagli organi e di reintrodurre etichetta luciferina che potrebbero aver eliminato dalla regione del cervello durante l'intervallo di tempo dal punto 4.1.
- Rimuovere delicatamente il cervello, utilizzando forbici curve, tagliando dalla base attorno alla circonferenza del cranio e sollevamento fuori la parte superiore del cranio, per permettere al cervelloper essere delicatamente tirato fuori con le pinze curve.
- Posizionare il cervello asportato su una sezione di plastica nera e pipettare 50 ml di 15 mg / ml luciferina sopra l'organo prima di imaging, per garantire un'adeguata luciferina è stato aggiunto al cervello asportato. Immagine utilizzando le impostazioni come sopra. Questo dimostrerà localizzazione dell'infezione agli emisferi cerebrali.
Nota: quantificazione valle parassitemia sul cervello asportato può essere effettuata da qPCR come precedentemente descritto 8. Altre applicazioni a valle alternative potrebbero includere l'istologia o immunoistochimica per identificare i parassiti nel tessuto cerebrale dopo la fissazione.
5. La quantificazione della bioluminescenza Imaging
Nota: bioluminescenza sia quantificabile secondo la regione di interesse (ROI) con il software di imaging e corretta per lo sfondo bioluminescenza.
- Utilizzando lo strumento ROI, creare un ROI di forma rettangolare per intero animale quantificazione unnd posizionarlo dell'immagine mouse sopra per coprire punta del naso alla base della coda del topo. Utilizzare la stessa casella di dimensione per ogni animale e ogni punto del tempo. Osservando il ROI per il cervello, utilizzare una ROI circolare nello stesso modo, posizionandolo sopra la regione della testa del mouse nell'immagine.
- Se necessario, regolare le immagini a comparire sullo stesso spettro per una rappresentazione visiva di infezione.
Nota: il software utilizzato qui genera una mappa di colori per ogni immagine regolata automaticamente per i conteggi minimo e massimo di fotoni. Per consentire un confronto visivo tra una serie di immagini, la scala di colore deve essere impostato gli stessi valori per tutte le immagini.- Usando l'immagine con il più alto bioluminescenza e la scheda 'Regolazione immagine' sulla tavolozza degli strumenti, selezionare una scala logaritmica e un adeguato minima scala di colori e massima (da determinare empiricamente). Applicare questa scala a tutte le immagini di tutto l'esperimento.
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Representative Results
Questo protocollo dimostra come seguire la progressione della malattia dopo l'infezione di topi con T. b. brucei, un modello per la tripanosomiasi africana umana. La figura 1 mostra la sequenza temporale del protocollo sperimentale, dimostrando il calendario per la fasi di trattamento e di imaging. La Figura 2 mostra un tipico campo di vista in uno striscio di sangue Giemsa-macchiate fisso utilizzato per quantificare parassitemia periferico, con trypanosomes e globuli rossi presenti. Sviluppo dell'infezione negli animali può essere seguita misurando la bioluminescenza come nella figura 3, che mostra gli animali infetti nel corso di un esperimento con gli stessi animali impressi in ogni punto. Attraverso il corso dell'infezione un aumento bioluminescenza può essere osservata in tutti gli animali nei primi 21 giorni come il segnale diventa più disseminata ed intenso, con alte regioni di BLI (rappresentato come rossodalla mappa scala di calore) nell'area milza. A topi D21 sono trattati con Diminazene aceturato come descritto nella figura 1, dopo l'esposizione, e una goccia in bioluminescenza possono osservare D28 come l'infezione periferica è controllata, con bassi livelli di segnale essendo presente nella regione della testa dei topi. Al D35 il segnale rimane ancora nella regione testa è diventata più intensa che indica una possibile infezione cerebrale. Il cervello è escisse per confermare il segnale è presente all'interno del tessuto cerebrale e può quindi essere quantificata qPCR.
Tradizionalmente, strisci di sangue vengono utilizzati per quantificare la progressione dell'infezione e gli effetti del trattamento. Tuttavia, questi misurano solo parassitemia periferico, e non possono essere usate per valutare i livelli parassita nel cervello. Figura 4 combina quantificazione sia del parassitemia periferico e bioluminescenza dimostrare cinetiche malattia. A D7 un segnale alto BLI è presente su 10 8 figura 3 . Ciò dimostra la maggiore sensibilità del metodo sopra bioluminescenza tradizionale conteggio pellicola di sangue.
Per verificare che la bioluminescenza nella regione della testa è veramente localizzazione al tessuto cerebrale, alla fine dell'esperimento i cervelli sono rimossi e bioluminesscenza misurata ex vivo (Figura 5). Una differenza di pressione tra l'infezione cervello è spesso visto e segnale non appare localizzare a specifiche regioni anatomiche come distribuzione di intensità del segnale BLI può variare tra animali infetti. Ad esempio, forte segnale BLI è presente nel bulbo olfattivo nel topo 2 e 3 e nel cervelletto nel topo 3, mentre il cervello dal mouse 1 mostra la distribuzione generale del segnale BLI tutto il cervello. Poiché i cervelli possono essere esposte subito dopo l'abbattimento dei topi, ulteriori analisi può essere effettuata sul tessuto cerebrale come il tessuto non sia danneggiato in vivo nel processo di imaging es.
Figura 1:. Timeline di Experiment tra cui l'imaging, il campionamento e il trattamento a causa della natura non invasiva delle immagini bioluminescenza, il monitoraggio di infezione può avvenire mori spesso dettagliato nel diagramma. Il campionamento e di imaging ogni 7 giorni consentono l'identificazione dell'infezione progredire. Il trattamento a D21 con aceturato Diminazene rimuove parassitemia periferici per consentire una migliore visualizzazione della testa e del cervello infezione. Aceturato Diminazene è un farmaco in fase iniziale e non è in grado di superare la barriera emato-encefalica in quantità adeguate per eliminare l'infezione fase tardiva. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Trypanosomes Giemsa macchiato tripanosomi su un film di sangue fisso, Giemsa macchiati (viola con i nuclei rosa, chiuso freccia) sono facilmente rilevabili contro i globuli rossi (di colore blu, freccia aperta) e può essere rapidamente contato per ottenere il numero di trypanosomes / 10campi di vista sotto un obiettivo 100X. La barra della scala indica 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: bioluminescenza Imaging di topi infettati Tre animali rappresentativi di un gruppo di 6 topi infettati con VSL-2 (M = mouse) ed una wild-type di controllo infetto (infettati dal tipo selvaggio linea nonbioluminescent parassita).. Luciferina è stato anche somministrato al mouse controllo prima di imaging, che prevede la misurazione del fondo. Una scala della mappa di calore è mostrato con l'indicazione rossa alti livelli di bioluminescenza, pari a un numero elevato di parassiti, e blu che indica bassi livelli di bioluminescenza (D = giorno). Il mouse di controllo non ha alcuna bioluminescenza come previsto, senza parassiti luciferasi che esprimono. immagine F rom Burrell-Saward et al. 8 per concessione di Oxford University Press. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Confronto di bioluminescenza e Sangue Film parassitemia bioluminescenza totale di ogni intero animale è stato quantificato come descritto nella sezione 5 e parassitemia periferico quantificato contando parassiti in strisci di sangue. Le barre di errore indicano la deviazione standard dalla media. Immagine da Burrell-Saward et al. 8 per concessione di Oxford University Press. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5:. Ex Vivo Imaging di asportato il cervello cervelli perfusi dei topi imaged in Figura 3 sono stati rimossi e ripreso come descritto in 4.5. Bioluminescenza è misurato su una scala della mappa di calore come per Figura 3. Il cervello di controllo da un mouse infettati con wild type parassiti nonbioluminescent è stato anche trattato con luciferina e non bioluminescenza può essere osservato. La barra di scala denota 1 cm. Questo dato è stato modificato da Burrell-Saward et al. 8 per concessione di Oxford University Press. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cinetica di Luciferin bioluminescenza nei topi VSL-2-infetti.Tre topi CD1 VSL-2-infette sono stati iniettati con 150 mg / kg ip luciferina e poste immediatamente all'interno del imager. I topi sono stati ripresi più di 60 minuti e la loro bioluminescenza è stato calcolato per determinare la finestra di imaging ottimale dopo la somministrazione luciferina. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo sviluppo di un T. bioluminescente b. brucei GVR35 ceppo permette la visualizzazione di una infezione tripanosoma dalla presto per la fase tardiva. Precedenti modelli di infezione erano in grado di rilevare la fase avanzata, quando i parassiti sono nel cervello, in tempo reale dalla microscopia striscio di sangue, e richiedevano l'abbattimento e la rimozione dei cervelli dal topi infettati per determinare parassita fardello 12. La bioluminescenza riduce la variabilità inter-mouse come un mouse può essere seguita per tutta la totalità della infezione e una valutazione qualitativa rapida di infezione si può osservare in qualsiasi momento. Il metodo altamente sensibile delle immagini bioluminescenza permette infezione di basso livello per essere identificati prima di microscopia sangue pellicola, con solo 100 trypanosomes rilevabili attraverso l'imaging rispetto ai 5 x 10 3 / ml trypanosomes rilevabili mediante microscopia 9. Inoltre, seguendo gli stessi animali tutto l'esperimento eliminares la necessità di gruppi di animali separati per ogni punto di tempo, riducendo notevolmente l'utilizzo degli animali.
Il protocollo di imaging qui descritto può essere adattato per soddisfare l'esigenza scientifica come la natura non invasiva significa che l'imaging ulteriori e più frequente può essere effettuato (con approvazione etica appropriata animali), ma per la valutazione di infezione cerebrale D21 è la prima volta punto. A questo punto, i farmaci in fase iniziale non sono più efficaci a chiarire i parassiti in fase avanzata. È inoltre indispensabile che i topi vengono esposte alle stesse condizioni in ogni punto. Ad esempio, gli stessi tempi di esposizione e stessa visualizzazione (ventrale o dorsale) dovrebbero essere utilizzati per assicurare una misurazione accurata del corso dell'infezione.
Se durante l'imaging assenza di segnale (quando è noto che il modello dovrebbe avere un'infezione), ci sono una serie di passi che possono essere seguiti per determinare l'origine del problema. In primo luogo, il tempo di esposizione può essere aumentatoad un massimo di 5 minuti, che dovrebbe essere in grado di rilevare il segnale molto basso bioluminescenza. Se il segnale non è ancora rilevato e pellicole di sangue sono positivi per parassiti, il passo successivo sarebbe quello di confermare se il parassita è ancora bioluminescenti. Ciò può essere eseguito utilizzando una vitro luciferasi test commerciale dell'attività e bioluminescenza sarebbero rilevati usando un luminometro. Se a questo punto il parassita non bioluminescenti è, la stabilità del costrutto nel parassita avrebbe bisogno di essere affrontate.
Il colore dei topi fa la differenza per la sensibilità dell'imaging come bioluminescenza emessa viene attenuato di pelliccia scura e 6,9 pelle. Scelta del ceppo di topi, come ad esempio i topi bianchi o topi nudi, può quindi migliorare i risultati. Se il colore del mouse è vincolato, ad esempio mediante l'uso di una linea transgenica, poi rasatura o depilazione topi in una regione di interesse può migliorare notevolmente la sensibilità 6.
deNonostante la maggiore sensibilità e segnalare che il modello bioluminescente produce, bioluminescenza non correla direttamente alla parassitemia periferica osservata in pellicole di sangue (giorni 7-21 mostrato in Figura 4). La letteratura ha documentato che l'infezione fase iniziale della tripanosomiasi infetta il sistema emolinfatico 1, e non è limitata unicamente al sistema sanguigno e questo, insieme con l'infezione di organi periferici, può spiegare perché quando parassitemia periferico è appena rilevabile nelle pellicole di sangue, bioluminescenza è visibile come è particolarmente evidente dai dati del giorno 7 in figura 3 e 4. Questo, tuttavia, significa che l'imaging bioluminescenza può essere usato solo come misura qualitativa di infezione, e ulteriori analisi è necessaria per determinare onere parassita assoluta.
Imaging bioluminescenza ha la capacità di essere usato con altri agenti patogeni infettivi che sono difficili da moNitor, con modelli di roditori di malattia di Chagas, la malaria e la toxoplasmosi già stabilito 13-16. L'elevato rapporto segnale-rumore di bioluminescenza accoppiato con la sua capacità di monitorare infezioni in tempo reale può fornire una più sensibile, la valutazione farmaco non invasiva, così come ottenere una migliore comprensione della cinetica di infezione del sistema nervoso centrale, rendendolo un valido strumento ricerca sulle malattie infettive.
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Acknowledgments
Ringraziamo John Kelly e Martin Taylor (London School of Hygiene & Tropical Medicine) per la fornitura di T. b. brucei GVR35-VSL-2 e il Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) per un consiglio su imaging in vivo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Bill e Melinda Gates Foundation globale Health Program (codice di autorizzazione OPPGH5337).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma, UK | P4417 | tablets pH 7.4 |
| Glucose | Sigma, UK | G8270 | 99.5% (molecular) grade |
| Ammonium chloride | Sigma, UK | A9434 | 99.5% (molecular) grade |
| Heparin (lithium salt) | Sigma, UK | H0878 | |
| Hi-FCS | Gibco, Life Technologies, UK | 10500-064 | 500 ml |
| DPBS | Sigma, UK | D4031 | Sterile filtered |
| Mr. Frosty | Nalgene, UK | ||
| Giemsa | Sigma, UK | G5637 | |
| D-Luciferin | Perkin Elmer, UK | ||
| Sigma, UK | 115144-35-9 | ||
| Diminazene aceturate | Sigma, UK | D7770 | Analytical grade |
| IVIS Lumina II | Perkin Elmer, UK | other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak | |
| Living Image v. 4.2 | Perkin Elmer, UK | proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own | |
| 1 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10142104 | |
| 20 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10743785 | |
| 25 G Needles | Greiner Bio-one | N2516 | |
| 21 G Needles | Greiner Bio-one | N2138 | |
| Twin-frosted microscope slide | VWR, UK | 631-0117 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | StarLab, UK | I1415-1000 | |
| 7 ml Bijou tube | StarLab, UK | E1412-0710 | |
| Mouse restrainer | Sigma, UK | Z756903 | our restrainer was made in-house, this is a similar model |
References
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