Protocol
倫理
すべての作業は、英国内務省動物（科学的手続）法1986と衛生＆熱帯医学動物福祉のロンドン・スクールと倫理審査委員会の承認の下で行いました。このレポートに続いているガイドラインに到着。
生物発光トリパノソーマブルセイのインビボ通路に1
- Tの凍結保存された株式（と呼ばれるstabilate）を削除B。トリパノソーマ株 GVR35-VSL-2（MTAを通じて衛生＆熱帯医学のロンドン・スクール教授のジョン・ケリーから入手可能）9液体窒素から、室温に平衡化することを可能にします。グルコース生理食塩水（PBS-G）は、pH 8.0（1L PBS + 15グラムのブドウ糖）10を滅菌リン酸緩衝で2×10 4トリパノソーマ/ mlにstabilateを希釈します。
注：T. B。トリパノソーマ GVR35-VSL-2は、ヒトに対して非感染性であり、SAPOは、実験を行うための施設をライセンスが必要です。 - インジェクション電気ショック療法0.2ミリリットル20〜25グラムのメスのCD1マウスは、25 G針で腹腔内経路（IP）経由トリパノソーマを希釈しました。これは、「ドナーマウス」です。特定病原体フリー（SPF）-cageおよび飼料を自由摂取に感染したマウスを置きます。
注：CD1マウスは近交系株及びT.ですB。トリパノソーマ GVR35感染はこの株でよく特徴付けられています。しかし、このプロトコルはまた、近交系または遺伝的に改変された株にも適用可能であるが、毛皮の色がイメージング6,9の感度に影響を与える可能性があることに留意することが重要です。 - 採血により末梢寄生虫を監視します。プラスチック製の制止にマウスを置き、21 G針や瀉血に静脈穿刺によって尾から血液の5μLを取り、赤血球を溶解し、より簡単にカウントを可能にするために、0.85％滅菌塩化アンモニウムで1/10を混ぜます。
- ノイバウアー血球計数器で希釈した血液をカウントします。
- 両室に希釈した血液をロードします。全体の中央グラムを数えます一方のチャンバのID は、nトリパノソーマを得ました。血液中のトリパノソーマの濃度= N×10 4トリパノソーマ/ mlで、任意の希釈倍率を調整し、2室の平均値を計算します。
注：後約5-7日後、感染、末梢寄生虫は、2×10 4トリパノソーマ/ mlの濃度で感染を行うために十分に上昇する必要があります。
- 両室に希釈した血液をロードします。全体の中央グラムを数えます一方のチャンバのID は、nトリパノソーマを得ました。血液中のトリパノソーマの濃度= N×10 4トリパノソーマ/ mlで、任意の希釈倍率を調整し、2室の平均値を計算します。
- トリパノソーマレベルが必要なマウスの数のために十分に高い場合には、1.6のステップに進みます。 1つのドナーマウスにおいて6×10 4トリパノソーマ/ mlの寄生虫血症レベルは、10匹のマウスの感染のために十分です。
注：統計的に有意なグループサイズは、N = 6匹のマウスの各処置群8を必要としています。感染症の他のモデルでは、電力の計算は、適切なグループサイズを決定するために適用される必要があるであろう。 - （約5〜10分間28-30℃で）熱ボックスに置きマウスは、尾静脈を拡張することを可能にします。終末麻酔を誘導するために、25 G針では20mg / kgのペントバルビタールの静脈内投与します。マウスは軽くない引っ込め反射がないことを確認するためにフットパッドを押すことによって麻酔されていることを確認。
- ビジューチューブに5000 USP単位/ mlで5ミリリットルのヘパリンを等分し、1ミリリットル注射器に取り付けられた針の内外二回吸引することによりヘパリンで治療する21 G針。
- ヘパリン処理した21 G針および1mlシリンジを取り、胸郭の下中央に針を挿入することにより、麻酔をかけた通路マウスの心臓穿刺を行う（血液のビーズは、針の基部にプールされます）、静かにプランジャーに引き戻します心臓の室を崩壊させないように。血液の0.7ミリリットルの最小値を収集します。
- 上記のステップ1.1のようにPBS-G pHが8.0で2×10 4トリパノソーマ/ mlの接種物を生成するために感染した血液を希釈します。
注：この時点で、残りの血液を8％グリセロールと混合することによってstabilateを生成するために凍結保存することができ、20％の熱不活性化胎児CALF血清（ハイFCS）および72％感染した血液。ゆっくりと液体窒素に移す前に、-1℃/分の冷却速度を達成するために、遅い凍結冷凍コンテナを使用して、-80℃で凍結します。
実験マウスの2.感染
- 静脈を拡張するために優しく暖かいに加熱ボックスにCD1雌マウス（〜21〜25グラム）を配置します。プラスチック製の拘束に温めマウスを置き、マウス当たり4000トリパノソーマと同等の尾静脈に25 G針、静脈内に接種物を希釈した0.2ミリリットルを注入。出血を止めるために、その後、注射部位に圧力をかけます。
注：腹腔内感染症は、感染の有効なルートであり、10以前の研究で使用されてきたが、我々は、静脈内経路よりも、この少ない再現性を発見しました。 - SPF-通気ケージに3のグループでの感染マウスとケージをランダム。対照として、野生型の非生物発光寄生虫、TとCD1雌マウスを注入B。ブルセイ GVR35 た（n =3）。
- ブラッドフィルム顕微鏡を介して感染を監視します
- 静脈穿刺または瀉血からスポット5μlの血液をスライドガラス上に血液塗抹標本行う（第2のガラススライドを使用して静かに薄膜を生成するために、スライド全体に一滴の血液を押します）。空気乾燥にスライドを許可します。
- dH 2 Oでリンスする前に10分間ギムザで100％のメタノールと染色で血液塗抹標本を修正し、空気乾燥させ。 100Xの目的の下で10視野（FOV）内のトリパノソーマの数を数えます。
注：血液撮影が早くも1日、感染後のような、動物全体の非侵襲的イメージングと一緒に行われます。動物の数を処理するときにサンプルを室温で保存し、後にカウントすることができるように、トリパノソーマ定量化のこの方法は、血球計計数よりも好ましいです。
3.生物発光イメージングは、感染を追跡します
注意：感染を監視するには、全体のアニメーションアル非侵襲的イメージングを使用することができます。
- 30 mg / mlとでダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中のD-ルシフェリン、ホタルルシフェラーゼ基質のストック溶液を準備します。フィルタは、滅菌し、-20℃でアリコートで凍結します。
注：D-ルシフェリンは光に敏感である、したがって箔にアリコートを包むことにより、光から保護します。それは活動11に影響を与えることができるように繰り返しルシフェリン凍結融解しないでください。 - 室温にD-ルシフェリンのアリコートを温めます。 （nonbioluminescent野生型寄生虫株に感染対照マウスを含む）ケージから各マウスを取り外し、25 G針を腹腔内（DPBSで希釈）温めD-ルシフェリン150mgの/キロを注入。 /分2.5 Lで2％のイソフルラン/ O 2混合物で麻酔を誘導するために約5分間イソフルランチャンバー内にマウスを置きます。
注：彼らは麻酔下にあるときにマウスを不動になります。ここで使用される撮像装置では、3匹のマウスを一度に処理することができます。マウスはanesthetある場合30分より長く化された、眼科用人工涙軟膏乾燥からマウスの眼を防止するために適用することができます。 - ここで説明したイメージャの場合は、ソフトウェアを開き、製造元の指示に従ってソフトウェアを使用してマシンを初期化します。カメラや加熱されたプレートは温度に達した後の画像を取得します。
注：この機器は、通常、一晩バックグラウンドキャリブレーションを実行するためにマシンを可能にする、オフにされていません。それが再起動する必要がある場合には、それは最初の校正チェックを実行する必要があります。 - （3.5を参照）イメージャに麻酔したマウスを置きます。任意の明るい生物発光信号の滲み出し最小限にするためにマウスとの間に大きな黒のセパレータを使用してください。露光時間のセットを使用して画像マウス。 1、3、10、30、60および180秒、メディアビニング、1 F /ストップ、オープンフィルタ、およびビューE（12.5 X 12.5 cm 2）でのフィールドを持ちます。
注：野生型nonbioluminescent GVR35寄生虫に感染した対照マウスは、backgrを提供しますound生物発光値。このモデルとルシフェリン動態実験（ 図6）から、我々は10分で生物発光信号のピークは投与後とイメージングは、約3匹のマウスのための5分を取ることを見出しました。麻酔マウスを撮影するときに考慮し、このタイムスケールを取ります。 - マウスの完全な画像化を確実にするために、腹側、背側及び側面図を得るために回転させます。シーケンシャル動物間イメージングのためのオリエンテーションのための一貫性を維持します。
- 撮影後、マウスはSPF-ケージに戻る前に観察下麻酔から回復することができます。
- 21日目、感染後まで7日毎にマウスを画像化を続行します。動物全体にわたる生物発光信号が着実に増加があるはずです。
- D21、画像および血液フィルムでのマウス前述したように、腹腔内に40mg / kgのジミナゼン・アセチュレートをマウスに投与量。この薬は、末梢寄生虫がクリアされますが、血液braiを横断しませんn個の障壁は、したがって、CNS感染のより良い可視化を可能にします。
注：ジミナゼンのaceturateは早期ナガナ病を治療するために使用される十分に確立された薬物です。 - D28とD35で撮影し、監視を続けます。
4. CNS感染を確認
- D35では、上記で詳述したように、画像マウス（3.1〜3.4ステップ）。
- 撮影後、さらなる分析のために血液を採取し、ステップ1.6から1.8で詳述したようにマウスが麻酔と放血させるマウスから回復することができます。
- 臓器から血液をクリアすると、時間間隔にわたって脳の領域から除去されている可能性があるルシフェリンのラベルを再導入するために、心臓を経由して：心臓穿刺に続いて、20ミリリットルのPBS（灌流液にルシフェリンの3 mg / mlでの追加オプション）でマウスを灌流ステップ4.1から。
- 静かに脳を可能にするために、湾曲したハサミを使用して、頭蓋骨の周囲ベースから切断し、頭蓋骨の上部を持ち上げて、脳を削除緩やかに湾曲鉗子を用いて持ち上げることができます。
- 適切なルシフェリンを確保するために、撮像前に臓器を超える15 mg / mlとルシフェリン50μlの黒いプラスチックピペットのセクションに摘出した脳を置き切除した脳に追加されました。上記のように設定を使用してイメージ。これは、脳半球への感染の局在化を実証します。
注意：以前に8に記載のように下流摘出脳の寄生虫の定量化は、定量PCRにより行うことができます。他の代替ダウンストリームアプリケーションは、固定後の脳組織内の寄生虫を識別するために、組織学または免疫組織化学が含まれる場合があります。
生物発光イメージングの5定量
注：生物発光は、イメージングソフトウェアを用いて関心領域（ROI）を用いて定量化し、バックグラウンド生物発光のために補正することができます。
- ROIツールを使用して、動物全体の定量aの長方形のROIを作成しますNDマウスの尾の付け根に鼻の先端をカバーするために、マウスの画像の上にそれを配置します。すべての動物、すべての時点について、同じサイズのボックスを使用します。脳のための投資収益率を見ると、画像中のマウスの頭部領域の上に配置する、同じように円形のROIを使用。
- 必要であれば、感染を視覚的に表現するために同じスペクトル上に表示されるように画像を調整します。
注：ここで使用されるソフトウェアは自動的に最小値と最大光子カウントのために調整画像ごとにカラーマップを生成します。一連の画像間の視覚的な比較を可能にするために、カラースケールは、すべての画像に同じ値に設定する必要があります。- （経験的に決定される）ツールパレット上で最高の生物発光と「画質調整」タブで画像を使用して、対数スケールを選択し、適切なカラースケールの最小値と最大値。実験を通してすべての画像にこのスケールを適用します。
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Representative Results
このプロトコルは、Tを用いたマウスの感染後の疾患の進行を追跡するために方法を示しますB。トリパノソーマ 、人間のアフリカトリパノソーマ症のためのモデルが。1治療およびイメージングのステップのためのタイムテーブルを実証し、実験プロトコルのタイムラインを示す図 。 図2は 、末梢寄生虫を定量するために使用される固定ギムザ染色血液塗抹標本のビューの一般的なフィールドを示していますトリパノソーマおよび赤血球に存在しています。動物における感染症の発症は、各時点で撮像された同一の動物を用いた実験の過程で感染した動物を示す図3のように生物発光を測定することによって追跡することができます。感染の経過を通じて、生物発光の増加は、BLIの高い領域（赤として表現して信号は、より散在性と強くなるように、第1の21日間ですべての動物で観察することができます脾臓エリア内）ヒートマップスケールから。 図1は 、イメージング後に詳述するようにD21マウスをジミナゼン・アセチュレートで処理し、そして周辺感染がクリアされるように生物発光の低下は、信号の低レベルは、マウスの頭部に存在すると、D28で観察することができますで。 D35での信号は、依然として頭部領域に残り、可能な脳の感染症を示す、より強烈になってきています。脳信号を確認するために摘出された脳組織内に存在し、その後qPCRにより定量することができます。
伝統的に、血液塗抹標本は、感染の進行及び治療の効果を定量するために使用されます。しかし、これらは、末梢寄生虫血を測定し、脳内の寄生虫のレベルを評価するために使用することができない。 図4は、末梢寄生虫および疾患動態を実証する生物発光の両方の定量を組み合わせる図 。 D7で高BLI信号は、10 8の存在であります図3に見られる頭部領域における生物発光の測定値。これは、従来の血液フィルムカウントの上に生物発光のアプローチのより高い感度を示しています。
頭部領域における生物発光は本当に脳を摘出し、実験とbioluminesの終了時に、脳組織にローカライズされていることを確認するにはcenceは、ex vivo（ 図5）を測定しました。脳の間に感染負担の差がしばしば見られ、信号が感染動物の間で変化することができる強烈なBLI信号の分布として特定の解剖学的領域に局在することが表示されません。マウス1からの脳は、すべての脳を超えるBLI信号の一般的な分布を示しているが、例えば、強いBLI信号は、マウス2と3で、マウス3の小脳における嗅球に存在しています。脳を直ちに、マウスを殺処分した後に画像化することができるように組織をex vivoでイメージングプロセスで破損されないように、さらなる分析は、脳組織上で行うことができます。
図1： イメージング、サンプリングと治療を含む実験のタイムラインにより生物発光イメージングの非侵襲的性質のために、感染の監視はMOを発生することがあります。図に詳述さよりも頻繁に再。サンプリングおよびイメージングは7日ごとに進行し、感染の識別を可能にします。ジミナゼン・アセチュレートとD21での治療は、頭部と脳感染のより良い可視化を可能にするために、周辺寄生虫を除去します。ジミナゼン・アセチュレートは、初期段階の薬剤であり、後期感染をクリアするのに十分な量の血液脳関門を通過することができません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ギムザ染色したトリパノソーマ固定血液膜上に、ギムザ染色トリパノソーマ（ピンク核を有する紫は、矢印閉じ）は、赤血球（染色青、白矢印）に対して容易に検出可能であり、すぐに数を取得するためにカウントすることができますトリパノソーマ/ 10100Xの目的の下での視野。スケールバーは10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：感染マウスの生物発光イメージング 6 VSL-2（M =マウス）に感染したマウスと（野生型nonbioluminescent寄生虫ラインを感染させた）は、野生型感染対照群の3つの代表的な動物。ルシフェリンはまた、バックグラウンド測定を提供し、撮像する前にコントロールマウスに投与しました。ヒートマップのスケールは、生物発光（D =日）の低いレベルを示すハイ寄生虫の数、及び青に等化、生物発光の赤色を示す高レベルで示されています。対照マウスは、無ルシフェラーゼ発現寄生虫と予想されるように何の生物発光を持っていません。画像f ROMバレル-Saward ら 8オックスフォード大学出版局の許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：生物発光と血フィルム寄生虫血症の比較部5と、血液塗抹標本に寄生虫をカウントすることにより定量化、周辺寄生虫で説明したように、各動物全体の総生物発光を定量しました。エラーバーは平均からの標準偏差を表します。バレル-Saward ら 8オックスフォード大学出版局の許可を得てからの画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5：4.5で説明したように摘出脳の ex vivo イメージングは 、図3で撮像されたマウスの灌流脳を摘出し、画像化しました。生物発光は、図3野生型nonbioluminescent寄生虫に感染したマウスからの対照脳のようなヒートマップのスケールで測定されるもルシフェリンで処理し、いかなる生物発光を観察することができません。スケールバーは1cmに示します。この図は、オックスフォード大学出版局の許可を得てバレル-Saward ら 8から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：VSL-2に感染したマウスにおけるルシフェリン生物発光の動力学。三VSL-2に感染したCD1マウスは、ルシフェリンの150 mgの/ kg腹腔内に注射し、イメージャの中に直ちに置きました。マウスを、60分かけて画像化し、それらの生物発光は、ルシフェリン投与後最適な画像窓を決定するために計算された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
生物発光Tの開発B。トリパノソーマ GVR35株は、初期から後期までトリパノソーマ感染の可視化を可能にします。以前の感染モデルは、血液フィルム顕微鏡からリアルタイムに、寄生虫は、脳にある場合、後期を検出することができなかった、および寄生虫負荷12を決定するために、感染マウスからの脳の淘汰及び除去を必要としました。単一のマウスが感染の全体を通して追跡することができ、感染の迅速な定性的評価は、いずれかの段階で観察することができるように生物発光は、インターマウスのばらつきを低減します。生物発光イメージングの高感度方法は、低レベルの感染は顕微鏡〜9 mlの検出可能な5×10 3トリパノソーマ/に比べて撮像して検出可能なわずか100としてトリパノソーマで、血液フィルムの顕微鏡よりも先に識別することができます。また、実験を通して同じ動物を、以下のことは排除します各時点について別々の動物群の必要性は非常に動物の使用量を低減すること、です。
ここに記載の撮像プロトコルは、非侵襲的な性質は、追加の、より頻繁なイメージングは（適切な動物倫理承認を得て）行うことができることを意味する科学的必要性に合うように適合されたが、脳感染D21の評価のために最も早い時間であることができますポイント。この時点では、初期段階の薬物はもはや後期寄生虫をクリアするのに有効ではありません。マウスを各時点で同じ条件で撮像されていることも不可欠です。例えば、同一の露光時間と同じビュー（腹側または背側）は感染の経過の正確な測定を確実にするために使用されるべきです。
（モデルが感染しているべきであることが知られているとき）は信号を画像化しない中に存在する場合、問題の原因を決定するために追跡することができるステップの数があります。まず、露光時間を増加させることができます非常に低い生物発光シグナルを検出することができる必要があり、5分の最大値です。信号がまだ検出され、血液のフィルムは寄生虫に対して陽性であるれていない場合、次のステップは、寄生虫が依然として生物発光であるかどうかを確認することであろう。これは、ルミノメーターを用いて検出されるコマーシャルインビトロルシフェラーゼ活性アッセイおよび生物発光を用いて行うことができます。この時点で寄生虫がもはや生物発光である場合、寄生虫における構築物の安定性に対処する必要はないであろう。
放出された生物発光が暗い毛皮と肌の6,9によって減衰されるようにマウスの色は、撮影の感度の違いになります。このような白いマウスまたはヌードマウスのようなマウス株の選択は、したがって結果を改善することができます。マウスの色が制約されている場合は、トランスジェニックラインの使用によって、例えば、次にシェービングまたは大幅に感度6を向上させることができ、関心領域にマウスを脱毛。
デにもかかわらず生物発光モデルが生成する改善された感度と信号、生物発光は、直接血フィルムで観察された周辺の寄生虫（ 図4に示されている日7月21日）には相関関係はありません。文学は、トリパノソーマ症の初期段階の感染がhemolymphaticシステム1に感染していることを文書化した、ともっぱら血液系に限定されず、末梢寄生虫血症は、血液映画の中でほとんど検出されたとき、これは、末梢器官の感染に伴って、なぜを説明することができます図3および4で7日目のデータから特に明らかなように、生物発光が表示されます。しかし、これは生物発光イメージングのみ感染の定性的測定として使用することができ、そしてさらなる分析が絶対寄生負荷を決定するために必要であることを意味しています。
生物発光イメージングは、MOが困難な他の感染性病原体に使用される能力を有しますnitorは、シャーガス病、マラリア、トキソプラズマ症のげっ歯類モデルで、すでに13-16を設立しました。リアルタイム感染を追跡する能力と結合された生物発光の高い信号対雑音比は、より敏感な、非侵襲的な薬物の評価を提供するだけでなく、中枢神経系感染動態のより良い理解を得ることができ、それは貴重なツールで行います感染症研究。
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Acknowledgments
我々はTを提供するためのジョン・ケリーとマーティン・テイラー（衛生＆熱帯医学のロンドン・スクール）を感謝しますB。トリパノソーマ GVR35-VSL-2およびin vivoイメージングのアドバイス博士アンドレアZELMER（LSHTM）。この作品は、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団グローバル・ヘルス・プログラム（助成金番号OPPGH5337）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma, UK | P4417 | tablets pH 7.4 |
| Glucose | Sigma, UK | G8270 | 99.5% (molecular) grade |
| Ammonium chloride | Sigma, UK | A9434 | 99.5% (molecular) grade |
| Heparin (lithium salt) | Sigma, UK | H0878 | |
| Hi-FCS | Gibco, Life Technologies, UK | 10500-064 | 500 ml |
| DPBS | Sigma, UK | D4031 | Sterile filtered |
| Mr. Frosty | Nalgene, UK | ||
| Giemsa | Sigma, UK | G5637 | |
| D-Luciferin | Perkin Elmer, UK | ||
| Sigma, UK | 115144-35-9 | ||
| Diminazene aceturate | Sigma, UK | D7770 | Analytical grade |
| IVIS Lumina II | Perkin Elmer, UK | other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak | |
| Living Image v. 4.2 | Perkin Elmer, UK | proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own | |
| 1 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10142104 | |
| 20 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10743785 | |
| 25 G Needles | Greiner Bio-one | N2516 | |
| 21 G Needles | Greiner Bio-one | N2138 | |
| Twin-frosted microscope slide | VWR, UK | 631-0117 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | StarLab, UK | I1415-1000 | |
| 7 ml Bijou tube | StarLab, UK | E1412-0710 | |
| Mouse restrainer | Sigma, UK | Z756903 | our restrainer was made in-house, this is a similar model |
References
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