Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bioluminesens Imaging å oppdage sent stadium smitte av sovesyke

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

etikk
Alt arbeid ble utført under godkjenning av de britiske hjemmekontoret Dyr (Scientific Procedures) Act 1986 og London School of Hygiene & Tropical Medicine dyrevelferd og etikk Review Board. ANKOMMER retningslinje følges i denne rapporten.

1. I Vivo Passage av Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

  1. Fjern en kryopreserveres lager (kalt stabilate) av T. b. brucei belastning GVR35-VSL-2 (tilgjengelig fra Professor John Kelly ved London School of Hygiene & Tropical Medicine gjennom MTA) 9 fra flytende nitrogen og la til romtemperatur. Fortynn stabilate til 2 x 10 4 trypanosomer / ml i steril fosfatbuffer-glukose saltvann (PBS-G), pH 8,0 (1 liter PBS + 15 g glukose) 10.
    Merk: T. b. brucei GVR35-VSL-2 er ikke-smittsomme for mennesker og krever SAPO lisensiert fasiliteter for å utføre eksperimenter.
  2. inject en 20-25 g kvinnelige CD1 mus med 0,2 ml fortynnet trypanosomer via intraperitonealt (ip) med en 25 G nål. Dette er den "donor mus". Plasser den infiserte mus inn i en bestemt Patogen Gratis (SPF) -cage og fôr ad libitum.
    Merk: CD1 mus er en outbred belastning og T. b. brucei GVR35 infeksjoner er godt karakterisert i denne stammen. Imidlertid er denne protokollen også gjelder for innavlede eller genmodifiserte stammer, men det er viktig å merke seg at pelsfarge kan påvirke følsomheten til bildebehandling 6,9.
  3. Overvåk perifert parasitemia ved blodprøvetaking. Plassere musen i en plast rainer og ta 5 ul av blod fra hale ved venepunksjon med 21 G nål eller årelating og bland 1/10 med sterilt 0,85% ammoniumklorid for å lysere røde blodceller og tillate lettere å telle.
  4. Tell Fortynnet blod i et Neubauer hemocytometer.
    1. Last fortynnet blod inn i begge kamre. Tell midt grid av et kammer for å gi N trypanosomer. Konsentrasjon av trypanosomer i blod = N x 10 trypanosomer / ml 4, justere for eventuell fortynning faktor og beregne gjennomsnittet av de to kamre.
      Merk: Etter ca 5-7 dager etter smitte, bør perifere parasitemia stige tilstrekkelig til å gjennomføre en infeksjon i en konsentrasjon på 2 x 10 4 trypanosomer / ml.
  5. Når trypanosom nivåene er høye nok til at antall mus som kreves, gå videre til trinn 1.6. En parasitemia nivå på 6 x 10 trypanosomer / 4 ml i en donor mus er tilstrekkelig for infeksjon av 10 mus.
    Merk: For statistisk signifikante gruppe størrelser, n = 6 for hver behandlingsgruppe av mus er nødvendig 8. For andre modeller av infeksjon, ville kraftberegninger må brukes for å fastsette egnede gruppe størrelser.
  6. Plasser mus i en varmeboks (ved 28-30 ° C i ca. 5-10 minutter) for å tillate halevenene til å utvide seg.For å indusere terminal anestesi, administreres 20 mg / kg pentobarbital iv med en 25 G nål. Bekreft musen er bedøvet ved å trykke forsiktig på footpads å sikre at det ikke uttak refleks.
  7. Heparinisere en 21 G nål ved alikvoteringsprosessen 5 ml heparin ved 5000 USP-enheter / ml i en Powell rør og suger to ganger inn og ut av nålen er festet til en 1 ml sprøyte.
  8. Ta heparinisert 21 G nål og 1 ml sprøyte, og utføre hjertepunktering på en bedøvet passasje mus ved å stikke nålen sentralt under brystkassen (en dråpe blod vil basseng i bunnen av nål) og forsiktig trekke tilbake på stempelet for ikke å skjule kammer av hjertet. Samle minst 0,7 ml blod.
  9. Fortynn infisert blod for å fremstille et inokulum på 2 x 10 4 trypanosomer / ml i PBS-G, pH 8,0 som steg 1.1 ovenfor.
    Note: På dette punktet, det resterende blod, kan fryses ned for å fremstille stabilate ved å blande med 8% glycerol, 20% varme-inaktivert føtalt ca.lf serum (hi-FCS) og 72% infisert blod. Sakte fryses ved -80 ° C under anvendelse av en langsom frysing frysebeholder for å oppnå en avkjølingshastighet på 1 ° C / min, før de overføres til flytende nitrogen.

2. Infeksjon of Experimental Mus

  1. Plasser CD1 hunnmus (~ 21-25 g) i en varmeboks til behagelig varme å utvide blodårene. Plasser varmet mus i en plaststøttene og injisere 0,2 ml fortynnet inokulum intravenøst ​​med en 25 G nål inn i halevenen, tilsvarende 4000 trypanosomer per mus. Sett press på injeksjonsstedet etterpå for å stanse blødningen.
    Merk: Intraperitoneal infeksjon er en gyldig infeksjonsrute og har vært brukt i tidligere studier 10, men vi har funnet dette mindre reproduserbar enn intravenøst.
  2. Tilfeldig infiserte mus og bur i grupper på tre i SPF-ventilerte bur. Som en kontroll, injisere CD1 hunnmus med villtype ikke-selvlysende parasitt, T. b. brucei GVR35 (n =3).
  3. Overvåk smitte gjennom blod Film Mikroskopi
    1. Spot 5 mL blod fra venepunksjon eller årelating på en glassplate og utføre et blodutstryk (ved hjelp av en andre glass lysbilde skyv dråpe blod over raset for å produsere en tynn film). Tillat lysbilder lufttørke.
    2. Fest blodutstryk med 100% metanol og flekken med Giemsa i 10 minutter før du skyller med dH 2 O og la det lufttørke. Under 100X objektiv telle antall trypanosomer i 10 synsfelt (FOV).
      Merk: Blod innspillingen utføres langs hele dyret ikke-invasiv avbildning så tidlig som en dag etter infeksjonen. Ved behandling av et antall dyr, er denne fremgangsmåte av trypanosom kvantifisering foretrukket over hemocytometer telling som prøvene kan lagres ved romtemperatur og telles senere.

3. Bioluminesens Imaging til spor infeksjon

Merk: For å overvåke infeksjon, hele animal ikke-invasiv avbildning kan benyttes.

  1. Fremstille en stamoppløsning av D-luciferin, den ildflueluciferase substratet, i Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning (DPBS) ved 30 mg / ml. Filter sterilisere og fryse i alikvoter ved -20 ° C.
    Merk: D-Luciferin er lysfølsom, derfor beskytte mot lys, ved å pakke porsjoner i folie. Ikke gjentatte fryse-tine luciferin som det kan påvirke aktivitet 11.
  2. Varm en delmengde av D-luciferin til romtemperatur. Fjern hver mus fra buret (inkludert kontroll mus infisert med nonbioluminescent vill-type parasitt-stamme) og injisere 150 mg / kg av den oppvarmede D-luciferin (fortynnet i DPBS) intraperitonealt med en 25 G nål. Plasser mus inn i et kammer isofluorane i ca. 5 minutter for å fremkalle bedøvelse med 2% isofluorane / O 2 blanding på 2,5 l / min.
    Merk: Mus blir immobile når de er under anestesi. For bildefanger som brukes her, kan 3 mus behandles om gangen. Dersom musene er anesthetsert i mer enn 30 minutter, kan oftalmisk kunstig tåre salve brukes for å hindre øynene av mus tørker ut.
  3. For imager er beskrevet her, åpne programvaren og initialisere maskinen ved hjelp av programvaren i henhold til produsentens anvisninger. Hente bilder når kamera og oppvarmet plate har nådd temperaturen.
    Merk: Dette instrumentet er vanligvis ikke slått av, slik at maskinen til å utføre bakgrunns kalibreringer over natten. I tilfelle at det er behov for å starte på nytt, må det kjøres en kalibreringssjekk først.
  4. Plasser bedøvet mus inn i imager (se 3.5). Bruk store sorte skilleark mellom musene å redusere blø gjennom av noen lyse selvlysende signal. Bilde mus ved hjelp av et sett med eksponeringstider; 1, 3, 10, 30, 60 og 180 sekunder, med medium binning, en f / stopp og et åpent filter, og synsfelt E (12,5 x 12,5 cm 2).
    Merk: Kontroll mus infisert med villtype nonbioluminescent GVR35 parasitter gi en background bioluminesens verdi. Fra en luciferin kinetikk eksperiment (figur 6) med denne modellen, har vi funnet ut at bioluminescence signal topper på 10 minutter etter administrasjon og bildebehandling tar ca 5 min for 3 mus. Ta denne tidsskalaen i betraktning når bedøvelse og bildebehandling musene.
  5. For å sikre grundig avbildning av musene, rotere for å få en ventral, rygg- og sidevisning. Opprettholde konsistens i størrelsesorden orientering for avbildning mellom sekvensielle dyr.
  6. Etter bildebehandling, la mus for å gjenopprette fra anestesi under observasjon før retur til SPF-buret.
  7. Fortsett bildebehandling mus hver 7. dag til dag 21 etter smitte. Det bør være en jevn økning i bioluminescens signal over hele dyret.
  8. På D21, bilde og blod film musene som beskrevet ovenfor, og dose mus med 40 mg / kg diminazene aceturate intraperitonealt. Dette stoffet vil fjerne perifere parasitemia men vil ikke krysse blod-brain barriere, og muliggjør således bedre visualisering av CNS-infeksjon.
    Merk: Diminazene aceturate er et veletablert legemiddel som brukes til å behandle tidlig stadium dyr trypanosomiasis.
  9. Fortsett bildebehandling og overvåking på D28 og D35.

4. Bekrefte CNS infeksjon

  1. På D35, bilde mus som beskrevet ovenfor (trinn 3,1-3,4).
  2. Etter bildebehandling, la mus for å gjenopprette fra anestesi og exsanguinate mus som beskrevet i trinn 1,6-1,8, samle blod for videre analyse.
  3. Etter hjertepunktering, perfuse mus med 20 ml PBS (valgfritt: legg til 3 mg / ml av luciferin til perfusjon oppløsning) via hjertet for å fjerne blod fra organer og for å gjeninnføre luciferin etikett som kan ha fjernet fra hjernen regionen i løpet av tidsintervallet fra trinn 4.1.
  4. Fjern forsiktig hjernen, ved hjelp av buede saks, skjæring fra bunnen rundt omkretsen av skallen, og løfting av den øverste delen av skallen, for å tillate hjernenå være forsiktig løftet ut med buede tang.
  5. Plasser skåret hjernen på en del av svart plast og pipette 50 mL av 15 mg / ml luciferin over orgelet før bildebehandling, for å sikre tilstrekkelig luciferin er lagt til det utskårede hjernen. Bilde med de innstillingene som ovenfor. Dette vil demonstrere lokalisering av smitte til hjernehalvdelene.
    Merk: Nedstrøms kvantifisering av parasitemia på det utskårede hjernen kan utføres ved qPCR som tidligere beskrevet 8. Andre alternative nedstrøms programmer kan inkludere histologi eller immunhistokjemi for å identifisere parasitter på hjernevev følgende fiksering.

5. Kvantifisering av Bioluminesens Imaging

Merk: Bioluminesens kan kvantifiseres ved hjelp av regionen av interesse (ROI) med bildebehandlingsprogrammer og korrigert for bakgrunns bioluminesens.

  1. Ved hjelp av ROI-verktøy, skape et rektangulært ROI for hele dyret kvantifisering ennd plassere den over musen bildet for å dekke nesetippen til roten av halen på musen. Bruk samme størrelse boks for hvert dyr og hvert tidspunkt. Når du ser på ROI for hjernen, bruk sirkel ROI på samme måte, plassere den over musen hodet regionen i bildet.
  2. Hvis ønskelig kan du justere bildene skal vises på samme spekteret for en visuell representasjon av infeksjon.
    Merk: Programvaren som brukes her genererer et fargekart for hvert bilde automatisk justert for minimums- og maksimumsfoton teller. For å aktivere visuell sammenligning mellom en serie med bilder, må fargeskalaen settes til de samme verdiene for alle bilder.
    1. Bruk av bildet med den høyeste bioluminescence og "Bilde justere fanen på verktøypaletten, velger du en logaritmisk skala og en passende fargeskala minimum og maksimum (som skal bestemmes empirisk). Bruk denne skalaen til alle bildene i hele forsøket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen demonstrerer hvordan å følge sykdomsprogresjon etter infeksjon av mus med T. b. brucei, en modell for human sovesyke. Figur 1 viser tidslinjen av den eksperimentelle protokollen, viser tidsplanen for behandling og bildebehandling trinn. Figur 2 viser en typisk synsfelt i en fast Giemsa-farget blodutstryk anvendt for å kvantifisere perifer parasitemia, med trypanosomer og røde blodceller til stede. Utvikling av infeksjon hos dyr kan følges ved å måle Bioluminescens som i figur 3, som viser de infiserte dyr i løpet av et eksperiment med de samme dyrene avbildes ved hvert tidspunkt. Gjennom i løpet av infeksjons en økning i bioluminescens kan observeres i alle dyrene i løpet av de første 21 dagene som signalet blir mer intens og disseminert, med høye regioner av BLI (representert som rødfra varmen kartmålestokk) i milten området. Ved D21 mus behandles med diminazene aceturate som vist i figur 1, post-avbildning, og et fall i biolumine kan observeres ved D28 som omkrets infeksjon er fjernet, med lave nivåer av signal er tilstede i hoderegionen av musene. Ved D35 fremdeles forblir signalet i hoderegionen og er blitt mer intens som indikerer en mulig hjerneinfeksjon. Hjernen er skåret ut for å bekrefte at signalet er til stede i hjernevevet, og kan deretter bli kvantifisert ved qPCR.

Tradisjonelt er blodutstryk brukes til å kvantifisere infeksjon progresjon og behandlingseffekter. Men disse bare måle perifer parasittemi, og kan ikke brukes til å evaluere parasitt-nivåer i hjernen. Figur 4 kombinerer kvantifisering av både det perifere og parasittemi bioluminescens for å demonstrere sykdomskinetikk. På D7 høy BLI signal er tilstede på 10 8 figur 3 . Dette viser større følsomhet for bioluminescence tilnærming enn tradisjonell blod film telling.

For å kontrollere at bioluminescence i hodet regionen er virkelig lokalisere til hjernevev, på slutten av eksperimentet hjernen er skåret ut og bioluminescence målt ex vivo (figur 5). En forskjell i infeksjon belastning mellom hjernene blir ofte sett og signal synes ikke å lokalisere til spesifikke anatomiske regioner som fordeling av intens BLI signal kan variere mellom infiserte dyr. For eksempel, er sterk BLI signal til stede i luktelappen i mus 2 og 3 og i lillehjernen hos mus 3, mens hjernen fra mus viser en generell fordeling av BLI signal over hele hjernen. Som hjernen kan avbildes umiddelbart etter selektiv avlivning musene, kan ytterligere analyse utføres på hjernevevet som vevet ikke blir skadet i ex vivo avbildningsprosessen.

Figur 1
Figur 1:. Tidslinje for Experiment inkludert Imaging, Prøvetaking og behandling på grunn av den ikke-invasiv natur bioluminesens imaging, kan overvåking av infeksjon more ofte enn beskrevet i diagrammet. Prøvetaking og bilde hver 7. dag muliggjøre identifikasjon av den vandrende infeksjon. Behandlingen ved D21 med diminazene aceturate fjerner perifer parasitemia å gi bedre visualisering av hodet og hjerneinfeksjon. Diminazene aceturate er et tidlig stadium narkotika og er ikke i stand til å passere blod-hjerne-barrieren i mengder tilstrekkelig for å fjerne sent stadium infeksjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Giemsa Stained trypanosomer På en fast blod film, Giemsa farget trypanosomer (lilla med rosa kjerne, lukket pil) er lett synlig mot de røde blodcellene (farget blå, åpen pil) og kan raskt telles for å få antall trypanosomer / 10synsfelt under ett 100X objektiv. Målestokk betegner 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Bioluminesens Imaging av infiserte mus Tre representative dyr av en gruppe på 6 mus infisert med VSL-2 (M = mus) og et villtype infisert kontroll (infisert med villtype nonbioluminescent parasitt linje).. Luciferin ble også administrert til kontrollgruppen mus før avbildning, noe som gir bakgrunnen målingen. En varmekartmålestokk er vist med rød indikerer høye nivåer av bioluminesens, tilsvarende høyt antall parasitter og blått indikerer lave nivåer av bioluminesens (D = dag). Kontrollen mus har ingen bioluminesens som forventet, uten luciferase-uttrykke parasitter. Bilde f rom Burrell-Saward et al. 8 med tillatelse fra Oxford University Press. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Sammenligning av Bioluminesens og Blood Film parasitemia Total bioluminescence av hver hele dyret ble kvantifisert som beskrevet i kapittel 5 og perifer parasitemia kvantifisert ved å telle parasitter i blodutstryk. Feil striper angir standardavvik fra middelverdien. Bilde fra Burrell-Saward et al. 8 med tillatelse fra Oxford University Press. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54032 / 54032fig5.jpg "/>
Fig. 5: Ex vivo avbildning av utskårede Brain De perfuserte hjernen til musene fotografert i figur 3 ble fjernet og avbildes som beskrevet i 4.5. Bioluminesens måles på et varmekartmålestokk som for figur 3. Styre hjerne fra en mus infisert med villtype nonbioluminescent parasitter ble også behandlet med luciferin og ingen bioluminescens kan observeres. Målestokk betegner 1 cm. Dette tallet har blitt forandret fra Burrell-Saward et al. 8 med tillatelse fra Oxford University Press. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6
Figur 6: Kinetics av Luciferin Bioluminesens i VSL-2-infiserte mus.Tre VSL-2-infiserte CD1 mus ble injisert med 150 mg / kg ip av luciferin og plasseres umiddelbart i imager. Musene ble fotografert over 60 minutter og deres bioluminesens ble beregnet til å bestemme den optimale bildevinduet etter luciferin administrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utviklingen av en bioluminescent T. b. brucei GVR35 belastning tillater visualisering av en trypanosom infeksjon fra tidlig til sent stadium. Tidligere smittemodeller ikke var i stand til å oppdage sent stadium, når parasitter er i hjernen, i sanntid fra blod film mikroskopi, og krevde culling og fjerning av hjerner fra den infiserte mus for å bestemme parasitt byrde 12. Bioluminescence reduserer inter-mus variasjon som et enkelt muse kan spores gjennom helheten av infeksjonen og en rask kvalitativ vurdering av infeksjon kan observeres på noe tidspunkt. Den svært følsom metode for biolumine avbildning muliggjør lavt nivå infeksjon som skal identifiseres tidligere enn blod-film mikroskopi, med så få som 100 trypanosomer detekterbare gjennom avbildning i forhold til de 5 x 10 3 trypanosomer / ml detekterbare gjennom mikros 9. I tillegg følger de samme dyrene gjennom hele forsøket elimineres behovet for separate dyregrupper for hvert tidspunkt, noe som reduserer animalsk bruk.

Bildebehandling Protokollen er beskrevet her kan tilpasses den vitenskapelige behovet som den ikke-invasiv natur betyr at ytterligere og hyppigere bildebehandling kan utføres (med passende dyreetikk godkjenning), men for vurdering av hjerneinfeksjon D21 er det tidligste tidspunktet punkt. På dette punktet, tidlig stadium narkotika er ikke lenger effektive til å fjerne sent stadium parasitter. Det er også viktig at musene blir avbildet under de samme betingelser ved hvert tidspunkt. For eksempel bør de samme eksponeringstider og samme visning (ventral eller dorsal) brukes for å sikre nøyaktig måling av forløpet av infeksjonen.

Hvis det i løpet tenkelig intet signal er til stede (når det er kjent at modellen skal ha en infeksjon), er det et antall trinn som kan følges for å bestemme kilden til problemet. For det første, kan eksponeringstiden økestil et maksimum på 5 min, som bør være i stand til å detektere meget lav bioluminescens signal. Hvis signalet er fremdeles ikke oppdages og blod filmer er positive for parasitten, vil neste steg være å bekrefte om parasitten er fortsatt selvlysende. Dette kan utføres ved anvendelse av et kommersielt in vitro luciferase aktivitetsanalysen og bioluminescens ville bli detektert ved anvendelse av et luminometer. Hvis på dette tidspunkt parasitten er ikke lenger bioluminescent, vil stabiliteten av konstruksjonen i parasitten må tas opp.

Fargen på mus gjør en forskjell for følsomheten til bildebehandling som slippes bioluminescence svekkes av mørk pels og hud 6,9. Valget av musestamme, for eksempel i form av hvite mus eller nakne mus, kan derfor forbedre resultatene. Hvis mus farge er begrenset, for eksempel ved anvendelse av en transgen linje, og deretter barbering eller depilating musene i en region av interesse kan forbedre følsomheten 6.

deTil tross forbedret følsomhet og signalisere at bioluminescent modell frembringer, Bioluminescens ikke direkte korrelerer til den perifere parasittemi observert i blod filmer (dager 7-21 vist i figur 4). Litteratur har dokumentert at tidlig stadium infeksjonen av trypanosomiasis infiserer hemolymphatic systemet 1, og er ikke utelukkende begrenset til blodsystemet, og dette, sammen med infeksjon av perifere organer, kan forklare hvorfor når omkrets parasitemia er knapt påvisbar i blod filmer, Bioluminescens er synlig som er spesielt tydelig fra data for dag 7 i figur 3 og 4. Dette er imidlertid betyr at bioluminescens avbildning kan bare brukes som en kvalitativ måling av infeksjon, og videre analyse er nødvendig for å bestemme absolutte parasittbelastning.

Bioluminesens avbildning har evnen til å bli brukt sammen med andre infeksiøse patogener som er vanskelige å momonitoren, med gnagermodeller av Chagas sykdom, malaria og toksoplasmose allerede etablert 13-16. Den høye signal-til-støyforhold på biolumine kombinert med dets evne til å spore sanntids-infeksjoner kan gi en mer følsom, ikke-invasiv medikament vurdering, samt få en bedre forståelse av CNS-infeksjon kinetikk, slik at det er et verdifullt verktøy i infeksjonssykdom forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker John Kelly og Martin Taylor (London School of Hygiene & Tropical Medicine) for å gi T. b. brucei GVR35-VSL-2 og Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) for råd om in vivo imaging. Dette arbeidet ble støttet av Bill og Melinda Gates Foundation Global Health Program (tilskudd nummer OPPGH5337).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375, (9709), 148-159 (2010).
  2. Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137, (14), 1995-2006 (2010).
  3. Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152, (8), 1155-1171 (2007).
  4. Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6, (9), 1037-1047 (2011).
  5. Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75, (2), 143-153 (1977).
  6. Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35, (2), 360-394 (2011).
  7. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, (6), 537-540 (2005).
  8. Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70, (2), 510-517 (2015).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, (11), e2571 (2013).
  10. Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51, (4), 381-388 (2002).
  11. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
  12. Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56, (4), 321-324 (2007).
  13. Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295 (2012).
  14. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (32), 11468-11473 (2005).
  15. Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7, (6), 837-848 (2005).
  16. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16, (9), 1285-1300 (2014).
Bioluminesens Imaging å oppdage sent stadium smitte av sovesyke
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter