Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ética
Todo el trabajo se llevó a cabo bajo la aprobación del Ministerio del Interior británico los Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley de 1986 y la London School of Higiene y Medicina Tropical de Bienestar Animal y la Junta de Revisión de Ética. LLEGA directriz se siguen en este informe.

1. En Vivo La aprobación de Trypanosoma brucei brucei bioluminiscente

  1. Retirar una acción criopreservados (denominado estabilizado) de T. segundo. brucei cepa GVR35-VSL-2 (disponible en el profesor John Kelly en la London School of Higiene y Medicina Tropical través MTA) de 9 de nitrógeno líquido y se deja que se equilibre a temperatura ambiente. Diluir estabilizado a 2 x 10 4 tripanosomas / ml en pH estéril salina tamponada con fosfato de glucosa (PBS-G) 8,0 (1 L PBS + 15 g de glucosa) 10.
    Nota: T. segundo. brucei GVR35-VSL-2 no es infecciosa para los humanos y no requiere licencia SAPO instalaciones para llevar a cabo los experimentos.
  2. inject un 20-25 g ratón hembra CD1 con 0,2 ml diluidos tripanosomas por vía intraperitoneal (ip) con una aguja de 25 G. Este es el "ratón donante". Coloque el ratón infectado en un libre de patógenos (SPF) -cage y alimentación ad libitum específico.
    Nota: Los ratones CD1 son una cepa no consanguínea y T. segundo. brucei infecciones GVR35 están bien caracterizados en esta cepa. Sin embargo, este protocolo también es aplicable a cepas puras o modificadas genéticamente, pero es importante tener en cuenta que el color de la piel puede afectar a la sensibilidad de formación de imágenes 6,9.
  3. Monitorear la parasitemia periférica mediante el muestreo de sangre. Coloque el ratón en un retenedor de plástico y tomar 5 l de sangre de la cola por punción venosa con aguja 21 G o sangría y mezclar 1/10 con cloruro de amonio estéril 0,85% para lisar las células rojas de la sangre y permitir el recuento más fácil.
  4. Contar la sangre diluida en un hemocitómetro Neubauer.
    1. Cargar la sangre diluida en ambas cámaras. Contar todo el centro grIdentificación de una cámara para dar N tripanosomas. La concentración de tripanosomas en la sangre = n x 10 4 tripanosomas / ml, ajuste para cualquier factor de dilución y calcular la media de las dos cámaras.
      Nota: Después de aproximadamente 5-7 días después de la infección, la parasitemia periférica debe elevarse lo suficiente como para llevar a cabo una infección a una concentración de 2 x 10 4 tripanosomas / ml.
  5. Cuando los niveles de tripanosomas son suficientes para el número de ratones requeridos alta, pasar al paso 1.6. Un nivel de parasitemia de 6 x 10 4 tripanosomas / ml en un ratón donante es suficiente para la infección de 10 ratones.
    Nota: Para tamaños de los grupos estadísticamente significativas, n = 6 para cada grupo de tratamiento de los ratones se necesitan 8. Para otros modelos de infección, tendría que ser aplicada para determinar los tamaños de grupo apropiados los cálculos de potencia.
  6. Coloque los ratones en una caja caliente (a 28-30 ° C durante aproximadamente 5-10 minutos) para permitir que las venas de la cola se dilaten.Para inducir la anestesia terminal, administrar 20 mg / kg iv pentobarbital con una aguja 25 G. Confirmar ratón se anestesia presionando suavemente las almohadillas de las patas para asegurar que no hay reflejo de retirada.
  7. Heparinizar una aguja 21 G por alícuotas de 5 ml de heparina de 5.000 unidades USP / ml en un tubo de Bijou y chupando dos veces en y fuera de la aguja unida a una jeringa de 1 ml.
  8. Tome el heparinizada 21 G aguja y jeringa de 1 ml, y realizar una punción cardiaca en el ratón paso anestesiado mediante la inserción de la aguja en el centro debajo de la caja torácica (una gota de sangre se acumule en la base de la aguja) y tire suavemente hacia atrás el émbolo a fin de no colapsar la cámara del corazón. Recoger un mínimo de 0,7 ml de sangre.
  9. Diluir la sangre infectada para producir un inóculo de 2 x 10 4 tripanosomas / ml en PBS-G pH 8,0 como paso 1.1 anteriormente.
    Nota: En este punto, la sangre restante se pueden criopreservar para producir estabilizado por mezcla con 8% de glicerol, 20% inactivado por calor ca fetalsuero LF (hi-FCS) y la sangre infectada del 72%. Poco a poco se congelan a -80 ° C utilizando un lento-freezing contenedor para lograr una velocidad de enfriamiento de -1 ° C / min, antes de transferir a nitrógeno líquido.

2. La infección de ratones experimentales

  1. Coloque el CD1 ratones hembra (~ 21-25 g) en una caja de calentamiento para calentar suavemente para dilatar las venas. Coloque los ratones calentado en un sistema de retención de plástico e inyectar 0,2 ml de inóculo diluido por vía intravenosa con una aguja de 25 G en la vena caudal, equivalente a 4.000 tripanosomas por ratón. Colocar presión en el sitio de la inyección después de detener la hemorragia.
    Nota: la infección intraperitoneal es una ruta válida de la infección y se ha utilizado en estudios previos 10, pero hemos hallado que este menos reproducible que la vía intravenosa.
  2. Selección aleatoria de los ratones infectados y la jaula en grupos de 3 en jaulas ventiladas SPF. Como control, se inyectan ratones hembra CD1 de tipo salvaje con parásito no bioluminiscente, T. segundo. brucei GVR35 (n =3).
  3. Monitorear la infección a través del cine Microscopía de Sangre
    1. Spot 5 l de sangre de la punción venosa o sangrías en un portaobjetos de vidrio y realizar un frotis de sangre (utilizando una segunda lámina de vidrio empuje suavemente la gota de sangre a través de la corredera para producir una película delgada). Permitir que las diapositivas se sequen al aire.
    2. Fijar la muestra de sangre con metanol al 100% y tinción con Giemsa durante 10 minutos antes de enjuagar con H2O destilada y dejar secar al aire. En el objetivo 100X contar el número de tripanosomas en 10 campos de visión (FOV).
      Nota: la filmación de la sangre se lleva a cabo junto con imágenes no invasivo animal entero tan pronto como un día después de la infección. Cuando se procesa un número de animales, se prefiere este método de cuantificación tripanosoma sobre conteo hemocitómetro que las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente y se contaron después.

3. La bioluminiscencia de imágenes para realizar el seguimiento de Infecciones

Nota: Para controlar la infección, toda animde formación de imágenes al no invasiva se puede utilizar.

  1. Preparar una solución madre de D-luciferina, el sustrato de luciferasa de luciérnaga, en Dulbecco salina tamponada con fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro de esterilizar y congelar en alícuotas a -20 ° C.
    Nota: D-luciferina es sensible a la luz, por lo tanto, protegerlo de la luz envolviendo alícuotas en papel de aluminio. No congelar y descongelar repetidamente luciferina, ya que puede afectar a la actividad 11.
  2. Calentar una alícuota de D-luciferina a temperatura ambiente. Retirar cada ratón de la jaula (incluyendo los ratones de control infectados con nonbioluminescent cepa del parásito de tipo salvaje) e inyectar 150 mg / kg de la D-luciferina calentado (diluido en DPBS) por vía intraperitoneal con una aguja 25 G. Coloque los ratones en una cámara de isofluorano durante aproximadamente 5 min para inducir la anestesia con isofluorano al 2% / O 2 mezcla a 2,5 L / min.
    Nota: Los ratones se vuelven inmóviles cuando están bajo anestesia. Para el generador de imágenes se utiliza aquí, 3 ratones pueden ser procesados ​​a la vez. Si los ratones son anesthetracterizado por más de 30 min, oftálmica ungüento lágrima artificial se puede aplicar a evitar que los ojos de los ratones de la desecación.
  3. Para el generador de imágenes se describe aquí, abra el software e inicializar la máquina utilizando el software según las instrucciones del fabricante. Adquirir imágenes una vez que la cámara y placa calentada han alcanzado la temperatura.
    Nota: Este instrumento no está normalmente apagado, permitiendo a la máquina para realizar las calibraciones de fondo durante la noche. En el caso de que se debe reiniciarse, se debe realizar una verificación de la calibración en primer lugar.
  4. Coloque los ratones anestesiados en el generador de imágenes (véase 3.5). Utilice separadores negros grandes entre los ratones para minimizar sangrar a través de cualquier señal bioluminiscente brillante. los ratones de imagen utilizando un conjunto de tiempos de exposición; 1, 3, 10, 30, 60 y 180 segundos, con binning medio, 1 f / stop y un filtro abierto, y el campo visual E (12,5 x 12,5 cm 2).
    Nota: Los ratones de control infectados con los parásitos de tipo salvaje GVR35 nonbioluminescent proporcionan un backgrvalor bioluminiscencia ound. Desde un experimento de cinética de luciferina (Figura 6) con este modelo, hemos encontrado que los picos de señal de bioluminiscencia en 10 minutos después de la administración y de formación de imágenes se lleva a aproximadamente 5 min para 3 ratones. Tome esta escala de tiempo en la consideración al anestesiar y imágenes de los ratones.
  5. Para asegurar la formación de imágenes a fondo de los ratones, girar para obtener un ventral, dorsal y lateral. Mantener la coherencia en el orden de orientación para formación de imágenes entre los animales secuenciales.
  6. Después de proyección de imagen, permiten ratones se recuperen de la anestesia bajo observación antes de volver a SPF-jaula.
  7. Continuar la formación de imágenes ratones cada 7 días hasta el día 21 después de la infección. Debe haber un aumento constante de la señal de la bioluminiscencia durante todo el animal.
  8. En D21, imagen y frotis de sangre de los ratones como se describió anteriormente, y la dosis de los ratones con 40 mg / kg por vía intraperitoneal diminazeno aceturato. Este fármaco se borrará la parasitemia periférica, pero no va a cruzar la barrera sangre-Brain barrera, y por lo tanto permite una mejor visualización de la infección del SNC.
    Nota: diminazeno aceturato es un fármaco bien establecido utilizado para tratar las primeras etapas de la tripanosomiasis animal.
  9. Continuar imágenes y controlarse en D28 y D35.

4. Confirmación de la infección del SNC

  1. En D35, los ratones de imagen indicados anteriormente (pasos 3.1-3.4).
  2. Después de proyección de imagen, permiten ratones se recuperen de la anestesia y ratones Exsanguinate como se detalla en el paso 1.6 hasta 1.8, la recogida de sangre para su posterior análisis.
  3. Después de punción cardíaca, perfundir los ratones con 20 ml de PBS (opcional: añadir 3 mg / ml de luciferina para solución de perfusión) a través del corazón para limpiar la sangre de los órganos y de volver a introducir la etiqueta luciferina que podrían haber desaparecido de la región del cerebro durante el intervalo de tiempo desde el paso 4.1.
  4. eliminar suavemente el cerebro, mediante el uso de tijeras curvas, el corte de la base alrededor de la circunferencia del cráneo, y el levantamiento de la parte superior del cráneo, para permitir que el cerebropara ser levantado suavemente con fórceps curvos.
  5. Coloque el cerebro extirpado en una sección de plástico negro y pipeta de 50 l de 15 mg / ml de luciferina sobre el órgano antes de la imagen, para asegurar luciferina adecuada se ha añadido al cerebro extirpado. Imagen utilizando la configuración que el anterior. Esto demostrará la localización de la infección a los hemisferios cerebrales.
    Nota: cuantificación Aguas abajo de parasitemia en el cerebro extirpado se puede llevar a cabo por qPCR como se describió previamente 8. Otras aplicaciones posteriores alternativas podrían incluir la histología o inmunohistoquímica para identificar los parásitos en el tejido cerebral después de la fijación.

5. La cuantificación de la bioluminiscencia Imaging

Nota: La bioluminiscencia se puede cuantificar utilizando la región de interés (ROI) con el software de imágenes y corregida para el fondo bioluminiscencia.

  1. Con la herramienta de retorno de la inversión, crear un ROI rectangular para la cuantificación de un animal enterond posicionarlo la imagen del ratón sobre para cubrir la punta de la nariz a la base de la cola del ratón. Utilice el mismo cuadro de tamaño para cada animal y cada punto de tiempo. Al mirar el retorno de la inversión para el cerebro, utilizar un ROI circular de la misma manera, el posicionamiento por encima de la región de la cabeza del ratón en la imagen.
  2. Si se desea, ajustar las imágenes a aparecer en el mismo espectro de una representación visual de la infección.
    Nota: El software utilizado aquí genera un mapa de colores para cada imagen se ajusta automáticamente para el recuento mínimo y máximo de fotones. Para permitir la comparación visual entre una serie de imágenes, la escala de color debe estar ajustado a los mismos valores para todas las imágenes.
    1. El uso de la imagen de mayor bioluminiscencia y la pestaña 'Ajuste de imagen "en la paleta de herramientas, seleccione una escala logarítmica y un mínimo de la escala de color adecuado y la máxima (a determinar empíricamente). Aplicar esta escala para todas las imágenes a lo largo del experimento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Este protocolo demuestra cómo seguir la progresión de la enfermedad después de la infección de ratones con T. segundo. brucei, un modelo para la tripanosomiasis africana humana. La Figura 1 muestra la línea de tiempo del protocolo experimental, lo que demuestra el calendario de tratamiento de imágenes y pasos. La figura 2 muestra un campo típico de vista en un frotis de sangre teñido con Giemsa fija que se utiliza para cuantificar la parasitemia periférica, con tripanosomas y células rojas de la sangre presente. Desarrollo de la infección en los animales puede ser seguida mediante la medición de la bioluminiscencia como en la figura 3, que muestra los animales infectados en el transcurso de un experimento con los mismos animales proyectado en cada punto de tiempo. A través del curso de la infección un aumento de bioluminiscencia se puede observar en todos los animales durante los primeros 21 días que la señal se vuelve más diseminada e intenso, con regiones altas de BLI (representado como rojode la escala del mapa de calor) en la zona del bazo. En ratones D21 se tratan con diminazeno aceturato como se detalla en la Figura 1, después de la proyección de imagen, y una caída en la bioluminiscencia pueden ser observados en D28 como la infección periférica se borra, estando presentes en la región de la cabeza de los ratones los bajos niveles de señal. En D35 la señal todavía permanece en la región de la cabeza y se ha vuelto más intensa que indica una posible infección en el cerebro. El cerebro se escinde para confirmar la señal está presente en el tejido cerebral y a continuación se puede cuantificar por qPCR.

Tradicionalmente, los frotis de sangre se usan para cuantificar la progresión de la infección y los efectos del tratamiento. Sin embargo, éstos sólo miden parasitemia periférica, y no se pueden utilizar para evaluar los niveles de parásitos en el cerebro. La figura 4 combina la cuantificación tanto de la parasitemia periférica y la bioluminiscencia para demostrar la cinética de la enfermedad. En D7 una señal de alta BLI está presente de 10 8 Figura 3 . Esto demuestra la mayor sensibilidad de los estudios sobre la bioluminiscencia conteo tradicional película de sangre.

Para comprobar que la bioluminiscencia en la región de la cabeza es verdaderamente localizando al tejido cerebral, al final del experimento los cerebros se extirpan y bioluminescencia mide ex vivo (Figura 5). A diferencia de la carga de la infección entre los cerebros se ve a menudo y la señal no aparece para localizar a regiones anatómicas específicas como la distribución de la intensa señal de BLI puede variar entre los animales infectados. Por ejemplo, una fuerte señal de BLI está presente en el bulbo olfativo en el ratón 2 y 3 y en el cerebelo en el ratón 3, mientras que el cerebro de ratón 1 muestra la distribución general de la señal de BLI por todo el cerebro. Como los cerebros se pueden obtener imágenes inmediatamente después de sacrificar los ratones, un análisis adicional puede llevarse a cabo en el tejido cerebral como el tejido no se dañe en el proceso de formación de imágenes ex vivo.

Figura 1
Figura 1:. Línea de tiempo del experimento, incluyendo imágenes, muestreo y tratamiento Debido a la naturaleza no invasiva de imágenes de bioluminiscencia, la vigilancia de la infección puede ocurrir movolver a menudo que se detalla en el diagrama. La toma de muestras y de imagen cada 7 días permiten la identificación de la infección progresa. El tratamiento en D21 con aceturato diminazeno elimina parasitemia periférica para permitir una mejor visualización de la infección cabeza y el cerebro. Aceturato diminazeno es un fármaco etapa temprana y no es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica en cantidades adecuadas para eliminar la infección etapa tardía. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Tripanosomas Giemsa manchada tripanosomas En un frotis de sangre fijo, Giemsa manchadas (púrpura con núcleos de color rosa, cerrado flecha) son fácilmente detectables contra las células rojas de la sangre (manchado azul, flecha abierta) y se pueden contar rápidamente para obtener el número de tripanosomas / 10campos de visión bajo un objetivo de 100X. La barra de escala indica 10 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: La bioluminiscencia Imaging de ratones infectados Tres animales representativos de un grupo de 6 ratones infectados con VSL-2 (M = ratón) y un control infectado de tipo salvaje (infectados con la línea de parásito nonbioluminescent tipo salvaje).. Luciferina también se administró al ratón de control antes de la imagen, que proporciona la medición de fondo. Una escala de mapa de calor se muestra con rojo que indica altos niveles de bioluminiscencia, lo que equivale a un elevado número de parásitos, y azul que indica bajos niveles de bioluminiscencia (D = día). El ratón control no tiene la bioluminiscencia como se esperaba, sin parásitos que expresan luciferasa. imagen f rom-Burrell Saward et al., 8 con permiso de Oxford University Press. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. Comparación de la bioluminiscencia y Cine parasitemia sangre bioluminiscencia total de todo cada animal se cuantificó como se describe en la sección 5 y la parasitemia periférica cuantificó contando los parásitos en frotis de sangre. Las barras de error indican la desviación estándar de la media. Imagen de Burrell-Saward et al., 8 con permiso de Oxford University Press. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54032 / 54032fig5.jpg "/>
Figura 5:. Ex Vivo Imaging de extirparon cerebro Los cerebros de los ratones perfundidos imagen formada en la Figura 3 se separaron y la imagen como se describe en 4.5. La bioluminiscencia se mide en una escala de mapa de calor como para la Figura 3. El cerebro de control de un ratón infectado con parásitos de tipo salvaje nonbioluminescent también se trató con luciferina y no bioluminiscencia se puede observar. La barra de escala representa 1 cm. Esta cifra ha sido modificado a partir de Burrell-Saward et al., 8 con permiso de Oxford University Press. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Cinética de la bioluminiscencia luciferina en ratones infectados con VSL-2.Tres ratones CD1 infectados por VSL-2 fueron inyectados con 150 mg / kg ip de luciferina y se colocan inmediatamente en el generador de imágenes. Los ratones se obtuvieron imágenes de más de 60 minutos y su bioluminiscencia se calculó para determinar la ventana óptima de imagen después de la administración luciferina. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

El desarrollo de un T. bioluminiscente segundo. brucei cepa GVR35 permite la visualización de una infección por tripanosoma de principios a la etapa tardía. Modelos de infección anteriores eran incapaces de detectar la fase de retraso, cuando los parásitos están en el cerebro, en tiempo real desde la microscopía de frotis de sangre, y requieren el sacrificio y la eliminación de los cerebros de los ratones infectados para determinar la carga parasitaria 12. La bioluminiscencia reduce la variabilidad inter-ratón como un solo ratón se puede seguir a lo largo de la totalidad de la infección y una evaluación cualitativa rápida de la infección se puede observar en cualquier etapa. El método altamente sensible de imágenes de bioluminiscencia permite la infección de bajo nivel para ser identificado antes de la microscopía de sangre película, con tan sólo 100 tripanosomas detectables a través de imágenes en comparación con los 5 x 10 3 tripanosomas / ml detectables mediante microscopía 9. Además, siguiendo los mismos animales durante todo el experimento a eliminares la necesidad de que los grupos de animales separados para cada punto de tiempo, lo que reduce en gran medida el uso de animales.

El protocolo de estudio aquí descrito se puede adaptar a la necesidad científica como medio de la naturaleza no invasiva que imágenes adicionales y más frecuentes se puede llevar a cabo (con la aprobación ética animal adecuado), pero para la evaluación de D21 infección cerebral es la hora más temprana punto. En este punto, los fármacos en fase inicial ya no son eficaces para eliminar los parásitos en fase tardía. También es imperativo que los ratones son imágenes en las mismas condiciones en cada punto de tiempo. Por ejemplo, los mismos tiempos de exposición y misma vista (ventral o dorsal) se debe utilizar para garantizar una medición precisa de la evolución de la infección.

Si durante la formación de imágenes no hay señal presente (cuando se sabe que el modelo debe tener una infección), hay una serie de pasos que pueden seguirse para determinar el origen del problema. En primer lugar, el tiempo de exposición se puede aumentarhasta un máximo de 5 minutos, que debe ser capaz de detectar la señal muy baja bioluminiscencia. Si la señal aún no se detecta y frotis de sangre son positivos para el parásito, el siguiente paso sería para confirmar si el parásito sigue siendo bioluminiscente. Esto puede llevarse a cabo mediante el uso de un ensayo de actividad comercial in vitro de la luciferasa y la bioluminiscencia se detectó usando un luminómetro. Si en este punto el parásito ya no bioluminiscente, sería necesario abordar la estabilidad de la construcción en el parásito.

El color de los ratones hace una diferencia en la sensibilidad de formación de imágenes como el bioluminiscencia emitida es atenuada por la piel oscura y 6,9 piel. Elección de la cepa de ratón, tales como ratones blancos o ratones desnudos, por lo tanto, puede mejorar los resultados. Si se ve limitada del ratón de color, por ejemplo mediante el uso de una línea transgénica, a continuación, afeitado o depilación los ratones en una región de interés puede mejorar en gran medida la sensibilidad 6.

DelawareA pesar de la mejora de la sensibilidad y la señal de que el modelo bioluminiscente produce, la bioluminiscencia no se correlaciona directamente a la parasitemia periférica observado en frotis de sangre (días 7-21 mostrados en la Figura 4). La literatura ha documentado que la infección etapa temprana de la tripanosomiasis infecta el sistema hemolinfática 1, y no se limita únicamente al sistema de la sangre y esto, junto con la infección de los órganos periféricos, puede explicar por qué cuando parasitemia periférica es apenas detectable en los frotis de sangre, la bioluminiscencia es visible como es particularmente evidente a partir de los datos de día 7 en la Figura 3 y 4. Esto, sin embargo, no significa que imágenes de bioluminiscencia sólo se puede utilizar como una medida cualitativa de la infección, y se requiere un análisis adicional para determinar la carga parasitaria absoluta.

Imágenes de bioluminiscencia cuenta con la capacidad de ser utilizado con otros agentes patógenos infecciosos que son difíciles de monitor, con modelos de roedores de la enfermedad de Chagas, la malaria y la toxoplasmosis ya establecida 13-16. La alta relación de señal a ruido de la bioluminiscencia, junto con su capacidad de realizar un seguimiento de las infecciones en tiempo real puede proporcionar una evaluación de drogas más sensible, no invasivo, así como obtener una mejor comprensión de la cinética de la infección del SNC, lo que es una herramienta valiosa en investigación de enfermedades infecciosas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Agradecemos a John Kelly y Martin Taylor (Escuela de Higiene y Medicina Tropical) para proporcionar T. segundo. brucei GVR35-VSL-2 y el Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) para el asesoramiento en imágenes in vivo. Este trabajo fue apoyado por el Programa Bill y Melinda Gates, la Fundación Mundial de la Salud (número de concesión OPPGH5337).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375, (9709), 148-159 (2010).
  2. Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137, (14), 1995-2006 (2010).
  3. Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152, (8), 1155-1171 (2007).
  4. Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6, (9), 1037-1047 (2011).
  5. Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75, (2), 143-153 (1977).
  6. Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35, (2), 360-394 (2011).
  7. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, (6), 537-540 (2005).
  8. Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70, (2), 510-517 (2015).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, (11), e2571 (2013).
  10. Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51, (4), 381-388 (2002).
  11. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
  12. Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56, (4), 321-324 (2007).
  13. Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295 (2012).
  14. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (32), 11468-11473 (2005).
  15. Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7, (6), 837-848 (2005).
  16. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16, (9), 1285-1300 (2014).
Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter