De Published: May 18, 2016 doi: 10.3791/54033

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Daniel E. Rothschild¹, Tara Srinivasan², Linette A. Aponte-Santiago¹, Xiling Shen^2,3,4, Irving C. Allen¹

¹Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, ²Department of Biomedical Engineering, Cornell University, ³School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, ⁴Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

Abstract

Primaire intestinale organoids zijn een waardevol modelsysteem dat het potentieel heeft om een ​​aanzienlijke invloed op het gebied van mucosale immunologie heeft. Echter, de complexiteit van de organoïde groei kenmerken dragen belangrijke kanttekeningen voor de onderzoeker. Met name de groeipatronen van elke afzonderlijke organoïde zijn zeer variabel en een heterogene populatie van epitheliale cellen in kweek. Met dergelijke restricties gemeenschappelijke weefselkweek praktijk niet zonder meer toegepast op de organoïde systeem vanwege de complexiteit van de celstructuur. Tellen en plating uitsluitend op basis van aantal cellen, hetgeen normaal is voor individueel gescheiden cellen, zoals cellijnen, geen betrouwbare methode om organoids tenzij een normalisering techniek toegepast. Normaliseren van het totale eiwitgehalte is complexer geworden als gevolg van de bewoner eiwit matrix. Deze kenmerken in termen van het aantal cellen, vorm en celtype moet rekening worden gehouden bij de evaluatie van uitgescheiden contenten uit de organoïde massa. Dit protocol is gegenereerd om een ​​eenvoudige procedure te schetsen om de cultuur en de behandeling van de dunne darm organoids met microbiële pathogenen en pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs). Het benadrukt ook de normalisatie technieken die moeten worden toegepast bij eiwitanalyse worden uitgevoerd na een dergelijke uitdaging.

Introduction

Het vermogen om te oogsten en cultuur primaire organoids zijn beschreven voor dunne darm, colon, pancreas, lever en hersenen en zijn spannende ontwikkelingen relevant voor het begrip van een fysiologisch representatieve verschijnselen weefselbiologie ^1-5. De eerste methode beschrijft de cultuur en het onderhoud van de dunne darm organoids werd gemeld door Sato et al. Uit het lab van Hans Clevers ^1. Voorafgaand aan deze methode, oogsten en kweek van primaire darmepitheelcellen bleek beperkt en ineffectief ondersteunen epitheliale celgroei. Werkwijzen onder dissociatie van weefsel via incubatie met enzymen, zoals collagenase en dispase, die uiteindelijk leiden tot de uitgroei van vermengd primaire fibroblastcellen ^6. Deze omstandigheden zouden ook tijd worden beperkt bij het instandhouden van de epitheliale celkweek. Minimaal tot geen epitheelcellen niche zouden vormen als de epitheliale cellen apoptose zou treden wegenshet gebrek aan geschikte groeifactoren of verlies van contact integriteit, genaamd anokis ^7. De komst van de 3D-organoïde kweeksysteem is een werkwijze cultuur primaire darmcellen die een spectrum van intestinale celtypen in langdurige kweek ¹ ontvangen. Deze epitheliale organoids voordelen hebben ten opzichte cellijnen is dat ze bestaan ​​uit diverse gedifferentieerde cellen, en beter nabootsen het orgaan zij zijn afgeleid van in vivo ^8. Het proces uiteindelijk "groeien een mini darm in een schotel" heeft bewezen een waardevol instrument voor het beoordelen van de respons van darmepitheel onder verschillende stimuli. Onderzoek naar de interactie van primaire darmcellen microbiële pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) is op het gebied van immunologie relevant deze moleculaire patronen diverse reacties van zowel gastheer als microbe ⁹ kan reguleren. Niet alleen kunnen de onderzoekers nu te verkennen deze interacties met de muis organoids, maar zekan gekweekt van mensen en ² zijn. Deze technologie heeft de potentie om drastisch te veranderen gepersonaliseerde geneeskunde en het is verleidelijk om te speculeren over de vooruitgang die deze techniek in de nabije toekomst mogelijk te maken.

Het algemene doel van deze methode is een protocol voor de kweek, groei, en behandeling van intestinale organoids een variëteit van stimuli. Dergelijke stimuli kan uiteindelijk variëren van vaccins, bacteriële PAMPs, live pathogenen, gastro-intestinale (GI) en kanker geneeswijze. De isolatie en de cultuur van de muis intestinale organoids is aangepast van Sato et al. Hoewel er lichte afwijkingen van de oorspronkelijke methode, het eindproduct wordt organoïde cultuur is nog steeds bereikt bij het ​​volgen van dit protocol. Deze methode is gericht op het beschrijven van een geschikte techniek voor een goede normalisatie bij het werken met niet-homogene celstructuur, waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van een assay op basis van cellen nomber.

Protocol

Al het onderzoek werd goedgekeurd en uitgevoerd onder Virginia Tech IACUC richtlijnen

1. Bereid R-Spondin1 geconditioneerde media Van HEK293T-Rspo1 Cell Line

1. HEK293T-productie van Rspondin1 cellen is eerder beschreven ^10. Zaad HEK293T-Rspondin1 uitscheidende cellen 5-10% confluentie van ongeveer 8 x 10 ⁵ -1,7 x 10 ⁶ cellen in een T-175 kolf met 40 ml 1 x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum ( FBS) als groeimedia, en incuberen bij 37 ° C + _5% CO2.
   LET OP: De groei media voor de HEK293T-Rspondin1 afscheidende cellen zullen als R-spondin1 geconditioneerde media dienen. R-spondin1 alternatief kan worden gekocht als een recombinant groeifactor gebruikt bij een eindconcentratie van 500 ng / ml.
2. Groeien de HEK293T-cellen Rspondin1 gedurende zeven dagen of tot aan 95% confluentie bepaald met helderveld microscopie. Oogst de 40 ml van geconditioneerd media en transfer naar een 50ml conische buis. Gooi de T-175 kolf van HEK293T-Rspondin1 afscheidende cellen.
3. Centrifugeer de buis met geconditioneerde medium bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om celresten te pelleteren. Verzamel de bovenstaande vloeistof, aangeduid als R-spondin1 geconditioneerde media, en het monster in 15 ml buizen. WINKEL aliquots bij -20 ° C voor korte of -80 ° C voor langdurige opslag.
   Opmerking: wanneer ontdooid, de R-Spondin1 geconditioneerde media kan tot 1 week een 4 ° C bewaard.

2. Voorbereiding van organoïde Growth Media en reagentia voor het oogsten Small Intestinal crypten  

1. Één dag voor het oogsten, plaats de bevroren matrix eiwit op ijs ontdooien en overnacht bij 4 ° C. Autoclaaf ontleden scharen, forceps en objectglaasjes die worden gebruikt voor crypt oogst.
2. De volgende dag, eerst bereiden 40 ml organoïde groeimedia bevattende supplementen en groeifactoren door toevoeging stock concentraties 40 ml 1x DMEM / F-12. Media supplementen bevatten: 10 mM 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-yl] ethaansulfonzuur (HEPES) - 400 pl, 1x glutamine supplement - 400 pl, 1x B27 zonder vitamine A - 400 pl, 1 x N2 - 200 pl, 1 mM N-acetyl-cysteïne - 40 ul, 100 ng / ml m-Noggin - 40 pl, 50 ng / ml m-EGF - 4 pl en in een 37 ^° C waterbad gebruik. Warm een ​​15 ml aliquot van R-spondin1 tot 37 ° C in een waterbad.
3. Warme drie steriele 24-putjesplaten tot 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten door het plaatsen in een incubator. Bereid 50 ml per muis 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) + 2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en koel af tot 4 ° C. Bereid 100 ml per muis 1x PBS dat 10% FBS en afkoelen tot 4 ° C.

3. Oogsten Mus musculus Small Intestinal crypten voor organoïde Cultuur ¹

1. Offer een mannelijke C57B6 / J muis 6-12 weken oud zijn gerezen over standaard knaagdieren chow en water beschikbaarad libitum volgens de institutionele richtlijnen. Euthanaseren via CO ₂ stikken, gevolgd door cervicale dislocatie.
   OPMERKING: Houd karkas op ijs tot weefsel oogst en voer het weefsel oogst in een biologische veiligheidskast om het risico op verontreiniging te minimaliseren.
   Opmerking: Een mannelijke of vrouwelijke muizen kunnen worden gebruikt om organoids genereren.
2. (Optioneel) Scheer de muis om de vacht te verwijderen voordat onderdompelen in 70% ethanol. Dompel de muis in 70% ethanol gedurende 2 minuten en speld ledematen pinning bord met de dorsale zijde van de muis aanraken van de raad van bestuur.
3. Gebruik vooraf gesteriliseerde ontleden schaar en een tang om een ​​mid-lijn incisie te maken op het ventrale deel van de muis. Maak de snede in de genitaliën gaan craniaal van de basis van de hals. Open de huid incisie zijdelings met een pincet en speld van de huid aan de pinning boord om het buikvlies bloot te leggen.
4. Maak een middellijn incisie in het buikvlies van de buik met het ontleden van een schaar en vouw the peritoneum met een pincet lateraal en pin de pinning boord teneinde de buikorganen bloot.
   LET OP: Wees voorzichtig om te voorkomen dat het snijden van buikorganen.
5. Verwijder de dunne darm uit de buikholte met ontleden pincet en schaar snijden door het proximale kruising van de dunne darm is verbonden met de maag en het distale knooppunt verbonden met het caecum. Plaats de dunne darm in een steriele petrischaal met 10 ml ijskoude 1x PBS.
6. Spoel de inhoud die in het lumen van de dunne darm met ijskoude 1x PBS onder toepassing van een 1 ml pipet. Herhaal deze stap tot het afval binnen het lumen van de dunne darm wordt verwijderd.
7. Snijd de dunne darm met het ontleden van een schaar in 3-4 ongeveer gelijke strips lengte en leg de strips in de lengterichting op een nieuwe steriele petrischaal. Per strip Plaats de snijrand van het ontleden schaar in het lumen van de dunne darm een ​​incisie de gehele lengte te of de strip. Tang zijdelings openklappen de insnijding teneinde het lumen van de dunne darm bloot te leggen.
8. Een steriele glasplaatje voorzichtig krab hem villi op het luminale oppervlak van de dunne darm. Snijd de dunne darm in 1-2 cm lengte stroken met dissectie scharen en deze stroken overgebracht in een 50 ml conische buis met 10 ml ijskoud 1x PBS.
9. Meng voorzichtig met het omkeren van de 50 ml conische buis en laat de inhoud weefsel naar de bodem van de 50 ml conische buis. Zuig het 1x PBS en herhaal dit drie keer door het wassen van het weefsel met 10 ml ijskoude 1x PBS. Op de laatste wassing laat de conische buis op ijs gedurende 10 min met 10 ml 1x PBS en de dunne darm weefselsegmenten.
10. Zuig het 1x PBS en voeg 25 ml 1x PBS + 2 mM EDTA. Plaats op een schudapparaat bij 4 ° C of in een ijsemmer gedurende 45 min. Terwijl het weefsel incuberen bestempelen zes 15 ml conische buizen "fractie # 1-6."
11. Laat de inhoud weefsel naar de bodem van de buis. Verwijder het supernatant en breng aan de buis 15 ml conische label "fractie 1". Herhaal 1x PBS + 10% FBS schudden stap (3,11) vijfmaal de supernatant inhoud overbrengen teneinde de geschikt gelabelde fractie buis.
12. Centrifugeer bij 125 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer pellets in 5 ml voorverwarmde 1x DMEM / F-12, zonder groeifactoren toegevoegd.
13. Centrifugeer bij 78 xg gedurende 2 minuten. Verzamelbak 4 ml van de supernatant en resuspendeer elke pellet in 1 ml van de resterende media.
14. Verwijder 20 ml van elke fractie en toe te voegen aan een glasplaatje. Visualiseren crypten en vuil onder een lichtmicroscoop en bepalen welke fracties te combineren en bundelen dienovereenkomstig de grootste perce verwezenlijkenntage van crypten om vuil ratio.
    LET OP: De fracties 2-6 op het grootste percentage van de crypten worden verzilverd. De fracties tot het zwembad zijn het vaakst fractie 3 met fractie 4, en fractie 5 met een fractie 6.
15. Centrifuge fracties worden uitgeplaat bij 125 xg gedurende 5 minuten. Zuig supernatant het verlaten van 50-100 pi resterende boven de pellet.
16. Blijf buizen op ijs en voeg 1 ml proteïnematrix de samengevoegde fracties. Pipet op en neer langzaam naar toevoeging van luchtbellen te voorkomen.
17. Verwijderen voorverwarmde 24 wells platen van 37 ° C incubator en voeg 50 ul proteïne matrix / crypt suspensie in het midden van elk putje. Breng de geënte platen een 37 ° C incubator gedurende 10 minuten om het proteïne matrix daling stollen.
18. Voeg 450 ul van eerder bereide organoïde groeimedia + 50 pi R-spondin1 geconditioneerde media per goed. Incubeer de platen bij 37 ° C + _5% CO2 gedurende de nacht.
19. Voeg 50-100 ul van R-spondin1 voorziene medieen goed per dag. Elke ^3e dag te vervangen hele organoïde groeimedia met vers bereide organoïde groeimedia 450 pl / goed beschreven in stap 2.2. Daarnaast voegen 50-100 ul van R-spondin1 geconditioneerde media per goed.
    LET OP: Het eiwit matrix daling behoudt zijn integriteit gedurende één week, maar na 7 dagen overgaan tot passage organoids.

4. Passage Organoids Elke 7 ^th Day

1. Ontdooi de matrix eiwit op ijs gedurende de nacht bij 4 ° C de dag voor passage. Warme steriele 24 wells plaat met 37 ° C gedurende ten minste 30 min. Bereid organoïde groeimedia in stap 2.2 beschreven en laten 37 ° C tot gebruik.
2. Verwijder organoïde plaat uit incubator en beginnen passage van de plaat op het ijs. Aspiraat groeimedia met een 10 ml pipet 3-4 putten starten.
   OPMERKING: Houd het opgezogen medium in de 10 ml pipet, omdat dit wordt gebruikt om de eiwit matrix daling in de volgende stap te verwijderen.
3. In de alspiraterij putjes, pipet op en neer om de eiwit matrix daling van de plaat los. Gentle schrapen met de punt van een 10 ml pipet is behulpzaam bij het loskomen proteïnematrix druppel. Breng de inhoud naar een 15 ml conische buis.
4. Incubeer de 15 ml conische buizen op ijs gedurende 10 minuten en centrifugeer bij 125 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Observeren een witte pellet op de bodem van de conische buis. Zuig voorzichtig en gooi het merendeel van de supernatant / oude organoïde kweekmedium boven de organoïde pellet verlaten 100-200 ul boven het pellet.
5. Breek de organoïde crypten met behulp van een 23 gauge naald bevestigd aan een 1 ml spuit. Zuig en uitwerpen 10-15 keer om de crypten distantiëren. Minimaliseer luchtbel vorming als gevolg van overmatige pipetteren.
6. Resuspendeer de organoids in 500 pl matrix eiwit en voeg 50 ul per putje in een nieuwe voorverwarmde 24 wells plaat. Voeg 450 ul van eerder bereide organoïde groeimedia + 50 pi R-spondin1geconditioneerde media per goed. Incubeer de platen bij 37 ° C overnacht.

5. Plating Organoids op dag 14 voor Pattern Recognition Receptor stimulatie met PAMPs en Listeria monocytogenes voor de analyse van genexpressie

1. Twee dagen voorafgaand aan te vechten, streak uit L. monocytogenes op een BHI agar plaat.
2. De volgende dag pluk een L. monocytogenes kolonie en groeien in 10 ml BHI bouillon bij 37 ° C geïncubeerd onder schudden bij 200 rpm.
3. Ontdooi de matrix eiwit op ijs gedurende de nacht bij 4 ° C de dag voordat organoïde challenge. Warme steriele 24 wells plaat met 37 ° C gedurende ten minste 30 min. Bereid organoïde groeimedia in stap 2.2 beschreven en laten 37 ° C tot gebruik.
4. Verwijder organoïde cultuur uit incubator en beginnen passage van organoids.
5. Aspiraat media 3-4 putjes en houdt het opgezogen medium in de 10 ml pipete omdat dit wordt gebruikt om de eiwit matrix druppel verwijderen. Pipet envastgesteld om de eiwit matrix daling van de plaat los. Gentle schrapen met de punt van een 10 ml pipet is behulpzaam bij het loskomen proteïnematrix druppel. Breng de inhoud naar een 15 ml conische buis.
6. Incubeer de 15 ml conische buizen op ijs gedurende 10 min. Centrifugeer bij 125 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Observeren een witte pellet op de bodem van de conische buis. Zuig het supernatant laat ongeveer 100 pl resterende supernatant achter.
7. Resuspendeer de organoïde pellet in 5 ml ijskoude 1x PBS en verwijderen 10 pi aliquot te tellen. Voeg de 10 ul monster naar het midden van een hemocytometer zonder glazen afdekplaat slip. Voorzichtig overlay de glazen dekglaasje bovenop de druppel.
   NB: De hemocytometer zal met organoids verstoppen als het glaasje wordt niet eerst verwijderd.
8. Tel het totaal aantal organoids via een lichtmicroscoop in elk raster / het hele kamer van de hemocytometer en bepaal de organoïde concentratie: number van de totale organoids geteld per 10 ul.
9. Verwijderen van een geschikt volume van 15 ml conische buis waarmee adequate aantallen organoids worden gezaaid voor de bepaling en centrifugeer deze suspensie bij 125 xg gedurende 10 min.
   LET OP: Het bereik tussen 40-100 organoids per putje van een plaat met 24 putjes is voldoende voor RNA-analyse. De typische organoïde grootte kan variëren van 300 pm tot 1000 pm in diameter.
10. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ml proteïnematrix genereren zonder luchtbellen. Voeg 50 ml organoïde / eiwit matrix schorsing per putje in een plaat met 24 putjes.
    LET OP: De hoeveelheid eiwit matrix gebruikt om organoids mengen zal variëren van het aantal behandeling omstandigheden en technische repliceert.
11. Voeg 500 ul van organoïde groeimedia (zonder N-acetyl-cysteïne) aan elk putje en incubeer bij 37 ° C + 5% _CO2 gedurende 1 uur.
12. Bereid 2x concentraties PAMPs (dwz flagelline,lipopolysaccharide) en live L. monocytogenes. Meet de OD van levende L. monocytogenes en biefstuk op een BHI plaat voor het tellen. Behandel organoids 1 x 10 ⁶ kolonievormende eenheden (CFU) / ml.
    LET OP: De OD CFU bepaling zal variëren door bacteriën typen en vooraf moeten worden beoordeeld aan stimulatie organoïde. Bijvoorbeeld, een OD van 0,6 ≈ 1 x 10 ⁹ CFU / ml voor L. monocytogenes, maar moet ook worden vastgesteld, onafhankelijk voorafgaand aan het experiment.
13. Streak een seriële verdunning van de behandeling stock van L. monocytogenes de behandeling CFU / ml nauwkeurig bepalen. De auteurs dat een 1 x 10 ⁸ verdunning van 100 ui op een BHI-agarplaat volstaat koloniën om een nauwkeurige CFU / ml te bepalen tellen.
14. Bereid een oplossing van hitte gedode L. monocytogenes door middel van een 1 ml portie van de live L. monocytogenes oplossing en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 10 min. Zuig het supernatant en wassende bacteriële pellet met 1 ml 1x PBS.
    1. Centrifugeer de L. monocytogenes bij 5000 xg gedurende 10 min en resuspendeer de pellet in 1 ml 1X PBS. Verhit de dood van de L. monocytogenes in een 1,7 ml polypropyleen buis door verwarming bij 80-90 ° C gedurende 1 uur. Cultuur een 100 pi hoeveelheid van de hitte gedode L. monocytogenes op een BHI agar plaat te bevestigen geen levende bacteriën blijven.
    2. Voeg 500 ul van de geschikte 2x PAMP en / of microbe behandeling 500 pl resident media in aparte putjes bepaald door de gebruiker. Incubeer bij 37 ° C + 5% _CO2 gedurende 24 uur.
       Opmerking: Het toevoegen van een 500 pi hoeveelheid van 2x PAMP / microbe behandeling 500 pl resident media behandeling concentratie 1x brengen in een totaal volume van 1 ml.
15. De volgende dag, handmatig L. tellen monocytogenes kolonies voor een nauwkeurige bepaling van behandeling CFU / ml. Aspireren media van de plaat van de behandelde organoids en was putten trie keer met 1x PBS.
16. Overgaan tot RNA-extractie via fenol / chloroform ¹¹ of RNA extractie kit volgens instructies van de fabrikant. Evalueer genexpressie onder toepassing van standaard qRT-PCR ^12.

6. Plating Organoids op dag 14 voor PAMP en L. monocytogenes Challenge voor eiwit analyse in Supernatant

1. Twee dagen vóór de prikkeling, start een celcultuur van Caco-2 cellen, zaaidichtheid ≈1 x 10 ⁶ cellen in een T-75 kolf met 1x DMEM + 20% FBS en incubeer de Caco-2-cellen bij 37 ° C + 5 _% CO2. Begin met een bacteriële cultuur van L. monocytogenes op BHI plaat en incubeer plaat in een bacteriële incubator bij 37 ° C.
2. De volgende dag pluk een L. monocytogenes kolonie en groeien in 10 ml BHI bouillon bij 37 ° C overnacht. Ontdooi de matrix eiwit op ijs gedurende de nacht bij 4 ° C de dag voordat organoïde challenge.
3. De volgende dag warme steriele 96 goed zwart-walledplaat 37 ° C gedurende ten minste 30 min. Bereid organoïde groeimedia zonder N-acetyl-cysteïne beschreven in stap 2.2 en laten 37 ° C tot gebruik. Verwijder organoïde cultuur uit incubator en beginnen passage van organoids.
   OPMERKING: De typische organoïde grootte kan variëren van 300 pm tot 1000 pm in diameter.
4. Aspiraat media 3-4 putjes en houdt het opgezogen medium in de 10 ml pipete omdat dit wordt gebruikt om de eiwit matrix druppel verwijderen. Resuspendeer met een pipet om de eiwit matrix daling van de plaat los. Gentle schrapen met een 10 ml pipet is handig bij het loskomen van het eiwit matrix druppel. Breng de inhoud naar een 15 ml conische buis.
5. Incubeer de 15 ml conische buizen op ijs gedurende 10 min. Centrifugeer bij 125 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Observeren een witte pellet op de bodem van de conische buis. Zuig het supernatant waardoor 100 pl resterende supernatant achter.
6. Resuspendeer de organoïde pellet in 5 ml ijskoude1x PBS en verwijderen van een 10 ul aliquot voor het tellen. Voeg de 10 ul monster naar het midden van een hemocytometer en voorzichtig overlay het glas dekglaasje.
   NB: De hemocytometer zal met organoids verstoppen als het glaasje wordt niet eerst verwijderd.
7. Tel het aantal organoids via een lichtmicroscoop in elk raster van de hemocytometer / de gehele ruimte en bepaal de organoïde concentratie: totaal aantal organoids geteld per 10 ml.
8. Verwijderen van een geschikt volume van 15 ml conische buis waarmee adequate aantallen organoids worden gezaaid voor de bepaling en centrifugeer deze suspensie bij 125 xg gedurende 10 min.
   OPMERKING: De hoeveelheid eiwit matrix gebruikt organoids mengen varieert de hoeveelheid behandelingsomstandigheden en technische replicaten. De auteurs merken dat 40-100 organoids volstaat afgescheiden eiwitanalyse.
9. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 pl matrix eiwit / putje zonder opwekkenluchtbellen.
   OPMERKING: De hoeveelheid eiwit matrix gebruikt organoids mengen varieert de hoeveelheid behandelingsomstandigheden en technische replicaten.
10. Laat ten minste twee kolommen leeg op de 96 putjes zwarte wanden weefselkweekplaat omdat deze dienen als putjes geënt met Caco-2-cellen voor het genereren van een standaardcurve. Voeg 50 ul proteïne matrix + organoïde suspensie per putje een voorverwarmde 96 en zwarte wanden weefselkweekplaat. Bewaar de plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten om eiwit matrix te stollen.
11. Voeg 100 ul van organoïde groeimedia (zonder N-acetyl-cysteïne) aan elk putje en incubeer bij 37 ° C + 5% _CO2 gedurende 1 uur.
12. Bereid 2x concentraties van PAMPs en leven L. monocytogenes. Voeg 100 ml van elk bepaalde behandeling staat per putje en incubeer gedurende 24 uur.
13. De volgende dag plaat Caco-2-cellen in de putjes standaardcurve. Begin met een warming steriele 1x PBS, 0,25% trypsine en 1x DMEM + 20% FBS to 37 ° C.
14. Verwijder de T-75 kolf die Caco-2-cellen en zuig het celkweekmedium. Was de cellen met 10 ml 1 x PBS. Zuig het 1x PBS, voeg 2 ml 0,25% trypsine en plaats T-75 kolf in 37 ° C incubator gedurende 15 minuten.
15. Visualiseren de kolf onder een lichtmicroscoop zorgen de cellen losgemaakt voeg 8 ml 1x DMEM + 20% FBS aan de vrijstaande Caco-2 cellen over in een 15 ml conische buis. Verwijderen 10 pi aliquot en tel de cellen door lichtmicroscopie met een hemocytometer.
    LET OP: Een bovenste cel aantal van 60.000 cellen / werkt goed goed en verdunningen kan worden uitgevoerd voor het genereren van de standaard curve tot aan 2500 cellen / putje.
16. Resuspendeer de Caco-2-cellen in eiwitmatrix en voeg 50 ul per putje aan geschikte putjes. Laat de eiwit matrix te stollen bij 37 ° C gedurende Caco-2 cellen.
    Opmerking: Het kweekmedium voor de Caco-2 cellen niet moeten worden toegevoegd na het stollen van de matrix eiwit.
17. volgendde 24 uurs behandeling tijd voor de organoïde assay, aspireren en sla het organoïde cellulaire bovenstaande media en blijf op ijs. Was de putjes drie maal met 1 x PBS. Voeg 100 ul 100% methanol aan elk putje zoals de Caco-2 standaardcurve wells en geïncubeerd bij 4 ° C of op ijs gedurende 20-30 min de organoids lossen.
    LET OP: Het is niet vereist dat de Caco-2 standaard curve wells worden gewassen met 1x PBS, want ze kunnen hebben methanol direct toegevoegd.
18. Na de incubatie methanol, driemaal wassen de putjes met ijskoud 1x PBS. Bewaar de plaat bij 4 ° C gedurende maximaal 1-2 weken.
19. Voeg nucleaire kleuring kleurstof in een concentratie van 1 ug / ml per putje, de plaat bedekken met aluminiumfolie en incuberen bij 4 ° C overnacht.
20. Gebruik een 96 puts plaat lezer nucleaire kleuring kleurstof excitatie / emissie (350 nm / 461nm respectievelijk) te meten en normaliseren iedere organoïde goed met de standaardkromme van Caco-2 cellen.
21. Overgaan tot downstream assays, zoals ELISA

Representative Results

Wanneer na dit protocol om intestinale organoids te cultiveren, zal karakteristieke bolvormige organoids aanwezig na het oogsten zijn. De toevoeging van R-spondin1 geconditioneerde media dag wordt de groei en ontluiken van de organoids initiëren. De groei van organoids wordt getoond in Figuur 1A - F en representeert intestinale organoids op dagen 1, 2, 4, 5, 6 en dag 14. Figuur 1F geeft de niet-homogene groeikenmerken van organoids op dag 14.

Zodra de organoids worden gekweekt tot voldoende aantal, kunnen deze worden uitgeplaat en uitgedaagd met diverse PAMPs en / of microben. Expressie analyse kan worden uitgevoerd via standaard technieken. Dit is weergegeven in Figuur 2A-C die de mRNA expressie van inflammatoire cytokines IL-18, IL-6 en TNFa die werden geanalyseerd na een toont24 uur uitdaging organoids met warmte gedode L. monocytogenes en de PAMP flagellin. De reden voor het evalueren van de mRNA expressie cytokinen IL-18, IL-6 en TNFa was dat deze waren goede kandidaten om te worden gemoduleerd door de epitheelcellen in respons op pathogene uitdaging, en modulatie van deze inflammatoire cytokines zou de doeltreffendheid van de techniek tonen.

Figuur 3A - C toont de relatieve nucleaire kleuring van intestinale organoids met nucleaire kleuring kleurstof na fixatie met minimale achtergrond kleuring van puin in de bewoner eiwit matrix. Deze methode van fixatie en kleuring kan op assays, die goed zijn voor verschillend aantal cellen in elk putje te normaliseren. Dit blijkt in figuur 4 bij het ​​genereren van een standaardcurve van seriële verdunningen van Caco-2 cellen uitgeplaat in matrix eiwitten, vervolgens gefixeerd en gekleurd met nucleairekleuring kleurstof. De ^R2 waarde van 0,89 duidt een lineair verband tussen het aantal cellen en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit, en de lineaire vergelijking kan worden gebruikt om organoids aantal cellen normaliseren. De standaardkromme weergegeven in figuur 4 begint de grens verzadiging dan 30.000 cellen per putje bereiken. Een titratie van cellen boven 30.000 cellen per putje is getoond in figuur 4 om de verzadiging reeks nucleaire kleuring kleurstof omvatten. Verhoogde nauwkeurigheid normalisatie wordt verkregen met een aantal cellen dat het lineaire gebied van de nucleaire kleuring kleurstof reflecteert voordat het verzadigingspunt is bereikt.

Figuur 1:. Dunne darm organoïde Groei Time loop van de groei van muizen dunne darm afgeleid organoids volgende isolement. (A) Dag 1. (B) Dag 2. (C) Dag 4. (D) Dag 5 (E) Dag 6 (F) Dag 14. Beelden zijn representatief voor organoïde groei voor elke willekeurige dag. Schaalbalken gelijk 200 pm linkerafbeelding voor de A, B, C, D en E gelijk schaalbalk 100 urn in het juiste beeld voor A, B, C, D en E. schaalbalk equal 1000 urn en 200 urn voor links en rechts beelden voor F, respectievelijk. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: mRNA expressie van ontstekingscytokinen Na 24 uur PAMP Challenge relatieve mRNA-expressie van wild-type intestinale organoids uitgedaagd met 24 uur PAMPs en warmte gedode Listeria monocytogenes (A - C) vertegenwoordigen voudige verandering van de i.. nflammatory cytokines IL-18, IL-6 en TNFa resp. Error bars vertegenwoordigt standaarddeviatie (SD) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Relatieve Fluorescerende kleuring van Organoids voor Normalisatie Nucleaire kleuring van organoids met de volgende fixatie.. (A) Bright gebied van organoids. (B) Fluorescerende kleuring van organoids met nucleaire kleuring kleurstof. (C) Samengevoegd beeld van helder veld en fluorescerende vlekken. Schaal bars gelijk aan 400 pm in alle afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

">
Figuur 4: standaardcurve gegenereerd van Caco-2 cellen standaard curve gegenereerd uit drievoudige putjes.. Cel zaaien had een bereik vanaf 60.000 cellen per putje met verdunningen beneden tot 2.500 cellen per putje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5:. Overzicht van het Protocol Diagram 1-bovenpaneel van de figuur toont het oogsten van de R-spondin1 geconditioneerde media. 2-Middle Panel van de figuur illustreert aspecten van het protocol om te oogsten en cultuur muis dunne darm organoids. 3-onderkant van de figuur illustreert: (A) De beplating van 14 dagen gekweekte organoids. (B) Challenge met PAMPs / L.monocytogenes en laat onbezette putten een standaardcurve. (C) Na de PAMP uitdaging, de beplating van Caco-2-cellen in de eerder onbezette putten een standaardcurve. (D) Naar aanleiding van de fixatie en toevoeging van een nucleaire kleuring kleurstof, het meten van de excitatie / emissie van de putten en het normaliseren tegen een standaard curve. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De cultuur en onderhoud van intestinale organoids is een procedure die kan worden beheerst door een persoon met voldoende weefselkweek. Er zijn nuances in passages in vergelijking met groeiende cellen in een meer conventionele monolaag, maar deze subtiele niet moeilijk te overwinnen. De kritische stappen van deze werkwijze omvatten de mogelijkheid om de organoids groeien tot een voldoende hoge dichtheid voor optimale zaaien. Experimenten Er moet worden opgeschaald organoids zo groot seeding dichtheden die vaak kan worden bereikt met cellijnen zijn niet praktisch. Dit is met name duidelijk wanneer er meerdere behandelingsgroepen.

Dit protocol is bedoeld om een ​​stap voor stap methode om gastheer-pathogeen interacties van het darmepitheel studie met een verschillende bacteriële verschaffen, virale en fungale pathogenen, evenals moeilijkheden adres via dit systeem ten opzichte van normalisatie. Rapporten zijn beschikbaar die describe de interacties van intestinale organoids met de bacteriële ziekteverwekker Salmonella, nog niet normalisatie methoden niet te pakken bij het ​​meten van uitgescheiden cytokines ^13.

Er zijn verschillende problemen die worden ondervonden bij het normaliseren organoïde culturen door verschillende methoden. Normaliseren gesecreteerd eiwit via bicinchoninezuur assay (BCA) is een optie; De groei die nodig zijn voor organoïde cultuur (N2 en / of vitamine B27) interfereren met de BCA-assay (data niet getoond) normaliseren via cellulaire levensvatbaarheid, zoals een gemodificeerde MTT assay beschreven ^14.; echter een behandeling die de mitochondriale metabole activiteit van de organoids zal veranderen zal een onnauwkeurig methodes voor het introduceren via deze techniek op basis van MTT reductie door de werking van mitochondriaal dehydrogenase ^15. Het is ook noodzakelijk om N-acetyl-cysteïne (NAC) van de media te verwijderen, niet oply als normalisatie via de MTT techniek gewenst is, maar als de behandeling van een bacteriële pathogenen zoals NAC kan bacteriegroei ¹⁶ remmen.

Voordelen van deze techniek zijn dat uitgescheiden cytokinen en eiwitten uit organoids nu genormaliseerd tegen een standaardcurve van Caco-2 cellen zijn. Beperkingen van deze techniek is dat de normalisering correlatieve vanwege nucleaire kleuring van niet-getransformeerde primaire epitheliale organoids zijn genormaliseerd tegen de nucleaire kleuring van darmkanker cellijn. De auteurs vinden dat de vaststelling van met methanol en vlekken kernen met nucleaire kleuring kleurstof is een effectieve normalisering techniek tegen een standaardcurve van Caco-2 cellen. Hoewel de groeikenmerken van deze colonkanker cellijn niet precies bootsen de groeikenmerken van intestinale organoids, met een nucleaire kleurstof en meting van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit is een goede strategie normaliseren tegen totale celaantal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11050	(Section 1,3,6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge	Thermo		(Section 1,3)
DMEM	GE Healthcare	Sh30243.01	(Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line			(Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia.
50 ml conical tube	Falcon	352070	(Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask	Corning	431079	(Section 1) Or equivalent brand
Protein Matrix	Corning	356231	(Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced
HyClone Dulbecco's (DPBS)	GE Healthcare	SH30264.01	(Section 2,3)
DMEM/F12	Life Technologies	12634-010	(Section 2,3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates	Corning	3524	(Section 2)
N2 Supplement 100x	Life Technologies	17502-048	(Section 2)
B27 without vitamin A 50x	Life Technologies	12587-010	(Section 2)
Trizol	Life Technologies	15596-026	(Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax)	Life Technologies	35050-061	(Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M)	Life Technologies	15630-080	(Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
10ml Serological Pipet	Falcon	357551	(Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin	Peprotech	250-38	(Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	(Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF	Biolegend	585608	(Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable	Bioexpres		(Section 3)
dissecting scissors			(Section 3)
forceps			(Section 3)
glass slides			(Section 3)
dissecting tweezers			(Section 3)
25 ml Serological Pipet	Falcon		(Section 3)
EDTA	Sigma-Aldrich	SLBB9821	(Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100mm x 15mm	Fisher	FB0875712	(Section 3) Or equal sized TC dish
1ml Syringe	Becton Dickinson	309659	(Section 4)
Precision Glide Needle	Becton Dickinson	305120	(Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm)
Flagellin from Bacillus subtilis	Invivogen	tlrl-bsfla	(Section 5,6)
Listeria monocytogenes	ATCC	19115	(Section 5,6) (Murray et al.)
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA	(Section 5,6)Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar	Becton Dickinson	211065	(Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion	Becton Dickinson	237500	(Section 5)
Caco-2	ATCC	HTB-37	(Section 6)
Trypsin	gibco	25200056	(section 6)
Methanol	Fisher	A412-4	(Section 6)
SpectraMax M5	Molecuar Devices		(Section 6)
96 Well Assay Plate	Corning	3603	(Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye	Life Technologies	H1399	(section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask	Corning	430641	(Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube	Falcon	352096	(Section1,3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube	Bioexpress	C-3262-1	Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep	Zymo Research	R1054	Or equivalent brand
TNF-alpha	Applied Biosystems	Mm 00443260_g1	Taqman gene expression assay kit
IL-6	Applied Biosystems	(Mm 00446190_m1	Taqman gene expression assay kit
IL-1beta	Applied Biosystems	Mm 00434228_m1	Taqman gene expression assay kit
IL-18	Applied Biosystems	Mm 00434225_m1	Taqman gene expression assay kit
18s	Applied Biosystems	Hs 99999901_s1	Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System	Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler	Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix	Life Technologies	4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies/Applied Biosystems	4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Life Technologies/Applied Biosystems	4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein	R&D Systems	3474-RS-050	500 ng/ml
chloroform	Sigma-Aldrich	C7559