Published: May 18, 2016 doi: 10.3791/54033

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Daniel E. Rothschild¹, Tara Srinivasan², Linette A. Aponte-Santiago¹, Xiling Shen^2,3,4, Irving C. Allen¹

¹Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, ²Department of Biomedical Engineering, Cornell University, ³School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, ⁴Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.

Abstract

Primer bağırsak organoids önemli ölçüde mukozal immünoloji alanında etkileme potansiyeline sahip değerli bir model sistem. Ancak, organoid büyüme özelliklerinin karmaşıklığı araştırmacı için önemli uyarılar taşır. Spesifik olarak, her bir organoid büyüme desenler oldukça değişkendir ve kültür epitel hücrelerinin bir heterojen oluşturun. Bu uyarılar, ortak bir doku kültür uygulamaları sadece bağlı hücresel yapının karmaşıklığına organoid sistemine uygulanamaz. Bazı normalizasyon tekniği uygulandığı sürece Sayma ve hücre hatları gibi ayrı ayrı ayrılmış hücreler için ortak olan hücre sayısı, yalnızca dayalı kaplama, organoids için güvenilir bir yöntem değildir. toplam protein içeriğine Normalize bağlı yerleşik protein matrisi karmaşık yapılır. salgılanmış con değerlendirirken hücre sayısı, şekli ve hücre türü açısından Bu özellikler dikkate alınmalıdırorganoid kitleden çadırları. Bu protokol kültürüne basit bir prosedür anahat ve mikrobiyal patojenler ve patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) ile ince bağırsak organoids tedavi oluşturuldu. Aynı zamanda protein analizi, böyle bir mücadeleden sonra yapılır iken uygulanmalıdır normalleştirme teknikleri vurgulamaktadır.

Introduction

Becerisi hasat ve kültürü birincil organoids doku biyolojisinde ^1-5 için daha fazla fizyolojik olarak Örnek olguları anlama germane verici gelişmeleri ince bağırsak, kolon, pankreas, karaciğer ve beyin için tarif edilmiştir ve. Ince bağırsak organoids kültürünü ve bakım açıklayan ilk yöntemler Sato ve arkadaşları tarafından rapor edildi. Hans Clevers ¹ laboratuar dışında. Bu yöntem, hasattan ve ispat primer intestinal epitelyal hücrelerin kültürü önce sınırlı ve epitel hücre büyümesinin sürdürülmesi etkisiz olduğunu göstermiştir. Yöntem sonuçta karışmış primer fibroblast hücreleri ⁶ büyümesinin yol açacak gibi kollajenaz ve dispase gibi enzimler ile inkübasyon yoluyla doku ayrılmasını içermektedir. Bu koşullar aynı zamanda zaman epitel hücre kültürü sürdürülmesinde sınırlı olacaktır. epitel hücreleri nedeniyle apoptoz girecek hiçbir epitel hücre niş Minimal, kuracaktıUygun büyüme faktörleri ya da kontak bütünlüğü kaybı olmaması anokis ⁷ olarak adlandırılan. 3D-organoid kültür sisteminin çıkışı sürekli kültürü ¹ intestinal hücre tiplerinin spektrumu içeren kültür primer bağırsak hücreleri için bir yöntem sağlamıştır. Bu epitel organoids da birkaç farklı hücrelerden oluşan, öyle ki hücre çizgileri üzerinde avantajlara sahip ve daha iyi bunlar, in vivo ⁸ elde edilir organı taklit eder. süreç sonunda farklı uyaranlara altında bağırsak epiteli yanıtını değerlendirmek için değerli bir araç olduğunu kanıtlamıştır "bir tabak içinde mini gut büyümek". Bu moleküler desenleri host ve mikrop ⁹ hem farklı yanıtları düzenleyen gibi mikrobik patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) ile primer intestinal hücrelerinin etkileşimi araştıran immünoloji alanında alakalı. Sadece Araştırmacılar şimdi fare organoids bu etkileşimleri keşfetmek, ama onlar yapabilirsinizkuyu ² olarak insanlardan kültüre olabilir. Bu teknoloji dramatik kişiselleştirilmiş tıp değiştirme potansiyeline sahiptir ve tekniğin yakın gelecekte mümkün hale getirecek ilerlemeler hakkında kurgulanabilir.

Bu yöntem genel amacı, çeşitli uyaranlara bir kültür, genişleme için protokol ve barsak organoids bir tedavinin temin edilmesini sağlamaktır. Bu tür uyaranlar aşılar, bakteriyel PAMPS, canlı patojenler, gastrointestinal (Gİ) ve kanser tedavi dan sonuçta uzanabilir. Fare bağırsak organoids izolasyonu ve kültürü Sato ve ark adapte edilmiştir. Bu protokolü takip ederken, son ürün kültürü organoid olmak hala elde edilir orijinal yönteminden hafif sapmalar olmasına rağmen. Bu yöntem, hücre n dayalı bir tahlilin gerçekleştirilmesi dikkate alınmalıdır homojen olmayan hücre yapıları, çalışırken uygun normalizasyonu için yeterli bir teknik tarif odaklanmıştırkoyu kahverengi.

Protocol

Tüm araştırma onaylanmış ve Virginia Tech IACUC kurallarına altında gerçekleştirildi

1. Ar-Spondin1 HEK293T-Rspo1 Hücre Hattı itibaren Medya Klima hazırlayın

1. HEK293T-Rspondin1 hücrelerinin üretimi, daha önce ¹⁰ tarif edilmiştir. Tohum HEK293T-Rspondin1 1x Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) içinde, 40 ml% 10 fetal sığır serumu (bir T-175 şişesi içinde, yaklaşık olarak% 5-10 birbirine karıştığında 8 x 10 ⁵ -1.7 x 10 ⁶ hücre salgılayan hücrelerin büyüme ortamı olarak FBS), ve 37 ° C'de 5% _CO2 inkübe edilir.
   NOT: R-spondin1 klimalı ortam olarak hizmet verecek HEK293T-Rspondin1 salgılayan hücreler için büyüme ortamı. R spondin1 seçenek olarak, 500 ng / ml'lik bir son konsantrasyonda kullanıldı bir rekombinant büyüme faktörü olarak satın alınabilir.
2. yedi gün boyunca ya da parlak alan mikroskopi ile belirlendi% 95 konfluent elde edilene kadar HEK293T-Rspondin1 hücreleri büyütün. Bir 50 koşullu ortam ve transfer 40 ml Hasatml konik tüp. HEK293T-Rspondin1 salgılayan hücrelerin T-175 şişesi atın.
3. Santrifüj, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de koşullu ortam içeren tüp hücre yıkıntıları pelet haline getirildi. Süpernatant toplayın, 15 ml tüpler içinde R spondin1 koşullu ortam, ve kısım olarak adlandırılan. Kısa süreli veya uzun süreli depolama için -80 ° C -20 ° C'de saklayın alikotları.
   NOT: Bir kere çözülmüş, R-Spondin1 koşullu ortam 1 hafta 4 ° C 'ye kadar saklanabilir.

2. organoid Büyüme Medya hazırlanması ve Hasat Küçük Bağırsak Crypts için Reaktifler  

1. Bir günlük toplanmadan önce, buz üzerinde bir protein matrisi yerleştirin ve 4 ° C'de bir gece eritin. kript hasat için kullanılacak makas, forseps ve cam slaytlar kesme otoklav.
2. Ertesi gün, 1 x DM 40 ml stok konsantrasyonları eklenerek takviyeleri ve büyüme faktörlerini içeren organoid büyüme ortamı 40 ml hazırlanmasıyla başlarEM / F-12. Ortam takviyeleri içerir: 10 mM 2- [4- (2-hidroksietil) piperazin-1-il] etansülfonik asit (HEPES) - 400 ul, 1 x glutamin eklemesi, - 400 ul, 1 x B27 vitamini olmaksızın - 400 ul, 1 x N2 - 200 ul, 1 mM N-asetil-sistein - 40 ul, 100 ng / ml, m-Noggin - 40 ul, 50 ng / ml, m-EGF - kullanıma kadar 37 ^o C su banyosu içinde 4 ul koyun. Bir su banyosu içinde 37 ° C R spondin1 bir 15 ml'lik bir şişe ısıtın.
3. bir kuluçka makinesi içinde yerleştirilmesi ile en az 30 dakika boyunca 37 ° C'ye ısınmaya üç steril 24 oyuklu plakalar. 4 ° C'de fare 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) + 2 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ve serin 50 ml hazırlayın. PBS,% 10 FBS ve 4 ° C'ye soğutun içeren 1 x fare başına 100 ml hazırlayın.

Organoid Kültür ¹ 3. Hasat Mus musculus Küçük Bağırsak Crypts

1. 6-12 haftalık standart kemirgen yemi ve mevcut su yükseltilmiş bir erkek C57B6 / J fare yaş Kurbanad libitum kurumsal kurallarına göre. CO ile servikal dislokasyon ₂ boğulmaya öldürülür.
   NOT: Doku hasat kadar buz üzerinde karkas tutun ve kontaminasyon riskini en aza indirmek için bir biyolojik güvenlik kabini doku hasat gerçekleştirin.
   Not: Bir erkek veya dişi fare organoids oluşturmak için kullanılabilir.
2. (İsteğe bağlı)% 70 etanol submersing önce kürk çıkarmak için fareyi Tıraş. 2 dakika süreyle% 70 etanol içinde fare daldırılması ve yönetim kurulu dokunmadan fare dorsal yüzü kurulu çivileme için uzuvlarını pin.
3. Önceden sterilize kullanın fare ventral kısmında bir orta hat kesi yapmak için makas ve forseps diseksiyon. boyun tabanına kranial geçmeden genital de kesi yapmak. cımbız ile yanal cilt kesisi açın ve periton maruz çivileme kuruluna cildi pin.
4. diseksiyon makas ile karın periton bir orta hat kesi yapmak ve inci katkarın organları açığa çıkarmak amacıyla sabitleme kuruluna yanal forseps ve iğne ile e periton.
   NOT: karın organları kesme önlemek için özen gösterin.
5. mide ve çekumda bağlı uzak kavşak bağlı ince bağırsağın proksimal kavşak keserek forseps ve makas diseksiyon ile karın boşluğuna küçük bağırsak çıkarın. PBS 1X buz gibi soğuk 10 mi içeren steril bir petri küçük bağırsak yerleştirin.
6. 1 ml pipet kullanarak PBS 1X buz ile ince bağırsağın lümeninde bulunan içeriği çalkalayın. ince bağırsak lümeni içinde enkaz çıkarılana kadar bu adımı tekrarlayın.
7. 3-4 yaklaşık eşit uzunlukta şeritler halinde makas diseksiyon ile ince bağırsağı kesin ve uzunlamasına yeni bir steril Petri kabı şeritler yatıyordu. Her şerit için, bir kesi tüm uzunluğu o hale getirmek için ince bağırsak lümeni içinde diseksiyon makas kesim kenarını yerleştirinşerit f. yanal ince bağırsağın lümen maruz amacıyla kesi açık kat için forseps kullanabilir.
8. yavaşça ince bağırsağın lümen yüzeyinde villuslar kazınması için steril bir cam slayt kullanın. Kesme makası ile 1-2 cm uzunluğunda şeritler halinde ince bağırsağa kesin ve PBS 1X 10 ml buz soğukluğunda içeren 50 ml konik tüp, bu şerit aktarma.
9. 50 ml konik tüp ters çevrilerek yavaşça karıştırın ve doku içerikleri 50 ml konik tüp tabanına oturmasına izin verin. 1x PBS aspire ve PBS 1x buz gibi soğuk 10 ml doku yıkayarak bu üç kez tekrarlayın. Son yıkama 10 PBS 1X ml ve küçük bağırsak dokusu parçalarını ihtiva eden, 10 dakika boyunca buz üzerinde konik tüp bırakın.
10. 1x PBS aspire ve 1 x PBS + 2mM EDTA 25 ilave edin. 4 ° C'de veya 45 dakika süre ile bir buz kovası sallanan bir platform üzerine yerleştirin. Doku kuluçka iken, altı 15 ml konik tüpler etiket "fraksiyon # 1-6."
11. Doku içeriği tüpün dibine yerleşmek için izin verin. Çıkarın ve "kesir 1" etiketli tüp 15 ml konik süpernatantı aktarın. aşama (3.11) beş kez çalkalanarak 1 x PBS +% 10 FBS tekrarlayın uygun biçimde etiketlenmiş fraksiyonu tüp amacıyla süpernatan içeriği aktarın.
12. 5 dakika boyunca 125 x g'de santrifüjleyin. 5 ml süpernatan ve pelet tekrar aspire önceden ısıtılmış 1x DMEM / F-12, büyüme faktörleri ile ilave edildi.
13. 2 dakika için 78 x g'de santrifüjleyin. Aspire 4 süpernatan mi ve geri kalan ortam 1 ml her bir pelet.
14. Her bir fraksiyondan 20 mi çıkarın ve cam bir slayta ekleyin. bir ışık mikroskobu altında crypts ve enkaz görselleştirmek ve birleştirmek için hangi kesirler belirlemek ve en büyük Perce elde etmek için buna göre havuzÇöp oranı kriptlerin ntage.
    NOT: Kesirler 2-6 crypts büyük yüzdesi kaplama için verim. havuza fraksiyonlar en sık fraksiyon 6 fraksiyon 4, ve fraksiyon 5 ile fraksiyon 3 vardır.
15. Santrifüj edilen fraksiyonlar, 5 dakika boyunca 125 x g'de kaplanacak. Süpernatant aspire pelet yukarıda kalan 50-100 ul bırakarak.
16. buz üzerinde tüpler tutun ve toplanmış fraksiyonları protein matrisi 1 ml ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı yavaş yavaş hava kabarcığı eklenmesini önlemek için.
17. 37 ° C inkübatör önceden ısıtılmış 24 gözlü levhalar çıkarın ve her bir orta protein matrisi / kript süspansiyon 50 ul ekle. Protein matriks damla katılaşmaya izin vermek için 10 dakika boyunca 37 ° C inkübatör tohumlanmış-plaka aktarın.
18. önceden hazırlanmış organoid büyüme ortamı + oyuk başına ortamla R spondin1 50 ul 450 ul ekle. 37 ° C'de 5% _CO2 gece boyunca inkübe edin.
19. R-spondin1 şartına medi 50-100 ul ekleyiniyi günde başına. Her ^3. gün de adım 2.2 tarif taze hazırlanmış organoid büyüme ortamı 450 ul / ile tüm organoid büyüme ortamı değiştirin. Ayrıca R-spondin1 koşullu ortamın 50-100 ul ekleyin başına iyi.
    NOT: Protein matriks damla bir hafta boyunca kendi bütünlüğünü korur, ancak 7 gün sonra pasaj organoids geçin.

4. Pasajlanması Organoids Her 7 ^inci Gün

1. 4 ° C Pasajlanması gün önce buz gecede protein matrisi çözülme. En az 30 dakika boyunca 37 ° C sıcak bir steril 24 oyuklu plaka. aşama 2.2 'de tarif edilen organoid büyüme ortamının hazırlanması ve kullanıma kadar 37 ° C'de tutun.
2. inkübatör organoid plakasını çıkarın ve buz üzerinde plaka pasajlanmasını başlar. 3-4 kuyudan bir 10 ml pipet ile aspire büyüme ortamı başlatın.
   Not: Bu, bir sonraki aşamada, protein matrisi damla çıkarmak için kullanılacak şekilde, 10 mi pipet aspire muhafaza edin.
3. olarakkorsan-kuyu, pipet yukarı ve aşağı plaka protein matrisi damla çıkarmak için. 10 ml'lik bir pipet ucu ile hafifçe kazınarak Protein matriks damla yerinden çıkarılmasına yardımcı olur. 15 ml konik tüp içeriği aktarın.
4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 125 x g'de 10 dakika santrifüj 15 ml buz üzerinde konik tüpler inkübe edin. Konik borunun altta beyaz topak dikkate alınmalıdır. Yavaşça aspire ve pelet yukarıda 100-200 ul bırakarak organoid pelet üzerinde yüzer madde / eski organoid büyüme ortamı çoğunluğu atın.
5. 1 ml şırınga bağlı 23 numaralı bir iğne kullanılarak organoid crypts bölün. Aspire crypts ayırmak için 10-15 kez çıkartmak ve. hava kabarcığı oluşumunu aşırı pipetleme küçült.
6. Protein matrisinin 500 ul organoids yeniden süspanse edin ve yeni önceden ısıtılmış 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 50 ul ekle. R spondin1 + 50 ul önceden hazırlanmış organoid büyüme ortamı 450 ul ekleoyuk başına koşullu ortamında kültürlenmiştir. gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

5. Kaplama Organoids Gen İfadesi Analizi PAMPS ve Listeria monocytogenes ile Örüntü Tanıma Reseptör Stimulation Gün 14

1. L. üzerinden, çizgi meydan iki gün önce Bir BHI agar plaka üzerinde monocytogenes.
2. Ertesi gün, bir L. almak koloni monocytogenes ve 200 rpm'de çalkalanarak bir gece boyunca 37 ° C 'de BHI et suyu 10 ml büyür.
3. 4 ° C organoid meydan gün önce buz gecede protein matrisi çözülme. En az 30 dakika boyunca 37 ° C sıcak bir steril 24 oyuklu plaka. aşama 2.2 'de tarif edilen organoid büyüme ortamının hazırlanması ve kullanıma kadar 37 ° C'de tutun.
4. inkübatör organoid kültürü çıkarın ve organoids pasajı başlar.
5. Bu protein matrisi damla çıkarmak için kullanılacaktır olarak 3-4 kuyudan aspire medya ve 10 ml pipete içinde aspire medya tutun. yukarı pipet veplaka protein matrisi damla çıkarmak için aşağı. 10 ml'lik bir pipet ucu ile hafifçe kazınarak Protein matriks damla yerinden çıkarılmasına yardımcı olur. 15 ml konik tüp içeriği aktarın.
6. 10 dakika boyunca 15 ml buz üzerinde konik tüpler inkübe edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 125 x g'de santrifüjleyin. Konik borunun altta beyaz topak dikkate alınmalıdır. Yavaşça arkasında kalan süpernatant yaklaşık 100 ul bırakarak süpernatant aspire.
7. PBS 1X buzla soğutulmuş 5 ml organoid pelletini ve sayım için 10 ul numuneyi çıkarın. cam kapak kayma olmadan bir hemasitometre ortasına 10 ul tablet ekleyin. Yavaşça damla üstüne cam lamel bindirme.
   NOT: cam slayt ilk kaldırılır değilse hemositometre organoids ile yapışmasına neden olacaktır.
8. / Her ızgara bir ışık mikroskobu aracılığıyla hemasitometre tüm odasını organoids toplam sayısını ve organoid konsantrasyonunu belirlemek: numtoplam organoids ber 10 ul başına sayılır.
9. organoids yeterli sayıda deney ve santrifüj 10 dakika boyunca 125 x g'de Bu süspansiyon için ekilmiş olmasını sağlayacaktır 15 ml konik tüp, bir uygun hacimde çıkarın.
   NOT: 24 plaka oyuk başına 40-100 organoids arasındaki aralık RNA analizi için yeterlidir. Tipik organoid boyutu çapı 300 um ila 1000 um arasında olabilir.
10. Süpernatant aspire ve hava kabarcıkları oluşturmadan protein matrisinden 500 ml pelet. 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına organoid / protein matrisi süspansiyon 50 ml ekleyin.
    Not: tedavi koşulları ve teknik kopya sayısı için değişir organoids tekrar süspansiyon için kullanılan protein matrisinden miktarı.
11. Her bir oyuğa (N-asetil-sistein) olmadan organoid büyüme ortamı 500 ul ilave edin ve 1 saat boyunca 37 ° C ila +% 5 _CO2 inkübe edilir.
12. Yani Flagellin (PAMPS 2x konsantrasyonlarını hazırlayın,lipopolisakkarid) ve L. canlı monocytogenes. Canlı L. OD ölçün sayım için bir BHI plakası üzerinde monocytogenes ve biftek. 1 x 10 ⁶ koloni oluşturan birim (CFU) / ml olarak organoids davranın.
    NOT: Bakteriler yazıp stimülasyon organoid önce değerlendirilmesi gerektiğini CFU belirlenmesi OD değişecektir. L. 0.6 ≈ 1 x 10 ⁹ CFU / ml, örneğin, bir OD monocytogenes, aynı zamanda deney bağımsız olarak önceden değerlendirilmelidir.
13. L. tedavisi stoğundan seri seyreltme Şerit monocytogenes doğru tedavi CFU / ml belirlemek için. Yazarlar, bir Büchi agar plakası üzerinde 100 ul, 1 x 10 ⁸ seyreltme doğru CFU / mL değerini hesaplamak için koloniler sayısı için yeterli bulmak.
14. L. ısı öldürülmüş çözeltisi hazırlayın canlı L. 1 ml'lik bir şişe alarak monocytogenes 10 dakika boyunca 5.000 xg'de çözüm ve santrifüj monocytogenes. Süpernatantı ve yıkama aspire1x PBS 1 ml bakteriyel pelet.
    1. L. santrifüj 10 dakika boyunca 5000 x g'de monocytogenes ve 1 x PBS'de 1 ml pelletini. L. öldürmek Isı 1 saat boyunca 80-90 ° C'de ısıtılarak 1.7 mi polipropilen tüp içinde monocytogenes. Kültür ısı 100 ul alikosu L. öldüren Bir BHI agar plaka üzerinde monocytogenes hiçbir canlı bakteri kalır onaylayın.
    2. kullanıcı tarafından belirlenir belirlenen kuyularda 500 ul ikamet medyaya uygun 2x pamp ve / veya mikrop tedavisi 500 ul ekleyin. 24 saat boyunca 37 ° C'de 5% _CO2 inkübe edin.
       Not: yerleşik ortam 500 ul 2x PAMP / mikrop tedavi 500 ul alikosu eklenerek 1 ml'lik toplam hacim içinde 1 x tedavi konsantrasyonu getirecektir.
15. Ertesi gün, el L. saymak Tedavi CFU / ml'lik bir doğru bir şekilde belirlenmesi için koloniler monocytogenes. tedavi organoids plaka aspire medya ve kuyu t yıkayın1X PBS ile HREE defa.
16. Fenol / kloroform ¹¹ veya imalatçının talimatlarına uygun olarak, bir RNA özütleme kiti ile RNA ekstraksiyonu geçin. Standart QRT-PCR ¹² kullanılarak gen ifadesini değerlendirin.

6. Kaplama Organoids Üst fazdaki protein Analiz pamp ve L. monocytogenes Challenge Gün 14

1. Meydan önce iki gün, Caco-2 hücreleri, bir hücre kültürü, 1x DMEM +% 20 FBS ile T-75 balonuna ≈1 x 10 ⁶ hücre tohum yoğunluğu başlar ve 37 ° C ile + 5 de Caco-2 hücreleri, inkübe % CO _2. L. bakteriyel kültürü başlatmak BHI plakası üzerine monocytogenes ve 37 ° C 'de bakteriyel bir kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin.
2. Ertesi gün, bir L. almak koloni monocytogenes ve gece boyunca 37 ° C 'de BHI et suyu 10 ml büyür. 4 ° C organoid meydan gün önce buz gecede protein matrisi çözülme.
3. Sıcak Ertesi gün bir steril 96 kuyu siyah duvarlıEn az 30 dakika süreyle 37 ° C plaka. N-asetil-sistein aşama 2.2'de tanımlanan ve kullanıma kadar 37 ° C'de devam etmeden organoid büyüme ortamının hazırlanması. inkübatör organoid kültürü çıkarın ve organoids pasajı başlar.
   Not: Tipik organoid boyutu çapı 300 um ila 1,000 arasında olabilir.
4. Bu protein matrisi damla çıkarmak için kullanılacaktır olarak 3-4 kuyudan aspire medya ve 10 ml pipete içinde aspire medya tutun. plaka protein matrisi damla çıkarmak için bir pipet ile yeniden süspanse edin. 10 ml'lik pipet ile nazik kazıma protein matriks damla yerinden çıkarılmasına yardımcı olur. 15 ml konik tüp içeriği aktarın.
5. 10 dakika boyunca 15 ml buz üzerinde konik tüpler inkübe edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 125 x g'de santrifüjleyin. Konik borunun altta beyaz topak dikkate alınmalıdır. Yavaşça arkasında kalan süpernatant 100 ul bırakarak süpernatant aspire.
6. buz soğukluğunda 5ml organoid pelletini1X PBS sayım için 10 ul bir kısım kaldırıp. Bir hemasitometre ortasına 10 ul tablet ekleyin ve hafifçe cam lamel kaplaması.
   NOT: cam slayt ilk kaldırılır değilse hemositometre organoids ile yapışmasına neden olacaktır.
7. hemositometre / tüm odasının her ızgarada ışık mikroskobu aracılığıyla organoids toplam sayısını ve organoid konsantrasyonunu belirlemek: 10 ml başına sayılan toplam organoids sayısı.
8. organoids yeterli sayıda deney ve santrifüj 10 dakika boyunca 125 x g'de Bu süspansiyon için ekilmiş olmasını sağlayacaktır 15 ml konik tüp, bir uygun hacimde çıkarın.
   Not: tedavi koşulları ve teknik çoğaltır miktarı değişir organoids tekrar süspansiyon için kullanılan protein matrisinden miktarı. Yazarlar 40-100 organoids salgılanan protein analizi için yeterli olduğunu bulmak.
9. Süpernatant aspire ve oluşturmadan protein matrisinden 500 ul pelet / oyuk tekrar süspansiyon haline getirinhava balonları.
   Not: tedavi koşulları ve teknik çoğaltır miktarı değişir organoids tekrar süspansiyon için kullanılan protein matrisinden miktarı.
10. Wells, standart eğrinin oluşturulması için Caco-2 hücreleri ile tohumlanmış olarak, bu hizmet edecek şekilde 96 gözlü siyah duvarlı doku kültürü plakası boş en az iki sütun bırakın. çukur başına önceden ısıtılmış 96 oyuklu siyah duvarlı bir doku kültürü plakasına protein matrisi + organoid süspansiyon 50 ul ekle. 10 dakika Protein matriks katılaşmaya izin vermesi için 37 ° C 'de plaka saklayın.
11. Her bir oyuğa (N-asetil-sistein) olmadan organoid büyüme ortamı 100 ul ilave edin ve 1 saat boyunca 37 ° C ila +% 5 _CO2 inkübe edilir.
12. PAMPS 2x konsantrasyonlarını hazırlayın ve L. canlı monocytogenes. kuyu başına verilen her bir tedavi durumun 100 ml ekleyin ve 24 saat süreyle inkübe.
13. Standart eğri kuyularda ertesi gün plaka Caco-2 hücreleri. Steril 1x PBS,% 0.25 tripsin ve 1x DMEM +% 20 FBS t ısıtarak başlayınO, 37 ° C.
14. Caco-2 hücreleri ihtiva eden T-75 balon çıkarın ve hücre kültür ortamı aspire. PBS 1X 10 ml hücreleri yıkayın. Aspire 1X PBS, 15 dakika için 37 ° C kuluçka makinesi içinde 2 mL% 0.25 tripsin ve yeri, T-75 balon ekleyin.
15. Hücreler daha sonra ayrılmış, Caco-2 hücreleri 1x DMEM +% 20 FBS 8 ml ilave edilir ve 15 ml konik bir tüp içine aktarmak müstakil sağlamak için ışık mikroskobu altında balon görselleştirme. 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak ışık mikroskobu ile hücreleri saymak.
    Not: 60,000 / oyuk iyi çalışır hücre ve dilüsyonları Üst hücre sayısı / çukur 2500 hücre aşağı standart eğrinin oluşturulması için yapılabilir.
16. protein matriksi içinde Caco-2 hücreleri yeniden süspanse edin ve uygun oyuklara oyuk başına 50 ul ekle. Protein matriks Caco-2 hücreleri, 37 ° C'de katılaşmaya izin verin.
    Not: Caco-2 hücreleri için büyüme ortamı, sonradan protein matrisi katılaşması, aşağıdaki ilave edilmesi gerekli değildir.
17. aşağıdakiorganoid tahlil, aspirat için 24 saat işlem süresi ve organoid hücresel süpernatant medyayı kaydetmek ve buz üzerinde tutmak. 1x PBS ile üç kez yıkayın. her bir Caco-2 standart eğri kuyular da dahil olmak üzere% 100 metanol, 100 ul ilave edin ve organoids düzeltmek için 20-30 dakika süreyle 4 ° C'de ya da buz üzerinde inkübe edin.
    NOT: metanol doğrudan eklemiş gibi bu, Caco-2 standart eğri kuyuları 1x PBS ile yıkanmış olması gerekli değildir.
18. metanol inkübasyonu takiben, PBS 1x buz ile wells üç kez yıkayın. 1-2 haftalık, 4 ° C 'de plaka saklayın.
19. 1 ug bir konsantrasyonda çekirdek boyama boyasının ekleme / ml 'de, alüminyum folyo ile plaka kapağı ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
20. Nükleer boyama boyasının uyarım / emisyon (350Nm / 461nm, sırasıyla) ölçmek için, bir 96 yuvalı plaka okuyucusu kullanarak ve normalize her organoid de Caco-2 hücreleri, standart eğrisine.
21. ELISA gibi aşağı deneyleri, geçin

Representative Results

bağırsak organoids yetiştirmek için bu protokolü izlerken, karakteristik küre şeklinde organoids hasattan sonra mevcut olacaktır. R-spondin1 koşullu ortamın eklenmesi günlük organoids büyüme ve tomurcuklanmayı başlatacaktır. Organoids büyümesi Şekil 1A gösterilmiştir - F, ve 1, 2, 4, 5, 6 ve günde bağırsak organoids temsili 14. Şekil 1F 14. günde organoids homojen olmayan bir büyüme özelliklerini temsil eder.

organoids yeterli sayıda kadar büyütülür sonra, yeniden ekildi ve çeşitli PAMPS ve / veya mikroplar ile itiraz edilebilir. İfade analizi, standart teknikler ile gerçekleştirilebilir. Bu, aşağıdaki analiz edilmiştir enflamatuar sitokinlerin IL-18, IL-6 ve TNFa mRNA ekspresyonunu gösteren Şekil 2A-C'de gösterilen birIsı ile organoids 24 saat meydan L. öldürdü monocytogenes ve PAMP flagellin. mRNA ekspresyonunu değerlendirmek için gerekçesi, IL-18 sitokin IL-6 ve TNFa, bu patojen mücadeleye cevap olarak epitel hücreleri ile modüle olduğu için iyi bir aday olduğu, ve bu enflamatuvar sitokinlerin modülasyonunun tekniğin etkinliğini gösterecektir.

Şekil 3A - C ikamet protein matrisi içinde enkaz minimal arka plan boyama ile tespitin aşağıdaki nükleer boyanma boya ile bağırsak organoids göreceli nükleer boyanma gösterir. Sabitleme ve boyama yöntemi her bir hücre, farklı sayıda hesap verecek deneyleri, normalize etmek için uygulanabilir. Protein matrisi kaplanmıştır Caco-2 hücreleri seri dilüsyonları bir standart eğri oluşturmak, bu, daha sonra sabit ve çekirdek ile boyanmış Şekil 4'te görüldüğüboyama boyasının. 0.89 ^R2 değeri, hücre sayısı arasında doğrusal bir ilişki olduğunu gösterir ve ortalama florasan yoğunluğu ve lineer denklem hücre sayısı organoids normalize etmek için kullanılabilir. Şekil 4'te gösterilen standart eğri oyuk başına 30,000 hücre dışına doyma ulaşmak başlar. Oyuk başına 30,000 hücre olarak hücre titrasyon nükleer boyama boyasının doyma aralığı içerir, Şekil 4'te gösterilmiştir. normalleşme Artan doğruluk doyma sınırına ulaşıldığında önce nükleer boyanma boya doğrusal dizi yansıtan bir hücre sayısı ile elde edilecektir.

Şekil 1:. Izolasyon aşağıdaki fare ince bağırsak kaynaklı organoids için büyüme Küçük Bağırsak organoid Büyüme Zaman kursu. (A) Gün 1. (B) 2. Gün (C) 4. Gün (D) Gün 5. (E) Gün 14. Görüntüler verilen her bir gün için organoid büyüme temsilcisi olan 6. (F) Günü. Ölçek çubukları 1,000 mikron ve 200 mikron eşit, B, C, D ve E Ölçeği bar, A, B, C, D, ve E Ölçeği barlar için doğru görüntüde 100 mikron eşit A sol görüntüde 200 mikron eşit F sağ ve sol görüntüler için, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: 24 saat PAMP Mücadelesi ardından İnflamatuar Sitokinler mRNA İfade PAMPS ve ısı öldürülmüş Listeria monocytogenes ile 24 saat boyunca meydan yabani tip bağırsak organoids göreceli mRNA ifadesi (A - C) i temsil kat değişim.. sırasıyla nflammatory sitokinler, IL-18, IL-6 ve TNFa. Hata çubukları Standart Sapma (SD) temsil eden bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Normalleştirme Organoids Göreli Floresan boyama fiksasyon aşağıdaki organoids Nükleer boyama.. (A) organoids Aydınlık alan. (B) bir nükleer boyama bir boya ile organoids florasanla lekelenmesi. (C), parlak alan ve floresan boyama Birleştirilmiş görüntü. Ölçek barlar görüntüleri 400 mikron eşit. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

">
Şekil 4: Caco-2 hücreleri, elde edilen standart bir eğri üç kopya halindeki gözlerin oluşturulan standart eğrisi.. Hücre tohumlama kuyu başına 2,500 hücre aşağı dilüsyonları ile göz başına 60,000 hücre başlayan bir dizi vardı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5:. Protokol Diagram Genel Bakış Şekil 1-Üst Panel R-spondin1 klimalı ortam hasat göstermektedir. Şekil 2-Orta Panel hasat protokol ve kültür fare ince bağırsak organoids yönlerini göstermektedir. Şekil 3-Alt Panel göstermektedir: (A) 14 günlük kültür organoids bir kaplama. PAMPS / L ile (B) Mücadelesimonocytogenes ve ayrılan boş oyuklar standart bir eğri oluşturmak için. (C) PAMP saldırısını takiben, daha önce boş Wells Caco-2 hücrelerinin kaplama standart bir eğri oluşturmak için. Fiksasyon ve nükleer boyanma boya ilavesinden sonra (D), bir standart eğri karşı kuyu ve normalize uyarma / emisyon ölçüm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bağırsak organoids kültürü ve bakım yeterli doku kültürü tekniği ile herhangi bir birey tarafından hakim olabilir bir işlemdir. Orada bir daha geleneksel tek tabaka hücreleri büyüyen karşılaştırıldığında Pasajlanması içinde inceliklerini, ancak bu inceliklerini üstesinden gelmek için zor değildir. Bu yöntemin kritik adımlar optimum tohumlama için yeterince yüksek bir yoğunluğa organoids büyümek için güçlü olmak içerir. genel olarak hücre hatları ile elde edilebilir, büyük ekme yoğunluğunun pratik değildir gibi deneyler organoids ile küçültülmüş olması gerekir. birden fazla tedavi grubu olduğunda, bu özellikle belirgin hale gelir.

Bu protokol, farklı bakteri çeşitli bağırsak epiteli konukçu-patojen etkileşimlerine çalışma için bir adım adım bir yöntem sağlamak amaçlanmıştır normale göre, bu sistem kullanılarak, viral ve mantar patojenler, aynı zamanda adresi zorluklar. Raporlar o describ mevcutture bakteriyel patojen Salmonella ile bağırsak organoids etkileşimleri, henüz salgılanan sitokinler ¹³ ölçerken normalizasyon yöntemlerini adresi yok.

Farklı yöntemlerle organoid kültürleri normalleştirilmesi karşılaşılan birkaç zorluklar vardır. bisinkoninik asit yöntemi yoluyla salgılanan protein normalleştirme (BCA) bir seçenektir; Ancak, büyüme bileşenleri organoid kültür ekmek için gerekli (N2 ve / veya vitamin B27) BCA deneyi müdahale (veriler gösterilmemiştir) normalleştirme hücre canlılığı ile, bu tür modifiye edilmiş MTT deneyi ¹⁴ tanımlandığı gibi., Ancak, MTT olarak bu tekniği ile normalleşmesi için bir yanlış bir yöntem tanıtacak organoids mitokondrial metabolik aktivitesini değiştirecek bir tedavi mitokondriyal dehidrogenazlar ¹⁵ eylem tarafından azaltılması dayanmaktadır. Olmasın, ortam, N-asetil-sistein (NAC) kaldırmak için gereklidirMTT tekniği ile normalleşme isteniyorsa ly, ancak NAC gibi bakteriyel patojen ile tedavi bakteri büyümesini inhibe ¹⁶ eğer.

Bu tekniğin avantajları organoids salgılanan sitokinler ve protein ürünleri artık Caco-2 hücreleri, standart bir eğriye karşı normalize olabilir vardır. Bu tekniğin kısıtlamaları dönüştürülmemiş birincil epitel organoids nükleer boyama, bir kolon kanseri hücre çizgisinin nükleer boyama karşısında normalize olduğu için normalizasyon bağıntılı olmasıdır. Yazarlar, nükleer ile metanol ve boyama çekirdekleri ile sabitleme bulmak boyaya Caco-2 hücreleri, standart bir eğriye karşı etkili bir normalizasyon tekniktir. Bu kolon kanseri hücre kuşağının büyümesinin özellikleri tam olarak bir nükleer boya kullanılarak ve ortalama florasan yoğunluğu bağırsak organoids büyüme özelliklerini taklit rağmen toplam hücre sayısı karşısında normalize etmek için iyi bir stratejidir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11050	(Section 1,3,6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge	Thermo		(Section 1,3)
DMEM	GE Healthcare	Sh30243.01	(Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line			(Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia.
50 ml conical tube	Falcon	352070	(Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask	Corning	431079	(Section 1) Or equivalent brand
Protein Matrix	Corning	356231	(Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced
HyClone Dulbecco's (DPBS)	GE Healthcare	SH30264.01	(Section 2,3)
DMEM/F12	Life Technologies	12634-010	(Section 2,3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates	Corning	3524	(Section 2)
N2 Supplement 100x	Life Technologies	17502-048	(Section 2)
B27 without vitamin A 50x	Life Technologies	12587-010	(Section 2)
Trizol	Life Technologies	15596-026	(Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax)	Life Technologies	35050-061	(Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M)	Life Technologies	15630-080	(Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
10ml Serological Pipet	Falcon	357551	(Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin	Peprotech	250-38	(Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	(Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF	Biolegend	585608	(Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable	Bioexpres		(Section 3)
dissecting scissors			(Section 3)
forceps			(Section 3)
glass slides			(Section 3)
dissecting tweezers			(Section 3)
25 ml Serological Pipet	Falcon		(Section 3)
EDTA	Sigma-Aldrich	SLBB9821	(Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100mm x 15mm	Fisher	FB0875712	(Section 3) Or equal sized TC dish
1ml Syringe	Becton Dickinson	309659	(Section 4)
Precision Glide Needle	Becton Dickinson	305120	(Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm)
Flagellin from Bacillus subtilis	Invivogen	tlrl-bsfla	(Section 5,6)
Listeria monocytogenes	ATCC	19115	(Section 5,6) (Murray et al.)
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA	(Section 5,6)Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar	Becton Dickinson	211065	(Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion	Becton Dickinson	237500	(Section 5)
Caco-2	ATCC	HTB-37	(Section 6)
Trypsin	gibco	25200056	(section 6)
Methanol	Fisher	A412-4	(Section 6)
SpectraMax M5	Molecuar Devices		(Section 6)
96 Well Assay Plate	Corning	3603	(Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye	Life Technologies	H1399	(section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask	Corning	430641	(Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube	Falcon	352096	(Section1,3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube	Bioexpress	C-3262-1	Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep	Zymo Research	R1054	Or equivalent brand
TNF-alpha	Applied Biosystems	Mm 00443260_g1	Taqman gene expression assay kit
IL-6	Applied Biosystems	(Mm 00446190_m1	Taqman gene expression assay kit
IL-1beta	Applied Biosystems	Mm 00434228_m1	Taqman gene expression assay kit
IL-18	Applied Biosystems	Mm 00434225_m1	Taqman gene expression assay kit
18s	Applied Biosystems	Hs 99999901_s1	Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System	Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler	Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix	Life Technologies	4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies/Applied Biosystems	4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Life Technologies/Applied Biosystems	4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein	R&D Systems	3474-RS-050	500 ng/ml
chloroform	Sigma-Aldrich	C7559