Abstract
Exosome forskning i de sidste tre år har i høj grad udvidet mod identifikation og karakterisering af biomarkører og deres terapeutiske anvendelser.
Exosomer er for nylig blevet vist at indeholde microRNA (Mirs). Mirs selv er opstået som værdifulde biomarkører for diagnostiske formål. Som prøvetagning i klinikker og hospitaler er ganske variabel, miRNA isolation fra hele galde varierer betydeligt. For at opnå solide, præcise og reproducerbare miRNA profiler fra indsamlede galde prøver på en enkel måde skal der udvikles en høj kvalitet protokol at isolere og karakterisere exosomer fra galden. Fremgangsmåden kræver flere centrifugeringer og et filtreringstrin med en endelig ultracentrifugeringstrin at pelletere de isolerede exosomer. Elektronmikroskopi, Western blots, flowcytometri og multi-parameter nanopartikler optisk analyse, hvor det er muligt, er afgørende karakterisering skridt til at validere kvaliteten af exosomes. Til isoleringen af miRNA fra disse exosomer, spiking lysatet med en ikke-specifik, syntetisk miRNA fra en art som Caenorhabditis elegans, dvs., Cel-MIR-39, er vigtig for normalisering af RNA ekstraktion. Isoleringen af exosom fra galde væske følger denne fremgangsmåde tillader vellykket miRNA profilering fra galde prøver opbevaret i flere år ved -80 ° C.
Introduction
Ligesom andre biologiske væsker, dvs modermælk, plasma eller urin, galde indeholder exosomer, lipid rige vesikler 1-4. Exosomer kan fremkalde eller ændre biologiske funktioner i modtagerlandene celler 5, 6, en form for celle-celle kommunikation, som kan være en del af deres normale funktion 4, 7-9. Exosomer kan indeholde miRNA arter, som kan give en værdifuld kilde til biomarkører til diagnosticering 10. miRNA profiler har fået betydelig opmærksomhed i de senere år som diagnostiske og prognostiske markører for en række sygdomme 11-14.
miRNA selv findes i biologiske væsker, eventuelt frigives af døde celler og mængden af stald celler kan blive kraftigt påvirket af en underliggende sygdom. Den miRNA profil exosomer ikke nødvendigvis afspejler miRNA profilen af cellen oprindelse 6, 10, 15-17, men exosomer kan bære miRNA signaturer, der kan være karakteristisk for forældrenes cell gerne en tumor celle. Tumorafledte exosomer er blevet identificeret i plasmaet fra patienter med lunge-adenocarcinom, prostata- og andre tumorer 8, 16, 18.
Målet med denne metode er pålidelig og robust isolering af exosomer fra humane galde prøver, stort set uafhængig af deres procedurer forudgående håndtering. Det blev udviklet til at udnytte galde som en pålidelig kilde til miRNA for den potentielle diagnosticering af sygdomme i galdegangen såsom cholangiocarcinom 19. Det består af flere trin i centrifugering med stigende hastigheder for at isolere exosomer og kan være gældende for andre biologiske væsker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Indhentning galde fra patienter med endoskopisk retrograd cholangiopancreatography (ERCP) skal godkendes af en menneskelig fag undersøgelse protokol af Institutional Review Board. Alt arbejde præsenteres her blev godkendt af Johns Hopkins University Board Institutional Review.
1. exosome Isolering fra Bile
- Udfør endoskopisk retrograd cholangiopancreatography (ERCP). Placer patienten i liggende stilling og intubere.
- Pass en duodenoscope gennem patientens mund og indsætte det i den anden del af duodenum og identificere de store papilla.
- Selektivt kanyle den fælles galdegang ved at indsætte en tredobbelt lumen sphincterotom præinstalleret med en 0,035 tommer (0,9 mm) hydrofile ledetråd.
- Advance ledetråden under fluoroskopisk vejledning til venstre hepatiske gang siden lejlighedsvis det kan være svært at skelne galdeblæregangen fra højre hepatiske gang, derefter fremføresphincterotom 5 cm ind i galdegang at erhverve en stabil position.
- Fjern guidewiren, vedhæfte en 10 ml sprøjte til ledetrådsport gennem Luer lock opsuges galden under anvendelse af 10 ml undertryk.
- Fjern sprøjten med galden at gå videre med ERCP ved genindsættelse ledetråden og injektion kontrastmiddel gennem injektionsporten at opacify galdetræet.
- Overfør det opsamlede galde ind i en 15 ml rør på is og holde på is, indtil klar til at fortsætte med centrifugering trin.
Forsigtig: Bær handsker for at beskytte dig selv og prøverne! Behandl galden som en potentiel kilde til infektion, da det kan indeholde Hepatitis A viruspartikler! - Hold prøve (r) på is. Enten fortsætte med trin 1.2 eller centrifuger ved 500 xg ved 4 ° C i 10 minutter og derefter fryse ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
Bemærk: Prøver opbevaret på denne måde i flere år har rutinemæssigt været anvendt med gode resultater 19. - Transfer 400 pi galde til et mikrocentrifugerør og indsamle celler og cellerester ved centrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten ved pipettering, overføres til et frisk mikrocentrifugerør og centrifugeres prøven (er) ved 16.500 x g i yderligere 20 minutter ved 4 ° C for at fjerne supernatanten af yderligere snavs. Kassér rørene i biologisk farligt affald. Alternativt, spinde prøverne i en ultracentrifuge i stedet.
- Opsaml supernatanten og filtrere det i et bio kabinet med en sprøjte gennem en 0,2 um polyethersulfon (PES) membranfilter, som har gode strømningshastigheder og lav proteinbinding at fjerne alle partikler større end 200 nm starter.
- Pipetter den filtrerede supernatant til ultracentrifugerør og tilføje PBS, således at rørene er mere end 2/3 fuld. Hvis rørene indeholder mindre væske end det, vil rørene kollapse under centrifugering! Rør kan vaskes, autoklaveres og genbruges flere gange.
- Pellet exosomerne gennem ultracentrifugering ved 120.000 xg i 70 min ved 4 ° C. Efter centrifugeringen se på bunden af ultracentrifugerør til tider se små gule pellets; disse er de exosomer.
- Supernatanten fjernes ved forsigtigt dekantering det og desinficere affaldet ved tilsætning blegemiddel til en slutkoncentration på 10% v / v, og lad det stå i 20 minutter.
- For downstream eksperimenter, bearbejde enten pelleten (r) i et lille volumen af den passende opløsning (dvs. radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer for protein isolation, RNA lyseringsbuffer til miR isolation) eller resuspendere den i 50-150 pi phosphatpufret saltvand (PBS), som kan enten opbevaret ved -80 ° C til fremtidig brug (kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR) eller protein ekstraktion etc.) eller anvendes til karakterisering af exosomet fremstilling ved TEM eller nanopartikel optisk analyse .
2. exosome Identifikation afTransmission Electron Microscopy (TEM) eller CryoEM
- Resuspender ekstracellulære vesikler i 100 pi PBS ved pipettering. Ideelt bruge exosomer der ikke er blevet lagret ved -20 ° C eller -80 ° C, især når der foretages en isolation for første gang.
- Adsorbere en 20 pi alikvot (ca. 2 ug) til 400 mesh carbon-coatet Parlodion kobbergitre i 2 min og lad dem tørre ved stuetemperatur.
- Fastgør exosomet i 1% (v / v) glutaraldehyd (EM kvalitet) i 5 minutter ved stuetemperatur ved at anbringe dråber forsigtigt på det tørrede præparat.
- Vask ristene to gange med vand i 5 minutter og derefter kontrast plet elbiler med 1% phosphorwolframsyre (PTA) i 30 sek.
- Anskaf billeder med et elektronmikroskop med en acceleration spænding på 80 kilovolt starter ved forstørrelser af 20.000 x og stigende til 100,000X ved udmåling af partiklerne.
Bemærk: Andre preps som lagdeling på Formvar kulstof-belagt 200 mesh kobber eller nikkel net og kontrast farvning like 1% eller 2% uranylacetat i 10-15 min er også mulige. - For CryoEM, blande en 20 pi alikvot (ca. 2 ug) med 60 pi protein G guld 10 nm (1: 3-forhold). Dette vil bidrage til at bestemme exosomet diameter.
- Overfør prøverne på glow-afladet C-flat Holey kulstof gitre og fjerne overskydende væske ved at duppe. Frys ristene ved at dyppe dem straks i flydende ethan.
- Monter gitre i en cryoholder i flydende nitrogen.
- Anskaf billederne ved 200 kV med forstørrelser af 20.000 x og 100,000X.
3. exosomet Identifikation af Multi-parameter Nanopartikel Optisk Analyse
- Resuspender de isolerede exosomer i 100 pi PBS ved pipettering.
- Fortynd exosomer i 600 pi PBS på flere forskellige forhold (som 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 og 1: 1.200).
- Visualisere exosomer ved laserlysspredning med et egnet instrument og software i realtid ifølge produrer protokol 20.
- Øge niveauet af kameraet i optagefunktion, indtil partikler bliver synlige, og derefter justere fokus til at gøre partiklerne se glat.
- Mens i standard mode, mindske kameraet til det laveste niveau, at partiklerne stadig kan ses, om nødvendigt justere kameraets lukker og gevinst at opnå dette.
- Visuel kontrol for at sikre 20-100 partikler er synlige på skærmen, hvis ikke skylle enheden og juster fortynding i PBS.
- Juster derefter fange varighed til mellem 30-60 sek. Efter videoen er optaget, justere procesparametre, indtil alle partikler er identificeret på skærmen, og behandle videofilen.
4. exosomet Karakterisering af Western Blot
- Lyserer exosom piller fra 2-5 ml galde i 100 pi iskold radioimmunfældningsassays assay (RIPA) buffer med en protease-inhibitor ved pipettering op og ned grundigt og blandes lysater kraftigt i 30 sekpå en vortex for at solubilisere proteinerne effektivt.
- Mens det meste af tiden ikke nødvendigt, brug puls-ultralydsbehandling af prøverne på is med 2 impulser i 10 sek hver for at sikre fuld lysis.
- Pelletere uopløselige materiale ved centrifugering ved 15.000 x g ved 4 ° C i 5 min og overføre supernatanten til et rent rør.
- Bestem proteinkoncentration med en fremgangsmåde til valg (dvs. bicinchoninsyre (BCA), Coomassie, modificeret Lowry, 660 nm Protein Assay osv) ifølge producentens protokol. Metoden er ikke så vigtigt, så længe der anvendes den samme metode konsekvent at opnå resultater, der kan sammenlignes på tværs af eksperimenter.
- Belastning 50 ug protein per prøve i Laemmli-puffer, efter opvarmning af prøven ved 95 ° C i 5 minutter i en brønd på en polyacrylamidgel til elektroforese (PAGE).
- Elektroforese prøverne på siden gelerne i 1,5 timer og overføre de separerede proteiner på en nylonmembran.
- Blåse membranen (r) med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand med 0,1% Tween 20 (TBS-T) i 1 time, derefter inkuberes med exosom-specifikke antistoffer som anti-CD63 og anti-TSG-101 ved en fortynding på 1: 500 fortrinsvis O / N ved 4 ° C.
- Vask membranerne med TBS-T 3 x 10 min, derefter inkuberes med et passende, matching HRP-konjugeret sekundært antistof i 5% fedtfri mælk i TBS-T i 1-2 timer ved stuetemperatur.
- Vask membranen (er) 3 x 5 min med TBS-T og påvise de specifikke proteiner med kemiluminescens reagenser ifølge producentens protokol.
- Billede membranerne med film eller et digitalt billeddannelsessystem ifølge producentens protokol.
5. MicroRNA Isolation fra Isolerede Exosomer
Bemærk: Isolering af miRNA fra galde exosomer udføres under anvendelse af en modificeret miRNA isolation baseret på et kommercielt tilgængeligt kit, men enhver anden RNA-isolering fremgangsmåde kan anvendes eller tilpasses.
- Tilsæt 300 &# 181; l lysis / bygning buffer til exosomet pellet (isoleret fra 400 pi galde), vortex, pipette eller passere gennem en nål / sprøjte til fuldstændigt at lysere exosomer at opnå en homogen lysat.
- Tilføj 1/10 (30 pi) volumen af miRNA Homogenisat Additive, og bland godt ved vortex eller vende røret flere gang.
- Inkuber blandingen i 10 minutter på is.
- Tilføj et rumfang syre-phenol: chloroform lig med det oprindelige homogenat (300 pi).
- Tilsæt 5 pi af 5 fmol / ul cel-miR 39 og vortex i 30-60 sek.
- Centrifugeres i 5 minutter ved 10.000 x g ved stuetemperatur for at separere den vandige (øvre) og organiske (nedre) fase.
- aspireres forsigtigt den øverste fase ved pipettering og overførsel til et nyt rør, mens bemærke volumen overføres. Kassér den organiske fase i den passende organisk affaldsbeholder.
- At berige for små RNA'er tilføje 1/3 volumen af 100% ethanol til den udvundne vandige fase og blandes ved grundigt omhvirvling eller invertere tuvære flere gange.
- Pipette lysat / ethanol-blandingen på filterpatronen, op til 700 pi af gangen.
- Centrifuger patroner til 15 sek ved maksimalt 10.000 xg eller anvende vakuum til at passere blandingen gennem filteret.
- Saml filtratet og hvis lysat / ethanol-blanding den overstiger 700 pi, overføre gennemstrømning til et frisk rør og gentag proceduren for at indsamle alle filtraterne. Disse filter indeholder RNA fraktioner blottet for små RNA og kan bruges til at gendanne disse større RNA.
- Tilføj 2/3 volumen af RT 100% ethanol til det samlede filtrat og bland grundigt ved hvirvelblanding.
- Pipette filtrat / ethanol-blandingen på en anden filterpatron. Ligesom før den maksimale lydstyrke, der kan anvendes på en gang er 700 pi.
- Centrifuger i 15 sek ved 10.000 xg eller anvende vakuum som beskrevet i trin 5.10.
- Kassér gennemløbet, og gentag indtil alle filtrat / ethanol-blanding er blevet filtreret.
- Påfør 70081; l miRNA Wash Solution 1 til filterpatronen, centrifugeres i 5-10 sek eller anvende vakuum og kassér gennemstrømning.
- Filteret vaskes med 500 pi vaskeopløsning 2/3 som udført i trin 5.16.
- Gentag vask en gang med 500 pi vaskeopløsning 2/3 som i trin 5.16, kasseres gennemstrømning og placer filteret tilbage i samlingen rør.
- Spin filterpatronen i 1 min ved 10.000 xg for at fjerne enhver resterende væske fra filtret.
- Overfør filterpatronen i et frisk opsamlingsrør og anvende 100 pi varm (95 ° C) nuklease frit vand til midten af filteret.
- Spin forsamlinger for 20-30 sek ved maksimal hastighed for at inddrive RNA.
- Eluatet opsamles og anvendes straks eller opbevares ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Da exosomer er for små til at blive detekteret ved regelmæssig mikroskopi eller flowcytometri, elektronmikroskopi eller nanopartikel optisk analyse skal udføres. Nanopartikel optisk analyse har den fordel i forhold elektronmikroskopi, at det også kvantitativt og giver størrelsesfordeling og koncentration. Instrumentet indfører et fint fokuseret laserstråle gennem et glas prisme i prøven. Den Brownske bevægelse af de isolerede vesikler indfanges via en EMCCD høj følsomhed kamera og spores på en ramme-for-ramme basis. Nanopartikel sporing analyse (NTA) softwareforanstaltninger denne Brownske bevægelse ramme til ramme til at beregne størrelsen, formen og fordelingen af galde exosom præparater. Figur 1 viser resultatet af en typisk NTA-analyse af exosom isoleret fra et humant galdeprøve.
Alternativt kan elektronmikroskopi udnyttesat bekræfte størrelsen af de isolerede partikler, dog uden kvantificering. Figur 2A viser den typiske resultat af transmissionselektronmikroskopi for exosom isoleret fra humant galde.
For yderligere kontrol af exosomal karakter af de isolerede partikler, Western blots sondering for tilstedeværelsen af proteiner som Tsg101 eller tetraspanin CD63, der er vist i figur 2B, skal anvendes. Exosom-specifikke proteiner ikke eksisterer i sig selv, men exosomer er beriget med tetraspanins, især CD9, CD63, CD81 og CD82 med CD63 og CD81 benævnes klassiske exosom markører, og proteiner, der er involveret i exosom-dannelse som TSG101 og Alix 21. Andre proteiner som varmechokprotein beslægtede 70 (Hsc70) og 73 (Hsc73) samt større histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse II-molekyler kan også findes beriget i exosomer med nogle ligesom Hsc73 og den perifere membranassocierede protei mælk fedtkugler - epidermal vækstfaktor-faktor 8 (Mfge8) er helt specifik for exosomer udskilles fra dendritiske celler 21.
Figur 3 viser de typiske realtidsamplifikation plots af forskellige miRNA arter ekstraheret fra exosomer af human galde. Siden exosomer modsætning celler, mangler pålidelige standarder som 18S eller 28S rRNA eller husholdning gener som GAPDH eller β-actin til normalisering, at spiking med en syntetisk miRNA er vigtig. De syntetiske miRNA bør være afledt fra en anden art som cel-miR 39 fra Caenorhabditis elegans at gøre det muligt at normalisere ekspressionsniveauerne effektivt.
For reproducerbarhed er det afgørende, at galden behandles så hurtigt som muligt og ikke frosne inden forarbejdning, da disse forhold kan føre til nedbrydning af miRNA til stede i galde. På den anden side, når isoleret, exoso mes er meget stabile og ganske modstandsdygtige som opbevaring ved stuetemperatur i 48 timer eller op til tre fryse-tø cykler forårsage ubetydelige virkninger på niveauerne af mindst to arter af miRNA, selv om stabilitet for miRNA af interesse skal bestemmes empirisk.
Figur 1. (Nanopartikel) NTA analyse for at karakterisere humane biliære exosomer Bile exosomer blev fortyndet i PBS i forholdet 1:. 600. (A) størrelsesfordeling og koncentration af elbiler isoleret fra human galde. Den gennemsnitlige størrelse blev bestemt til at være ca. 97 nm for denne prøve (x-akse: exosomer størrelse, y-akse: exosomer koncentration for hver størrelse). (B) Prøve snap shot af den samme prøve analyseret i A. størrelsesorden viser vesikler spænder fra 30 til 110 nm.= "_ Blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kontrol af exosomal karakter af præparatet ved Transmission elektronmikroskopi og Western blot. (A) Transmission (TEM) af sfæriske strukturer er til stede i human galde 70-110 nm i størrelse. Scale bar er 100 nm. (B) Western blot analyse af galde exosomer viser tilstedeværelse af de typiske exosome markørproteiner TSG101 og CD63. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Real-time PCR af miRNA arter isoleret fra galde exosomer. Rigtig-tid PCR af en miR vifte viser forstærkningen af flere MIR arter udvundet fra humane galde exosomer (x-aksen, PCR cyklus nummer, y-akse, relativ intensitet). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til pålideligt udnytte exosomer isoleret fra galde, er det vigtigt at anvende en ensartet høj kvalitet isoleringsmetoder at få prøver af høj kvalitet til gengæld. Den metode, som fastlægges i dette papir er en veletableret måde at isolere exosomer og miRNA fra menneskelig galde. Det fremhæver flere afgørende skridt på karakterisering af isolerede exosomer der som minimum bør omfatte elektronmikroskopi eller nanopartikel optisk analyse og Western blotting.
Det mest afgørende skridt i isoleringen af exosomer, i hvert fald når det kommer til miRNA stabilitet, er at behandle frisk galde snarest muligt. Langvarig opbevaring af hele galde ved stuetemperatur eller endda en enkelt fryse-tø-cyklus kan væsentligt reducere miRNA indhold, mens i modsætning de isolerede exosomer er meget stabile, selv når de opbevares ved stuetemperatur eller undergår flere fryse-tø cykler. Så længe de pågældende prøver er blevet opbevaret ved -80 ° C, vellykket isolering af exosomer og miRNA fra galde kan udføres med stor reproducerbarhed at identificere miRNA signaturer i prøverne. Det anbefales at begynde med at starte med frisk galde til at sikre korrekt miRNA integritet. Dette er en vigtig overvejelse, når de forsøger at opbygge en samling af galde prøver over tid som det ville være tilfældet for patientprøver. Det gør det muligt at behandle prøver, der er blevet indsamlet over måneder eller endog år, der skal behandles og evalueres samtidig.
Dette forøger i høj grad anvendelsen af galde til diagnostiske formål, enten at lede efter miRNA signaturer, der bekræfter tilstedeværelsen af en sygdomstilstand som kræft eller svaret af en sygdom, terapeutiske indgreb. Faktisk har resultater fra kliniske prøver blevet brugt til at etablere miRNA signaturer som biomarkører for cholangiocarcinoma 19.
Det første centrifugeringstrin fjerner intakte celler, der er til stede i galde. I den anden, højere hastighed centrifugering celle debris, er apoptotiske organer og andre større organeller pelleteret. For at sikre, at kun partikler mindre end 200 nm opsamles i ultracentrifugeringstrin, filtreringstrinnet med en lav proteinbinding filter er vigtig. Nogle protokoller udelade dette trin, men vi mener, det er nødvendigt. Efter ultracentrifugering ved 120.000 x g den opnåede pellet indeholder forholdsvis rene exosomer der enten kan forarbejdes straks eller efter resuspension i PBS opbevares ved -80 ° C. En begrænsning ved denne metode er, at den opnåede pellet kun er højt beriget i exosomer men dette gælder for andre berigelse metoder såsom størrelsesudelukkelse og polymere udfældning. Yderligere behandling kan indebære en anden oprensningstrin ved saccharosegradient eller binding til antistof-coatede magnetiske perler. Hvis kilden til exosomer (som for eksempel plasma) indeholder bundfald som følge af koagulation, kan være nødvendigt denne ekstra oprensning som disse partikler ofte kan have størrelsen af exosomer.Især immuno-oprensning fører til en mere exosome markør beriget præparat. Ulempen er, at dette reducerer yderligere mængden af exosomer og / eller miRNA stede, og til de fleste formål, kan ikke begrunde tids- og ressourcekrævende proces. Hvis der imidlertid Western blot-analyse detekterer tilstedeværelsen af mikrosom kontaminering via en endoplasmatisk reticulum protein, såsom calnexin, yderligere oprensning, især immuno-isolation baseret, tilrådes. Det er vores erfaring er dette sjældent tilfældet for galde, hvis man bruger andre kilder til biologiske væsker en immun-baserede rensning skridt ville blive anbefalet.
Anvendelsen af forskellen ultracentrifugering til at isolere og berige exosomer fra galde fluidum er en forholdsvis hurtig og omkostningseffektiv metode. Mens den kræver anvendelse af en ultracentrifuge, fortrinsvis med en gynge spand rotor, disse enheder er almindeligt forekommende i mange institutioner. Yderligere oprensning via densitetscentrifugering er possible med det samme udstyr og rørene er genanvendelige flere gange efter rengøring og sterilisering. Mens polymerbaseret udfældning kræver kun anvendelse af mikrocentrifuger eller standard centrifuger til pelletering præcipitaterne ved hastighed på 10.000 xg eller mindre, det generelt co-isolater ikke-vesikulære kontaminanter herunder lipoproteiner. Mens lipoproteiner ikke er generelt til stede i galde, omkostningerne ved de ofte patenterede polymerer gør isoleringen dyre i sammenligning. Polymererne også undertiden uforenelige med efterfølgende anvendelser såsom massespektrometri, men når nedstrøms analyse er kompatibel med polymeren (RNA eller protein isolation), hvilken fremgangsmåde er let, hurtig og ikke kræver specifikt udstyr.
Gelpermeationskromatografi har ulempen af lange køretider og kravet om særligt udstyr, men tillader den præcise adskillelse af store og små partikler. Immunoaffinitetsoprensning giver den største purity fra exosomal vesikler og endda tillader isolering af specifikke exosomal fraktioner som epitel afledt, men dette sker på bekostning af det samlede udbytte. Desuden er det begrænset til små prøver volumener kræver en første berigelse skridt, hvis et stort volumen skal behandles, og de isolerede exosomer kan miste funktionel aktivitet eller udviser ændret biologisk funktion på grund af de bundne antistoffer.
Det er vigtigt at overveje den nedstrøms ansøgning (er) og tilgængeligheden af specialiserede udstyr, når det kommer til isolering af exosomer. Karakteriseringen af de isolerede / berigede partikler er vigtig uanset den isolation, der anvendes. Ultracentrifugering har hidtil været en "gold standard" bruges af mange laboratorier på grund af sin robuste og hurtigt (og omkostningseffektive, hvis en ultracentrifuge er tilgængelig) berigelse af exosomal partikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
References
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
