Abstract
Exosome onderzoek in de afgelopen drie jaar sterk uitgebreid de omvang in de richting van identificatie en karakterisering van biomarkers en hun therapeutische toepassingen.
Exosomes onlangs aangetoond microRNA (miRs) bevatten. Mirs zich hebben voorgedaan als waardevolle biomarkers voor diagnostische doeleinden. Zoals specimen collectie in klinieken en ziekenhuizen is erg variabel, miRNA isolatie van hele gal varieert aanzienlijk. Robuuste, nauwkeurige en reproduceerbare miRNA profielen van verzamelde monsters gal te bereiken op een eenvoudige wijze vereist de ontwikkeling van een kwalitatief hoogwaardige protocol te isoleren en te karakteriseren exosomes van gal. De werkwijze vereist verscheidene centrifugeren en een filtratiestap met een laatste stap van ultracentrifugatie om de geïsoleerde exosomes pelleteren. Elektronenmicroscopie, Western blots, stroomcytometrie en multiparameter nanodeeltjes optische analyse, indien beschikbaar, zijn cruciaal karakterisering maatregelen om de kwaliteit van de e validerenxosomes. Voor de isolatie van miRNA uit deze exosomes, spiking het lysaat met een aspecifiek synthetische miRNA van een soort zoals Caenorhabditis elegans, dwz Cel-miR-39, is belangrijk voor normalisatie van RNA extractie-efficiëntie. De isolatie van exosome van galvloeistof volgens deze werkwijze kan de succesvolle miRNA profilering van galmonsters bewaard jarenlang bij -80 ° C.
Introduction
Net als andere biologische vloeistoffen, dat wil zeggen, moedermelk, plasma of urine, gal bevat exosomes, lipide rijke blaasjes 1-4. Exosomes kunnen induceren of biologische functies te wijzigen ontvangende cellen 5, 6, een vorm van cel-cel communicatie die hun normale functie 4, 7-9 kan zijn. Exosomes kunnen miRNA soorten die een waardevolle bron van biomarkers voor diagnose 10 bevatten. miRNAs profielen hebben aanzienlijke aandacht gekregen in de afgelopen jaren als diagnostische en prognostische merkers voor verschillende ziekten 11-14.
miRNA zelf vindt in biologische vloeistoffen, eventueel vrijgegeven door dode cellen en de hoeveelheid cellen stal kan sterk worden beïnvloed door een onderliggende ziekte. De miRNA profiel van exosomes niet noodzakelijk overeen met de miRNA profiel van de cel uit 6, 10, 15-17, maar exosomes kan miRNA handtekeningen die karakteristiek zijn voor de ouderlijke ce zou kunnen dragenll graag een tumorcel. Tumor afgeleide exosomes geïdentificeerd in het plasma van patiënten met longadenocarcinoom, prostaatkanker en andere tumoren 8, 16, 18.
Het doel van deze methode is de betrouwbare en robuuste isolatie van exosomes uit humane gal specimens, grotendeels onafhankelijk van hun procedures voorafgaande behandeling. Het werd ontwikkeld om gal gebruiken als een betrouwbare bron van miRNA voor mogelijke diagnose van ziekten van de galwegen zoals cholangiocarcinoma 19. Het bestaat uit verschillende stappen van centrifugatie bij toenemende snelheden exosomes isoleren en voor andere biologische vloeistoffen kunnen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het verkrijgen van de gal van patiënten met endoscopische retrograde cholangiopancreaticografie (ERCP) behoeft de goedkeuring van een menselijke proefpersonen onderzoeksprotocol door de Institutional Review Board. Al het werk hier wordt gepresenteerd werd goedgekeurd door de Johns Hopkins University Institutional Review Board.
1. exosome Isolatie van Bile
- Voer endoscopische retrograde cholangiopancreaticografie (ERCP). Plaats de patiënt in rugligging en intuberen.
- Laat een duodenoscoop door de mond van de patiënt en plaats deze in het tweede deel van de twaalfvingerige darm en identificeren van de belangrijkste papilla.
- Selectief canule de galbuis door het invoegen van een triple lumen sphincterotome voorgeladen met een 0,035 inch (0,9 mm) hydrofiele geleidingsdraad.
- Advance de geleidedraad onder fluoroscopische begeleiding van de lever kanaal links omdat soms moeilijk kan zijn om de cystic kanaal van rechts lever kanaal te differentiëren, dan vooraf desphincterotome 5 cm in de galwegen stevigheid verkrijgen.
- Verwijder de voerdraad, sluit een 10 ml spuit om de geleidedraad doorgang door de luer lock en zuig de gal via 10 ml onderdruk.
- Verwijder de spuit met de gal te gaan met de ERCP door opnieuw inbrengen van de geleidingsdraad en het injecteren van contrastmiddel via de injectiepoort de galboom ondoorzichtig.
- Breng de verzamelde gal in een 15 ml buis op ijs en houden op ijs tot zover om de centrifugatiestap.
Let op: Draag handschoenen om jezelf en de monsters te beschermen! Behandel de gal als een mogelijke bron van infectie zoals hepatitis A virus deeltjes kan bevatten! - Houd het monster (s) op ijs. Ofwel doorgaan met stap 1,2 en centrifugeer bij 500 xg bij 4 ° C gedurende 10 min en vervolgens bevriezen bij -80 ° C tot verder gebruik.
Opmerking: De monsters opgeslagen zo al jarenlang routinematig gebruikt met goede resultaten 19. - Overdracht 400 ul van gal in een microcentrifugebuis en laat cellen en celresten door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant door pipetteren, overbrengen naar een nieuwe microcentrifugebuis en centrifugeer de monster (s) bij 16.500 xg gedurende 20 min bij een 4 ° C aan het supernatant verdere puin. Gooi de buizen in de biologisch gevaarlijk afval. Als alternatief, draaien de monsters in een ultracentrifuge plaats.
- Verzamel de supernatant en filteren in een bioveiligheid kast met een spuit door een 0,2 micrometer polyethersulfon (PES) membraan filter die een goede debieten en lage eiwit binding aan alle deeltjes die groter zijn dan 200 nm links te verwijderen is.
- Pipet de gefiltreerde supernatant ultracentrifuge buizen en voeg PBS zodat de buizen meer dan 2/3 vol. Als de buizen bevatten minder liquide dan zal de buizen instorten tijdens centrifugeren! Buizen kunnen gewassen geautoclaveerd en meerdere keren hergebruikt.
- Pellet de exosomes met ultracentrifugatie bij 120.000 xg gedurende 70 min bij 4 ° C. Na het centrifugeren blik op de bodem van de ultracentrifuge buis te zien soms kleine gele pellets; Dit zijn de exosomes.
- Verwijder het supernatant door het zorgvuldig decanteren het en desinfecteren het afval door het toevoegen van bleekmiddel tot een uiteindelijke concentratie van 10% v / v en laat het staan voor 20 min.
- Voor downstream experimenten, ofwel verwerken de pellet (s) in een klein volume van de geschikte oplossing (bijvoorbeeld, radio-immunoprecipitatie assay (RIPA) buffer voor isolatie van eiwitten, RNA lysisbuffer voor miR isolatie) of resuspenderen in 50-150 pl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die hetzij bij -80 ° C voor toekomstig gebruik (kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) of eiwitextractie etc.) worden opgeslagen of karakterisering van de exosome voorbereiding door TEM of nanodeeltjes optische analyse .
2. exosome Identificatie doorTransmissie Elektronen Microscopie (TEM) of CryoEM
- Resuspendeer extracellulaire blaasjes in 100 pl PBS door pipetteren. Gebruik bij voorkeur exosomes die niet bij -20 ° C opgeslagen of -80 ° C, in het bijzonder bij het uitvoeren van de isolatie voor het eerst.
- Adsorberen een 20 ui monster (ongeveer 2 ug) tot 400 mesh met koolstof beklede Parlodion koper roosters gedurende 2 minuten en laten drogen bij kamertemperatuur.
- Bevestig de exosoom in 1% (v / v) glutaaraldehyde (EM-kwaliteit) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur door het plaatsen van druppels voorzichtig op het gedroogde preparaat.
- Was de roosters tweemaal met water gedurende 5 minuten en daarna contrast vlek EV met 1% fosfowolfraamzuur (PTA) gedurende 30 sec.
- Verwerven beelden met een elektronenmicroscoop bij een versnellingsspanning van 80 kilovolt beginnend bij vergrotingen van 20.000 x en oplopend tot 100,000X bij het bepalen van de grootte van de deeltjes.
Opmerking: andere bereidingen zoals gelaagdheid op Formvar koolstof beklede 200 mesh koper of nikkel roosters en contrast vlekken like 1% of 2% uranylacetaat gedurende 10-15 min zijn mogelijk. - Voor CryoEM, meng 20 pl monster (ongeveer 2 ug) met 60 ul Proteïne G goud 10 nm (1: 3 verhouding). Dit zal helpen om de exosome diameter bepalen.
- Breng de monsters op-glow afgevoerd C-flat essen carbon roosters en verwijder overtollige vloeistof door te deppen. Freeze de roosters door ze onmiddellijk dompelen in vloeibare ethaan.
- Monteer de roosters in een cryoholder in vloeibare stikstof.
- Het verwerven van de beelden op 200 kV met vergrotingen van 20.000 x en 100,000X.
3. exosome Identificatie van Multi-parameter nanodeeltjes Optical Analyse
- Resuspendeer de geïsoleerde exosomes in 100 pl PBS door pipetteren.
- Verdun exosomes in 600 gl PBS bij verschillende verhoudingen (zoals 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 en 1: 1200).
- Visualiseer de exosomes door laserlicht verstrooiing met de juiste instrumenten en software in real-time op basis van manufacturer's protocol 20.
- Verhoging van het niveau van de camera in de opnamestand tot deeltjes zichtbaar worden, pas dan de focus om de deeltjes kijken glad.
- Terwijl in de standaardmodus, verminderen de camera tot het laagste niveau dat de deeltjes nog te zien, indien nodig aan te passen sluiter van de camera en krijgen om dit te bereiken.
- Visueel te controleren om ervoor te zorgen 20-100 deeltjes zichtbaar zijn op het scherm, als het apparaat niet te spoelen en pas de verdunning in PBS.
- Stel vervolgens de vangst duur tussen 30-60 sec. Nadat de beelden worden vastgelegd, stel procesparameters totdat alle deeltjes worden geïdentificeerd op het scherm en het video opnemen.
4. exosome karakterisering door Western Blot
- Lyse exosoom pellets 2-5 ml van gal in 100 pl ijskoude assay radio-immunoprecipitatie (RIPA) buffer met een proteaseremmer op en neer te pipetteren en grondig mengen lysaten krachtig gedurende 30 secop een vortex om de eiwitten effectief oplosbaar.
- Hoewel meestal niet nodig, puls-sonicatie van de monsters op ijs met 2 pulsen van 10 seconden per volledige lysis te verzekeren.
- Pellet onoplosbare materiaal door centrifugeren bij 15.000 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten en overbrengen supernatant naar een schone buis.
- Bepaal de eiwitconcentratie met een gekozen werkwijze (bijv bicinchoninezuur (BCA), Coomassie, gemodificeerde Lowry, 660 nm Protein Assay, enz.) Volgens het protocol van de fabrikant. De werkwijze is niet zo belangrijk zolang dezelfde methode consistent gebruikt wordt om die te vergelijken over experimenten bereiken.
- Belasting 50 ug eiwit per monster in Laemmli buffer na verwarmen van het monster bij 95 ° C gedurende 5 min in een putje van een polyacrylamidegel voor elektroforese (PAGE).
- Electrophorese de monsters op de PAGE gels 1,5 uur en breng de gescheiden eiwitten op een nylonmembraan.
- Block het membraan (en) met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBS-T) gedurende 1 uur, daarna geïncubeerd met exosome-specifieke antilichamen zoals anti-CD63 en anti-TSG-101 bij een verdunning van 1: 500 bij voorkeur O / N bij 4 ° C.
- Was de membranen met TBS-T 3 x 10 min, vervolgens geïncubeerd met een geschikte, bijpassende HRP-geconjugeerd secundair antilichaam in 5% magere melk in TBS-T gedurende 1-2 uur bij KT.
- Was het membraan (s) 3 x 5 min met TBS-T en detecteren van specifieke eiwitten met chemoluminescentie reagens volgens het protocol van de fabrikant.
- Beeld de membranen met film of een digitaal beeldvormingssysteem volgens het protocol van de fabrikant.
5. MicroRNA isolatie van de geïsoleerde exosomes
Noot: Isolatie van miRNA van gal exosomes wordt uitgevoerd met een gemodificeerde miRNA isolatie op basis van een commercieel verkrijgbare kit, maar elk ander RNA isolatiewerkwijze kunnen worden gebruikt of aangepast.
- Voeg 300 &# 181; l lysis / gebouw buffer om de exosome pellet (geïsoleerd uit 400 ul gal), vortex, pipet of passeren van een naald / spuit om de exosomes volledig te lyseren om een homogene lysaat te verkrijgen.
- Voeg 1/10 (30 pi) volume van miRNA Homogenaat Additive, en meng goed door vortexen of het buisje diverse tijd.
- Incubeer het mengsel gedurende 10 min op ijs.
- Voeg een hoeveelheid zuur fenol: chloroform gelijk aan de initiële homogenaat (300 ui).
- Voeg 5 ul van 5 fmol / pl CEL-miR 39 en vortex gedurende 30-60 sec.
- Centrifugeer 5 min bij 10.000 xg bij kamertemperatuur scheiden de waterige (bovenste) en organische (onderste) fase.
- Zorgvuldig aspireren de bovenste fase door pipetteren en overdracht naar een nieuwe buis maar tekent daarbij het volume overgedragen. Gooi de organische fase in de daarvoor bestemde container organisch afval.
- Te verrijken voor kleine RNA voeg 1/3 volume 100% ethanol aan de waterige fase teruggewonnen en meng goed door vortexen of omkeren van de tuverscheidene keren.
- Pipet het lysaat / ethanol mengsel op de filterpatroon tot 700 gl per keer.
- Centrifugeer de patronen voor 15 sec bij maximaal 10.000 xg of toepassen vacuum om het mengsel pass filter.
- Vang filtraat en indien het lysaat / ethanol mengsel dan 700 pl, dragen het doorstroomkanaal een nieuwe buis en herhaal de procedure om alle filtraten verzamelen. Deze filter bevat RNA fracties zonder kleine RNA's en kunnen worden gebruikt om deze grotere RNAs herstellen.
- Voeg 2/3 volume van RT 100% ethanol aan de totale filtraat en meng goed door vortexen.
- Pipet het filtraat / ethanol mengsel op een tweede filter cartridge. Zoals voor het maximumvolume dat tegelijk kan worden toegepast, is 700 pi.
- Centrifugeer gedurende 15 sec bij 10.000 xg of vacuum toe te passen zoals beschreven in stap 5.10.
- Gooi de doorstroom en herhalen totdat alle filtraat / ethanol mengsel werd gefiltreerd.
- Solliciteer 70081; l miRNA Wash Solution 1 tot en met de filterpatroon, centrifuge voor 5-10 sec of toe te passen vacuüm en gooi de doorstroming.
- Was het filter met 500 pi wasoplossing 2/3 zoals gedaan in stap 5.16.
- Herhaal het wassen een tweede keer met 500 pl wasoplossing 2/3 als in stap 5,16, gooi het doorstroomkanaal en plaats het filter terug in de verzamelbuis.
- Draai de filter cartridge 1 min bij 10.000 xg alle overblijvende vloeistof uit het filter te verwijderen.
- Breng de filterpatroon in een frisse verzamelbuis en 100 pl warm (95 ° C) nuclease vrij water op het midden van het filter.
- Spin de assemblages voor 20-30 sec op maximale snelheid aan het RNA te herstellen.
- Verzamel het eluaat en onmiddellijk te gebruiken of op te slaan bij -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aangezien exosomes zijn te klein om gedetecteerd door regelmatige microscopie of flowcytometrie, elektronenmicroscopie of nanodeeltje optische analyse worden uitgevoerd. Het nanodeeltje optische analyse heeft het voordeel boven elektronenmicroscopie dat het ook kwantitatief en geeft grootteverdeling en concentratie. Het instrument voert een fijn gefocusseerde laserbundel door een glazen prisma in het monster. De Brownse beweging van de geïsoleerde blaasjes wordt opgevangen via een EMCCD hoge gevoeligheid camera en bijgehouden op een frame per frame basis. Het nanodeeltje tracking-analyse (NTA) software maatregelen deze Brownse beweging in het beeld om de grootte, de wijze en de verdeling van de gal exosome preparaten berekenen. Figuur 1 toont het resultaat van een typische NTA analyse van exosome geïsoleerd uit een menselijke gal monster.
Alternatief kan elektronenmicroscopie worden gebruiktde grootte van de geïsoleerde deeltjes, zij het zonder kwantificering. Figuur 2A toont de typische resultaat van transmissie elektronenmicroscopie voor exosome geïsoleerd uit humane gal bevestigen.
Voor verder onderzoek van de exosomaal aard van de geïsoleerde deeltjes, Western blots sonderen op de aanwezigheid van eiwitten zoals Tsg101 of tetraspanine CD63, getoond in figuur 2B, gebruikt te worden. Exosoom-specifieke eiwitten bestaan niet per se, maar exosomes zijn verrijkt in tetraspanins, vooral CD9, CD63, CD81 en CD82 met CD63 en CD81 genoemd klassieke exosome markers en eiwitten betrokken bij exosome vorming zoals Tsg101 en Alix 21. Andere eiwitten zoals heat shock eiwit verwante 70 (hsc70) en 73 (Hsc73), alsmede major histocompatibility complex (MHC) klasse II moleculen kunnen ook gevonden worden verrijkt in exosomes met andere, zoals Hsc73 en perifere membraangeassocieerde protein melkvet bolletje - epidermale groeifactor-factor 8 (Mfge8) wordt heel specifiek is voor exosomes afgescheiden van dendritische cellen 21.
Figuur 3 toont de typische real time amplificatie percelen van verschillende soorten miRNA onttrokken exosomes menselijke gal. Sinds exosomes, in tegenstelling tot de cellen, geen betrouwbare standaarden zoals 18S of 28S rRNA of het huishouden genen zoals GAPDH of β-actine voor normalisatie, de stekelige met een synthetische miRNA is belangrijk. De synthetische miRNA moet worden afgeleid van een andere soort zoals cel-miR 39 van Caenorhabditis elegans één staat te stellen de effectieve expressieniveaus normaliseren.
Voor reproduceerbaarheid is het essentieel dat de gal zo spoedig mogelijk en niet wordt verwerkt bevroren voorafgaand aan de verwerking van deze voorwaarden leiden tot afbraak van miRNAs die aanwezig zijn in de gal. Anderzijds, eenmaal geïsoleerd, exoso mes zijn zeer stabiel en goed bestand als opslag bij kamertemperatuur 48 uur of maximaal drie vries-ontdooi cycli veroorzaken verwaarloosbare effecten op het niveau van ten minste twee soorten miRNA, hoewel de stabiliteit van de miRNA plaats moet empirisch worden bepaald.
Figuur 1. (nanodeeltjes) NTA-analyse van menselijke biliaire exosomes karakteriseren Bile exosomes werden in PBS verdund in een verhouding van 1:. 600. (A) de distributie Grootte en concentratie van EV's geïsoleerd uit menselijke gal. De gemiddelde grootte werd bepaald als ongeveer 97 nm voor de steekproef (x-as: exosomes size, y-as: concentratie exosomes voor elke maat). (B) Voorbeeld momentopname van hetzelfde monster in A. De omvang bereik geanalyseerd toont blaasjes variërend 30-110 nm.= "_ Blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Verificatie van de exosomaal aard van het preparaat door transmissie elektronenmicroscopie en Western blot. (A) Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) van bolvormige structuren in menselijk gal 70-110 nm in grootte. Schaal bar is 100 nm. (B) Western blot analyse van de galwegen exosomes toont aanwezigheid van de typische exosome marker eiwitten Tsg101 en CD63. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Real-time PCR van miRNA soorten geïsoleerd uit gal exosomes. Real-tijd PCR van een miR-array demonstreert de versterking van meerdere miR soorten onttrokken aan menselijk gal exosomes (x-as, PCR-cyclus nummer, y-as, relatieve intensiteit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om op betrouwbare wijze te benutten exosomes geïsoleerd uit gal, is het belangrijk om een constante hoge kwaliteit isolatie methoden gebruiken om de kwaliteit van de monsters een hoog rendement te verkrijgen. De methodologie die in dit document is een gevestigde manier om exosomes en miRNA te isoleren uit humane gal. Het wijst op de volgende essentiële stappen ter karakterisering van de geïsoleerde exosomes dat ten minste elektronenmicroscopie of nanodeeltjes optische analyse en Western blots moeten omvatten.
De meest cruciale stap in het isoleren van exosomes, tenminste wat betreft miRNA stabiliteit is verse gal zo snel mogelijk te verwerken. Langdurige opslag van de gal bij kamertemperatuur of zelfs een enkele vries- ontdooicyclus kan aanzienlijke vermindering van de miRNA inhoud terwijl daarentegen de geïsoleerde exosomes zijn zeer stabiel, zelfs bij opslag bij kamertemperatuur of ondergaan verscheidene vries-dooicycli. Zolang de monsters in kwestie bij -80 ° C, succesvolle isolatie van exosomen en miR opgeslagenNA van gal kan worden uitgevoerd met grote reproduceerbaarheid miRNA signaturen te identificeren in de monsters. Het verdient aanbeveling om in eerste instantie beginnen met verse gal miRNA goede integriteit. Dit is een belangrijke overweging bij een poging het opbouwen van een verzameling van galmonsters tijd zoals het geval patiënt monsters. Het maakt het mogelijk om monsters die zijn verzameld gedurende maanden of zelfs jaren worden verwerkt en geëvalueerd tegelijkertijd verwerken.
Dit vergroot het gebruik van gal voor diagnostische doeleinden, ofwel te zoeken miRNA signaturen dat de aanwezigheid van een ziekte zoals kanker of de respons van een ziekte therapeutische interventies te bevestigen. In feite waren de resultaten uit klinische monsters gebruikt om miRNA juistheid handtekening als biomarkers voor cholangiocarcinoma 19.
De eerste centrifugefase verwijdert intacte cellen die in gal. In de tweede, hogere snelheid centrifugeren cel debris, apoptotische lichamen en andere grotere organellen worden gepelleteerd. Zodat alleen deeltjes kleiner dan 200 nm worden verzameld in de ultracentrifugatie stap de filtratietrap met een lage eiwitbinding filter is belangrijk. Sommige protocollen deze stap overslaan, maar we denken dat het nodig is. Na ultracentrifugatie bij 120.000 xg de verkregen pellet bevat redelijk zuiver exosomes die onmiddellijk of na resuspensie kunnen worden verwerkt in PBS bewaard bij -80 ° C. Een beperking van deze methode is dat de verkregen pellet wordt alleen hoog verrijkt in exosomes maar dit geldt voor andere verrijking werkwijzen zoals grootte-uitsluiting en polymère neerslag. Verdere verwerking kan een zuiveringsstap door sucrosegradiënt of door binding met antilichaam gecoate magnetische korrels meebrengen. Als de bron van de exosomes (zoals bijvoorbeeld plasma) bevat precipiteert als gevolg van stolling, kan dit extra zuivering noodzakelijk zijn, aangezien deze deeltjes vaak de grootte van exosomes.Met name de immuno-zuivering leidt tot een exosome marker verrijkt preparaat. Het nadeel is dat de hoeveelheid exosomes en / of miRNA onderhavige verder vermindert, en voor de meeste doeleinden niet de tijd en middelen in beslag rechtvaardigen. Indien echter, Western blot analyse de aanwezigheid van microsoom verontreiniging door een endoplasmatisch reticulum eiwit zoals calnexine, verdere zuivering, in het bijzonder immuno-isolatie gebaseerde detecteert, wordt geadviseerd. In onze ervaring is dit zelden het geval voor gal, als men gebruik maakt van andere bronnen van biologische vloeistoffen een immuun gebaseerde zuiveringsstap worden aanbevolen.
Het gebruik van differentiële ultracentrifugatie te isoleren en verrijken exosomes van gal vloeistof een relatief snelle en kosteneffectieve methode. Hoewel het gebruik van een ultracentrifuge vereist, bij voorkeur met een swing bucket rotor, deze inrichtingen worden aangetroffen in veel instellingen. Verdere zuivering via centrifugatie dichtheid zijn mogele met dezelfde uitrusting en de buizen verschillende keren hergebruiken na reiniging en sterilisatie. Terwijl polymeren gebaseerde precipitatie vereist alleen het gebruik van standaard microcentrifuges of centrifuges om de precipitaten pellet bij snelheid van 10.000 xg of minder, in het algemeen co-isolaten niet-vesiculair verontreinigingen waaronder lipoproteïnen. Hoewel lipoproteïnen niet algemeen aanwezig in de gal, de kosten van de vaak merkgebonden en gepatenteerd polymeren maken de isolatie duur in vergelijking. Ook zijn de polymeren soms onverenigbaar met verdere toepassingen zoals massaspectrometrie, maar als downstream analyse verenigbaar met het polymeer (RNA of eiwit isolatie), de methode is eenvoudig, snel en vereist geen speciale apparatuur.
Gelpermeatiechromatografie heeft het nadeel van lange looptijden en de eis van speciale apparatuur, maar kan de precieze scheiding van grote en kleine deeltjes. Immunoaffiniteitszuivering levert de hoogste purity van exosomaal blaasjes en zelfs maakt de isolatie van specifieke exosomaal fracties zoals epitheliale afgeleid, maar dat gaat ten koste van het totale rendement. Bovendien beperkt tot kleine monsters volumes die een eerste verrijkingsstap als een groot volume moet worden verwerkt en de geïsoleerde exosomes kan functionele activiteit verliest of vertonen veranderde biologische functie door de gebonden antilichamen.
Het is belangrijk om de downstream applicatie (s) en de beschikbaarheid van gespecialiseerde apparatuur overwegen wanneer het gaat om de isolatie van exosomes. De karakterisering van de geïsoleerde / verrijkte deeltjes belangrijk ongeacht de isolatiewerkwijze gebruikt. Ultracentrifugatie tot nu toe een "gouden standaard" gebruikt door veel laboratoria als gevolg van de robuuste en snelle (en kosten-effectief als een ultracentrifuge beschikbaar) verrijking van exosomaal deeltjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
References
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
