Summary
原位乳腺癌原发肿瘤模型和手术切除原发肿瘤，延长生命鼠标产生自发转移的描述。肿瘤的生长和发展进行监测和通过萤光素酶荧光成像定量。
Abstract
转移是乳腺癌患者的死亡的首要原因。该机制癌细胞转移，包括乳腺癌转移底层，在很大程度上是未知的，是在癌症研究的焦点。各种乳腺癌自发转移小鼠模型已经建立。在这里，我们报告的简化程序，建立原位移植乳腺癌原发灶和由此产生的自发转移，模仿人类乳腺癌转移。用生物发光活肿瘤成像相结合，该小鼠模型允许肿瘤生长和进展动力学进行监测和定量。在这种模式下，4T1-吕克乳腺癌细胞的低剂量（1×10 4个细胞），使用结核菌素注射器注入BALB / c小鼠乳腺脂肪垫。小鼠用萤光素注射，并在使用生物发光成像系统的不同时间点成像。当原发肿瘤生长的大小限制为在IACUC批准的协议（APPRoximately 30天），将小鼠在2％异氟烷和氧气的流量恒定麻醉。肿瘤区域用70％乙醇灭菌。肿瘤周围的小鼠皮肤切除以暴露其用一对无菌剪刀除去肿瘤。原发肿瘤的切除延伸的4T-1荷瘤小鼠的存活一个月。小鼠然后重复成像的转移性肿瘤扩散到远处器官。治疗剂可施用在这一点上，以抑制肿瘤的转移。这种模式是在主站点和进展动力学远处器官量化乳腺癌细胞的生长简单而敏感，因此是研究乳腺癌的生长和恶化，并在体内测试抗转移治疗和免疫治疗剂的优秀典范。
Introduction
根据美国癌症协会，乳腺癌是女性癌症在美国是最常见的诊断形式。在最近开发的靶向疗法组合早期检测已经显著减少乳腺癌的死亡率在过去二十年。然而，乳腺癌仍然是妇女在美国1癌症相关死亡的第二大原因。大多数乳腺癌患者的死亡是由于肿瘤细胞转移。不幸的是，大多数的乳腺癌是浸润性和经常转移至淋巴结，并随后到远处器官，包括骨，肺，肝和脑。1,2-目前转移性乳腺癌没有有效的治疗方法。因此，化疗和免疫治疗剂的发展来抑制转移性乳腺癌具有十分重要的意义。
各种乳腺癌自发转移小鼠模型bEEN开发研究乳腺肿瘤细胞进展和转移，也可以用作模型治疗剂的发展的分子机制。1,3-5然而，大多数这些小鼠模型是遗传肿瘤模型，虽然优良模型机械研究，不适合用于测试治疗剂，因为转移需要几个月在这些遗传模型来开发，因此需要的抗癌剂的昂贵长期施用。在活体小鼠6,7-监测肿瘤进展也是技术上具有挑战性。相反，移植乳腺癌转移模型具有短期肿瘤进展和在活体小鼠的肿瘤进展的容易跟踪的优点。在4T1原位乳腺癌自发转移的小鼠模型是这样的移植肿瘤模型8在这个模型中，乳腺肿瘤细胞移植到乳房脂肪垫建立原发性肿瘤结节。原发性肿瘤然后可在人类乳腺癌患者进行手术切除。 4T1肿瘤细胞是高度侵入性的。8,9，3,10几乎所有携带肿瘤的小鼠发展转移在30天后肿瘤移植到乳房脂肪垫后。然而，4T1肿瘤的原发部位长出积极与肿瘤大小往往超出了允许的大多数动物协议的限制。在这个阶段中，转移往往是微转移。因此，重要的是去除原发肿瘤，以允许用于测试治疗剂转移的进展。这里，我们报告建立原发性肿瘤移植，手术切除原发肿瘤和4T1肿瘤的生长和发展在体内的生物发光基于成像的量化的一个简单且敏感的程序。
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Protocol
所有的程序遵循摄政佐治亚大学动物使用及护理委员会指导原则和批准协议。
1.原位乳腺癌肿瘤的建立
- 实验前一天，培养约2×10 6个 4T1-吕克肿瘤细胞在10厘米的培养皿在10ml RPMI培养基中含有10％FBS。孵育在CO 2培养箱中的培养皿，在37℃和5％的CO 2。
- 对肿瘤细胞注射当天，从与真空培养皿除去培养基，加入5毫升无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH为7.4至培养皿中，并轻轻摇动培养皿洗培养表面，除去PBS通过真空。
- 加2ml胰蛋白酶-EDTA（0.05％胰蛋白酶和0.53毫摩尔EDTA）的培养皿中，在37℃下孵育其中的CO 2培养箱中约5分钟。检查细胞上倒置显微镜，以确保所有细胞从培养皿底部剥离。</ LI>
- 通过加入8毫升含有血清的培养基，转移细胞到15毫升锥形管中，并离心将细胞以大约450×g离心在RT 3分钟猝灭胰蛋白酶。
- 在10ml PBS中除去由真空和悬浮细胞上清液。离心细胞以大约450×g离心3分钟。通过真空除去上清液，并重新悬浮在10ml PBS中的细胞。
- 移取10微升的细胞悬液到玻璃罩下血球。计数细胞，以确定细胞浓度。悬浮细胞在PBS中以2×10 5个细胞/ ml的HBSS的密度。转移细胞到1.5ml无菌微量离心管中，并保持细胞在冰上直到使用。
- 使用6只雌性BALB / c小鼠 - 8周为肿瘤细胞注射。
- 附近刮胡子使用电子头发剪乳头周围3号的头发。 4T1细胞进入乳腺3脂肪垫的注射重复性产生肺转移。用蘸取70％ethano的棉签清洁剃光面积湖3次 - 颠倒的离心管2悬浮细胞。轻轻吸50微升细胞悬液成半CC 27 G 1/2结核菌素注射器。
- 注入下一个BALB / c小鼠的＃3乳腺肿瘤细胞到乳腺脂肪垫。鼠标放置在干净的笼子里，并返回笼子的动物住房设施。等待大约21 - 30天为肿瘤的发展。肿瘤的生长应该定期按机构的对肿瘤的研究策略进行监测。
2.肿瘤生长的活老鼠生物发光成像
- 图像小鼠后每3天肿瘤注射转移小鼠的摄像设备。注入100μl的荧光素（在PBS中30毫克/毫升）腹腔内（IP）给小鼠成像之前。经过大约10分钟，麻醉小鼠用2％异氟醚/ O 2流量感应室。使用镊子去摸鼠标了腿。触摸无反应证实塔T中的鼠标完全不省人事。
- 放置在连续的2％异氟烷和O 2成像室小鼠以2升/分钟的流速。鼠标放置，使得所感兴趣的区域（ 即 ，初始肿瘤注射的乳腺垫）面向所述成像系统的照相机。确保鼻子和鼠标的嘴的麻醉剂管路内被牢固地设置。动物应每兽药标准在该机构进行麻醉。
- 获得生物发光成像的各个曝光时间的阵列。例如，设置曝光至30日，（FOV）视场为25，物体高度为1.5厘米，并获得具有低功耗的X射线荧光照片图像。设置测量单位为“光辉”。
- 使用自动线性颜色范围内最大约2.4×10 7四射单位。获得初始图像后，调整设置并获得优化的图像（ 图第3和4）。
- 回到老鼠笼子清洁，确保老鼠返回动物住房设施之前重新获得下地活动的意识。
- 用与成像仪器相关的生活成像软件分析数据。使用映像程序，画出感兴趣区域（ROI）的区域周围封闭线。使用图像处理软件，以确定投资回报率的光辉力度。记录每个ROI每只小鼠的相对强度。
注：较高的辐射强度指示发光单元的更高水平，并因此更大的肿瘤生长。 - 目视检查小鼠，每3天的不良影响。
注：老鼠会每周一次进行权衡。 15％体重的重量损失被认为是不利的影响，如在步骤5中小鼠溃烂肿瘤也将安乐死描述的荷瘤小鼠进行安乐死。
3.原发性肿瘤的手术切除
没有TE：蒸压剪刀，镊子和伤口夹和伤口施夹器（ 图1）。
- 在无菌罩下进行手术，以保持无菌状态，以减少感染的风险。手术前一天，剃包围荷瘤小鼠的肿瘤用电动毛发修剪器的区域。
- 约2 - 手术前4小时，进料配制用于小鼠小鼠咀嚼卡布洛芬片剂，剂量为5毫克/公斤体重。
- 把小鼠在含有2％异氟烷在氧气中约30秒的腔室。在整个手术期间使用的麻醉机不断麻醉鼠标。
- 用消毒棉棍兽医软膏适用于鼠标的眼睛，防止干燥时的麻醉下。使用镊子去摸鼠标了腿。触摸没有反应证实了鼠标完全不省人事。
- 消毒肿瘤周围部位的皮肤区域与三个交替抹肥皂擦洗消毒。擦拭用70％的酒精擦拭手术区。
- 用无菌解剖刀（ 图1）切割肿瘤附近的一个小切口。
- 插入一对灭菌剪刀的尖端切口切开皮肤肿瘤周围以暴露肿瘤结节（ 图2A）。持用无菌镊子肿瘤并使用剪刀的肿瘤从皮肤（ 图2B）中分离出来。通过在-80℃冷冻器冷冻或通过在供将来使用10％福尔马林溶液固定保存肿瘤样品。
- 关闭手术部位与使用自动施夹器（ 图1）9毫米卷绕夹子。返回鼠标到一个干净的笼子蒸压床上用品。动物应该每个机构准则进行监控。
注：鼠标通常收复足够的意识，并开始在笼子里大约10移动 - 30分钟后手术。 - 辖卡布洛芬到手术后的小鼠再次24小时。卡洛芬是手术后镇痛和手术后镇痛处方应该由该机构的兽医人员直接协商进行验证。 （ - 手术后7天通常在5）在伤口愈合后伤口取出夹子。除去使用自动剪辑去除缠绕剪辑。
4.肿瘤转移的活老鼠生物发光成像
- 每隔3天手术后图像小鼠如步骤2所述。
5.肺转移瘤验证的使用荷瘤肺的墨汁通货膨胀
注：要验证荧光素酶活肿瘤成像效果，执行荷瘤小鼠肺的墨汁通胀量化肿瘤结节。 4T1细胞也转移到其他器官和组织（ 图5），因此，如果需要的话，应执行这些器官以验证肿瘤转移的组织学检查。该协议使用LUN摹转移作为一个例子。
- 养老鼠在自己现有的家庭笼安乐死。当安置与其他动物，搬迁不被安乐死到不同的笼子里那些老鼠。
- 移除笼滤波器顶部并与CO 2的过滤器顶部替换。打开被连接到CO 2滤波器顶部的压缩的 CO 2气体筒（100％）。定在2升/分钟的流速，并保持CO 2的上为至少10分钟。如果将小鼠仍然在10分钟结束时呼吸，离开上的 CO 2，直到至少1分钟的小鼠停止呼吸之后。关闭CO 2的气缸控制和流量计。等待3分钟，取出过滤器顶部。
- 放置牺牲鼠标在其上聚苯板回来。针腿以确保对气管畅通无阻。喷用70％乙醇的小鼠。
- 使用剪刀，沿着鼠标的-腹部中间的中线切穿胸腔和向上朝向SalI位有所不同的腺体。观察气管。使用钳去除周围气管暴露气管组织。
- 螺纹气管下枪头。保持尖端用一只手，轻轻向上和从主体向外移动气管。
- 旋转平台上按住鼠标180°。用一个半的CC 27 G 1/2结核菌素注射器注入印度油墨（10％印度墨水和0.1％氢氧化铵）到经由气管肺。完全用墨膨胀肺部，直到强烈感觉到阻力。
- 用剪刀切开气管。使用镊子按住鼠标并插入肺部下另一套镊子和拉肺叶了鼠标。冲洗在含烧杯水肺部短暂。
- 在化学通风橱，肺部转移到装有3毫升的Fekete的溶液（50％乙醇，6％甲醛，和3％冰醋酸）的玻璃闪烁管中。盖上小瓶，以防止从蒸发溶液。
注意：将组织可以存储在菲克特的溶液无限期。 - 几分钟后，观察肿瘤结节为白点的黑色肺（ 图5）。白色结节肿瘤是历历在目。转移肺部菜在通风橱并计数白点的数目。每一个白点代表一个单独的转移性肿瘤结节。
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Representative Results
原位乳腺癌小鼠模型的建立
4T1是一个积极的乳腺癌细胞系。小至1×10 4个细胞进入乳房脂肪垫的注射可导致建立一个单一的肿瘤结节中注入（ 图2A）的部位。因此，肿瘤模仿人原发性乳房癌。几乎100％的小鼠发展的原位肿瘤。肿瘤大小可以使用数字测径器或通过活肿瘤成像（ 图3）进行定量。肿瘤是使用生物发光成像系统肿瘤注射后可检测的约3天，发光强度随着肿瘤大小的增加（ 图3）。因此，这种模式是用于测试针对乳腺癌的各个阶段的化疗和免疫治疗剂的疗效的理想原位乳腺癌模型。
自发转移
在人乳腺癌的患者中，主肿瘤手术确诊后除去。然而，大量的患者已经具有LN或远处转移的诊断的时间。在此过程中，大部分的小鼠已经经过肿瘤移植后30天开发LN与远处转移。所描述的外科手术过程完全删除原发肿瘤（ 图2B）。手术后30天（ 图2B） -无残留原发性肿瘤在原发肿瘤位点10被检测。手术切除原发肿瘤的延伸的荷瘤小鼠的寿命，但不会阻止肿瘤转移到小鼠的各个部分。这些转移可通过实时成像方法（ 图4）来检测。因此，该模型是一种自发转移乳腺癌模型模仿人类乳腺癌患者。这种模式是有用的：1）研究自发BREAST癌症转移（例如，4T1细胞可以与感兴趣的基因，以测试在乳腺癌自发转移这些基因的功能转染）;和2）的测试中的免疫感受态宿主针对自发性乳腺癌转移的化疗和免疫治疗剂的功效。的位点和程度转移可以通过实时成像（ 图4）被检测，并用第二种方法（ 图5）确认。发光成像可以量化整个肺肿瘤负荷。荷瘤肺墨通货膨胀使每个肺（ 图5）的实际肿瘤结节的准确计数，从而，代表肿瘤转移的免费定量方法。
图1.手术工具。1.Stainless手术刀，镊子2。 3.不锈钢剪刀。 4. Autoc唇伤施夹。 5. Autoclip伤口剪辑卸妆。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 4T1原位肿瘤模型。一个 。4T1肿瘤细胞（1×10 4个细胞在100μl的PBS）细胞注射到乳腺脂肪垫。肿瘤注射后三十天，将小鼠处死并检查肿瘤生长。示出的是与注射（黄色箭头）的部位的单个肿瘤结节。B中的荷瘤小鼠。在A中的肿瘤正如手术切除。显示的是4T1荷瘤小鼠手术切除原发肿瘤后10天。 请点击此处查看大图版本这个数字。
图通过基于荧光素酶的Live肿瘤显像3.活肿瘤显像。4T1肿瘤细胞（1×10 4个细胞在100μl的PBS）细胞注射到乳腺脂肪垫。鼠标在天成像7，第14和28显示的是原发肿瘤的发光强度。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.通过基于荧光素酶的Live肿瘤显像可视肿瘤进展。4T1肿瘤细胞（1×10 4个细胞在100μl的PBS）细胞注射到乳腺脂肪垫。原发肿瘤手术切除为SH自己的在图3中，鼠标，然后17天手术切除原发肿瘤后成像。显示的是转移的形象。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.可视化由墨汁通货膨胀肺部肿瘤结节，肿瘤轴承鼠标肺与印油墨膨胀并固定在菲克特的解决方案。白点是肺转移。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
许多类型的乳腺癌转移的转基因小鼠模型已经被开发。1这些转基因小鼠具有高的肿瘤的发病率范围从60到100％。然而，这些转基因小鼠的转移发生率比肿瘤发病率要低得多（14 - 100％）。肿瘤细胞转移至LN和肺中的大多数乳腺癌转移的这些转基因小鼠模型。转移延迟从模型变化以模拟和从2〜8个月的范围内。6,11-16乳腺癌转移的这些转基因小鼠模型可用于研究乳腺癌转移基础的遗传和分子机制优良系统。但是，低转移发生率和长转移延迟限制在抗癌剂的测试这些模型的有用性。
4T1细胞在乳房脂肪垫的原位移植，与原发肿瘤和随后的转移性生长，resembl形成上课恶性乳腺癌的多个阶段，包括原发肿瘤的形成，淋巴结转移和远处器官转移。此外，同系移植避免免疫宿主抗移植物反应使肿瘤微环境的贡献，包括免疫系统的研究中，对恶性肿瘤的进展。这种模式也为研究宿主的抗肿瘤免疫应答是有用的。因此，4T1细胞在乳房脂肪垫的注射表示快速和定量的方法来研究乳腺癌转移。
原位移植4T1肿瘤模型在不到30天，并在不到60天（ 图2-4）100％转移率100％的肿瘤发病率。此外，与大多数乳腺癌转移的转基因小鼠模型的，4T1肿瘤细胞也转移至骨（ 图4），由此，类似人类乳腺癌转移。
稳定expressi上的荧光素酶编码在4T1肿瘤细胞的cDNA允许随时间的肿瘤的生长和发展中的活体小鼠监测（ 图3）。肿瘤负荷和转移动力学可以基于发光强度进行定量。此外，转移的站点，也可以通过荧光素酶成像（ 图4）确定并与互补的方式（ 图5）的验证。因此，这种乳腺癌自发转移模型是用于确定体内抗转移剂的功效的优良模型。
大多数手术涉及缝合切口关闭。这里，我们观察到不锈钢伤口夹很好地工作（ 图1）。伤口夹子可容易地灭菌并与autoclip施放（ 图1）容易地应用。伤口剪辑可以与夹子去除（ 图1）的伤口已经愈合之后容易地除去。我们已经OB担任此手术技术没有感染过20次手术。
这种模型的一个限制是快速的肿瘤生长速度。该轴承转移小鼠的大部分死亡1 - 手术后2个月因广泛转移的负担。另一个限制是，4T1是小鼠细胞系及其对实验性药物反应可能不同于由人细胞的反应。这应该研究设计实验药物测试加以考虑。
总之，我们已经优化原位乳腺癌自发转移模型的一个简单且敏感的过程。该模型模拟人乳腺癌转移。肿瘤进展动力学可以监测和随时间推移定量。该模型是一种理想的，不仅用于研究乳腺癌生长和转移，同时也为在自发乳腺癌转移的抑制17测试化疗和免疫治疗剂的功效。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ami-X Imaging System | Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ | ||
| IsoTec SurgiVet | Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA | ||
| AutoClip Physicians Kit | Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD | 427638 | |
| 9 mm AutoClip Applier | Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD | 427630 | |
| 9 mm AutoClip Remover | Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD | 427637 | |
| 9 mm AutoClip Wound Clip | Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD | 427631 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher | 8940 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher | 8875 | |
| 1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe | Becton Dickinson and Co. NJ | 305620 | |
| RPMI 1640 medium | Mediatech Inc | 10-040-CV | |
| PBS | Mediatech Inc | 21-040-CV | |
| 70% Ethanol | Ultrapure-usa.com | ||
| Trypsin-EDTA | Mediatech Inc | 25-040-CI |
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