Introduction
细胞内细菌病原体─引起传染病和能生长和再现人类宿主细胞内的细菌─是全世界主要的健康关注5。入侵和哺乳动物细胞内复制，细胞内病原体已取得成熟的致病机制和因素。虽然这些机制是引起疾病的能力根本，我们知之甚少的监管和动态。因为在液体培养基中生长的细菌的基因表达分布不反映宿主细胞内的实际的环境中，人们越来越需要转录在它们的细胞内的壁龛生长的细菌的分析。这种分析将使主机触发特异性细菌适应的解密，并将有助于确定治疗方案设计新的目标。细胞内生长的细菌的转录组分析是非常具有挑战性，因为哺乳动物RNA多于由细菌RNA至少十倍。在这个手稿中，我们描述的实验方法，从单核细胞增生李斯特菌小鼠巨噬细胞中分离出不断增长的细菌RNA。提取的RNA可用于研究细胞内的适应和致病菌转录分析的各种技术，如RT-PCR，RNA测序，微阵列和其它基于杂交的技术的毒力机制。
李斯特菌是李斯特菌在人体中的病原体，临床表现主要对象是免疫功能低下者，老人和孕妇6的疾病。它 是，侵入一个宽已在宿主-病原体的相互作用被使用了几十年作为模型研究7哺乳动物细胞的阵列的革兰氏阳性兼性细胞内病原体。在侵袭，它最初驻留在液泡或吞噬体（在吞噬细胞的情况下），从它必须转义入T他宿主细胞胞质溶胶中，以便进行复制。几个毒力因子已经显示介导的逃生过程中，主要是孔隙形成溶血素，李斯特O（LLO）和两个附加的磷脂8。在胞质溶胶中的细菌使用主机肌动蛋白聚合机械推动自己对小区内的肌动蛋白丝，并从细胞扩散到细胞（ 图1）。 L.所有主要毒力因子参与入侵，细胞内生存和复制的单核细胞 ，都是由主控毒力调节转录激活，经皮射频消融8-10。
在过去十年中，许多研究由我们进行的和其他人已经成功地应用于宿主细胞2,11-15内部为胞内生长的细菌的转录组分析的方法。两种主要的方法用于细菌RNA从其基于主机的RNA分离：1）细菌RNA的选择性富集和2）RNA分离由迪菲rential细胞裂解。第一种方法依赖于（使用市售的试剂盒为例）的总RNA提取物消减杂交哺乳动物RNA分子或细菌转录序列（SCOTS）11选择性捕获。第二种方法依赖于细菌和宿主细胞中，其中在细菌细胞中保持完整的宿主细胞裂解的差分裂解。细菌细胞，然后从宿主细胞裂解物中分离，通常是通过离心，并且将RNA是使用标准技术提取。使用这种方法的主要问题是，连同完好无损的细菌，宿主细胞细胞核也分离，从而将RNA制剂仍含有哺乳动物RNA。克服这个问题的一种方式是完整的细菌使用差速离心的宿主细胞的细胞核中分离出来，虽然这过程通常需要时间提高在基因表达谱变化的提取过程中的关注。在本文中，我们提出了一个改进的和快速的巴cteria RNA提取协议，这是基于对细胞差动裂解的方法。首先，L.巨噬细胞感染单核细胞的细胞裂解用冷水。接着，巨噬细胞的核是由一个简短离心除去完整细菌迅速收集在过滤器上，从该RNA被使用的细菌核酸的热酚-SDS提取隔离。
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Protocol
注意：在整个实验中，巨噬细胞，在5％CO 2的强制空气培养箱中在37℃下保温，并仅用于实验操作，其在II类生物安全柜进行取出的孵化。与L.工作菌等细菌是根据生物安全2级法规。
1.细胞的制备及细菌感染（1日和2）
- 1天
- 种子2.0×10 7个骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）上在30毫升BMDM +青霉素-链霉素介质（ 表2）145毫米的菜。种子3板为每个细菌菌株进行分析。在一个5％CO 2的强制空气培养箱中在37℃孵育过夜。
- 启动野生型（WT）L.的过夜细菌培养在标准培养箱单核细胞株10403S在10ml脑心脏浸液（BHI）培养基中，在30℃下。地方培养管倾斜无晃动。注意：这些生长条件上调鞭毛基因的表达，从而促进有效的感染。
- 第2天
- 预暖BMDM介质（不含青霉素-链霉素抗生素）（ 表2）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）在37℃。
- 用25毫升预热的PBS洗单层巨噬细胞两次以去除抗生素。加入30毫升的新鲜BMDM网上平台。
- 通过在> 14000 xg离心离心细菌1分钟，弃去上清，并通过移液在1.5ml PBS中轻轻重悬细菌洗涤1.5毫升PBS中过夜的细菌培养物。重复两次。
- 每个感染巨噬细胞板用0.5毫升野生型L的洗过夜培养菌等 。如果使用多个板块，除了感染每盘15分钟。该时间间隔将使得在感染结束时分别收获每个板。
注：感染复数（MOI），是通过镀覆连续稀释测定后在37℃下板中的24小时温育用于感染上BHI琼脂平板上，计数克隆形成单位（CFU）的细菌培养的第使用0.5毫升WT L的菌菌株在〜100的MOI 10403S的结果（每巨噬细胞100细菌CFU）。当分析细胞内生长缺陷细菌突变体，更高的MOI应予以考虑。 - 以下在37℃下0.5小时温育后，洗涤被感染的细胞两次用PBS以除去未附着的细菌，并添加30毫升预热BMDM介质。细菌附着接下来将0.5小时期间内化。
- 在1小时感染后，添加30微升庆大霉素（1：1000，以达到50微克/ ml的终浓度），以杀死细胞外细菌。
- 通过将过滤器头与一个真空出口的收集液烧瓶组装过滤装置。然后放置在过滤头的过滤器（0.45微米），接着气缸漏斗并用金属C安全的不同部分灯。准备冰冷的无RNA酶的水。
- 在如下6小时感染后，收获细菌感染的细胞。个别对待每一个板块。
注：通常情况下，L。单核细胞增生完成1日志增长的过程中巨噬细胞感染了6个小时。长时间孵育可能导致细菌过度生长和巨噬细胞的细胞死亡，而较短的潜伏期，可能会导致相当低细菌负荷。在MOI和感染的时间可以被修改以达到最佳的条件。- 洗涤感染的细胞用PBS一次。加入20毫升冰冷的无RNA酶的水以裂解细胞巨噬细胞的细胞。使用细胞刮，刮关闭单元板很快，但仔细。
- 收集裂解的细胞到50ml锥形管中。涡旋30秒。离心机在800×g离心在4℃下3分钟。
- 通过使用真空系统的过滤装置通过上清液。使用镊子，滚动过滤器，并迅速转移到一个15毫升的CONICAL管。用在液氮中的过滤器单元冻结管。
- 组装过滤装置与用于下一个样品一个新的过滤器，如在1.2.7中描述。
- 在-80℃下为第二天存储冻结滤波器。或者，直接进行核酸提取。
2.核酸提取（3天）
注意：在通风橱中进行用苯酚和氯仿溶液的所有操作。
- 制备1：酸化苯酚1混合：氯仿，400微升各样品。混在分开的管中，然后通过抽吸撤离得到的水层。加入40微升10％SDS的。
- 在冰上解冻含有过滤管，让他们感冒。到各含有过滤管添加650微升乙酸乙酯- EDTA（AE）缓冲液（ 表2）。
- 尽可能快地执行以下步骤。
- 大力涡包含过滤器，这样管该过滤器搅乳到管的外周和缓冲充分洗涤该过滤器。始终放置回冰上保持管冷。注意：可能需要额外地涡管而反转为充分洗菌落滤波器。
- 重复所有管。它可能是到降速不久悬浮液（在120 xg离心1分钟）在过程的结束时是有用的。
- 含细菌缓冲器转移至含有SDS和苯酚/氯仿混合物（如在2.1制备）1.5ml微量离心管中。重复所有管。可能有必要再次旋转该含过滤管（在120 xg离心1分钟），以从过滤器得到的残余缓冲液。
- 将所有在多管涡旋器1.5毫升管，并涡旋全速10分钟。
- 孵育在65℃的加热块的管10分钟。离心以最大速度（> 14000 xg离心）5分钟。
- 从各t传送，水层（约400微升）UBE到含有40微升3M乙酸钠（pH 5.2）和1.0毫升100％乙醇的新的1.5毫升管。彻底涡每管。
注意：糖原可以在这个步骤中加入，以改善沉淀的沉淀的可视化。 - 孵育样品在-80℃下1小时。可替代地，在-20孵育样品℃过夜。然后，离心将样品在4℃下以最大速度（> 14000 XG）20分钟。
- 小心吸断从每个管的乙醇（上层）。 500微升冷的70％乙醇添加到每个样品和涡彻底。离心机在4℃下以最大速度（> 1 4000 xg离心）20分钟。
- 小心吸断从每个管的乙醇。干燥该样品使用真空蒸发器无热约2分钟。不要过度干燥的样品。
- 25μl的无RNA酶的水添加到每个样品。在室温下孵育20分钟。仔细涡和降速。
- 测量在T RNA浓度他样本使用微量紫外可见分光光度计。期望以提取约0.5 - 1微克的每板核酸。
注：技术重复可以在此阶段进行组合。
3. DNase处理
- 根据在一个离心管的表1设置了反应。孵育在37℃下45分钟。添加450微升不含RNA酶的水和500μl的苯酚-氯仿- IAA混合物（ 表2），分离相的通过以最大速度（> 14000 XG）离心2分钟。
- 将水层转移到新管中，并通过2分钟离心以最大速度（> 14000 XG）加入500μl氯仿IAA混合物（ 表2），涡旋并分离相。
- 将水层转移到新管中，并加入1毫升乙醇和50微升3M乙酸钠（pH 5.2）。涡流。
注意：糖原可以在这个步骤中加入，以改善沉淀的沉淀的可视化。 - 小心吸断从每个管的乙醇。 500微升冷的70％乙醇添加到每个样品和涡彻底。离心机在4℃下以最大速度20分钟。小心吸断从每个管的乙醇。
- 干燥该样品使用真空蒸发器无热约2分钟。不要过度干燥的样品。
- 加入12微升无RNase水，孵育在室温下，旋涡和降速2分钟。该样品中含有纯化的RNA，让他们在冰上。可替换地，溶解RNA的RNA酶的游离H 2 O与0.1毫摩尔EDTA或TE缓冲液（10mM的Tris，1mM EDTA）中。
- 测量使用微量紫外可见分光光度计RNA的浓度。期待〜100纳克每样RNA（如果技术复制组合）。
注：根据本协议RNA提取是适合初学者通过多种技术受体基因的转录分析。我们通常采用RT-qPCR的分析来研究L.巨噬细胞1-4的感染过程中单核细胞的基因转录。
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Representative Results
该模型系统示于图1，并包括感染L.巨噬细胞菌等细菌，这在复制巨噬细胞胞浆图2表示实验方案。 图3表示WT L.期间的毒力基因等RT-qPCR的分析典型结果单核细胞巨噬细胞的增长相比，在丰富的实验室中BHI的增长。结果显示的L的两个主要毒力因子的转录水平单核细胞增生;溶血素编码LLO毒素和Acta编码肌动蛋白装配蛋白，这是在巨噬细胞感染诱发强劲。
图1：L的总体概述 单核细胞 生活方式为Intracellular病原。L.单核细胞通过表达称为诱导活性内化至非吞噬细胞，而吞噬细胞吞噬细菌internalins特别的蛋白质侵入宿主细胞。入侵后，L。单核细胞增生最初发现核内体/液泡吞噬体从中逃脱快速使用主要是李斯特Ô毒素（LLO）之内。在细胞质L.宿主细胞单核细胞增生迅速复制，并从细胞通过传播其蛋白质的ActA使用基于肌动蛋白的蠕动细胞。所有提及的毒力因子由主毒力活化剂，经皮射频消融监管。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：流程图代表的EXPerimental步骤，其主要步骤包括感染细胞的裂解，宿主细胞的细胞核和细菌细胞和RNA分离的分离。中说明的关键步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 在 L. 毒力基因的转录分析 菌 细胞内生长。 溶血素基因（编码LLO）的转录分析和Acta基因L.期间在6小时巨噬细胞单核细胞 10403S胞 内生长指数生长期间在BHI培养基用RT-qPCR的分析在感染后相比，其水平。转录水平被表示为相对量（RQ），相对以BHI生长过程中的转录水平。转录水平标准化为16S rRNA基因的水平作为参考基因。数据代表3个独立的生物重复（N = 3）。误差线代表95％置信区间。 请点击此处查看该图的放大版本。
| RNA | 高达2微克（44微升最大体积） |
| 10X DNA酶缓冲 | 5微升 |
| 无RNA酶的水 | 完整的50微升总量 |
| DNA酶 | 1μL（1台） |
表1：DNA酶反应协议。
| 1.500毫升BMDM +青霉素 - 链霉素媒体（过滤消毒）： | |
| DMEM | 235毫升 |
| FBS（在54℃灭活30分钟） | 100毫升 |
| M-CSF（L-929的条件培养基）19 | 150毫升 |
| 谷氨酰胺 | 5毫升 |
| 丙酮酸钠 | 5毫升 |
| β-巯基乙醇 | 0.5毫升 |
| 青霉素/链霉素 | 5毫升 |
| 总 | 500毫升 |
| 2.500毫升BMDM（过滤消毒）： | |
| DMEM | 235毫升 |
| FBS（在54℃灭活30分钟） | 100毫升 |
| M-CSF（L-929的条件培养基）19 | 150毫升 |
| 谷氨酰胺 | 5毫升 |
| 丙酮酸钠 | 5毫升 |
| β-巯基乙醇 | 0.5毫升 |
| 总 | 500毫升 |
| 3. AE缓冲 | |
| 醋酸钠pH为5.2 | 50毫米 |
| EDTA | 10毫 |
| 无RNA酶的水 | |
| 4.苯酚-氯仿- IAA | |
| 苯酚 | 25毫升 |
| 氯仿 | 24毫升 |
| 异戊醇 | 1毫升 |
| 5.氯仿- IAA | |
| 氯仿 | 24毫升 |
| 异戊醇 | 1毫升 |
表2：媒体和缓冲器的食谱。
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Discussion
这里描述的协议代表了从属细菌RNA分离的优化方法细菌单核细胞巨噬细胞在细胞内不断增长。这个协议是基于细胞差动裂解，并包括用于细菌RNA富集两个主要步骤：使用离心和过滤细菌的快速采集巨噬细胞的细胞核沉淀。这些步骤之后是一个标准的RNA提取步骤。虽然这个协议描述李斯特菌RNA的纯化，它可以很容易地修改为其它的细菌病原体。虽然方法主要针对RNA进行转录分析的纯化，用于分离从它的主机中的细胞内生长的细菌的原则也可应用于其他细菌成分，例如DNA，蛋白质，细胞壁等 。这样的基因组和纯化生化分析将提供细胞内病原体的更好的理解和表征感染的过程中的生命周期。
该过程的结果〜100毫微克的总细菌RNA的。虽然RNA产量相对较低，它们适合用于使用多个技术，如RT-qPCR的，RNA测序和现代基于杂交技术基因转录的下游分析。为了提高RNA的产率，它建议使用新鲜的细菌接种物，以及新鲜的苯酚溶液不含核酸酶的水和缓冲液，以避免可能的RNA酶污染。收获细菌并分离的RNA应在提取过程中始终保持在冰上。感染时间可以根据生物问题进行调整和生物体的影响。以增加RNA的量，实验可以扩大到包括每各样品更感染板。
进行这样的实验，当主要关心的是在收获步骤改变细菌的转录概况的风险。大多数杆菌IA通过激活冷休克应激反应在低温下反应，并应尽可能迅速地进行这样的细菌收获。试剂和设备应提前制备，并且每个样品，应分别对待。最关键的步骤是立即冻结含过滤细菌在液氮中。如果不这样做可能会大幅降低分离RNA的质量。在这个协议中的另一个关键步骤是相对少量的核酸的乙醇沉淀。格外小心，应注意不要破坏无形的核酸沉淀。糖原可以添加到沉淀溶液在这些步骤，以改善粒料的可视化。
对于一些后续的应用中， 例如，RT-qPCR的，去除的DNA是非常关键的。虽然我们不定期监测DNA酶处理的效率，减少了3 - 下列DNA酶吨的核酸总量5折reatment表明有效的DNA酶处理的。值得注意的是，从RNA样品的任何可商购的技术或试剂盒用于DNA去除是合适的。另外，使用质量控制样品，如与不进行逆转录的样品，是在这样的应用中是有益的。
此处所描述的协议的一个主要限制是RNA的提取的相对低的量，这是约100ng的总RNA。因此，这种技术不适合于经典的杂交技术，例如Northern印迹分析，这需要的RNA微克。
最近在RNA测序（深的RNA-SEQ）的技术进步使双方的细菌病原体和哺乳动物宿主的转录概况一起的分析，而不需要分离其的RNA，名为“双RNA-SEQ'16-18方法。虽然双RNA-SEQ分析是在研究宿主 - 病原体相互作用的理想，这是非常expensive和不能频繁使用。因为在被感染的细胞细菌RNA含量特别低，这是非常困难和昂贵的获得足够的细菌读取的有效的基因表达分析，即使通过最新测序平台所提供的高读深度。这种方法的另外一个缺点是频繁使用的RNA或cDNA的扩增步骤，这可能会导致基因表达的偏压的结果。这里介绍的方法提供了获得的信息和成本效益之间的折衷。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37 °C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30 °C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
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