Introduction
חיידקים פתוגנים תאיים ─ חיידקים גורמי מחלות זיהומיות מסוגלים לגדול והתחילו להתרבות תאים בתוך צבאות האדם ─ הם דאגה בריאותית משמעותית ברחבי העולם 5. כדי לפלוש לשכפל בתוך תאים יונקים, פתוגנים תאיים רכשו מנגנוני ארסיות מתוחכמים גורמים. בעוד מנגנונים אלה הם יסוד את היכולת לגרום מחלה, אנו יודעים מעט מאוד על רגולצית הדינמיקה שלהם. מאז פרופילי ביטוי גנים של חיידקי גדלי תקשורת נוזלת אינם משקפים את הסביבה בפועל בתוך תאי מארחים, יש צורך הולך וגדל transcriptome המנתח של חיידקים הגדלים נישות התאיות שלהם. ניתוחים כאלה ייאפשרו הפיענוח של עיבודים ספציפיים חיידקים מופעלים על ידי המארח יעזרו לזהות מטרות חדשות עבור עיצוב טיפולי. ניתוח transcriptome של חיידקים גדלו intracellularly הוא מאתגר מאוד מאז RNA יונק במספרם RNA חיידקים ידי בפי עשרה לפחות. בכתב היד הזה, אנו מתארים שיטה ניסיונית לבודד RNA חיידקים מחיידקי חיידקים ליסטריה גדלו בתוך תאי מקרופאג בעכברים. רנ"א החילוץ יכול לשמש כדי לחקור עיבודים תאיים ומנגנונים ארסיים של חיידקים פתוגניים על ידי טכניקות שונות של ניתוח שעתוק, כגון RT-PCR, RNA-seq, microarray וטכנולוגיות מבוססות הכלאה אחרות.
ל חיידקים הוא הגורם הסיבתי של ליסטריה בבני אדם, מחלה עם ביטויים קליניים מיקוד אנשי מדוכאי חיסון בעיקר, קשישים ונשים בהריון 6. זה הוא פתוגן התאי פקולטטיבי גראם חיובי כי פולש מגוון רחב של בתאי יונק כי שמשו במשך עשרות שנים כמודל באינטראקציות מארח הפתוגן לומד 7. לאחר הפלישה, הוא שוכן בתחילה בתוך vacuole או phagosome (במקרה של תאים phagocytic), שממנו הוא חייב לברוח לתוך tהוא לארח cytosol התא כדי לשכפל. מספר גורמים ארסיים הוכחו לתווך בתהליך הבריחה, ובעיקר המוליזין יוצרים הנקבובי, Listeriolysin O (LLO) ושני 8 נוסף phospholipases. ב cytosol החיידקים משתמשים במכונות פילמור אקטין המארח כדי להניע את עצמם על סיבי אקטין בתוך התא להתפשט מתא לתא (איור 1). כל הגורמים הארסיים הגדולים של L. חיידקי מעורבי פלישה, הישרדות שכפול תאיים, מופעלים על ידי רגולטור תעתיק ארסיות מאסטר, PrfA. 8-10.
בעשור האחרון, מספר מחקרים שנערכו על ידינו ואחרים יישמו בהצלחה שיטות לניתוח transcriptome של חיידקים גדל intracellularly בתוך התאים המארחים 2,11-15. שתי גישות עיקריות משמשות להפריד RNA חיידקים מ-RNA המארח אשר מבוססים על: 1) עשרה סלקטיבית של RNA חיידקים ו -2) בידוד RNA על ידי diffeתמוגה התא rential. הגישה הראשונה מתבססת על כלת תוסף של תמציות RNA סכו למולקולות רנ"א יונקות (למשל באמצעות ערכות זמינות מסחרי) או ללכוד סלקטיבית של רצפים עבדו בקטריאלי (סקוטים) 11. הגישה השנייה מתבססת על תמוגה הפרש של חיידקים ותאי מארח, שבו תאי המארחים הם lysed בעוד תאים חיידקיים נותרו על כנן. תאים חיידקיים אז מופרדים lysate התא המארח, בדרך כלל על ידי צנטריפוגה, ואת RNA מופק באמצעות טכניקות סטנדרטיות. הבעיה העיקרית בגישה זו היא כי יחד עם החיידקים השלמים, גרעיני תאים לארח גם מבודדים, ובכך הכנות RNA עדיין מכילות RNA היונק. אחת דרכים להתגבר על בעיה זו היא להפריד חיידקים שלמים מגרעיני תאי מארחים באמצעות צנטריפוגה הפרש, אבל פרוצדורה בדרך כלל לוקחת זמן שדווח על החשש משינויי פרופיל ביטוי גנים במהלך חילוץ. במאמר זה אנו מציגים ba משופרת ומהירהפרוטוקול חילוץ cteria RNA, אשר מבוסס על גישת תמוגה הפרש תא. ראשית, L. חיידקים נגועים בתאי מקרופאג הם lysed עם מים קרים. לאחר מכן, גרעינים מקרופאג יוסרו על ידי צנטריפוגה קצר וחיידקים שלמים נאספים במהירות על מסננים, שממנו RNA הוא מבודד באמצעות מיצוי פנול-SDS חמים של חומצות גרעין חיידקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: במהלך הניסוי כולו, תאי מקרופאג מודגרת על 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO 2 כפיית אוויר ונלקחו מתוך האינקובטור רק מניפולציות ניסיון, אשר מבוצעות בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II. עבודה עם L. חיידקי חיידקים הם בהתאם לרמת 2 תקנות בטיחות ביולוגית.
Cell 1. הכנת זיהום חיידקים (יום 1 ו -2)
- יום 1
- זרע 2.0 x 7 מח עצם נגזר 10 תאים מקרופאג (BMDM) על צלחת 145 מ"מ 30 מ"ל התקשורת BMDM + עט סטרפטוקוקוס (טבלה 2). צלחות זרע 3 עבור כל זן חיידקים להיות מנותחות. דגירה לילה בשעה 37 ° C באינקובטור 5% CO 2 נאלץ באוויר.
- התחל תרבית חיידקי לילה של wild-type (WT) ל חיידקי 10403S זן ב 10 מיליליטר של עירוי לב המוח בינוני (BHI), ב 30 מעלות צלזיוס חממה סטנדרטית. צינורות תרבות מקום מלוכסנים בלי לרעוד. הערה:תנאי גידול אלה עד להסדיר את הביטוי של הגנים שוטונים, המקדמת זיהום יעיל.
- יום 2
- בינוני טרום חמים BMDM (ללא אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס) (לוח 2) ופוספט בופר (PBS) ב 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף monolayer מקרופאג פעמיים עם 25 מ"ל של PBS מחומם מראש להסיר אנטיביוטיקה. הוסף 30 מ"ל בינוני BMDM טריים.
- לשטוף 1.5 מ"ל של תרבית החיידקים לילה עם PBS על ידי צנטריפוגה החיידקים> 14,000 XG דקות 1, השלכת supernatant, ו resuspending חיידקים בעדינות ב 1.5 מ"ל של PBS על ידי pipetting. חזור פעמיים.
- להדביק כל צלחת מקרופאג עם 0.5 מ"ל של תרבות הלילה שטף של wild-type L. חיידקים. אם אתה משתמש הצלחות מרובות, להדביק כל דקות צלחת 15 זה מזה. מרווח זמן זה יאפשר קצירה כל צלחת בנפרד בסוף הזיהום.
הערה: ריבוי של זיהום (משרד הפנים) הוא assayed ידי ציפוי דילול סדרתיים של תרבית החיידקים המשמשים זיהום על צלחות אגר BHI ויחידות המושבה להרכיב לספור (CFU) לאחר 24 שעות הדגירה של צלחות על 37 מעלות צלזיוס. באמצעות 0.5 מ"ל של WT ל חיידקי להתאמץ תוצאות 10403S בתוך משרד הפנים של ~ 100 (100 חיידקים CFU לכל תא מקרופאג). כשמנתחי חיידקי מוטציות פגומות בצמיחה תאית, גבוה יותר משרד פנים צריך להיחשב. - בעקבות 0.5 דגירת שעות ב 37 ° C, לשטוף את התאים הנגועים פעמים עם PBS, להסיר חיידקים פנויים, ולהוסיף 30 מיליליטר מחומם מראש בינוני BMDM. חיידקים מצורפים יפנימו במהלך 0.5 השעות הבאות.
- בשעה 1 זיהום hr לכתוב, להוסיף 30 μl של גנטמיצין (1: 1,000 להגיע לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל) כדי להרוג חיידקים חוץ תאית.
- להרכיב את מנגנון הסינון על ידי הצבת ראש מסנן על בקבוק נוזל איסוף עם יציאת ואקום. אז במקום מסנן (0.45 מיקרומטר) על ראש המסנן, ואחריו משפך גליל ולאבטח את החלקים השונים עם ג מתכתמנורה. הכן מים קרים כקרח RNase חינם.
- לאחר 6 שעות לאחר הדבקה, חיידקי אסיף תאים נגועים כדלקמן. פנקו כל צלחת בנפרד.
הערה: בדרך כלל, L. חיידקי משלים 1-יומן של צמיחה במהלך 6 שעות של זיהום בתאים מקרופאג. incubations יותר עלול לגרום לצמיחת יתר של חיידקים ומות תא של מקרופאגים, ואילו תקופות דגירה קצרות יכול לגרום המון חיידקים נמוכים משמעותי. משרד הפנים ואת הזמן של זיהום יכולים להיות שונים כדי להגיע תנאים אופטימליים.- שטוף תאים נגועים עם PBS פעם. הוסף 20 מ"ל מים RNase ללא קרים כקרח כדי lyse התאים מקרופאג. באמצעות מגרד תא, לגרד את התאים את הצלחת במהירות אך בזהירות.
- איסוף תאים lysed צינור חרוטי 50 מ"ל. וורטקס למשך 30 שניות. צנטריפוגה ב 800 XG 3 דקות ב 4 ° C..
- להעביר את supernatant דרך מכשירי סינון באמצעות שואב אבק. בעזרת פינצטה, לגלגל את מסנן ובמהירות ולהעביר אותו 15 מ"ל Coniצינור קאל. צמד להקפיא את הצינורות עם המסננים בחנקן נוזלי.
- להרכיב את מנגנון סינון עם מסנן חדש למדגם הבא, כמתואר 1.2.7.
- אחסן את המסננים קפואים ב -80 מעלות צלזיוס במשך למחרת. לחלופין, להמשיך ישירות מיצוי חומצות גרעין.
2. הפקת חומצות גרעין (יום 3)
הערה: בצע את כל המניפולציות עם פתרונות פנול כלורופורם במנדף.
- כן 1: תערובת 1 של פנול acidified: כלורופורם, 400 μl עבור כל דגימה. מערבבים צינורות נפרדים, ולאחר מכן למשוך את השכבה המימית וכתוצאה מכך על ידי שאיפה. הוסף 40 μl של 10% SDS.
- להפשיר את צינורות המכילים מסנן על קרח כדי לשמור אותם קרים. צינור אחד המכיל מסנן להוסיף 650 μl של אצטט-EDTA (AE) חיץ (טבלה 2).
- בצע את השלבים הבאים מהר ככל האפשר.
- בתוקף מערבולת הצינור המכיל מסנן כךשמסנן whisks לפריפריה של הצינור ואת החיץ מלא רוחץ את המסנן. תמיד לשמור על צינור קר על ידי הצבת אותו בחזרה על הקרח. הערה: ייתכן שיהיה צורך גם מערבולת הצינור בעוד הפוכה כדי לשטוף את החיידקים באופן מלא את המסנן.
- חזור על הפעולה עבור כל הצינורות. זה עשוי להיות שימושי כדי לסובב למטה ההשעיה זמן קצר (1 דקות ב 120 XG) בסוף התהליך.
- מעבירים את חיץ חיידקים המכילים לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל את SDS ותמהיל פנול / כלורופורם (כפי שהוכנו 2.1). חזור על הפעולה עבור כל הצינורות. זה עשוי להיות נחוץ כדי לסובב את הצינורות המכילים מסנן (1 דקות ב 120 XG) שוב כדי לקבל חיץ שיורית מהמסנן.
- מניחים את כל צינורות 1.5 מ"ל במכשיר מערבולת רב-צינור, מערבולת במלוא המהירות למשך 10 דקות.
- דגירת הצינורות בתוך גוש חום C 65 מעלות במשך 10 דקות. צנטריפוגה במהירות המרבית (> 14,000 XG) במשך 5 דקות.
- מעבירים את השכבה המימית (כ -400 μl) מכל tUbe לצינור 1.5 מיליליטר חדש המכיל 40 μl של 3 M נתרן יצטט (5.2 pH) ו 1.0 מיליליטר של 100 אתנול%. וורטקס כל צינור ביסודיות.
הערה: גליקוגן ניתן להוסיף בשלב זה כדי לשפר להדמיה של הגלולה זרזה. - דגירת הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לחלופין, דגירת דגימות ב -20 ° C הלילה. ואז, צנטריפוגה דגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות המרבית (> 14,000 XG).
- בזהירות לשאוב את אתנול (שכבה עליונה) מצינור כל. הוסף 500 μl קר 70% אתנול לטעום כל מערבולת ביסודיות. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות מרבית (> 1 4,000 XG).
- בזהירות לשאוב את אתנול מן צינור אחד. ייבש את הדגימות עבור כ 2 דקות באמצעות מאייד ואקום ללא חום. אל מעל לייבש את הדגימות.
- הוסף 25 μl מים RNase ללא מדגם זה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. מערבולת ספין למטה בזהירות.
- מדוד ריכוז רנ"א tהוא דוגם באמצעות microvolume UV-Vis ספקטרופוטומטר. מצפה לחלץ כ -0.5 - 1 מיקרוגרם של חומצות גרעין לכל צלחת.
הערה: משכפל טכני ניתן לשלב בשלב זה.
3. DNase טיפול
- הגדר את התגובה לפי טבלה 1 בתוך שפופרת microfuge. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. להוסיף 450 מים μl RNase ללא ו 500 μl של תערובת פנול-כלורופורם-רשות העתיקות (טבלה 2), שלבים נפרדים על ידי צנטריפוגה במשך 2 דקות במהירות מקסימלית (> 14,000 XG).
- מעביר את השכבה המימית לצינור חדש ולהוסיף 500 μl תמהיל כלורופורם-רשות עתיקות (טבלה 2), מערבולת שלבים נפרדים על ידי צנטריפוגה 2 דקות במהירות מקסימלית (> 14,000 XG).
- מעבירים את השכבה המימית לצינור חדשה ולהוסיף 1 מ"ל של אתנול 50 μl של 3 נתרן אצטט M (pH 5.2). מְעַרבּוֹלֶת.
הערה: גליקוגן ניתן להוסיף בשלב זה כדי לשפר להדמיה של הגלולה זרזה. - בזהירות לשאוב את אתנול מן צינור אחד. הוסף 500 μl קר 70% אתנול לטעום כל מערבולת ביסודיות. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות מרבית. בזהירות לשאוב את אתנול מן צינור אחד.
- ייבש את הדגימות עבור כ 2 דקות באמצעות מאייד ואקום ללא חום. אל מעל לייבש את הדגימות.
- להוסיף 12 μl של RNase ללא מים, דגירה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, מערבולת, ו-למטה ספין. הדגימות מכילות RNA המטוהר, ולשמור אותם על קרח. לחלופין, לפזר רנ"א RNase ללא H 2 O עם 0.1 mM EDTA או חיץ TE (10 מ"מ טריס, 1 mM EDTA).
- למדוד ריכוזים RNA באמצעות microvolume UV-Vis ספקטרופוטומטר. צפה ~ 100 ננוגרם של רנ"א לדגימה (אם משכפל טכני משולבים).
הערה: RNA חילוץ על פי פרוטוקול זה מתאים FOניתוח r שעתוק הגנים על ידי מספר רב של טכניקות. אנחנו בדרך כלל להעסיק ניתוח RT-qPCR ללמוד L. חיידקי שעתוק גנים במהלך ההדבקה של תאי מקרופאג 1-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת המודל מוצגת באיור 1 וכוללת תאי מקרופאג נגועים ל חיידקי חיידקים, אשר לשכפל cytosol מקרופאג. איור 2 מייצגים את מערך הניסוי. איור 3 מייצג תוצאות אופייניות של ניתוח RT-qPCR כגון גנים ארסיים במהלך WT ל חיידקי צמיחה מקרופאגים בהשוואה לצמיחת BHI הבינוני מעבדה עשירה. התוצאות מראות רמות השעתוק של שני גורמים ארסיים גדולים של L. חיידקים; hly קידוד רעלן LLO ו ACTA קידוד חלבון הרכבה אקטין, אשר מושרים וחסונה על זיהום של מקרופאגים.
איור 1: סקירה כללית של L. חיידקי סגנון חיים כמו שאניntracellular פתוגן. L. חיידקים פולש לתאים מארחים ידי לבטא חלבונים מיוחדים כינת internalins משרי הפנמה פעילה לתוך תאים שאינם phagocytic, ואילו תאי phagocytic phagocytose החיידקים. לאחר הפלישה, L. חיידקים נמצאים בתחילה בתוך vacuole אנדוזום / phagosome שממנו הוא בורח במהירות באמצעות רעלן O listeriolysin בעיקר (LLO). בתוך התא המארח cytosol L. חיידקי משכפל במהירות, ומתפשטים מתא לתא באמצעות תנועתיות מבוסס יקטין באמצעות חלבון Acta שלה. כל הגורמים הארסיים ציינו מוסדרים על ידי מפעיל ארסיות מאסטר, PrfA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תרשים זרימה ייצוג Experimental נוהל. השלבים העיקריים כוללים תמוגה של תאים נגועים, הפרדת גרעיני תאי מארחים ותאים חיידקי בידוד RNA. צעדים קריטיים מומחשים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניתוח שעתוק של גנים ארסיים במהלך L. צמיחה תאית חיידקים. ניתוח תמלול של גן hly (קידוד LLO) ושל גן Acta במהלך L. חיידקי 10403S צמיחה תאיים בתאי מקרופאג ב -6 שעות שלאחר זיהום בהשוואה לרמות שלהם במהלך הצמיחה המעריכית בינוני BHI באמצעות ניתוח RT-qPCR. רמות תמלול מיוצגות כמות יחסית (RQ), ביחסלרמות השעתוק במהלך גידול BHI. רמות התמלול היו מנורמלות הרמות של 16S rRNA כמו גן התייחסות. הנתונים הוא נציג של 3 חזרות ביולוגיות עצמאיות (N = 3). ברי שגיאה מייצגים 95% מרווח ביטחון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| RNA | עד 2 מיקרוגרם (בנפח מרבי של 44 μl) |
| חיץ 10x DNase | 5 μl |
| RNase ללא מים | שלם 50 μl נפח הכולל |
| DNAse | 1 μl (יחידה 1) |
טבלה 1: פרוטוקול התגובה DNase.
| BMD 1. 500 מ"לM + מדיה עט סטרפטוקוקוס (מסנן מעוקר): | |
| DMEM | 235 מ"ל |
| FBS (מומת 30 דקות ב 54 מעלות צלזיוס) | 100 מ"ל |
| M-CSF (L-929 בינוני מותנה) 19 | 150 מ"ל |
| גלוטמין | 5 מ"ל |
| פירובט נתרן | 5 מ"ל |
| בטא mercaptoethanol | 0.5 מ"ל |
| פניצילין / סטרפטומיצין | 5 מ"ל |
| סה"כ | 500 מ"ל |
| 2. 500 מ"ל BMDM (מסנן מעוקר): | |
| DMEM | 235 מ"ל |
| FBS (מומת 30 דקות ב 54 מעלות צלזיוס) | 100 מ"ל |
| M-CSF (L-929 בינוני מותנה) 19 | 150 מ"ל td> |
| גלוטמין | 5 מ"ל |
| פירובט נתרן | 5 מ"ל |
| בטא mercaptoethanol | 0.5 מ"ל |
| סה"כ | 500 מ"ל |
| 3. חיץ AE | |
| pH NaOAc 5.2 | 50 מ"מ |
| EDTA | 10 מ"מ |
| RNase ללא מים | |
| 4. פנול, כלורופורם-רשות העתיקות | |
| פנול | 25 מ"ל |
| כְּלוֹרוֹפוֹרם | 24 מ"ל |
| אלכוהול Iso-אמיל | 1 מ"ל |
| 5. כלורופורם-רשות העתיקות | |
| כְּלוֹרוֹפוֹרם | 24 מ"ל |
| אלכוהול Iso-אמיל | 1 מ"ל |
= "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> טבלה 2: מתכונים של מדיה חוצצת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה אופטימיזציה עבור בידוד של RNA חיידקי L. חיידקי חיידקים הגדלים intracellularly בתאים מקרופאג. פרוטוקול זה מבוסס על תמוגה תא הפרש וכולל שני שלבים עיקריים להעשרת RNA חיידקים: שקיעת גרעינים מקרופאג באמצעות צנטריפוגה ואוסף מהיר של חיידקים על ידי סינון. צעדים אלה ואחריו הליך מיצוי RNA סטנדרטי. בעוד פרוטוקול זה מתאר טיהור RNA listerial, זה יכול בקלות להיות שונה חיידקים פתוגנים אחרים. למרות שהשיטה מתמקדת טיהור RNA לניתוח תעתיק, העיקרון ששימשו להפרדת חיידקים הגדלים intracellularly ממארחו יכול להיות מיושם גם לטיהור רכיבים חיידקים אחרים, כגון דנ"א, חלבונים, תאים קיר ועוד גנומי כזה ו ניתוחי ביוכימיים יספקו הבנה ואפיון טובה יותר של הפתוגן התאימחזור חיים במהלך הזיהום.
תוצאות ההליך ~ 100 ננוגרם של רנ"א חיידקים כולל. למרות תשואות RNA נמוכות יחסית, הם מתאימים עבור ניתוחים במורד זרם של שעתוק גנים בטכניקות שונות, כגון RT-qPCR, RNA-seq וטכנולוגיות מבוססות הכלאה מודרנית. כדי לשפר את תשואות RNA, מומלץ להשתמש inoculums חיידקים טרי, כמו גם מי nuclease ללא פתרון פנול טריים מאגרים כדי למנוע זיהומי RNase אפשריים. חיידקים שנקטפו ו- RNA המבודד תמיד צריכים להיות כל זמן על הקרח במהלך תהליך החילוץ. שעת הזיהום יכולה להיות מותאמת בהתאם לשאלה ביולוגית האורגניזם למד. כדי להגדיל את סכומי RNA, הניסוי וניתן לשנותם עד כדי לכלול יותר צלחות זיהום לכל מדגם.
החשש העיקרי בעת ביצוע ניסוי כזה הוא הסיכון של שינוי פרופיל השעתוק של החיידקים במהלך שלבים קציר. רוב bacterIA להגיב לטמפרטורות קרות על ידי הפעלת תגובות דחק הלם קרות, ובכך קציר חיידקים צריכות להתבצע במהירות אפשרית. חומרים כימיים וציוד צריכים להיות מוכנים מראש, ואת כל דגימה ראוי לדון בהם בנפרד. השלב הקריטי ביותר הוא מייד להקפיא את החיידקים המכיל מסנן בחנקן נוזלי. אי ביצוע הוראה זו עלול להפחית באופן דרמטי את איכות RNA בודד. עוד שלב קריטי פרוטוקול זה הוא משקעים אתנול של כמויות קטנות יחסית של חומצות גרעין. טיפול נוסף יש לנקוט כדי לא לשבש את גלולת חומצות גרעין בלתי נראית. גליקוגן ניתן להוסיף את הפתרון הממטר לשפר להדמיה של הגלולה במהלך השלבים הבאים.
עבור יישומים מסוימים שלאחר מכן, למשל, RT-qPCR, הסרת DNA היא קריטית. למרות שאנו שגרתי לא לפקח על היעילות של טיפול DNase, ירידה של 3 - 5 לקפל בסך הכולל של חומצות גרעין הבאה DNase treatment מעיד על טיפול DNase יעיל. מן ראוי לציין כי כל טכניקה או ערכה זמינה מסחרי להסרת דנ"א מדגימה RNA מתאימה. בנוסף, באמצעות דגימות בקרת איכות, כגון מדגם ללא שעתוק לאחור בצע, הוא מועיל ביישומים כאלה.
מגבלה עיקרית של הפרוטוקול המתואר כאן היא הכמות נמוכה יחסית של RNA חילוץ, שזה בערך 100 ננוגרם של רנ"א הכל. לפיכך, טכניקה זו אינה מתאימה טכניקות כלאה קלסיות, כגון ניתוח כתם הצפון, אשר דורשות מיקרוגרם של רנ"א.
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה רצף RNA (-seq RNA העמוק) מאפשרת הניתוח של שני הפתוגן חיידקי ואת פרופילי תעתיק מארח יונקים יחד, ללא הצורך להפריד RNAs שלהם, שיטה בשם "RNA-seq הכפול" 16-18. למרות ניתוח RNA-seq כפול אידיאלי בלימוד אינטראקציה מארח הפתוגן, זה מאוד expensivדואר ולא יכול לשמש לעיתים קרובות. מאחר שתוכן RNA חיידקים בתאים נגועים הוא נמוך במיוחד, זה מאוד קשה ויקר להשיג מספיק חיידקי קורא עבור ניתוח ביטוי גנים יעיל, אפילו עם עומק קריאה הגבוה שמספק פלטפורמות רצף חדשות. חסרון נוסף של גישה זו הוא השימוש התכוף צעד הגברת RNA או cDNA, דבר שעלול להוביל לתוצאות מוטות של ביטוי גנים. השיטה המוצגת כאן מציעה פשרה בין המידע המתקבל וחסכנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37 °C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30 °C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- World Health Organization WHO. , http://www.who.int/en/ (2005).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
