Introduction
Intracellulari batteri patogeni ─ batteri che causano malattie infettive e in grado di crescere e riprodursi all'interno delle cellule di ospiti umani ─ sono un grave problema di salute in tutto il mondo 5. Per invadere e replicarsi all'interno di una cellula di mammifero, patogeni intracellulari hanno acquisito sofisticati meccanismi di virulenza e fattori. Mentre questi meccanismi sono fondamentali per la capacità di causare una malattia, si sa poco circa la loro regolazione e la dinamica. Dal momento che i profili di espressione genica di batteri coltivate in mezzi liquidi non riflettono l'ambiente reale all'interno di cellule ospiti, vi è una crescente necessità per le analisi del trascrittoma di batteri coltivati nelle loro nicchie intracellulari. Tali analisi consentiranno la decifrazione di specifici adattamenti batteriche innescati dal conduttore e contribuiranno a identificare nuovi bersagli terapeutici per la progettazione. analisi del trascrittoma di batteri intracellulare coltivate è molto impegnativo dal momento che l'RNA dei mammiferi più numerosi RNA batterica da ATalmeno dieci volte. In questo manoscritto, descriviamo un metodo sperimentale per isolare l'RNA batterica da Listeria monocytogenes batteri che crescono all'interno delle cellule macrofagi murini. L'RNA estratto può essere usato per studiare adattamenti intracellulari e meccanismi di virulenza dei batteri patogeni di varie tecniche di analisi della trascrizione, come RT-PCR, RNA-Seq, microarray e altre tecnologie di ibridazione base.
L. monocytogenes è l'agente eziologico della listeriosi negli esseri umani, una malattia con manifestazioni cliniche di targeting principalmente individui immunocompromessi, anziani e donne incinte 6. esso è un agente patogeno intracellulare facoltativo Gram-positivi che invade una vasta gamma di cellule di mammiferi che sono stati utilizzati per decenni come un modello in interazioni ospite-patogeno studi 7. Dopo l'invasione, risiede inizialmente in un vacuolo o phagosome (nel caso delle cellule fagocitiche), da cui deve fuggire in tegli ospitare citoplasma delle cellule al fine di replicare. Diversi fattori di virulenza hanno dimostrato di mediare il processo di fuga, soprattutto l'emolisina pore-forming, listeriolysin O (LLO) e due fosfolipasi ulteriori 8. Nel citosol i batteri utilizzano macchinari polimerizzazione ospitante per spingersi sui filamenti di actina all'interno della cellula e di diffondersi da cellula a cellula (Figura 1). Tutti i principali fattori di virulenza di L. monocytogenes coinvolti nella invasione, la sopravvivenza intracellulare e la replica, vengono attivati dal regolatore di trascrizione maestro virulenza, PrfA. 8-10.
Negli ultimi dieci anni, diversi studi condotti da noi e altri hanno applicato con successo metodi per l'analisi del trascrittoma di batteri intracellulare cresciuti all'interno delle cellule ospiti 2,11-15. Due approcci principali sono utilizzati per separare l'RNA batterica da host-RNA che si basano su: 1) l'arricchimento selettivo di RNA batterico e 2) l'isolamento di RNA da diffelisi cellulare renziale. Il primo approccio si basa sulla ibridazione sottrattiva del totale estratti di RNA di molecole di RNA di mammiferi (ad esempio utilizzando kit disponibili in commercio) o la cattura selettiva di sequenze di trascritti batteriche (Scozia) 11. Il secondo approccio si basa sulla lisi differenziale di batteri e cellule ospiti, in cui le cellule ospiti vengono lisate mentre le cellule batteriche rimangono intatte. Le cellule batteriche sono poi separati dal lisato cellula ospite, di solito per centrifugazione, e l'RNA è estratto utilizzando tecniche standard. Il problema principale di questo approccio è che, insieme con i batteri intatti, cellule ospiti nuclei sono anche isolati, in tal modo i preparativi di RNA contengono ancora RNA mammiferi. Un modo per superare questo problema è quello di separare i batteri intatti da cellule ospiti nuclei mediante centrifugazione differenziale, se questa procedura richiede solitamente tempo aumentare la preoccupazione delle variazioni del profilo di espressione genica durante l'estrazione. In questo articolo presentiamo un ba migliore e rapidaprotocollo di estrazione cteria RNA, che si basa sulla differenza di cellule approccio lisi. Primo, L. monocytogenes infetti macrofagi sono lisate con acqua fredda. Successivamente, i nuclei dei macrofagi vengono rimossi da una breve centrifugazione e batteri intatti sono rapidamente raccolti su filtri, da cui l'RNA è isolato tramite hot estrazione con fenolo-SDS degli acidi nucleici batterici.
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Protocol
Nota: Durante l'intero esperimento, macrofagi vengono incubate a 37 ° C in un incubatore CO 2 ad aria forzata 5% e il prelievo delle dell'incubatore solo per manipolazioni sperimentali, che vengono eseguite in una cappa di sicurezza biologica Classe II. Lavorare con L. batteri monocytogenes è in base al livello di sicurezza biologica 2 regolamenti.
1. Preparazione e cellulare infezione batterica (giorno 1 e 2)
- Giorno 1
- Cellule Seed 2.0 x 10 7 midollo osseo derivate macrofagi (BMDM) su un piatto 145 millimetri in 30 ml BMDM + Pen-Strep supporti (Tabella 2). Seed 3 piastre per ogni ceppo batterico da analizzare. Incubare per una notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 ad aria forzata 5%.
- Avviare una coltura batterica durante la notte di wild-type (WT) L. monocytogenes 10403S deformazione in 10 ml di terreno, cuore, cervello infusione (BHI), a 30 ° C in un incubatore standard. tubi porre la cultura inclinati senza agitare. Nota:Queste condizioni di crescita up-regolare l'espressione dei geni flagelli, che promuove l'infezione efficiente.
- Giorno 2
- Medio Pre-caldo BMDM (senza antibiotici Pen-Strep) (Tabella 2) e tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C.
- Lavare monostrato macrofagi due volte con 25 ml di PBS preriscaldata per rimuovere antibiotici. Aggiungere 30 ml di media BMDM fresco.
- Lavare 1,5 ml di coltura batterica durante la notte con PBS mediante centrifugazione dei batteri a> 14000 g per 1 minuto, scartando il surnatante, e risospendere i batteri delicatamente in 1,5 ml di PBS pipettando. Ripetere due volte.
- Infettare ogni piatto macrofagi con 0,5 ml di una cultura durante la notte lavata di wild-type L. monocytogenes. Se si utilizzano più piatti, infettare ogni piatto 15 min a parte. Questo intervallo di tempo consentirà raccolta ciascuna piastra singolarmente al termine dell'infezione.
Nota: la molteplicità di infezione (MOI) è dosati con placcatura diluizione in series di coltura batterica usati per l'infezione su piastre di agar BHI e contando unità formanti colonie (CFU) dopo 24 ore di incubazione delle piastre a 37 ° C. Utilizzando 0,5 ml di WT L. monocytogenes ceppo risultati 10403S in un MOI di ~ 100 (100 CFU di batteri per cella macrofagi). Nell'analizzare mutanti batterici difettosi in crescita intracellulare, un più alto MOI dovrebbe essere considerato. - Dopo 0,5 ore di incubazione a 37 ° C, lavare le cellule infette due volte con PBS per rimuovere i batteri senza legami, e aggiungere 30 ml di pre-riscaldato medie BMDM. batteri attaccati saranno interiorizzare durante il prossimo 0,5 ore.
- A 1 dall'infezione hr, aggiungere 30 ml di gentamicina (1: 1.000 a raggiungere una concentrazione finale di 50 mg / ml) per uccidere i batteri extracellulari.
- Montare l'apparecchiatura filtrante inserendo una testa filtro su un pallone di liquido di raccolta con una luce di uscita del vuoto. Poi posto un filtro (0,45 micron) su una testa del filtro, seguito da un imbuto cilindro e fissare le varie parti con un metallo clampada. Preparare acqua priva di RNasi ghiacciata.
- Al 6 ore dopo l'infezione, batteri raccolto dalle cellule infette come segue. Trattare ogni piatto individualmente.
Nota: Di solito, L. monocytogenes completa 1-log di crescita durante 6 ore di infezione in cellule macrofagi. incubazione più lunghi potrebbero causare la proliferazione batterica e la morte cellulare dei macrofagi, mentre periodi di incubazione più brevi potrebbero causare cariche batteriche sensibilmente inferiori. Il MOI e momento dell'infezione può essere modificato per raggiungere le condizioni ottimali.- Lavare le cellule infettate con PBS una volta. Aggiungere 20 ml di acqua priva di RNasi ghiacciata per la lisi delle cellule macrofagi. Utilizzando un raschietto cellulare, raschiare le cellule dalla piastra rapidamente, ma con attenzione.
- Raccogliere cellule lisate in una provetta conica da 50 ml. Vortex per 30 sec. Centrifugare a 800 xg per 3 min a 4 ° C.
- Passare il surnatante attraverso l'apparecchio filtro con un sistema a vuoto. Usando le pinzette, rotolare il filtro e rapidamente trasferirla a 15 ml CONItubo cal. Snap-congelare i tubi con i filtri in azoto liquido.
- Montare l'apparecchiatura di filtrazione con un nuovo filtro per il campione successivo, come descritto in 1.2.7.
- Conservare i filtri congelati a -80 ° C per il giorno successivo. In alternativa, procedere direttamente alla estrazione degli acidi nucleici.
2. Estrazione acidi nucleici (3 ° giorno)
Nota: eseguire tutte le manipolazioni con soluzioni di fenolo e cloroformio in una cappa aspirante.
- Preparare una 1: 1 miscela di fenolo acidificati: cloroformio, 400 microlitri per ogni campione. Mescolare in tubi separati, e quindi ritirare la fase acquosa risultante per aspirazione. Aggiungere 40 ml di 10% SDS.
- Scongelare i tubi del filtro contenente il ghiaccio per tenerli freddo. Per ogni tubo-filtro contenente aggiungere 650 ml di acetato-EDTA (AE) tampone (Tabella 2).
- Effettuare le seguenti operazioni il più rapidamente possibile.
- Vigorosamente vortice la provetta contenente il filtro in modoche il filtro conduce allo periferia del tubo e il buffer lava completamente il filtro. Tenere sempre il freddo tubo ponendolo di nuovo sul ghiaccio. Nota: Potrebbe essere necessario inoltre vortice tubo mentre invertito per lavare completamente i batteri il filtro.
- Ripetere l'operazione per tutte le provette. Può essere utile spin-giù la sospensione breve (1 min a 120 xg) alla fine del processo.
- Trasferire il buffer di batteri contenenti in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente SDS e il mix di fenolo / cloroformio (come preparato in 2.1). Ripetere l'operazione per tutte le provette. Può essere necessario girare i tubi del filtro contenente (1 min a 120 xg) per ottenere tampone residuo dal filtro.
- Mettere tutti i tubi da 1,5 ml in un dispositivo a vortice multi-tubo, e vortex a pieno ritmo per 10 minuti.
- Incubare le provette in un blocco di calore a 65 ° C per 10 minuti. Centrifugare alla massima velocità (> 14.000 xg) per 5 min.
- Trasferire la fase acquosa (circa 400 ml) per ogni tube in una nuova provetta da 1,5 ml contenente 40 ml di 3 M acetato di sodio (pH 5,2) e 1,0 ml di etanolo al 100%. Vortice accuratamente ogni provetta.
Nota: Glicogeno può essere aggiunto in questa fase per migliorare la visualizzazione della pastiglia precipitato. - Incubare i campioni a -80 ° C per 1 ora. In alternativa, incubare a -20 ° C per una notte. Poi, centrifugare i campioni a 4 ° C per 20 min alla massima velocità (> 14.000 xg).
- Aspirare con cautela il etanolo (strato superiore) da ogni provetta. Aggiungere 500 ml freddo etanolo al 70% per ogni campione e miscelare accuratamente. Centrifugare a 4 ° C per 20 min alla massima velocità (> 1 4.000 xg).
- Aspirare con cautela il etanolo da ogni provetta. Essiccare i campioni per circa 2 minuti usando un evaporatore sotto vuoto senza riscaldamento. Non over-asciugare i campioni.
- Aggiungere acqua priva di RNasi 25 microlitri di ciascun campione. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. Attenzione vortice e spin-down.
- Misurare la concentrazione di RNA in tegli campioni utilizzando un microvolumi UV-Vis spettrofotometro. Aspettatevi di estrarre circa 0,5-1 mg di acidi nucleici per piastra.
Nota: repliche tecniche possono essere combinati in questa fase.
3. Trattamento DNase
- Impostare la reazione in base alla tabella 1 in una provetta per microcentrifuga. Incubare a 37 ° C per 45 min. Aggiungere 450 acqua priva di RNasi ml e 500 ml di fenolo-cloroformio-IAA mix (Tabella 2), fasi separate mediante centrifugazione per 2 minuti a velocità massima (> 14000 g).
- Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 500 microlitri cloroformio-IAA mix (Tabella 2), vortice e fasi separate da 2 min centrifugazione a velocità massima (> 14.000 xg).
- Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 1 ml di etanolo e 50 ml di 3 M acetato di sodio (pH 5,2). Vortice.
Nota: Glicogeno può essere aggiunto in questa fase per migliorare la visualizzazione della pastiglia precipitato. - Aspirare con cautela il etanolo da ogni provetta. Aggiungere 500 ml freddo etanolo al 70% per ogni campione e miscelare accuratamente. Centrifugare a 4 ° C per 20 min alla massima velocità. Aspirare con cautela il etanolo da ogni provetta.
- Essiccare i campioni per circa 2 minuti usando un evaporatore sotto vuoto senza riscaldamento. Non over-asciugare i campioni.
- Aggiungere 12 ml di acqua RNase-free, incubare per 2 minuti a temperatura ambiente, vortice e spin-down. I campioni contengono RNA purificato, tenerli su ghiaccio. In alternativa, sciogliere RNA in RNase-free H 2 O con 0,1 mM EDTA o tampone TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
- Misurare le concentrazioni di RNA utilizzando un microvolumi UV-Vis spettrofotometro. Aspettatevi ~ 100 ng di RNA per campione (se replicati tecniche sono combinate).
Nota: RNA estratto in base a questo protocollo è adatto foR analisi del gene trascrizione con tecniche multiple. Noi di solito utilizziamo l'analisi RT-qPCR per studiare L. monocytogenes trascrizione genica durante l'infezione delle cellule macrofagi 1-4.
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Representative Results
Il sistema modello è illustrato nella figura 1 e comprende cellule di macrofagi infettati con L. monocytogenes batteri, che replicano nel citoplasma dei macrofagi. La figura 2 rappresenta lo schema sperimentale. Figura 3 rappresenta i risultati tipici di tale analisi RT-qPCR di geni di virulenza durante WT L. monocytogenes crescita nei macrofagi in confronto alla crescita ricca di laboratorio medio BHI. I risultati mostrano i livelli di trascrizione di due importanti fattori di virulenza di L. monocytogenes; HLY codifica LLO tossina e Acta codifica actina proteine di montaggio, che sono robustamente indotto dopo l'infezione dei macrofagi.
Figura 1: panoramica generale di L. monocytogenes Stile di vita come hontracellular patogeno. L. monocytogenes invade cellule ospiti esprimendo proteine specializzate internalins che inducono internalizzazione attiva nelle cellule non fagocitiche, mentre fagociti fagocitano i batteri denominati. Al momento dell'invasione, L. monocytogenes è inizialmente trovato all'interno di un vacuolo endosome / phagosome da cui fuoriesce rapidamente utilizzando principalmente la tossina listeriolysin O (LLO). All'interno della cellula ospite citosol L. monocytogenes replicati rapidamente, e si diffonde da cella a cella utilizzando la motilità basato actina tramite la sua proteina Acta. Tutti i fattori di virulenza menzionati sono regolati dalla attivatore maestro di virulenza, PrfA. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Un diagramma di flusso rappresentante il ExpProcedura erimental. Le fasi principali includono la lisi delle cellule infette, la separazione delle cellule ospiti nuclei e le cellule di batteri e l'isolamento di RNA. Passaggi critici sono illustrati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Trascrizione Analisi di geni di virulenza durante L. monocytogenes intracellulare crescita. Analisi della trascrizione di geni HLY (codifica LLO) e di ACTA genica durante L. monocytogenes 10403S crescita intracellulare nelle cellule macrofagi a 6 ore dopo l'infezione rispetto ai loro livelli durante la crescita esponenziale dei media BHI utilizzando l'analisi RT-qPCR. livelli di trascrizione sono rappresentati come quantità relativa (RQ), relativai livelli di trascrizione durante la crescita in BHI. livelli di trascrizione sono stati normalizzati ai livelli di 16S rRNA come gene di riferimento. I dati sono rappresentativi di 3 ripetizioni biologiche indipendenti (n = 3). Le barre di errore rappresentano il 95% intervallo di confidenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| RNA | fino a 2 ug (in volume massimo di 44 microlitri) |
| Buffer 10x DNase | 5 ml |
| acqua priva di RNasi | completa a 50 ml di volume totale |
| DNAsi | 1 ml (1 unità) |
Tabella 1: DNasi Reazione protocollo.
| 1. 500 ml BMDsupporti M + Pen-Strep (filtro sterilizzato): | |
| DMEM | 235 ml |
| FBS (inattivato 30 min a 54 ° C) | 100 ml |
| M-CSF (L-929 terreno condizionato) 19 | 150 ml |
| glutammina | 5 ml |
| piruvato di sodio | 5 ml |
| beta-Mercaptoethanol | 0,5 ml |
| Penicillina / streptomicina | 5 ml |
| Totale | 500 ml |
| 2. 500 ml BMDM (filtro sterilizzato): | |
| DMEM | 235 ml |
| FBS (inattivato 30 min a 54 ° C) | 100 ml |
| M-CSF (L-929 terreno condizionato) 19 | 150 ml |
| glutammina | 5 ml |
| piruvato di sodio | 5 ml |
| beta-Mercaptoethanol | 0,5 ml |
| Totale | 500 ml |
| 3. Il tampone AE | |
| NaOAc pH 5.2 | 50 mm |
| EDTA | 10 mM |
| acqua priva di RNasi | |
| 4. fenolo-cloroformio-IAA | |
| Fenolo | 25 ml |
| Cloroformio | 24 ml |
| alcol iso-amile | 1 ml |
| 5. cloroformio-IAA | |
| Cloroformio | 24 ml |
| alcol iso-amile | 1 ml |
Tabella 2: Ricette di Media e di buffer.
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Discussion
Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo ottimizzato per l'isolamento di RNA batterico da L. monocytogenes batteri che crescono intracellulare nelle cellule macrofagi. Questo protocollo si basa su lisi differenziale cellulare e comprende due fasi principali per l'arricchimento di RNA batterico: macrofago sedimentazione nuclei mediante centrifugazione ed un rapido accumulo di batteri per filtrazione. Questi passaggi sono seguiti da un procedimento di estrazione di RNA standard. Mentre questo protocollo descrive purificazione dell'RNA listerial, può essere facilmente modificato per altri batteri patogeni. Anche se il metodo si concentra sulla purificazione dell'RNA per l'analisi trascrizionale, il principio utilizzato per separare i intracellulare crescenti batteri dal suo ospite può essere applicato anche per la purificazione di altri componenti batteriche, come DNA, proteine, cellule parete, ecc Tale genomica e analisi biochimiche fornirebbero una migliore comprensione e caratterizzazione del patogeno intracellulareciclo di vita durante il corso dell'infezione.
I risultati della procedura di ~ 100 ng di RNA batterica totale. Anche se i rendimenti di RNA sono relativamente bassi, sono adatti per le analisi a valle di trascrizione genica utilizzando più tecniche, come RT-qPCR, RNA-Seq e moderne tecnologie di ibridazione base. Per migliorare le rese di RNA, si consiglia di utilizzare inoculums freschi batteriche, così come l'acqua priva di nucleasi fresco soluzione di fenolo e tamponi per evitare possibili contaminazioni RNasi. batteri raccolte e RNA isolato dovrebbero essere sempre tenuti in ghiaccio durante il processo di estrazione. Il tempo di infezione può essere regolata a seconda della domanda biologica e l'organismo studiato. Per aumentare la quantità di RNA, l'esperimento può essere scalata fino a includere più piastre di infezione per ogni campione.
La preoccupazione principale quando si esegue un esperimento è il rischio di cambiare il profilo trascrizione dei batteri durante la procedura di raccolta. La maggior parte Bacteria rispondere agli freddo attivando fredde urto risposte di stress, e la raccolta pertanto batterica deve essere effettuata il più rapidamente possibile. Reagenti e attrezzature devono essere preparati prima del tempo, e ogni campione devono essere trattati separatamente. La fase più critica è di congelare immediatamente i batteri del filtro contenenti in azoto liquido. In caso contrario si potrebbe ridurre drasticamente la qualità del RNA isolato. Un altro passo fondamentale in questo protocollo è la precipitazione di etanolo relativamente piccole quantità di acidi nucleici. La cura supplementare dovrebbe essere presa non interrompere l'invisibile acidi nucleici pellet. Glicogeno può essere aggiunto alla soluzione di precipitazione per migliorare la visualizzazione della pastiglia durante queste fasi.
Per alcune applicazioni successive, ad esempio, RT-qPCR, la rimozione del DNA è critica. Sebbene non monitoriamo l'efficacia del trattamento DNasi, una riduzione del 3 - 5 volte nella quantità totale di acidi nucleici seguente DNase tRATTAMENTO è indicativo di un trattamento DNasi efficiente. Da segnalare, qualsiasi tecnica disponibile in commercio o un kit per la rimozione di DNA da campioni di RNA è adatto. Inoltre, usando campioni di controllo qualità, come un campione senza trascrizione inversa eseguita, è utile in tali applicazioni.
Un importante limitazione del protocollo qui descritto è relativamente bassa quantità di RNA estratto, che è di circa 100 ng di RNA totale. Così, questa tecnica non è adatto per le tecniche di ibridazione classiche, come l'analisi Northern blot, che richiedono microgrammi di RNA.
I recenti progressi tecnologici in RNA sequenziamento (deep RNA-Seq) permette l'analisi sia del batterio patogeno e dei profili di trascrizione ospite mammifero insieme, senza la necessità di separare i loro RNA, un metodo chiamato 'doppio RNA-Seq' 16-18. Anche se a doppia analisi di RNA-Seq è ideale per studiare l'interazione ospite-patogeno, è molto expensive non può essere utilizzato di frequente. Poiché il contenuto di RNA batterico in cellule infette è particolarmente basso, è estremamente difficile e costoso ottenere abbastanza batterica legge per un'efficace analisi di espressione genica, anche con la profondità elevata di lettura fornito dalle piattaforme di sequenziamento più nuovi. Un ulteriore inconveniente di questo approccio è l'uso frequente di un passo RNA o cDNA amplificazione, che può portare a risultati distorti di espressione genica. Il metodo presentato qui offre un compromesso tra le informazioni ottenute e costo-efficacia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37 °C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30 °C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- World Health Organization WHO. , http://www.who.int/en/ (2005).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
