Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

RNA Purification fra intracellulært Grown doi: 10.3791/54044 Published: June 4, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Intracellulære bakterielle patogener ─ bakterier som forårsaker infeksjonssykdommer og i stand til å vokse og reprodusere inne celler av menneskelige verter ─ er et stort helseproblem over hele verden 5. Å invadere og gjenskape i en pattedyrcelle, har intracellulære patogener kjøpt sofistikerte virulensmekanismer og faktorer. Selv om disse mekanismene er grunnleggende evne til å forårsake sykdom, vet vi lite om deres regulering og dynamikk. Siden genuttrykk profiler av bakterier som dyrkes i flytende media ikke gjenspeiler den faktiske miljøet i vertsceller, er det et økende behov for transkriptomet analyser av bakterier dyrket i sine intracellulære nisjer. Slike analyser vil gjøre det mulig å tyde av spesifikke bakterie tilpasninger utløst av verten, og vil bidra til å identifisere nye mål for terapeutisk design. Transkriptomet analyse av intracellulært dyrket bakterier er svært utfordrende siden pattedyr RNA tallmessig bakteriell RNA ved atminst ti ganger. I dette manuskriptet, beskriver vi en eksperimentell metode for å isolere bakteriell RNA fra Listeria monocytogenes bakterier vokser inni murine makroceller. Det ekstraherte RNA kan brukes til å studere intracellulære tilpasninger og virulensmekanismer av patogene bakterier av forskjellige teknikker for transkripsjon analyse, så som RT-PCR, RNA-Seq, mikromatriser og andre hybridiserings-baserte teknologier.

L. monocytogenes er den utløsende agent for listeriose hos mennesker, en sykdom med kliniske manifestasjoner målgruppe primært immunsupprimerte individer, eldre mennesker og gravide kvinner 6. Den er en Gram-positive fakultativ intracellulær patogen som invaderer et bredt utvalg av pattedyrceller som har blitt brukt i flere tiår som en modell i verts patogen interaksjoner studerer 7. Ved invasjonen, ligger det i utgangspunktet i en vacuole eller en phagosome (i tilfelle av phagocytic celler), som det må flykte inn than vert celle cytosol for å gjenskape. Flere virulensfaktorer har vist seg å megle flukten prosessen, først og fremst poredannende hemolysin, Listeriolysin O (LLO) og to ekstra fosfolipaser 8. I cytosol bakterier bruke verts aktin polymerisasjon maskiner til å drive seg selv på aktin filamenter i cellen og å spre seg fra celle til celle (figur 1). Alle større virulensfaktorer av L. monocytogenes er involvert i invasjon, intracellulær overlevelse og replikasjon, blir aktivert av hoved virulens transkripsjonsregulator, PrfA. 8-10.

I det siste tiåret, flere studier utført av oss og andre har med hell brukt metoder for transkriptomet analyse av intracellulært dyrket bakterier inne vertsceller 2,11-15. To hovedtilnærmingsmåter er brukt til å separere bakterielle RNA fra vert-RNA som er basert på: 1) selektiv anrikning av bakterielle RNA og 2) RNA isolering av differential cellelyse. Den første tilnærmingen er avhengig av subtraktiv hybridisering av total RNA ekstrakter til pattedyr RNA-molekyler (for eksempel ved bruk av kommersielt tilgjengelige kits) eller selektiv fangst av bakterielle transkriberte sekvenser (skotsk) 11. Den andre fremgangsmåten er avhengig av differensiallysering av bakterier og vertsceller, hvori vertscellene blir lyserte mens bakteriecellene er intakte. Bakteriecellene separeres deretter fra verts cellelysat, vanligvis ved sentrifugering, og den RNA blir ekstrahert ved anvendelse av standardteknikker. Hovedproblemet med denne løsning er at sammen med de intakte bakterier, blir vertsceller kjerner også isolert, og dermed RNA-preparatene fremdeles inneholde pattedyr-RNA. En måte å løse dette problemet er å skille intakte bakterier fra vertsceller kjerner ved bruk av differensiell sentrifugering, selv om denne fremgangsmåten vanligvis tar tid å heve bekymring for endringer i genekspresjon profil under ekstraksjonen. I denne artikkelen presenterer vi en bedre og rask bacteria RNA ekstraksjon protokoll, som er basert på celle differensial lyse tilnærming. Først L. monocytogenes infiserte makrofagceller lyseres med kaldt vann. Deretter blir makrofag kjerner fjernes ved en kort sentrifugering og intakte bakterier hurtig oppsamles på filter, hvorfra RNA blir isolert ved anvendelse av varm fenol-SDS-ekstraksjon av bakterielle nukleinsyrer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Merk: I løpet av hele eksperimentet, er makrofagceller inkubert ved 37 ° C i en 5% CO2 med tvungen luftinkubator og tatt ut av inkubatoren bare for eksperimentelle manipulasjoner, som utføres i en klasse II biologisk trygghetskabinett. Arbeide med L. monocytogenes bakterier er i henhold til biologisk sikkerhetsnivå 2 forskrifter.

1. Cell Forberedelse og bakteriell infeksjon (Dag 1 og 2)

  1. Dag 1
    1. Seed 2,0 x 10 7 benmarg avledet makroceller (BMDM) på en 145 mm fatet i 30 ml BMDM + Pen-Strep media (tabell 2). Seed 3 plater for hver bakteriestamme som skal analyseres. Inkuber over natten ved 37 ° C i en 5% CO2 med tvungen luftinkubator.
    2. Begynn en overnatting bakteriekultur av villtype (WT) L. monocytogenes strekk 10403S i 10 ml hjerne-hjerte-infusjon (BHI) medium, ved 30 ° C i en standard inkubator. Place kultur rør skråstilt uten risting. notat:Disse vekstbetingelser oppregulerer ekspresjonen av flagellene gener, som fremmer effektiv infeksjon.
  2. dag 2
    1. Forvarm BMDM medium (uten Pen-Strep antibiotika) (tabell 2) og fosfatbufret saltløsning (PBS) ved 37 ° C.
    2. Vask makrofag monolag to ganger med 25 ml forvarmet PBS for å fjerne antibiotika. Legg 30 ml fersk BMDM mellom.
    3. Vask 1,5 ml av over natten bakteriekultur med PBS ved sentrifugering bakterier ved> 14 000 xg i 1 min, kaste supernatanten, og resuspendering bakterier forsiktig i 1,5 ml PBS ved pipettering. Gjenta to ganger.
    4. Infisere hver makrofag plate med 0,5 ml av en vasket over natten kultur av vill type L. monocytogenes. Ved bruk av flere plater, infisere hver plate 15 min fra hverandre. Dette tidsintervall vil gjøre det mulig å høste hver plate individuelt ved slutten av infeksjonen.
      Merk: mangfold av infeksjon (MOI) er analysert ved plating seriefortynningsmetodes av bakteriekultur anvendes for infeksjon på BHI agarplater og teller-kolonidannende enheter (CFU) etter 24 timers inkubering av platene ved 37 ° C. Ved anvendelse av 0,5 ml WT L. monocytogenes belastning 10403S resulterer i en MOI på ~ 100 (100 bakterier CFU pr makrofagcellelinje). Ved analyse av bakterie mutanter defekte i intracellulær vekst, bør en høyere MOI vurderes.
    5. Etter 0,5 time inkubering ved 37 ° C, vask de infiserte cellene to ganger med PBS for å fjerne utilsluttede bakterier, og tilsett 30 ml forvarmes BMDM medium. Vedlagte bakterier vil internalisere i løpet av neste 0,5 timer.
    6. Ved 1 time etter infeksjon, tilsett 30 ul gentamicin (1: 1000 for å nå en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml) for å drepe ekstra-cellulære bakterier.
    7. Montere filterapparatet ved å plassere en filterhodet på en oppsamlings væske kolbe med en vakuumutløpsåpning. Deretter plassere et filter (0,45 um) på en filterhode, etterfulgt av en sylinder trakt og feste de forskjellige delene med en metall clampe. Forbered iskald RNase-fritt vann.
    8. Ved 6 timer etter infeksjon, slakte bakterier fra infiserte celler som følger. Unn hver plate hver for seg.
      Merk: Vanligvis L. monocytogenes fullfører en-log av vekst i seks timer for infeksjon i makroceller. Lengre inkubasjoner kan føre til bakterievekst og celledød av makrofager, mens kortere inkuberingsperioder kan føre til betydelig lavere bakterie belastninger. MOI og smittetidspunkt kan bli endret for å oppnå optimale forhold.
      1. Vask infiserte celler med PBS gang. Tilsett 20 ml iskald RNase-fritt vann for å lysere makrofagceller. Ved hjelp av en celle skrape, skrape cellene av platen raskt, men forsiktig.
      2. Samle lyserte celler til et 50 ml konisk rør. Vortex i 30 sek. Sentrifuger ved 800 x g i 3 min ved 4 ° C.
      3. Bestå av supernatanten gjennom filterapparatet ved hjelp av et vakuumsystem. Ved hjelp av pinsett, rulle filteret og raskt overføre den til en 15 ml Conical tube. Snap-fryse rørene med filtrene i flytende nitrogen.
      4. Montere filtreringsapparat med et nytt filter for neste prøve, slik som beskrevet i 1.2.7.
      5. Oppbevar frosne filtrene ved -80 ° C for neste dag. Alternativt, gå direkte til nukleinsyre utvinning.

2. nukleinsyrer Extraction (Dag 3)

Merk: Utfør alle manipulasjoner med fenol og kloroform løsninger i en avtrekkshette.

  1. Tilbered en 1: 1 blanding av surgjort fenol: kloroform, 400 ul for hver prøve. Bland i separate rør, og deretter trekke den resulterende vandige laget ved aspirasjon. Legg 40 ul 10% SDS.
  2. Tine filterholdige rørene på is for å holde dem kalde. Til hvert filter-inneholdende rør legger til 650 ul av acetat-EDTA (AE) buffer (tabell 2).
  3. Utfør følgende trinn så raskt som mulig.
    1. Kraftig vortex røret som inneholder filteret såat filteret visper til omkretsen av røret og bufferen vasker fullt ut filteret. Hold alltid røret kaldt ved å plassere den tilbake på isen. Merk: Det kan være nødvendig å i tillegg vortex røret mens invertert for å vaske fullt bakterier av filteret.
    2. Gjenta for alle rør. Det kan være nyttig å spinne ned suspensjonen kort tid (1 min ved 120 x g) ved slutten av prosessen.
  4. Overfør den bakterieholdige buffer til et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende SDS, og fenol / kloroform blanding (som fremstilt i 2.1). Gjenta for alle rør. Det kan være nødvendig å spinne filterinneholdende rør (1 min ved 120 xg) igjen for å få restbufferen fra filteret.
  5. Legg alle de 1,5 ml rør i en multi-tube vortex enhet, og vortex i full fart i 10 min.
  6. Inkuber rørene i en 65 ° C varmeblokk i 10 min. Sentrifuger ved maksimal hastighet (> 14 000 xg) i 5 min.
  7. Overfør det vandige sjikt (ca. 400 ul) fra hver tube til et nytt 1,5 ml rør inneholdende 40 ul av 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 1,0 ml av 100% etanol. Vortex hvert rør grundig.
    Merk: Glykogen kan legges på dette trinnet for å bedre visualisering av utfelt pellet.
  8. Inkuber prøvene ved -80 ° C i 1 time. Alternativt inkubere prøvene ved -20 ° C over natten. Deretter, sentrifugere prøvene ved 4 ° C i 20 minutter ved maksimal hastighet (> 14.000 xg).
  9. Nøye aspireres av etanol (øvre lag) fra hvert rør. Legg 500 ul kald 70% etanol til hver prøve og virvle grundig. Sentrifuge ved 4 ° C i 20 minutter ved maksimal hastighet (> 1 4000 xg).
  10. Nøye aspireres av etanol fra hvert rør. Tørk prøvene i ca. 2 min ved anvendelse av en vakuumfordamper uten varme. Ikke over-tørke prøvene.
  11. Tilsett 25 ul RNase-fritt vann til hver prøve. Inkuber ved romtemperatur i 20 min. Nøye vortex og spin-ned.
  12. Mål RNA konsentrasjon i than prøver ved hjelp av en microvolume UV-Vis spektrofotometer. Forvente å ekstrahere omtrent 0,5 til 1 ug av nukleinsyrer pr plate.
    Merk: Teknisk replikater kan bli kombinert på dette stadiet.

3. DNase Treatment

  1. Sett opp reaksjonsblandingen i henhold til tabell 1 i et mikrosentrifugerør. Inkuber ved 37 ° C i 45 min. Legg 450 ul RNase-fritt vann og 500 mL av fenol-kloroform-IAA blanding (tabell 2), separate faser etter sentrifugering i 2 minutter ved maksimal hastighet (> 14.000 xg).
  2. Overfør det vandige lag til et nytt rør og tilsett 500 ul kloroform-IAA blanding (tabell 2), Vortex og separate faser etter 2 min sentrifugering ved maksimal hastighet (> 14.000 xg).
  3. Overfør det vandige lag til et nytt rør og tilsett 1 ml etanol og 50 pl av 3 M natriumacetat (pH 5,2). Vortex.
    Merk: Glykogen kan legges på dette trinnet for å bedre visualisering av utfelt pellet.
  4. Nøye aspireres av etanol fra hvert rør. Legg 500 ul kald 70% etanol til hver prøve og virvle grundig. Sentrifuge ved 4 ° C i 20 minutter ved maksimal hastighet. Nøye aspireres av etanol fra hvert rør.
  5. Tørk prøvene i ca. 2 min ved anvendelse av en vakuumfordamper uten varme. Ikke over-tørke prøvene.
  6. Tilsett 12 pl RNase-fritt vann, inkuberes i 2 minutter ved romtemperatur, vortex, og spinn-ned. Prøvene inneholder renset RNA, holde dem på is. Alternativt kan oppløse RNA i RNase-fritt H2O med 0,1 mM EDTA eller TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
  7. Mål RNA-konsentrasjoner ved hjelp av en microvolume UV-Vis spektrofotometer. Forvent ~ 100 ng av RNA per prøve (hvis tekniske replikater kombineres).
    Merk: RNA ekstrahert i henhold til denne protokollen er egnet for gentranskripsjon analyse av flere teknikker. Vi benytter vanligvis RT-qPCR analyse for å studere L. monocytogenes gentranskripsjon ved infeksjon av makrofagceller 1-4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Modellsystemet er vist i figur 1 og omfatter makrofag-celler infisert med L. monocytogenes bakterier, som replikerer i makrofag cytosol. Figur 2 representerer forsøksordning. Figur 3 viser typiske resultater av en slik RT-qPCR analyse av virulens gener under WT L. monocytogenes vekst i makrofager i forhold til vekst i rike laboratorium medium BHI. Resultatene viser transkripsjonsnivåer to viktige virulensfaktorer L. monocytogenes; hly koding LLO toksin og Acta koding aktin montering protein, som er robust indusert ved infeksjon av makrofager.

Figur 1
Figur 1: Generell Oversikt over L. monocytogenes Lifestyle som jegntracellular Patogen. L. monocytogenes invaderer vertsceller ved å uttrykke spesialiserte proteiner betegnet internalins som induserer aktiv internalisering til ikke-fagocyttiske celler, mens fagocytiske celler fagocyttere bakterier. Ved invasjon, L. monocytogenes er opprinnelig funnet i en endosomet / phagosome vacuole som det raskt unnslipper ved hjelp primært listeriolysin O toksin (LLO). Innenfor vertscellen cytosol L. monocytogenes replikerer seg raskt, og sprer seg fra celle til celle ved hjelp av aktin basert motilitet via sin ACTA protein. Alle nevnte virulensfaktorer er regulert av master virulens aktivator, PrfA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: En Flow Diagram Representerer Experimental Prosedyre. Hovedtrinnene omfatter lysering av infiserte celler, separasjon av vertsceller kjerner og bakterieceller og RNA isolering. Kritiske trinn er illustrert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Transkripsjon Analyse av virulens gener under L. monocytogenes Intracellulær Vekst. transkripsjon analyse av hly genet (koder LLO) og Acta genet under L. monocytogenes 10403S intracellulær vekst i makroceller på 6 timer etter infeksjon i forhold til sine nivåer under eksponentiell vekst i BHI medium ved hjelp av RT-qPCR analyse. Transkripsjonsnivå er representert som relativ mengde (RQ), relativtil transkripsjons nivåer under vekst i BHI. Transkripsjonsnivåer ble normalisert til nivåer av 16S rRNA som en referanse genet. Dataene er representative for 3 uavhengige biologiske gjentagelser (N = 3). Feilfelt representerer 95% konfidensintervall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

RNA opp til 2 ug (i maksimalt volum på 44 ul)
10x DNase buffer 5 pl
RNase-fritt vann komplett til 50 pl totalt volum
DNAse 1 pl (1 enhet)

Tabell 1: DNase Reaksjon protokoll.

1. 500 ml BMDM + Pen-strep media (Filter sterilisert):
DMEM 235 ml
FBS (inaktivert 30 minutter ved 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929 kondisjonert medium) 19 150 ml
glutamin 5 ml
natriumpyruvat 5 ml
B-merkaptoetanol 0,5 ml
Penicillin / streptomycin 5 ml
Total 500 ml
2. 500 ml BMDM (Filter sterilisert):
DMEM 235 ml
FBS (inaktivert 30 minutter ved 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929 kondisjonert medium) 19 150 ml
glutamin 5 ml
natriumpyruvat 5 ml
B-merkaptoetanol 0,5 ml
Total 500 ml
3. AE buffer
NaOAc pH 5,2 50 mm
EDTA 10 mm
RNase-fritt vann
4. fenol-kloroform-IAA
fenol 25 ml
kloroform 24 ml
Iso-amylalkohol 1 ml
5. kloroform-IAA
kloroform 24 ml
Iso-amylalkohol 1 ml

Tabell 2: Oppskrifter av Media og buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen er beskrevet her representerer en optimalisert fremgangsmåte for isolering av bakterie RNA fra L. monocytogenes bakterier vokser intracellulært i makroceller. Denne protokollen er basert på celle differensiallyse og innbefatter to viktige trinn for anrikning av bakterielle RNA: makrofag kjerner sedimentering ved hjelp av sentrifugering og en hurtig samling av bakterier ved filtrering. Disse trinnene følges av en standard RNA-ekstraksjon prosedyre. Mens denne protokollen beskriver rensing av listerial RNA, kan den lett modifiseres til andre bakterielle patogener. Selv om fremgangsmåten fokuserer på rensing av RNA-transkripsjonen for analyse, kan det prinsipp som brukes for å separere de intracellulært voksende bakterier fra sin vert også anvendes for rensing av andre bakterielle komponenter, for eksempel DNA, proteiner, cellevegg, etc. Slike genomisk og biokjemiske analyser ville gi en bedre forståelse og karakterisering av det intracellulære patogenelivssyklus i løpet av infeksjonen.

Prosedyren gir ~ 100 ng av total bakteriell RNA. Selv om RNA-utbyttene forholdsvis lave, er de egnet for nedstrøms analyser av gen-transkripsjon ved bruk av flere teknikker, for eksempel RT-qPCR, RNA-Seq og moderne hybridiserings-baserte teknologier. For å forbedre RNA avkastning, er det anbefalt å bruke friske bakterie Inokulant, samt frisk fenol løsning nukleasefritt vann og buffere for å unngå mulige RNase forurensing. Høstet bakterier og isolerte RNA bør alltid holdes på is under utpakkingen. Infeksjonen Tiden kan justeres avhengig av den biologiske spørsmål og organismen studert. For å øke mengdene av RNA, kan eksperimentet skaleres opp til å omfatte flere infeksjons plater per hver prøve.

Hovedproblemet ved utføring av et slikt eksperiment er risikoen for å endre profilen transkripsjon av bakterier under høstetrinn. De fleste bakterielleia svare på lave temperaturer ved å aktivere kuldesjokk stressreaksjoner, og således bakterielt høstingen bør utføres så raskt som mulig. Reagenser og utstyr bør være forberedt på forhånd, og hver prøve bør behandles separat. Den mest kritiske trinn er å umiddelbart fryse filter-holdige bakterier i flytende nitrogen. Hvis du ikke gjør det, kan dramatisk redusere kvaliteten på den isolerte RNA. Et annet kritisk punkt i denne protokollen er den etanolutfelling av de relativt små mengder av nukleinsyrer. Ekstra forsiktighet bør utvises for ikke å forstyrre den usynlige nukleinsyrer pellet. Glykogen kan tilsettes til utfellingen løsning for å forbedre synliggjøring av pellet i løpet av denne fremgangsmåten.

For noen senere søknader, for eksempel, RT-qPCR, fjerne DNA er kritisk. Selv om vi ikke rutinemessig overvåke effektiviteten av DNase-behandling, en reduksjon på 3 - 5 ganger i den totale mengden av nukleinsyrer etter DNase treatment er indikativ for effektiv DNase-behandling. Av notatet, er enhver kommersielt tilgjengelig teknikk eller kit for DNA fjerning fra RNA prøver egnet. I tillegg, ved bruk av kvalitetskontroll prøver, for eksempel en prøve med ingen revers transkripsjon utført, er nyttig i slike anvendelser.

En vesentlig begrensning av protokollen som er beskrevet her er den relativt lave mengden av RNA ekstrahert, som er omtrent 100 ng av total RNA. Dermed er denne teknikk ikke er egnet for klassiske hybridiseringsteknikker, slik som Northern blot-analyse, noe som krever mikrogram RNA.

Den nylige teknologiske fremskritt i RNA-sekvensering (dyp RNA-seq) muliggjør analyse av både bakterielle patogenet og pattedyrvertstranskripsjons profilene sammen, uten behov for å separere sine RNA, en metode kalt "dual RNA-seq '16-18. Selv om dual RNA-seq analyse er ideell i å studere host-patogen interaksjoner, er det svært expensive og kan ikke brukes ofte. Fordi bakterielle RNA-innhold i infiserte celler er meget lav, er det svært vanskelig og kostbart å få nok bakteriell står for et effektivt genekspresjon analyse, selv med den høye lese dybde levert av nyeste sekvense plattformer. En ytterligere ulempe med denne tilnærmingen er den hyppige anvendelse av et RNA eller cDNA forsterkningstrinn, som kan føre til forspente resultatene av genekspresjon. Metoden som presenteres her gir et kompromiss mellom informasjon som er innhentet og kostnadseffektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Listeria monocytogenes 10403S 20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice 21
H2O, RNAse free Thermo Scientific 10977-015 DEPC-treated water can be used
DMEM Gibco 41965039
Glutamine Gibco 25030081
Sodium pyruvate Gibco 11360-088
β-Mercaptoethanol Gibco 31350010
Pen/Strep Gibco 15140-122
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
FBS Gibco 10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS Sigma-Aldrich D8537
Brain heart infusion (BHI) Merckmillipore 1104930500
Phenol saturated pH 4.3 Fisher BP1751I-400
Chloroform Fisher BP1145-1
Iso-amyl alcohol Sigma-Aldrich W205702
Sodium acetate Sigma-Aldrich W302406
EDTA Sigma-Aldrich EDS
DNaseI Fermentas EN0521
SDS 10% Sigma-Aldrich L4522
Ethanol absolute Merck Millipore 1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator Thermo Scientific Model 3111
Cell scrapers Nunc 179693
Kontes glass holder for 45 mm filters Fisher K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm Merck Millipore HAWP04700
SpeedVac system Thermo Scientific SPD131DDA
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Model G560E
NanoDrop Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes Greiner 639 160
1.7 ml tubes, RNase-free Axygen MCT-175-C
30 °C incubator Thermo Scientific
65 °C heat block Thermo Scientific
4 °C table centrifuge Eppendorf 5417R
Sterile pipettes, 25 ml Greiner
Falcon tubes, 50 ml Greiner
Liquid nitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. (2014).
  2. Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
  3. Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
  4. Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
  5. World Health Organization WHO. http://www.who.int/en/ (2005).
  6. Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
  7. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  8. Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
  9. Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
  10. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
  11. Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
  12. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  13. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
  15. La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
  16. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
  17. Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
  18. Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
  19. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
  20. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
  21. Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
RNA Purification fra intracellulært Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).More

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter