Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

РНК Очистка от внутриклеточно Grown doi: 10.3791/54044 Published: June 4, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Внутриклеточные бактериальные патогены ─ бактерии , вызывающие инфекционные заболевания и способны расти и воспроизводить внутри клеток человека хозяев ─ являются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире 5. Для того, чтобы вторгнуться и размножаться внутри клетки млекопитающих, внутриклеточные патогены приобрели сложные механизмы вирулентности и факторы. В то время как эти механизмы имеют основополагающее значение для способности вызывать заболевание, мы мало знаем о их регуляции и динамики знают. Так как профили экспрессии генов бактерий, выращенных в жидких средах, не отражают реальную среду внутри клеток-хозяев, существует растущая потребность в транскриптома анализа бактерий, выращенных в их внутриклеточных ниш. Такой анализ позволит расшифровку специфических бактериальных адаптаций сработавших хозяином и поможет определить новые цели для терапевтического дизайна. Транскриптом анализ внутриклеточно выращенных бактерий является весьма сложной задачей, поскольку РНК млекопитающих превышает число бактерий РНК вкак минимум в десять раз. В этой рукописи мы опишем экспериментальный метод для выделения бактериальной РНК из листерий бактерий , растущих внутри мышиных клеток макрофагов. Извлеченный РНК может быть использован для изучения внутриклеточных адаптации и вирулентность механизмов патогенных бактерий с помощью различных методик анализа транскрипции, таких как RT-PCR, РНК-Seq, микрочипов и других гибридизацией на основе технологий.

L. моноцитогенес является возбудителем листериоза у людей, заболевание с клиническими проявлениями , ориентированных в первую очередь лица с ослабленным иммунитетом, пожилых людей и беременных женщин 6. Это является грамположительных факультативным внутриклеточным патогеном , который вторгается широкий спектр клеток млекопитающих , которые были использованы на протяжении десятилетий в качестве модели в хозяин-патоген взаимодействий изучает 7. После вторжения, он находится первоначально в вакуоли или фагосому (в случае фагоцитирующих клеток), из которых он должен уйти в тон пройдет цитозоль клетки для репликации. Несколько факторов вирулентности было показано, опосредует процесс утечки, в первую очередь в качестве порообразующего гемолизин, Listeriolysin O (ДСО) и два дополнительных фосфолипаз 8. В цитоплазме бактерии используют хозяина машины полимеризации актина , чтобы продвинуть себя на актиновых филаментов внутри клетки и передается от клетки к клетке (Рисунок 1). Все основные факторы вирулентности L. моноцитогенес , участвующие в инвазии, внутриклеточного выживания и репликации, активируются с помощью регулятора транскрипции мастер вирулентности, PrfA. 8-10.

В последнее десятилетие было проведено несколько исследований , проведенных нами и другие успешно применяются методы транскриптом анализа внутриклеточно выращенных бактерий внутри клеток хозяина 2,11-15. Два основных подхода используются для разделения бактериальной РНК из хозяина-РНК, которые основаны на: 1) селективное обогащение бактериальной РНК и 2) выделения РНК по сиситемахrential лизис клеток. Первый подход основан на субтрактивном гибридизации общих экстрактов РНК молекулы РНК млекопитающих (например , с использованием коммерчески доступных наборов) или селективного захвата бактериальных последовательностей транскрибируемых (шотландцы) 11. Второй подход основан на дифференциальном лизис бактерий и клеток-хозяев, в котором клетки-хозяева лизируют в то время как бактериальные клетки остаются нетронутыми. Бактериальные клетки затем отделяют от клетки-хозяина лизата, как правило, путем центрифугирования, и РНК экстрагируют с использованием стандартных методик. Основная проблема с использованием этого подхода является то, что вместе с интактной бактерии, клетки-хозяева ядра также изолированы, таким образом, препараты РНК по-прежнему содержат РНК млекопитающих. Один из способов решения этой проблемы заключается в разделении неповрежденные бактерии из клеток хозяина, ядер с использованием дифференциального центрифугирования, хотя эта процедура обычно занимает много времени поднимая беспокойство изменений в гене профиля экспрессии в процессе экстракции. В этой статье мы представляем улучшенный и быстрый баПротокол экстракции cteria РНК, которая основана на клеточной дифференциального лизиса подхода. Во- первых, Л. моноцитогенес инфицированные макрофаги клетки лизируют с холодной водой. Затем макрофаг ядра удалены кратковременным центрифугированием и неповрежденные бактерии быстро собирают на фильтрах, из которых РНК выделяют с помощью горячей экстракции фенолом-SDS бактериальных нуклеиновых кислот.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Примечание: В течение всего эксперимента, макрофаг клетки инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 приточно-инкубаторе и вынимали из инкубатора только для экспериментальных манипуляций, которые выполняются в кабинете биологической безопасности класса II. Работа с L. моноцитогенес бактерии в соответствии с биологическим уровнем безопасности 2 правил.

1. Сотовый Подготовка и бактериальные инфекции (день 1 и 2)

  1. 1 день
    1. Семенной 2,0 х 10 7 из костного мозга макрофаги (клетки BMDM) на 145 мм чашку в 30 мл BMDM + Pen-Strep средах (таблица 2). Семенной 3 пластины для каждого бактериального штамма, чтобы быть проанализированы. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 приточно-инкубаторе.
    2. Начало ночной бактериальной культуры дикого типа (WT) L. моноцитогенес штамм 10403S в 10 мл мозга и сердца вливание (BHI) среды, при температуре 30 ° C в стандартном инкубаторе. Место культуры трубки наклонены без встряхивания. Заметка:Эти условия роста вверх-регулируют экспрессию генов жгутиков, что способствует эффективной инфекции.
  2. День 2
    1. Предварительно теплая BMDM среда (без Пен-Strep антибиотиков) (Таблица 2) и забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) , при 37 ° С.
    2. Вымойте макрофагами монослой дважды 25 мл подогретого PBS для удаления антибиотики. Добавьте 30 мл свежей BMDM среды.
    3. Промыть 1,5 мл ночной бактериальной культуры с PBS при центрифугировании бактерии при> 14.000 х г в течение 1 мин, отбрасывая супернатант и ресуспендирования бактерий осторожно в 1,5 мл PBS с помощью пипетки. Повторите дважды.
    4. Infect каждую макрофага пластину с 0,5 мл промытого ночной культуры дикого типа L. моноцитогенес. При использовании нескольких пластин, заражает каждую пластину 15 минут друг от друга. Этот временной интервал позволит заготовки каждой пластины индивидуально в конце инфекции.
      Примечание: множественность инфекции (MOI) анализируют при посеве серийным разведениемс бактериальной культуры использовали для инфицирования на чашках с BHI и подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) после 24 ч инкубации планшетов при 37 ° С. С использованием 0,5 мл WT L. моноцитогенес напрягать 10403S результаты в УМВД ~ 100 (100 бактерий КОЕ на макрофагальной клетки). При анализе бактериальных мутантов дефектные в внутриклеточного роста, выше MOI следует рассмотреть.
    5. После 0,5 ч инкубации при температуре 37 ° С, промыть инфицированные клетки дважды с PBS, чтобы удалить неприкрепленные бактерии, и добавляют 30 мл подогретого BMDM среды. Прикрепленные бактерии будут усваивать в течение следующего 0,5 ч.
    6. Через 1 ч после инфицирования, добавить 30 мкл гентамицина (1: 1000 до конечной концентрации 50 мкг / мл), чтобы убить внеклеточные бактерии.
    7. Сборка устройства фильтра путем размещения головки фильтра на накопительную колбу жидкости с вакуумным выпускным отверстием. Затем поместите фильтр (0,45 мкм) на головке фильтра, а затем с помощью цилиндра воронки и креплению различных частей с металлической Cлампа. Подготовьте ледяную РНКазы воду.
    8. Через 6 ч после инфицирования, урожай бактерий из инфицированных клеток следующим образом. Рассматривать каждую тарелку по отдельности.
      Примечание: Как правило, L. моноцитогенес завершает 1-журнал роста в течение 6 ч инфекции в клетках макрофагов. Более длинные инкубирование может привести к бактериальному росту и гибели клеток макрофагов, в то время как более короткие периоды инкубации может привести к значительно более низкие бактериальной нагрузки. MOI и время инфицирования могут быть изменены, чтобы достичь оптимальных условий.
      1. Промыть инфицированные клетки с PBS один раз. Добавьте 20 мл охлажденного на льду не содержащей РНКазы воды, чтобы лизировать клетки макрофагов. Использование сотового скребок, скрести клетки от пластины быстро, но осторожно.
      2. Сбор лизированных клеток в коническую пробирку на 50 мл. Vortex в течение 30 сек. Центрифуга при 800 х г в течение 3 мин при температуре 4 ° С.
      3. Пропускают супернатант через устройство фильтра с использованием вакуумной системы. С помощью пинцета, катить фильтр и быстро перенести его на 15 мл Coniкал трубки. Оснастка замерзают трубы с фильтрами в жидком азоте.
      4. Собирают устройство с фильтрующей новым фильтром для следующего образца, как описано в разделе 1.2.7.
      5. Хранить замороженные фильтры при температуре -80 ° С в течение следующего дня. В качестве альтернативы, перейдем непосредственно к экстракции нуклеиновой кислоты.

2. нуклеиновые кислоты экстракции (3-й день)

Примечание: Выполнить все манипуляции с фенолом и хлороформом растворов в вытяжном шкафу.

  1. Готовят смесь 1: 1 подкисленного фенол: хлороформ, 400 мкл каждого образца. Смешайте в отдельные пробирки, а затем вывести полученный водный слой с помощью аспирации. Добавьте 40 мкл 10% SDS.
  2. Растаяйте фильтров, содержащих пробирки на лед, чтобы держать их холодно. Для каждого фильтра , содержащего пробирку добавляют 650 мкл ацетатного-ЭДТА (АЭ) буфера (таблица 2).
  3. Выполните следующие шаги как можно быстрее.
    1. Энергично вихрь трубки, содержащей фильтр таким образом,что фильтр венчиков к периферии трубы и буфер полностью промывает фильтр. Всегда держите трубки с холодным, поместив его на льду. Примечание: Может возникнуть необходимость дополнительно вихревой трубки в то время как перевернутая, чтобы полностью вымыть бактерии из фильтра.
    2. Повторите эти действия для всех труб. Может быть полезным, чтобы спин-вниз подвеску коротко (1 мин при 120 х г) в конце процесса.
  4. Перенести бактерии-содержащий буфер в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую ДДС и фенол / хлороформ смеси (полученного в 2.1). Повторите эти действия для всех труб. Это может быть необходимо, чтобы закрутить фильтр, содержащий трубы (1 мин при 120 х г) еще раз, чтобы получить остаточный буфер из фильтра.
  5. Поместите все в 1,5 мл трубки в вихревом устройстве с несколькими трубками и завихрение на полной скорости в течение 10 мин.
  6. Инкубировать пробирки в тепловой блок 65 ° C в течение 10 мин. Центрифуга на максимальной скорости (> 14 000 XG) в течение 5 мин.
  7. Перенести водный слой (около 400 мкл) из каждого тUbe к новой 1,5 мл пробирку, содержащую 40 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 1,0 мл 100% этанола. Vortex каждую пробирку тщательно.
    Примечание: Гликоген могут быть добавлены на данном этапе, чтобы улучшить визуализацию осажденного гранул.
  8. Инкубируйте образцы при -80 ° С в течение 1 часа. В качестве альтернативы, инкубировать образцов при -20 ° С в течение ночи. Затем, Центрифуга образцов при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости (> 14 000 XG).
  9. Тщательно аспирата от этанола (верхний слой) из каждой пробирки. Добавить 500 мкл холодного 70% этанола к каждому образцу и вихре тщательно. Центрифуга при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости (> 1 4000 XG).
  10. Тщательно аспирата от этанола из каждой пробирки. Сухие образцы в течение примерно 2 мин с использованием вакуумного испарителя без отопления. Не пересушивайте образцы.
  11. Добавьте 25 мкл РНКазы без воды к каждому образцу. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Аккуратно вихря и спин-вниз.
  12. Измерение концентрации РНК в тон пробует, используя микрообъем UV-Vis спектрофотометр. Ожидать добывать около 0,5 - 1 мкг нуклеиновых кислот на чашку.
    Примечание: Технические повторностях могут быть объединены на данном этапе.

3. ДНКазы Лечение

  1. Настройка реакции в соответствии с таблицей 1 , в пробирке. Инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин. Добавить 450 мкл РНКазы воды и 500 мкл фенолхлороформом-МАА смеси (таблица 2), отдельные фазы центрифугированием в течение 2 мин при максимальной скорости (> 14 000 XG).
  2. Передача водного слоя в новую пробирку и добавляют 500 мкл хлороформа-МАА смеси (таблица 2), вихревые и отдельные фазы 2 мин центрифугированием при максимальной скорости (> 14 000 XG).
  3. Передача водного слоя в новую пробирку и добавляют 1 мл этанола и 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2). Vortex.
    Примечание: Гликоген могут быть добавлены на данном этапе, чтобы улучшить визуализацию осажденного гранул.
  4. Тщательно аспирата от этанола из каждой пробирки. Добавить 500 мкл холодного 70% этанола к каждому образцу и вихре тщательно. Центрифуга при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости. Тщательно аспирата от этанола из каждой пробирки.
  5. Сухие образцы в течение примерно 2 мин с использованием вакуумного испарителя без отопления. Не пересушивайте образцы.
  6. Добавьте 12 мкл РНКазы воды, инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре, вихревые и спин-вниз. Образцы содержат очищенный РНК, держать их на льду. В качестве альтернативы, растворить РНК в РНКазы H 2 O с 0,1 мМ ЭДТА или ТЕ - буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА).
  7. Измерение концентрации РНК с использованием микрообъем UV-Vis спектрофотометр. Ожидать ~ 100 нг РНК на образец (если технические повторности объединены).
    Примечание: РНК экстрагировали в соответствии с этим протоколом подходит FOг анализ транскрипцию генов несколькими способами. Как правило , мы используем анализ RT-КПЦР для изучения L. моноцитогенес транскрипцию генов при заражении клеток макрофагов 1-4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Система модель показана на фиг.1 , и включает в себя клетки макрофагов инфицированных L. моноцитогенес бактерии, которые копируют в цитоплазме макрофага. Рисунок 2 представляет собой схему эксперимента. На рисунке 3 представлены типичные результаты такого анализа RT-КПЦР генов вирулентности во время WT L. моноцитогенес рост макрофагов по сравнению с ростом в богатых лабораторной среде BHI. Результаты показывают уровни транскрипции двух основных факторов вирулентности L. моноцитогенес; HLY кодирующий LLO токсин и ACTA , кодирующий белок актин сборки, которые энергично индуцируется при заражении макрофагов.

Рисунок 1
Рисунок 1: Общий обзор L. моноцитогенес Образ жизни как Intracellular Возбудитель. Л. моноцитогенес вторгается клетки - хозяева , экспрессией специализированные белки называют internalins , которые вызывают активную интернализацию в не-фагоциты, в то время как фагоциты фагоцитируют бактерии. После вторжения, Л. моноцитогенес первоначально найден в пределах эндосомы / фагосом вакуоли , из которого она быстро сбегает с использованием в первую очередь токсин listeriolysin O (ДСО). Внутри клетки - хозяина цитозоле L. моноцитогенес быстро размножается и распространяется от клетки к клетке с помощью моторики на основе актина с помощью своего белка Acta. Все указанные факторы вирулентности регулируются мастером вирулентности возбудителя, PrfA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Блок - схема Представление Experimental Процедура. Основные этапы включают лизис инфицированных клеток, отделение клеток хозяина ядер и клеток бактерий и выделения РНК. Критические шаги показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Транскрипция Анализ вирулентности генов во время L. моноцитогенес внутриклеточный рост. Транскрипция анализ гена HLY (кодирование ДСО) и гена Acta во время L. моноцитогенес 10403S внутриклеточный рост клеток макрофагов через 6 часов после инфицирования по сравнению с их уровнем во время экспоненциального роста в BHI среде с использованием анализа RT-КПЦР. Уровни транскрипции представлены в виде относительной величины (RQ), относительныйна уровни транскрипции в процессе роста в BHI. Уровни транскрипции были нормализованы к уровням 16S рРНК в качестве контрольного гена. Данные представитель 3-х независимых биологических повторами (N = 3). Усы представляют собой 95% доверительный интервал. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

РНК до 2 мкг (в максимальном объеме 44 мкл)
10X буфера ДНКазы 5 мкл
РНКазы вода Полный до 50 мкл общий объем
ДНКазы 1 мкл (1 единица)

Таблица 1: Протокол ДНКазы реакции.

1. 500 мл BMDM + Pen-Strep носитель (стерилизуют):
DMEM 235 мл
ФБС (инактивированная 30 мин при 54 ° C) 100 мл
M-CSF (L-929 кондиционированная среда) 19 150 мл
глутамин 5 мл
пируват натрия 5 мл
-меркаптоэтанола 0,5 мл
Пенициллин / стрептомицин 5 мл
Всего 500 мл
2. 500 мл BMDM (стерилизуют):
DMEM 235 мл
ФБС (инактивированная 30 мин при 54 ° C) 100 мл
M-CSF (L-929 кондиционированная среда) 19 150 мл
глутамин 5 мл
пируват натрия 5 мл
-меркаптоэтанола 0,5 мл
Всего 500 мл
3. Буфер AE
NaOAc рН 5,2 50 мМ
ЭДТА 10 мМ
РНКазы вода
4. фенол-хлороформ-МАА
Фенол 25 мл
Хлороформ 24 мл
Изо-амиловый спирт 1 мл
5. хлороформ-IAA
Хлороформ 24 мл
Изо-амиловый спирт 1 мл

Таблица 2: Рецепты СМИ и буферами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол , описанный здесь , представляет собой оптимизированный способ выделения бактериальной РНК из L. моноцитогенес бактерии растущих внутриклеточно в клетках макрофагов. Этот протокол основан на лизисе клеток дифференциального и включает в себя два основных шага для обогащения бактериальной РНК: макрофагальной ядер седиментации центрифугированием и быстрое скопление бактерий путем фильтрации. Эти шаги выполняются с помощью стандартной процедуры экстракции РНК. В то время как этот протокол описывает очистку listerial РНК, она может быть легко модифицирована для других бактериальных патогенов. Хотя метод фокусируется на очистке РНК для транскрипционного анализа, принцип , используемый для разделения внутриклеточно растущих бактерий с животного- хозяина также могут быть применены для очистки других бактериальных компонентов, таких как ДНК, белки, клеточную оболочку и т.д. Такие геномные и биохимические анализы бы обеспечить лучшее понимание и определение характеристик внутриклеточным патогеномЖизненный цикл в течение инфекции.

Результаты процедуры в ~ 100 нг общей бактериальной РНК. Хотя урожайность РНК являются относительно низкими, они пригодны для последующих анализов транскрипции генов с использованием нескольких методов, таких как RT-КПЦР, РНК-Seq и современных технологий на основе гибридизации. Для повышения урожайности РНК, рекомендуется использовать свежие бактериальные посевного, а также свежего раствора фенола нуклеазы без воды и буферов, чтобы избежать возможных загрязнений РНКазы. Заготовленные бактерии и Выделенную РНК должна быть всегда держали на льду в течение процесса экстракции. Время инфекции может быть отрегулирована в зависимости от биологического вопроса и организм изучен. Для увеличения количества РНК, то эксперимент можно масштабировать до включать больше инфекции пластин в каждом образце.

Основной проблемой при проведении такого эксперимента является риск изменения профиля транскрипции бактерий на стадиях сбора урожая. Наиболее BacterИ. реагируют на низкие температуры, активизируя холодные ответные реакции на стресс шок, и, таким образом, бактериальный заготовка должна быть выполнена как можно быстрее. Реагенты и оборудование должны быть подготовлены заранее, и каждый образец должен рассматриваться отдельно. Наиболее важным шагом является немедленно заморозить содержащей фильтр бактерии в жидком азоте. Несоблюдение этого правила может значительно снизить качество выделенной РНК. Еще одним важным шагом в этом протоколе является осаждение этанолом из относительно небольших количеств нуклеиновых кислот. Особую осторожность следует соблюдать осторожность и не нарушать невидимую нуклеиновых кислот осадок. Гликоген может быть добавлен к раствору осаждения для улучшения визуализации гранул в течение этих этапов.

Для некоторых последующих применений, например, RT-КПЦР, удаление ДНК имеет решающее значение. Несмотря на то, что мы не регулярно контролировать эффективность лечения ДНКазы, сокращение 3 - 5 раз в общей сумме нуклеиновых кислот следующие ДНКазы тreatment является показателем эффективного лечения ДНКазы. Следует отметить, что любой коммерчески доступный метод или набор для удаления ДНК из образцов РНК подходит. Кроме того, с использованием образцов контроля качества, такие как образец, без обратной транскрипции, выполняемой, является полезным в таких приложениях.

Основным ограничением протокола, описанного здесь, является относительно небольшое количество РНК, выделенной, которая составляет около 100 нг полной РНК. Таким образом, этот метод не подходит для классических методов гибридизации, таких как Нозерн - блот - анализа, которые требуют микрограммов РНК.

Недавний технологический прогресс в РНК последовательности (глубокая РНК-сл) позволяет анализировать как бактериальным патогеном и млекопитающих профили хозяина транскрипции вместе, без необходимости разделения их РНК, метод , названный "двойной РНК-сл '16-18. Хотя двойной РНК-сл анализ идеален при изучении взаимодействия хозяин-патоген, очень дорогостоящих,е и не может быть использован часто. Поскольку содержание бактерий РНК в инфицированных клетках, в частности, низкий, крайне сложно и дорого, чтобы получить достаточно бактериальный читает для эффективного анализа экспрессии генов, даже при высокой глубины чтения представленной новейших секвенирования платформ. Дополнительным недостатком этого подхода является то, частое использование на стадии РНК или кДНК, амплификации, что может привести к смещенным результатам экспрессии генов. Метод, представленный здесь, предлагает компромисс между информацией, полученной и экономической эффективности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Listeria monocytogenes 10403S 20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice 21
H2O, RNAse free Thermo Scientific 10977-015 DEPC-treated water can be used
DMEM Gibco 41965039
Glutamine Gibco 25030081
Sodium pyruvate Gibco 11360-088
β-Mercaptoethanol Gibco 31350010
Pen/Strep Gibco 15140-122
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
FBS Gibco 10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS Sigma-Aldrich D8537
Brain heart infusion (BHI) Merckmillipore 1104930500
Phenol saturated pH 4.3 Fisher BP1751I-400
Chloroform Fisher BP1145-1
Iso-amyl alcohol Sigma-Aldrich W205702
Sodium acetate Sigma-Aldrich W302406
EDTA Sigma-Aldrich EDS
DNaseI Fermentas EN0521
SDS 10% Sigma-Aldrich L4522
Ethanol absolute Merck Millipore 1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator Thermo Scientific Model 3111
Cell scrapers Nunc 179693
Kontes glass holder for 45 mm filters Fisher K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm Merck Millipore HAWP04700
SpeedVac system Thermo Scientific SPD131DDA
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Model G560E
NanoDrop Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes Greiner 639 160
1.7 ml tubes, RNase-free Axygen MCT-175-C
30 °C incubator Thermo Scientific
65 °C heat block Thermo Scientific
4 °C table centrifuge Eppendorf 5417R
Sterile pipettes, 25 ml Greiner
Falcon tubes, 50 ml Greiner
Liquid nitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. (2014).
  2. Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
  3. Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
  4. Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
  5. World Health Organization WHO. http://www.who.int/en/ (2005).
  6. Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
  7. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  8. Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
  9. Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
  10. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
  11. Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
  12. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  13. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
  15. La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
  16. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
  17. Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
  18. Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
  19. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
  20. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
  21. Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
РНК Очистка от внутриклеточно Grown<em&gt; листерий</em&gt; В клетках макрофагальной
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).More

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter