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Immunology and Infection

La purificación del ARN intracelularmente Grown doi: 10.3791/54044 Published: June 4, 2016

Introduction

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Patógenos bacterianos intracelulares ─ bacterias causantes de enfermedades infecciosas y capaz de crecer y reproducirse dentro de las células del huésped humano ─ son un importante problema de salud en todo el mundo 5. Para invadir y replicarse dentro de una célula de mamífero, patógenos intracelulares han adquirido sofisticados mecanismos de virulencia y factores. Aunque estos mecanismos son fundamentales para la capacidad de causar una enfermedad, se sabe poco acerca de su regulación y dinámica. Desde los perfiles de expresión de genes de bacterias cultivadas en medio líquido no reflejan el entorno real dentro de células huésped, hay una necesidad creciente de transcriptoma análisis de bacterias cultivadas en sus nichos intracelulares. Estos análisis permitirán al desciframiento de adaptaciones específicas bacterianas provocadas por el anfitrión y le ayudará a identificar nuevas dianas para el diseño terapéutico. El análisis del transcriptoma de bacterias que crecen de forma intracelular es muy difícil, puesto que superan en número a ARN de mamífero ARN bacteriano por lopor lo menos diez veces. En este manuscrito, se describe un método experimental para aislar el ARN bacteriano de Listeria monocytogenes bacterias que crecen dentro de las células de macrófagos murinos. El ARN extraído se puede utilizar para estudiar las adaptaciones intracelulares y mecanismos de virulencia de las bacterias patógenas por diversas técnicas de análisis de la transcripción, tales como RT-PCR, el ARN-Seq, microarrays y otras tecnologías basadas en hibridación.

L. monocytogenes es el agente causante de la listeriosis en humanos, una enfermedad con manifestaciones clínicas dirigidas principalmente a los individuos inmunocomprometidos, ancianos y mujeres embarazadas 6. Eso es un patógeno intracelular facultativo Gram-positiva que invade una amplia gama de células de mamíferos que se han utilizado durante décadas como modelo en las interacciones huésped-patógeno estudia 7. Tras la invasión, que reside inicialmente en una vacuola o fagosoma (en el caso de las células fagocíticas), de la que debe escapar en tque acogerá citosol de la célula con el fin de replicar. Varios factores de virulencia han demostrado mediar en el proceso de escape, principalmente la hemolisina de formación de poros, listeriolisina O (LLO) y dos fosfolipasas adicionales 8. En el citosol las bacterias utilizan el anfitrión maquinaria polimerización de la actina para impulsarse en los filamentos de actina dentro de la célula y propagarse de célula a célula (Figura 1). Todos los principales factores de virulencia de L. monocytogenes involucrados en la invasión, la supervivencia intracelular y la replicación, son activados por el regulador de la transcripción de virulencia principal, PrfA. 8-10.

En la última década, varios estudios realizados por nosotros y otros han métodos para el análisis del transcriptoma de bacterias que crecen de forma intracelular aplicado con éxito dentro de las células anfitrionas 2,11-15. Dos enfoques principales se utilizan para separar el ARN bacteriano de host-RNA que se basan en: 1) el enriquecimiento selectivo de ARN bacteriana y 2) el aislamiento de ARN por difelisis celular rential. El primer enfoque se basa en la hibridación de sustracción de extractos de ARN total de las moléculas de ARN de mamífero (por ejemplo, utilizando kits disponibles en el comercio) o la captura selectiva de secuencias transcritas bacterianas (escoceses) 11. El segundo enfoque se basa en la lisis diferencial de bacterias y células huésped, en el que se lisan las células huésped mientras que las células bacterianas se mantienen intactos. Las células bacterianas se separan a continuación a partir del lisado de la célula huésped, generalmente por centrifugación, y el ARN se extrae usando técnicas estándar. El principal problema con este enfoque es que, junto con las bacterias intactas, también se aíslan células huésped núcleos, por lo tanto las preparaciones de ARN todavía contienen ARN de mamífero. Una forma de superar este problema es separar bacterias intactas de células huésped núcleos utilizando centrifugación diferencial, aunque este procedimiento por lo general toma tiempo el aumento de la preocupación de los cambios en el perfil de la expresión génica durante la extracción. En este artículo presentamos un ba mejorada y rápidaprotocolo de extracción de ARN cteria, que se basa en el enfoque de lisis diferencial de células. En primer lugar, L. monocytogenes células de macrófagos infectados se lisan con agua fría. A continuación, los núcleos de los macrófagos se eliminan mediante una breve centrifugación y bacterias intactas se recogen rápidamente en los filtros, de la que el ARN se aísla usando caliente extracción con fenol-SDS de los ácidos nucleicos bacterianos.

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Protocol

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Nota: Durante todo el experimento, las células de macrófagos se incubaron a 37 ° C en un incubador de CO2 de aire forzado 5% y sacados de la incubadora sólo para las manipulaciones experimentales, que se llevan a cabo en una cabina de seguridad biológica de Clase II. Trabajar con L. bacterias monocytogenes es de acuerdo al nivel de seguridad biológica 2 regulaciones.

1. Preparación de células y la infección bacteriana (Día 1 y 2)

  1. Día 1
    1. Células de semillas 2,0 x 10 7 de médula ósea derivadas de macrófagos (BMDM) en un plato de 145 mm en 30 ml BMDM + medios de Pen-Strep (Tabla 2). Seed 3 placas para cada cepa bacteriana a ser analizados. Incubar toda la noche a 37 ° C en una incubadora de CO2 de aire forzado 5%.
    2. Iniciar un cultivo bacteriano durante la noche de tipo salvaje (WT) L. monocytogenes 10403S cepa en 10 ml de medio de cerebro y corazón de infusión (BHI), a 30 ° C en un incubador estándar. Coloque los tubos de cultivo inclinados sin agitación. Nota:Estas condiciones de crecimiento hasta de regular la expresión de los genes flagelos, que promueve la infección eficiente.
  2. Dia 2
    1. Medio Pre-caliente BMDM (sin antibióticos Pen-Strep) (Tabla 2) y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C.
    2. Lavar monocapa de macrófagos dos veces con 25 ml de PBS precalentado para eliminar los antibióticos. Añadir 30 ml de medio fresco BMDM.
    3. Lavar 1,5 ml de cultivo bacteriano durante la noche con PBS por centrifugación las bacterias a> 14.000 xg durante 1 min, desechar el sobrenadante, y resuspendiendo las bacterias suavemente en 1,5 ml de PBS mediante pipeteo. Repetir dos veces.
    4. Infectar a los macrófagos cada placa con 0,5 ml de un cultivo de una noche de lava de tipo salvaje de L. monocytogenes. Si el uso de múltiples placas, infectar a cada placa de 15 minutos de diferencia. Este intervalo de tiempo permitirá la cosecha de cada placa individualmente al final de la infección.
      Nota: La multiplicidad de infección (MOI) se ensaya mediante siembra de diluciones en series de cultivo bacteriano usado para la infección en placas de BHI agar y contando las unidades formadoras de colonias (CFU) después de 24 hr de incubación de las placas a 37 ° C. Usando 0,5 ml de WT L. monocytogenes cepa 10403S resultados en una MOI de ~ 100 (100 UFC de bacterias por célula macrófagos). Al analizar los mutantes bacterianos defectuosos en el crecimiento intracelular, un MOI más alto debe ser considerado.
    5. Después de 0,5 horas de incubación a 37 ° C, se lavan las células infectadas dos veces con PBS, para eliminar las bacterias no unidas, y añadir 30 ml pre-calentado medio BMDM. bacterias adheridas internalicen durante el próximo 0,5 horas.
    6. A 1 h después de la infección, añadir 30 l de gentamicina (1: 1.000 para alcanzar una concentración final de 50 mg / ml) para matar las bacterias extracelulares.
    7. Montar el aparato de filtración mediante la colocación de una cabeza de filtro en un matraz de recogida de líquido con un puerto de salida de vacío. A continuación, coloque un filtro (0,45 micras) en una cabeza de filtro, seguido de un embudo de cilindro y asegurar las diferentes partes con un metal clámpara. Preparar agua libre de RNasa helada.
    8. A las 6 horas después de la infección, las bacterias de la cosecha de las células infectadas de la siguiente manera. Tratar a cada placa individual.
      Nota: Por lo general, L. monocytogenes completa 1-log de ​​crecimiento durante 6 h de infección en células de macrófagos. incubaciones más largas podrían dar lugar a la proliferación bacteriana y la muerte celular de los macrófagos, mientras que los períodos de incubación más cortos podrían resultar en cargas bacterianas considerablemente inferiores. El MOI y el tiempo de la infección pueden ser modificados para alcanzar condiciones óptimas.
      1. Lavar las células infectadas con PBS una vez. Añadir 20 ml de agua libre de RNasa enfriado con hielo para lisar células macrófagos. El uso de un rascador de células, raspar las células de la placa rápidamente, pero con cuidado.
      2. Recoger las células lisadas a un tubo cónico de 50 ml. Vortex durante 30 segundos. Centrifugar a 800 xg durante 3 min a 4 ° C.
      3. Pasar el sobrenadante a través del aparato de filtro usando un sistema de vacío. Usando las pinzas, el rollo de filtro y rápidamente la transferencia a un 15 ml CONItubo de cal. Snap-congelar los tubos con los filtros en nitrógeno líquido.
      4. Montar el aparato de filtración con un filtro nuevo para la siguiente muestra, como se describe en 1.2.7.
      5. Almacenar los filtros congelados a -80 ° C para el día siguiente. Como alternativa, proceder directamente a la extracción de ácidos nucleicos.

2. Ácidos nucleicos extracción (día 3)

Nota: Realice todas las manipulaciones con las soluciones de fenol y cloroformo en una campana de humos.

  1. Preparar una mezcla 1: 1 de fenol acidificado: cloroformo, 400 l para cada muestra. Mezclar en tubos separados, y luego retirar la capa acuosa resultante por aspiración. Añadir 40 l de 10% SDS.
  2. Descongelar los tubos que contienen filtros-en hielo para mantenerlos fríos. A cada tubo que contiene filtro de añadir 650 l de acetato-EDTA (AE) (Tabla 2).
  3. Realice los siguientes pasos lo más rápido posible.
    1. Vigorosamente vórtice el tubo que contiene el filtro paraque el filtro bate a la periferia del tubo y el tampón se lava completamente el filtro. Siempre mantenga el tubo frío colocándolo de nuevo en hielo. Nota: puede ser necesario vórtice, además, el tubo mientras invertida para lavar completamente las bacterias fuera del filtro.
    2. Repita este procedimiento para todos los tubos. Puede ser útil para hacer girar hacia abajo la suspensión en breve (1 min a 120 xg) al final del proceso.
  4. Transferir el tampón de bacterias que contienen a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene el SDS y la mezcla de fenol / cloroformo (como se preparó en 2,1). Repita este procedimiento para todos los tubos. Puede que sea necesario para hacer girar los tubos de filtro que contiene (1 min a 120 xg) de nuevo para obtener tampón residual del filtro.
  5. Coloque todos los tubos de 1,5 ml en un dispositivo de vórtice de tubos múltiples, y vórtice a velocidad máxima durante 10 min.
  6. Incubar los tubos en un bloque de calor C 65 ° durante 10 min. Centrifugar a máxima velocidad (> 14.000 xg) durante 5 min.
  7. La transferencia de la capa acuosa (aproximadamente 400 l) de cada uno tUbe a un nuevo tubo de 1,5 ml que contiene 40 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 1,0 ml de etanol al 100%. Vortex cada tubo a fondo.
    Nota: El glucógeno se puede añadir en esta etapa para mejorar la visualización de la pastilla precipitado.
  8. Incubar las muestras a -80 ° C durante 1 hr. Alternativamente, se incuban las muestras a -20 ° C durante la noche. A continuación, centrifugar las muestras a 4 ° C durante 20 min a la velocidad máxima (> 14.000 xg).
  9. aspirar cuidadosamente el etanol (capa superior) de cada tubo. Añadir etanol 500 l frío 70% a cada muestra y mezclar bien. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min a la velocidad máxima (> 1 4.000 xg).
  10. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada tubo. Secar las muestras durante aproximadamente 2 minutos usando un evaporador al vacío sin calor. No sobre-secar las muestras.
  11. Añadir 25 l de agua libre de RNasa a cada muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Con cuidado vórtice y spin-down.
  12. Medir la concentración de ARN en tél muestras usando un microtomo UV-Vis. Esperar a extraer aproximadamente 0,5 - 1 mg de ácidos nucleicos por placa.
    Nota: Técnico repeticiones se pueden combinar en esta etapa.

3. El tratamiento de DNasa

  1. Configurar la reacción de acuerdo con la Tabla 1 en un tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 45 min. Añadir 450 l de agua libre de RNasa y 500 l de fenol-cloroformo-IAA mezcla (Tabla 2), fases separadas por centrifugación durante 2 minutos a velocidad máxima (> 14.000 xg).
  2. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo y añadir 500 l de cloroformo-IAA mezcla (Tabla 2), mezclar y fases separadas por centrifugación de 2 minutos a velocidad máxima (> 14.000 xg).
  3. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo y añadir 1 ml de etanol y 50 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2). Vórtice.
    Nota: El glucógeno se puede añadir en esta etapa para mejorar la visualización de la pastilla precipitado.
  4. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada tubo. Añadir etanol 500 l frío 70% a cada muestra y mezclar bien. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min a velocidad máxima. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada tubo.
  5. Secar las muestras durante aproximadamente 2 minutos usando un evaporador al vacío sin calor. No sobre-secar las muestras.
  6. Añadir 12 l de agua libre de RNasa, se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente, vórtice, y spin-down. Las muestras contienen ARN purificado, los mantienen en hielo. Como alternativa, disolver ARN en RNasa libre de H 2 O con EDTA 0,1 mM o tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM).
  7. Medir las concentraciones de ARN usando un microtomo UV-Vis. Esperar ~ 100 ng de RNA por muestra (si se combinan técnica repeticiones).
    Nota: el ARN extraído de acuerdo con este protocolo es adecuado for análisis de transcripción génica mediante múltiples técnicas. Por lo general, empleamos el análisis RT-qPCR para estudiar L. monocytogenes la transcripción de genes durante la infección de las células de macrófagos 1-4.

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Representative Results

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El sistema modelo se muestra en la Figura 1 e incluye células de macrófagos infectados con L. monocytogenes bacterias, que se replican en el citoplasma de los macrófagos. La figura 2 representa el esquema experimental. La figura 3 representa los resultados típicos de tales análisis de RT-qPCR de genes de virulencia durante WT L. monocytogenes en los macrófagos en comparación con el crecimiento en medio rico laboratorio BHI. Los resultados muestran los niveles de transcripción de dos importantes factores de virulencia de L. monocytogenes; Hly que codifica la toxina LLO y actA que codifica proteína de ensamblaje de actina, que se inducen con firmeza a la infección de los macrófagos.

Figura 1
Figura 1: Visión general de L. monocytogenes estilo de vida como yontracellular patógeno. L. monocytogenes invade las células huésped mediante la expresión de proteínas especializadas internalinas que inducen la internalización activo en células no fagocíticas, mientras que las células fagocíticas fagocitan las bacterias denominadas. Tras la invasión, L. monocytogenes se encuentra inicialmente dentro de una vacuola endosoma / fagosoma de los que escapa rápidamente utilizando principalmente la toxina listeriolisina O (LLO). Dentro de la célula huésped citosol L. monocytogenes se replica rápidamente y se propagan de célula a célula usando basada en la motilidad actina a través de su proteína ACTA. Todos los factores de virulencia mencionados son regulados por el activador de virulencia principal, PrfA. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: un diagrama de flujo En representación de la ExpProcedimiento erimental. Las principales medidas incluyen la lisis de las células infectadas, la separación de las células huésped núcleos y células de las bacterias y el aislamiento de ARN. Los pasos críticos están ilustrados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Análisis de la transcripción de genes de virulencia durante L. El crecimiento intracelular monocytogenes. El análisis de la transcripción del gen Hly (que codifica LLO) y del gen actA durante L. monocytogenes 10403S crecimiento intracelular en las células de macrófagos en 6 horas después de la infección en comparación con sus niveles durante el crecimiento exponencial en medio BHI usando análisis RT-qPCR. los niveles de transcripción se representan como cantidad relativa (RQ), relativaa los niveles de transcripción durante el crecimiento en BHI. los niveles de transcripción se normalizaron a los niveles de 16S rRNA como un gen de referencia. Los datos son representativos de 3 repeticiones biológicos independientes (n = 3). Las barras de error representan el 95% intervalo de confianza. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ARN hasta 2 g (en volumen máximo de 44 l)
10x tampón ADNasa 5 l
agua libre de RNasa completa a 50 l de volumen total de
DNAsa 1 l (1 unidad)

Tabla 1: Protocolo de Reacción DNasa.

1. 500 ml BMDmedios M + Pen-Strep (esterilizado por filtración):
DMEM 235 ml
FBS (inactivado por 30 min a 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929 medio acondicionado) 19 150 ml
glutamina 5 ml
piruvato de sodio 5 ml
ß-mercaptoetanol 0,5 ml
Penicilina / estreptomicina 5 ml
Total 500 ml
2. 500 ml BMDM (esterilizado por filtración):
DMEM 235 ml
FBS (inactivado por 30 min a 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929 medio acondicionado) 19 150 ml
glutamina 5 ml
piruvato de sodio 5 ml
ß-mercaptoetanol 0,5 ml
Total 500 ml
3. tampón AE
NaOAc pH 5,2 50 mM
EDTA 10 mM
agua libre de RNasa
4. fenol-cloroformo-IAA
Fenol 25 ml
Cloroformo 24 ml
alcohol iso-amilo 1 ml
5. cloroformo-IAA
Cloroformo 24 ml
alcohol iso-amilo 1 ml

Cuadro 2: Recetas de Medios y tampones.

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Discussion

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El protocolo descrito aquí representa un método optimizado para el aislamiento de ARN bacteriana de L. monocytogenes bacterias que crecen intracelularmente en células de macrófagos. Este protocolo se basa en la lisis diferencial de células e incluye dos pasos principales para el enriquecimiento de ARN bacteriano: sedimentación núcleos de macrófagos utilizando centrifugación y una rápida acumulación de bacterias por filtración. Estos pasos son seguidos por un procedimiento de extracción de ARN estándar. Si bien este protocolo describe la purificación de ARN Listeria, se puede modificar fácilmente para otros patógenos bacterianos. Aunque el método basado en la purificación de ARN para el análisis de la transcripción, el principio utilizado para separar las bacterias en crecimiento intracelular de su huésped también puede ser aplicado para la purificación de otros componentes bacterianos, tales como ADN, proteínas, la pared celular, etc. Tal y genómico análisis bioquímicos proporcionarían una mejor comprensión y caracterización del patógeno intracelular-Ciclo de vida durante el curso de la infección.

Los resultados del procedimiento en ~ 100 ng de ARN total de bacterias. Aunque los rendimientos de ARN son relativamente bajos, que son adecuados para el análisis de aguas abajo de la transcripción de genes utilizando múltiples técnicas, tales como RT-qPCR, RNA-Seq y tecnologías basadas en la hibridación modernos. Para mejorar los rendimientos de ARN, se recomienda el uso de inóculos bacterianos frescas, así como agua libre de nucleasa solución de fenol fresco y tampones para evitar posibles contaminaciones RNasa. bacterias cosechadas y ARN aislado deben ser siempre mantuvieron en hielo durante el proceso de extracción. El tiempo de la infección se puede ajustar dependiendo de la pregunta biológica y el organismo estudiado. Para aumentar las cantidades de ARN, el experimento se puede ampliar para incluir más placas de infección por cada muestra.

La principal preocupación cuando se realiza un experimento de este tipo es el riesgo de cambiar el perfil de transcripción de las bacterias durante las etapas de cosecha. La mayoría bacteria responder a bajas temperaturas mediante la activación de las respuestas de estrés de choque en frío, y la cosecha de este modo bacteriana se debe realizar lo más rápidamente posible. Reactivos y equipos deben estar preparados de antemano, y cada muestra deben ser tratados por separado. El paso más crítico es congelar inmediatamente las bacterias que contiene filtradores en nitrógeno líquido. De no hacerlo, puede reducir drásticamente la calidad del ARN aislado. Otro paso crítico en este protocolo es la precipitación con etanol de las cantidades relativamente pequeñas de ácidos nucleicos. Un cuidado especial se debe tomar para no perturbar el sedimento invisible ácidos nucleicos. El glucógeno se puede añadir a la solución de precipitación para mejorar la visualización de la pastilla durante estos pasos.

Para algunas aplicaciones posteriores, por ejemplo, RT-qPCR, la eliminación de ADN es crítica. Aunque nosotros no vigilar rutinariamente la eficacia del tratamiento con DNasa, una reducción de 3 - 5 de veces en la cantidad total de ácidos nucleicos siguiente DNasa tratamiento es indicativo de DNasa tratamiento eficaz. De nota, cualquier técnica o kit disponible en el mercado para la eliminación de ADN a partir de muestras de ARN es adecuado. Además, utilizando muestras de control de calidad, como una muestra sin transcripción inversa realizada, es beneficioso en tales aplicaciones.

Una de las principales limitaciones del protocolo descrito aquí es la relativamente baja cantidad de ARN extraído, que es aproximadamente 100 ng de ARN total. Por lo tanto, esta técnica no es adecuada para las técnicas de hibridación clásicos, tales como análisis de transferencia Northern, que requieren microgramos de RNA.

El reciente progreso tecnológico en la secuenciación de ARN (RNA-seq profunda) permite el análisis de tanto el patógeno bacteriano y los perfiles de transcripción huésped de mamíferos juntos, sin la necesidad de separar sus ARN, un método denominado "doble RNA-seq '16-18. Aunque el análisis de doble ARN-ss es ideal en el estudio de la interacción huésped-patógeno, es muy expensive y no pueden ser utilizados con frecuencia. Debido a que el contenido de ARN bacteriana en las células infectadas es particularmente bajo, es extremadamente difícil y costoso para obtener suficiente bacteriana lee para un análisis eficaz de la expresión génica, incluso con la profundidad máxima de lectura proporcionada por plataformas de secuenciación más nuevos. Un inconveniente adicional de este enfoque es el uso frecuente de un paso ARN o ADNc de amplificación, que puede conducir a resultados sesgados de la expresión génica. El método que aquí se presenta ofrece un compromiso entre la información obtenida y la rentabilidad.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Listeria monocytogenes 10403S 20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice 21
H2O, RNAse free Thermo Scientific 10977-015 DEPC-treated water can be used
DMEM Gibco 41965039
Glutamine Gibco 25030081
Sodium pyruvate Gibco 11360-088
β-Mercaptoethanol Gibco 31350010
Pen/Strep Gibco 15140-122
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
FBS Gibco 10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS Sigma-Aldrich D8537
Brain heart infusion (BHI) Merckmillipore 1104930500
Phenol saturated pH 4.3 Fisher BP1751I-400
Chloroform Fisher BP1145-1
Iso-amyl alcohol Sigma-Aldrich W205702
Sodium acetate Sigma-Aldrich W302406
EDTA Sigma-Aldrich EDS
DNaseI Fermentas EN0521
SDS 10% Sigma-Aldrich L4522
Ethanol absolute Merck Millipore 1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator Thermo Scientific Model 3111
Cell scrapers Nunc 179693
Kontes glass holder for 45 mm filters Fisher K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm Merck Millipore HAWP04700
SpeedVac system Thermo Scientific SPD131DDA
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Model G560E
NanoDrop Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes Greiner 639 160
1.7 ml tubes, RNase-free Axygen MCT-175-C
30 °C incubator Thermo Scientific
65 °C heat block Thermo Scientific
4 °C table centrifuge Eppendorf 5417R
Sterile pipettes, 25 ml Greiner
Falcon tubes, 50 ml Greiner
Liquid nitrogen

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References

  1. Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. (2014).
  2. Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
  3. Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
  4. Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
  5. World Health Organization WHO. http://www.who.int/en/ (2005).
  6. Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
  7. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  8. Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
  9. Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
  10. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
  11. Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
  12. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  13. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
  15. La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
  16. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
  17. Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
  18. Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
  19. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
  20. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
  21. Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
La purificación del ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En los macrófagos
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Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).More

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).

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