Protocol
Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com os regulamentos estabelecidos pela Universidade de Michigan Unidade de Medicina Laboratorial Animal.
1. Induzir recombinação genética em ratos
Nota: O Gli1 tm3 (cre / ERT2) ALJ / J estirpe de ratinhos (Gli1-CreERT2) 13 permite a segmentação de recombinação genética induzida pelo tamoxifeno para TD epitélios. Atravesse esta estirpe com B6.129S4-Gt (ROSA) ratos repórter 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 para gerar Gli1; animais LacZ para visualizar as células TD por whole-mount coloração abaixo.
- Preparar a solução de tamoxifeno a uma concentração de 12,5 mg / ml em óleo de milho.
- Em um tubo de 1,5 ml, adiciona-se a 20 mg de tamoxifen cristalinos, e, em seguida, 1 ml de óleo de milho. Firmemente fita do tubo para um misturador vortex e vortex continuamente ao mais alto ajuste à temperatura ambiente até que o tamoxifeno foi totalmente dissolvido (2-4 hr), comoconfirmado por exame do tubo sob um microscópio de dissecação para a ausência de partículas de tamoxifeno.
- Transferir a solução para um tubo de 15 ml e diluir o tamoxifeno para uma concentração final de 12,5 mg / ml, com o óleo de milho adicional. Misturar em vortex a solução viscosa durante mais 30 segundos adicionais. Conserva-se a solução durante até 1 semana a 4 ° C no escuro.
- Injectar a solução de tamoxifeno por via intraperitoneal em Gli1; ratinhos LacZ, a um volume de 200 mL por 20 g de peso corporal do rato, para uma dose eficaz de tamoxifeno 2,5 mg por 20 g de peso do rato.
2. biópsias de pele de colheita
Nota: Dependendo do experimento, biópsias de pele colheita vários dias ou semanas após a indução tamoxifeno. Para todas as cirurgias, siga protocolos padrão para a cirurgia de roedores, incluindo o uso de luvas estéreis, vestindo uma máscara ou cirúrgica do cabelo net, e cobrindo o animal com um campo cirúrgico esterilizado durante o procedimento.
- Prepare 10x solução de anestésico através da mistura de 90 mg / ml de cetamina e 6,5 mg / ml de xilazina na água. Dilui-se esta solução de 1:10 em PBS estéril imediatamente antes da utilização, e armazenar à TA no escuro durante até 8 meses.
- Alternativamente, anestesiar os ratos por inalação de isoflurano, começando com uma concentração de gás de 4% com oxigénio para anestesiar completamente o animal, e, em seguida, subsequentemente, reduzindo isto a 1-2% para a duração do processo.
- Injectar a solução de anestésico por via intraperitoneal numa dose de 200 ul por 20 g de peso corporal do rato. Verifique se o animal atingiu o plano adequado de sedação por ensaio toe pitada, e confirmar que freqüências cardíaca e respiratória são normais (aproximadamente 600 batidas e 160 respirações por minuto, respectivamente).
- Use um aparador elétrico para remover os pêlos do local da biópsia na pele dorsal de volta, tomando cuidado para não nick ou danificar a pele subjacente.
- Prepare o local da cirurgia, limpando o barbearárea de d em um sentido ântero-a-posterior usando Betadine e álcool toalhetes. Assegurar que todos os recortes de cabelo são removidos do local.
- Delinear o local da biópsia usando um marcador preto, colocar o animal em uma almofada de aquecimento em uma área cirúrgica asséptica, e cobrir com uma cortina cirúrgica estéril (para fins de demonstração, cortina estéril foi omitido para aumentar a visibilidade).
Nota: Para obtenção de cortes longitudinais de folículos de cabelo, a mais borda da biópsia (a extremidade a ser cortada para a histologia, ~ 1 cm) deve ser executado numa direcção ântero-posterior (paralela à direcção dos folículos pilosos), parassagitais a a linha média dorsal (Figura 1A). - Use um estéril # 11 bisturi para fazer uma excisão espessura total ao longo da área marcada sem danificar a fáscia muscular subjacente.
Nota: O tecido da pele excisada inclui a epiderme, a derme, e a gordura subcutânea panículo carnoso. Sangramento é normalmente mínimo. - achatar tele extirpou amostra de pele em uma toalha de papel seco, derme lado para baixo, aparar o excesso de toalha de papel, e armazenar a amostra em PBS frio por até 1 hora se outras amostras precisam ser coletadas. Quando estiver pronto, prossiga para Passos 3.1 ou 3.2 para processar amostras para histologia ou Passo 4 para β-galactosidase (LacZ) coloração todo-mount.
- Sutura fechar o local da biópsia usando 6-0 nylon, em um padrão simples interrompido espaçadas a cerca de 3 mm.
- Não devolva os ratos que foram submetidos a cirurgia na mesma gaiola como outros animais até após a recuperação completa.
- Monitorar os animais imediatamente após a cirurgia até que recupere a consciência, e também diariamente até a área cirúrgica foi curado, geralmente dentro de uma semana. Use analgésicos de acordo com orientações de cuidados de animais e uso institucional designados se os ratos apresentam sinais de dor ou angústia. Remover suturas dentro de 7-10 dias após a cirurgia.
Nota: Se for necessário, preparar a solução analgésica diluindo carprofeno (50 mg / ml da solutião) 1: 100 em água estéril. Injectar a solução por via subcutânea entre as omoplatas perto da nuca do pescoço, a uma dose de 200 ul por 20 g de peso corporal (5 mg / kg de peso corporal do rato).
3. As amostras de processo para histologia
Nota: Para corrigir e processar o tecido excisado, use um método abaixo dependendo da aplicação.
- Para gerar amostras histológicas embebidos em parafina, corrigir a pele em 3,7% de formalina em PBS O / N à temperatura ambiente e armazenar em 70% de etanol por até 2 semanas. Retire o papel toalha antes de embutir em parafina.
- Para a gerao de amostras histológicas congelados, submergir o tecido no frio paraformaldeído 4% em PBS e agitar suavemente durante 1 h. Remover a solução e lava-se a amostra com 3 mudas de PBS, cerca de 5 minutos cada. Em seguida, mergulhe a amostra em 30% de sacarose em PBS para cryoprotect o tecido ( "afundamento sacarose").
- Incubar com agitação suave O / N a 4 ° C. No dia seguinte, retire o papel de reboqueel e aparar o excesso de tecido adiposo do lado do dérmica da pele. Incorporar o tecido directamente para outubro e armazenar o bloco congelado a -80 ° C.
Nota: Após o corte, quer parafina ou amostras congeladas pode ser manchado por imuno-histoquímica para identificar TDs, células de Merkel e nervos utilizando anticorpos contra queratina 17, queratina 8 e neurofilamento, respectivamente, como descrito anteriormente 5,19.
4. As amostras Visualize por Whole-mount LacZ Coloração
- Prepare solução de coloração X-gal.
- Combinar 0,94 g de fosfato de sódio monobásico, e 2,6 g de fosfato dibásico de sódio em 250 ml de água estéril. Ajustar o pH para 7,3. Para isso, adicionar 0,5 ml de cloreto de magnésio 1 M, 0,528 g de ferrocianeto de potássio, e 0,412 g de ferricianeto de potássio. Adicionar 250 ul de octilfenil-polietileno-glicol e 125 mg de desoxicolato. A solução de base pode ser armazenado a 4 ° C durante até 6 meses no escuro.
- Prepare 50x banco de soluti X-galem dimetilformamida, adicionando ao frasco de estoque de X-gal para gerar uma solução a 50 mg / ml. Conserva-se a solução a -20 ° C no escuro.
- Imediatamente antes do uso, dilui-se solução de reserva de X-gal 1:50 em solução de base de X-gal para gerar solução de coloração. Para biópsias mais pequenos (<1 cm 2), alíquotas de 1-2 ml de solução de coloração por amostra.
- Fixar a amostra de pele recolhida no Passo 2.7 numa solução contendo 2% paraformaldeído / 0,2% de glutaraldeído em PBS frio durante 30 min, agitando suavemente em gelo. Para biópsias mais pequenos (<1 cm 2), utilizar 1-2 ml de solução fixadora por amostra.
Nota: Como alternativa, fixar amostras em 2-4% paraformaldeído apenas, ou apenas em glutaraldeído 0,5%. condições de fixação óptimas dependem do tecido, grau de expressão de LacZ e de aplicação. - Remover a solução fixadora, e lavar as amostras com 3 mudas de PBS, 5 minutos cada, num agitador à temperatura ambiente.
- Remover a toalha de papel por baixo da amostra e cortar excess tecido adiposo a partir de lado dérmico da pele ao agarrar a gordura com uma pinça sem corte e de corte com uma tesoura de dissecação.
- Submergir a amostra na solução de coloração com X-gal, e incuba-se a 37 ° CO / N. Expressão de LacZ será visível como uma mancha azul sob um microscópio de dissecação (Figura 1B).
Nota: Se a intensidade do sinal é fraco, substitua a solução de coloração no dia seguinte e repetir o O / N incubação. Se a coloração de fundo é demasiado intensa, reduzir o tempo de coloração, ou incubar a amostra a temperatura ambiente em vez de 37 ° C. - Remover a solução de coloração e lavar as amostras em 3 mudas de PBS contendo 3% de DMSO durante aproximadamente 5 min, agitando à temperatura ambiente.
- Lavar as amostras em 2-3 mudanças de etanol a 70% para 5 minutos cada. Armazene as amostras em 70% de etanol.
5. A desnervação cirúrgica
- Anestesiar o animal como no Passo 2.2 e raspar a pele dorsal inteiro.
- Prepare a área cirúrgica of a pele de volta usando Betadine e toalhetes com álcool, e cobrir o animal com um campo cirúrgico estéril (para fins de demonstração, cortina estéril foi omitido para aumentar a visibilidade). Manter o animal aquecido usando uma almofada de aquecimento durante a operação em uma área cirúrgica asséptica.
- Realizar uma incisão utilizando um bisturi estéril # 11 ao longo da linha média dorsal desde a base do pescoço até cerca de 0,5 centímetros acima da cauda.
- Usando fórceps rombas, reflectir suavemente a pele sobre o lado esquerdo longe do flanco para visualizar o tecido subjacente das almofadas de gordura escapular perto do pescoço até imediatamente acima do membro posterior.
Nota: os nervos dorsais cutâneas aparecem como fios brancos que viajam caudalmente translúcida através da faseia da parede do tronco antes de fazer curvas apertadas e entrar no tecido conjuntivo frouxo debaixo da pele (Figura 2). - Usando fórceps ultra-finos sob um microscópio de luz dissecando, remover os nervos exclusivamente a partir do lado esquerdo da animal localizados em locais anatômicos T3-12 por arrancar a partir de onde a segmentos de curva na parede do tronco para seus locais de entrada na pele (Figura 2).
- Fórceps orientar verticalmente e remover os nervos agarrando aproximadamente 0,5 cm abaixo dos seus locais de curvatura e puxando para cima, fazendo com que o nervo para esticar e separar a partir do tecido circundante (Figura 2C - E). Tenha cuidado para evitar a ruptura dos vasos sanguíneos adjacentes.
- Continuar até que todos os nervos que se estendem a partir da parede do tronco para a pele são removidos. Não perturbar os nervos no interior da fáscia densa da parede do tronco. Manter o tecido húmido em todo o processo por aplicação periódica de gotas de solução salina estéril a 0,9%.
- Como alternativa, remova nervos, segurando suas extremidades proximais perto da parede do tronco com uma pinça e cortando com uma tesoura fina. Em seguida, cortar as extremidades distais perto da pele (Figuras 2F - H). Finalmente, remova o intervening segmentos de nervo (Figura 2I).
- Remova todos os nervos do retalho de pele exposta no Passo 5.4. Estas fibras compreendem os ramos distais dos nervos cutâneos dorsais e aparecem como fios de ramificação brancos localizados esporadicamente dentro do tecido conjuntivo no lado dérmico do retalho de pele (Figuras 2J - K).
- Para remover esses galhos finos, posicione a pinça fina mais ou menos paralelo à superfície da derme, segure os nervos e arrancar para cima, para evitar perturbar os vasos sanguíneos e perfurar a pele. Continuar até que todos os nervos visíveis tenham sido removidos.
- Utilizando uma dissecção romba, reflectir a pele do lado direito da linha média dorsal incisão, mas não remover os nervos. Isto irá servir como o controle sham-operados contralateral.
- Sutura ao longo da linha média dorsal, em um teste padrão simples interrompido para fechar a incisão. Monitorar o animal durante a recuperação e pós-opertivamente como já foi demonstrado (Passos 2,8-10). Remover suturas dentro de 7-10 dias após a cirurgia.
- Para avaliar funcionalmente estável desnervação até várias semanas após a cirurgia, remover os pêlos da pele dorsal usando um aparelho eléctrico.
- Gentilmente picar a área da pele desnervado usando uma agulha hipodérmica, e observar se o animal responde, normalmente estremecendo ou virar a cabeça. Se a área da pele foi desnervado de forma estável, o animal vai exibem pouca ou nenhuma resposta.
- Utilizando um marcador de preto, o contorno da área de não resposta, assim como uma área de tamanho e local semelhante no lado contralateral sham.
- Recolha biópsias a partir destes sites que nos Passos 2.1-2.9 para análise.
Observação: Como alternativa, toda a pele dorsal para trás, incluindo as regiões desnervados e operados por simulação, pode ser removido como uma única folha para montagem inteira-coloração, semelhante ao descrito no Passo 4.
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Representative Results
Por ratinhos que expressam gerando tamoxifeno induzível Gli1-CreERT2 e um alelo repórter LacZ, é possível visualizar TD epitélios e rastrear o destino destas células ao longo do tempo. O procedimento de desnervação inteira normalmente pode ser concluída dentro de 1 hora por rato e deve causar desconforto mínimo para o animal.
Os nossos estudos anteriores têm indicado que os nervos são cruciais para manter ambos os DT normais, bem como as suas células associadas queratina 8 + Merkel (Figuras 3A - C) 5,19. Nervos também são fundamentais para a promoção da expressão Gli1 no TD (Figura 3D). Dada a aparência relativamente pouco frequentes de clusters TD toda a pele (Figura 1B), é imperativo para provar vários cortes congelados para quantificar com precisão a frequência TD. Normalmente, avaliamos 15 não-contrasseções ecutive (cada 10 mm de espessura e ~ 1 cm de comprimento), tanto farsa e pele desnervado de cada animal. Após desnervação, a perda de estabilidade de nervos, tanto na TD e em toda a pele, pode ser confirmada pela ausência de coloração imuno-histoquímica para os marcadores pan-neural padrão, tais como neurofilamento em qualquer secções congeladas ou de parafina (Figuras 3A e 3C, e como anteriormente relataram 5). Alternativamente, os nervos podem também ser identificados pela expressão de β3-tubulina ou PGP9.5 6,9.
Ao utilizar Gli1; ratinhos LacZ, é também possível para confirmar tanto o requisito para nervos na activação de sinalização Hedgehog na TD e na manutenção de destino celular TD através da variação da sequência de recombinação induzida por tamoxifeno e desnervação. Se desnervação é realizada antes da recombinação, por exemplo, isso seria testar a exigência para nervos na activação do pathwa Hedgehogy, como monitorizado pela actividade de recombinase Cre e os níveis, que estão correlacionadas com a expressão Gli1 nestes animais. Por outro lado, se a desnervação é realizada após recombinação, isto iria avaliar o requisito para nervos na manutenção de células já marcados na TD.
Figura 1. biópsia de pele e de montagem em todo LacZ coloração da TD epitélios. (A) (Top) Fotografia de rato após a biópsia e antes da sutura. (Inferior esquerdo) Imagem ampliada do local da biópsia. (Canto inferior direito) amostra de pele obtida a partir de biópsia com o lado da derme espalhar plana sobre uma toalha de papel seco. (B) coloração LacZ de montagem inteira da pele de uma Gli1; LacZ rato, 7 dias após a indução tamoxifeno, depiladas pouco antes da biópsia para melhorar a visualização da pele. Gli1 + / LacZ + TDs são rotulados como aglomerados azuis intensos.Barra de escala = 1 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Duas abordagens para denervating pele dorsal. (A) diagrama dos desenhos animados de pele inervado mouse. linhas a tracejado vermelhas indicam um único excisão feito ao longo da linha média dorsal para expor a musculatura subjacente na parede do tronco (roxo), bem como a derme (Gray, asterisco) sob a pele reflectida. Dorsal nervos cutâneos que viajam caudal parecem "bend" que saem da parede do tronco (a seta preta indica uma tal curva). segmentos nervosos a ser extirpado são demarcadas por linhas pontilhadas pretas. (B) Fotografia de nervos intactos com os locais de dobra indicados (setas). setas azuis apontam para segmentos 2 nervosas que serão removed. (C - D) Fotografias mostrando técnica de desnervação. Utilizando uma pinça ultra-finas, aperto os nervos 0,5 cm abaixo dos seus locais de dobra e puxe para fora. (E) fotografia que mostra a cavidade do corpo após a remoção de 2 segmentos de nervo (setas azuis). Os nervos restantes também precisam ser removidos. (F - I) Uma abordagem alternativa para a remoção do nervo é descrito, onde os nervos estão cortou nas suas extremidades proximais logo abaixo de onde eles Bend (setas) (G), e também para distal, perto de seu local de entrada na pele (pontas de seta) (H). Note-se que a incisão na linha média nestas imagens é mais do que o normal para efeitos de uma melhor visualização. (J) Fotografia do lado dérmico da aba de pele reflectida para um lado da linha mediana. (K) Nervos são descritas (linhas pretas), com os vasos sanguíneos maiores indicados em vermelho. Os nervos localizados no lado da derme do esquin retalho também precisa ser extirpado. Asterisk, subjacente a derme do retalho de pele refletida. Barra de escala = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Perda Estável de nervos e deterioração das TDs após desnervação. (A) Imunohistoquímica mostrando TD epitélios com queratina 8 + células de Merkel (K8, verde) e Neurofilamentos + nervos (NF, vermelho) na pele operação simulada. (B) representação dos desenhos animados, com epitélio TD em destaque na células roxo, Merkel em verde, e os nervos sensoriais no azul. (C) A imuno-histoquímica mostrando a pele desnervado (den) sem complexos celulares-neurite Merkel dentro da área de TD. linhas amarelas tracejadas, folículo piloso epitélio. Asterisk, background coloração. (D) de montagem inteira LacZ coloração dorsal volta pele de Gli1 LacZ / rato + 2 semanas após a desnervação pele unilateral. Na caixa à esquerda da incisão na linha média curado (seta), abundantes epitélios TD marcadas são observadas na pele de operação simulada. À direita da linha média, TDs não são visíveis na pele desnervado. Barra de escala = 10 uM para (A), (C); e 1 mm para (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nervos desempenham funções cruciais não só na sensação, mas também no desenvolvimento de órgãos de mamíferos, manutenção e regeneração 13,24-27. Como nervos recentemente têm sido implicados em diversas doenças de pele, as técnicas descritas aqui podem ser usadas para estudar a exigência de inervação numa variedade de modelos de doenças animais. Na verdade, a técnica desnervação unilateral permite a comparação directa da pele quer com os nervos intactos ou interromperam a partir do mesmo rato. Isto proporciona um controlo interno ideal para compensar as diferenças de animal para animal, com análises de dados subsequente fazendo uso de um teste t emparelhado.
Embora os procedimentos descritos aqui em grande parte, utilizar o gene repórter LacZ, estas experiências podem ser adaptados de modo a que o alelo Gli1-CreERT2 é combinado com outros repórter fluorescente ou condicionais alelos para modificar a expressão do gene na TD. Por exemplo, ratinhos Gli1-CreERT2 pode ser atravessadacom animais que albergam alelos condicionais de Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 para gerar ratinhos que formam tumores derivados TD-5 após a indução tamoxifeno. É importante notar que a estirpe-Gli1 CreERT2 também induz recombinação em um subconjunto de Gli1 + células estaminais do folículo capilar que estão fisicamente separados dos do TD 13.
Após a desnervação, os nervos da pele permanecem estavelmente excisada durante vários meses (Figura 3C) 5,19. Em outros estudos, no entanto, algumas re-inervação foi relatado para ocorrer ao longo do tempo 6. O perdurance do fenótipo desnervado pode depender da profundidade de remoção do nervo, como é absolutamente crítico para excisar segmentos de nervo entre a sua saída a partir da parede do peito para um ponto perto dos locais de inserção para a derme da pele.
completamente Removing o cabelo da pele antes da biópsia pode melhorar a capacidade de visualizar posteriormente TDs por mount-toda coloração (Figura 1B). Isto é conseguido através da aplicação de creme depilatório para a pele cortada durante 2 min, e em seguida secando o cabelo de distância numa direcção anterior para posterior usando bolas de algodão. Por favor note que a depilação pode afetar a cinética do ciclo do cabelo, promovendo a entrada na fase de crescimento anágena. Alternativamente, o cabelo pode ser completamente removido usando uma lâmina de barbear. Além disso, toda a montagem imunohistoquímica pode ser realizada para visualizar os DT e células de Merkel em folhas epiteliais separada da derme, como foi anteriormente descrito 23.
Resta a possibilidade de que a denervação cirúrgica pode causar inflamação no local da cirurgia, potencialmente confundindo quaisquer fenótipos observados. Em nossa experiência, não observamos inflamação significativa após a desnervação, provavelmente porque o dano tecidual garantia efectuadas no skin é pequena, se o procedimento for feito corretamente. Para minimizar a possibilidade de que a inflamação pode afectar os resultados de controlo adicionais podem ser incorporados na experiência. Por exemplo, observou-se que a denervação especificamente inibida tumores derivados de TD, mas as lesões nas mesmas amostras de pele não cabelo adjacente folículo-associado, argumentando que a denervação e não um inflamatória tumorigênese geral induzida pela ferida resposta de probabilidade inibida no TD 5.
É importante notar que a desnervação cirúrgica ablates todos os nervos cutâneos, incluindo fibras sensoriais e simpáticos 5, e, portanto, fornece uma avaliação global geral da influência destes nervos em ambos pele normal ou doente. Outras abordagens experimentais, por exemplo, utilizando pharmacologics como neurotoxina botulínica para bloquear a neurotransmissão, pode produzir insights mecanicistas mais detalhados 7, embora não esteja claro se estes agentes inibem retrógradaa secreção de citoquinas, tais como ligandos hedgehog. Alternativamente, compostos tais como 6-hidroxidopamina tem sido usado para fazer a ablação nervos simpáticos na pele 9. Além disso, tendo como alvo os receptores para os factores derivados de nervos tais como peptídeo relacionado com o gene da calcitonina e substância P podem ser úteis para interrogar as interacções específicas entre os nervos e células vizinhas dentro de seu nicho 6. Em última análise, múltiplos estratégias podem ser utilizadas em combinação para identificar, pelo menos, ou exclui, potenciais mecanismos de sinalização.
Finalmente, alvo deleção genética dos fatores derivados do nervo na linhagem neural usando Wnt1-Cre ou advilina-Cre pode representar o padrão ouro para elucidar os sinais que são trocados entre os nervos e seu nicho 19. Como nenhuma destas estirpes são tamoxifeno induzível, no entanto, alguma cautela deve ser tomado para assegurar que a interrupção desses sinais não prejudicar o desenvolvimento do nervo ou ta adequadargeting de aferentes neurais. O uso de um Cre tamoxifeno induzível tal como advilina-CreERT2 pode ajudar a contornar estas questões 29.
Em geral, as técnicas descritas aqui, uma combinação de rastreamento de linhagem, visualização celular e abordagens poderosas desnervação-oferta cirúrgicos para estudar a influência dos nervos na pele normal e doente. Com a experiência, estes procedimentos podem ser realizados rotineiramente e de forma confiável, enquanto causando desconforto mínimo para o animal ou o investigador.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
- Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
- Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
- Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
- Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
- Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
- Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
- Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
- Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
- Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
- Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
- Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
- Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
- Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
- Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
- Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
- English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
- Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
- Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
- Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
- Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
- Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
- Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).
