Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للوائح التي تضعها جامعة ميشيغان وحدة لمختبر الطب الحيواني.
1. الحث على إعادة التركيب الجيني في الفئران
ملاحظة: Gli1 TM3 (لجنة المساواة العرقية / ERT2) العلج / J الماوس سلالة (Gli1-CreERT2) 13 تمكن تستهدف إعادة التركيب الجيني تاموكسيفين التي يسببها لTD ظهائر. عبور هذه السلالة مع B6.129S4-GT (ROSA) 26Sor tm1Sor / J الفئران مراسل (LacZ) 22 لتوليد Gli1، الحيوانات LacZ لتصور خلايا TD التي كتبها كامل جبل تلطيخ أدناه.
- يعد حل تاموكسيفين إلى تركيز 12.5 ملغ / مل في زيت الذرة.
- في أنبوب 1.5 مل، تضيف ما يصل إلى 20 ملغ من عقار تاموكسيفين البلورية، ثم 1 مل من زيت الذرة. الشريط بحزم أنبوب لخلاط دوامة، ودوامة مستمرة على أعلى الإعداد في RT حتى تاموكسيفين قد حلت بالكامل (2-4 ساعة)، كماأكدت دراسة أنبوب تحت المجهر تشريح لعدم وجود الجسيمات تاموكسيفين.
- نقل الحل إلى أنبوب 15 مل ويخفف من عقار تاموكسيفين لتركيز النهائي من 12.5 ملغ / مل مع زيت الذرة إضافية. خلط قبل vortexing الحل لزج لمدة 30 ثانية إضافية. تخزين هذا الحل لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع في 4 درجات مئوية في الظلام.
- حقن محلول تاموكسيفين البريتونى إلى Gli1، الفئران LacZ، في حجم 200 ميكرولتر لكل 20 غرام من وزن جسم الفأر، لجرعة تاموكسيفين فعالة من 2.5 ملغ لكل 20 غرام من وزن الفأر.
2. حصاد خزعات الجلد
ملاحظة: اعتمادا على التجربة، خزعات الجلد الحصاد عدة أيام إلى أسابيع بعد تحريض تاموكسيفين. لجميع العمليات الجراحية، اتبع بروتوكولات موحدة لجراحة القوارض، بما في ذلك استخدام القفازات المعقمة، وارتداء قناع الشعر أو العمليات الجراحية الشبكة، والتي تغطي حيوان مع ثنى الجراحية المعقمة أثناء العملية.
- إعداد 10X حل سهم مخدر عن طريق خلط 90 ملغ / مل الكيتامين و 6.5 ملغ / مل زيلازين في الماء. تمييع هذا المحلول 01:10 في برنامج تلفزيوني العقيمة فقط قبل استخدامها، وتخزينها في RT في الظلام لمدة تصل إلى 8 أشهر.
- بدلا من ذلك، تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلورين، بدءا من تركيز الغاز من 4٪ مع الأكسجين لتخدير الكامل للحيوان، ثم بعد ذلك خفض هذا إلى 1-2٪ لمدة الإجراء.
- حقن محلول مخدر داخل الصفاق بجرعة 200 ميكرولتر لكل 20 غرام من وزن الجسم الماوس. تأكد من أن الحيوان قد وصل إلى الطائرة المناسبة للتخدير عن طريق فحص قرصة أخمص قدميه، وتؤكد أن القلب والجهاز التنفسي معدلات طبيعية (حوالي 600 نبضة و 160 نفسا في الدقيقة، على التوالي).
- استخدام المقص الكهربائي لإزالة الشعر من موقع خزعة على الجلد ظهري إلى الوراء، والحرص على عدم شق أو تلف الجلد الكامنة وراءها.
- إعداد الموقع الجراحي عن طريق المسح حلاقةمنطقة د في الاتجاه الأمامي إلى الخلفي باستخدام Betadine والكحول مناديل. ضمان تتم إزالة كافة قصاصات الشعر من الموقع.
- مخطط الموقع الخزعة باستخدام علامة سوداء، ووضع الحيوان على وسادة الاحترار في المنطقة الجراحية العقيم، وتغطي مع ثنى الجراحية المعقمة (لأغراض العرض التوضيحي، تم حذف ثنى العقيمة لزيادة وضوح).
ملاحظة: للحصول على المقاطع الطولية من بصيلات الشعر، وعلى حافة أطول من خزعة (حافة أن يكون مقطوع لالأنسجة، ~ 1 سم) يجب أن تعمل في اتجاه الأمامي الخلفي (موازية لاتجاه من بصيلات الشعر)، parasagital ل خط الوسط الظهرية (الشكل 1A). - استخدام معقم # 11 مشرط لجعل الختان سمك الكامل على طول منطقة ملحوظة دون الإضرار اللفافة العضلية الأساسية.
ملاحظة: تتضمن أنسجة الجلد رفعه البشرة، الأدمة، والدهون تحت الجلد والعضلية السبلة. النزيف عادة ما يكون الحد الأدنى. - تتسطح رانه رفعه عينة من الجلد على منشفة ورقية جافة، جنبا الأدمة أسفل، تقليم بعيدا منشفة ورقية الزائدة، وتخزين العينة في برنامج تلفزيوني الباردة لمدة تصل إلى 1 ساعة إذا لا بد من جمع عينات أخرى. عندما تصبح جاهزة، والمضي قدما في خطوات 3.1 أو 3.2 لمعالجة عينات للأنسجة، أو الخطوة 4 لبيتا غالاكتوزيداز (LacZ) تلطيخ كله جبل.
- خياطة إغلاق الموقع الخزعة باستخدام 6-0 خيوط النايلون، في نمط توقف بسيط متباعدة تقريبا 3 ملم بعيدا.
- لا عودة الفئران التي خضعت لعملية جراحية في نفس القفص كما غيرها من الحيوانات حتى بعد الشفاء التام.
- مراقبة الحيوانات مباشرة بعد عملية جراحية حتى يستعيد وعيه، وأيضا يوميا حتى تلتئم منطقة العمليات الجراحية، عادة في حدود 1 في الاسبوع. استخدام المسكنات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية المعينة إذا الفئران تبدي علامات الألم أو الضيق. إزالة الغرز في غضون 7-10 أيام بعد الجراحة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، وإعداد حل مسكن عن طريق تمييع كاربروفين (50 ملغ / مل الأسهم solutأيون) 1: 100 في الماء المعقم. حقن تحت الجلد حل بين لوحي الكتف بالقرب من القفا من الرقبة، وبجرعة 200 ميكرولتر لكل 20 غرام من وزن الجسم (5 ملغ / كغ الماوس وزن الجسم).
3. عينات العملية لعلم الأنسجة
ملاحظة: لإصلاح ومعالجة الأنسجة رفعه، استخدم الأسلوب أدناه اعتمادا على التطبيق.
- لتوليد العينات النسيجية جزءا لا يتجزأ من البارافين، إصلاح الجلد في 3.7٪ من الفورمالين في برنامج تلفزيوني O / N في RT وتخزينها في الايثانول 70٪ لتصل إلى 2 أسابيع. إزالة منشفة ورقية قبل التضمين في البارافين.
- لتوليد عينات نسيجية المجمدة، غمر النسيج في البرد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني ويهز بلطف لمدة 1 ساعة. إزالة الحل وغسل العينة مع 3 تغييرات في برنامج تلفزيوني، ما يقرب من 5 دقائق لكل منهما. بعد ذلك، غمر العينة في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني لcryoprotect النسيج ( "غرق السكروز").
- احتضان مع طيف تهز O / N عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، وإزالة ورقة سحبايل وتقليم بعيدا النسيج الزائد الدهنية من الجانب الجلد من الجلد. تضمين الأنسجة مباشرة في أكتوبر وتخزين كتلة المجمدة في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: بعد باجتزاء، إما البارافين أو العينات المجمدة يمكن أن تكون ملطخة بواسطة المناعية للتعرف على المواد الصلبة الذائبة، وخلايا ميركل والأعصاب باستخدام أجسام مضادة ضد كيراتين 17، القرتين 8 و خيط عصبي، على التوالي، كما هو موضح سابقا 5،19.
4. عينات تصور كتبها جبل لالجامع LacZ تلطيخ
- إعداد X-غال حل تلطيخ.
- الجمع بين 0.94 غ فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة، و 2.6 جم فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة في 250 مل من الماء المعقم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3. إلى ذلك، إضافة 0.5 مل من 1 M كلوريد المغنيسيوم، 0.528 غرام من فيرو سيانيد البوتاسيوم، و0.412 غرام من فيري سيانيد البوتاسيوم. إضافة 250 ميكرولتر من جلايكول octylphenyl البولي اثيلين و 125 ملغ من deoxycholate. الحل قاعدة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر في الظلام.
- إعداد 50X الأسهم soluti X-غالعلى طريق إضافة ثنائي ميثيل الفورماميد إلى الزجاجة الأسهم X-غال لتوليد 50 ملغ / مل حل. تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية في الظلام.
- فقط قبل استخدامها، وتمييع الحل الأسهم X-غال 1:50 إلى حل قاعدة X-غال لتوليد حل تلطيخ. لخزعات أصغر (<1 سم 2)، قسامة 1-2 مل من محلول تلطيخ كل عينة.
- إصلاح عينة من الجلد التي تم جمعها في الخطوة 2.7 في محلول يحتوي على 2٪ امتصاص العرق / 0.2٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني الباردة لمدة 30 دقيقة، والهز برفق على الجليد. لخزعات أصغر (<1 سم 2)، استخدم 1-2 مل من محلول تثبيتي في العينة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، وتحديد العينات في 2-4٪ امتصاص العرق فقط، أو في 0.5٪ غلوتارالدهيد فقط. تعتمد شروط التثبيت الأمثل على النسيج، ودرجة التعبير LacZ والتطبيق. - إزالة الحل تثبيتي، وشطف عينات مع 3 تغييرات في برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل منهما، على شاكر في RT.
- إزالة منشفة ورقية تحت العينة وقطع excesق الأنسجة الدهنية من الجانب الجلد من الجلد عن طريق تجتاح الدهون مع ملقط كليلة وتقليم مع مقص تشريح.
- غمر العينة في X-غال حل تلطيخ، واحتضان عند 37 درجة CO / N. سوف LacZ التعبير تكون واضحة كما وصمة عار الزرقاء تحت المجهر تشريح (الشكل 1B).
ملاحظة: إذا كانت كثافة إشارة ضعيفة، يستعاض عن حل تلطيخ في اليوم التالي وكرر O / N الحضانة. إذا كان تلوين الخلفية مكثفة جدا، والحد من الوقت للتلطيخ، أو احتضان العينة في RT بدلا من 37 درجة مئوية. - إزالة حل تلطيخ وغسل العينات في 3 تغييرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 3٪ DMSO لحوالي 5 دقائق، هز بلطف على RT.
- غسل العينات في 2-3 التغيرات في الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما. تخزين العينات في 70٪ من الإيثانول.
5. إزالة التعصيب الجراحي
- تخدير الحيوان كما في الخطوة 2.2 وحلق جلد ظهري بأكمله.
- اعداد منطقة الجراحية سو الجلد مرة أخرى باستخدام Betadine ومناديل الكحول، وتغطية حيوان مع ثنى الجراحية المعقمة (لأغراض العرض التوضيحي، تم حذف ثنى العقيمة لزيادة وضوح). إبقاء الحارة الحيوان باستخدام وسادة التدفئة في حين تعمل في منطقة العمليات الجراحية العقيم.
- إجراء شق باستخدام معقم # 11 مشرط على طول خط الوسط الظهرية من قاعدة العنق إلى ما يقرب من 0.5 سم فوق الذيل.
- باستخدام الملقط حادة، تعكس بلطف الجلد على الجهة اليسرى من الجهة تصور الأنسجة الكامنة من منصات كتفي الدهون بالقرب من العنق إلى ما فوق أطرافه الخلفية.
ملاحظة: الأعصاب الجلدية ظهري تظهر خيوط كما البيضاء التي يسافر caudally خلال لفافة شفافة الجدار جذع قبل اتخاذ الانحناءات الحادة ودخول النسيج الضام فضفاضة تحت الجلد (الشكل 2). - باستخدام ملقط غاية في الدقة تحت المجهر تشريح ضوء، وإزالة الأعصاب حصرا من الجانب الأيسر من أنيمال تقع في مواقع تشريحية T3-12 به يقطف من حيث منعطف قطاعات في الجدار الجذع إلى مواقع دخولها في الجلد (الشكل 2).
- ملقط توجيه عموديا وإزالة الأعصاب من خلال استيعاب حوالي 0.5 سم تحت مواقع ينحني وسحب صعودا، مما تسبب في العصب على التمدد ومنفصلة عن الأنسجة المحيطة بها (الشكل 2C - E). كن حذرا لتجنب تمزق الأوعية الدموية المجاورة.
- تستمر حتى تتم إزالة كافة الأعصاب التي تمتد من الجدار جذع على الجلد. لا تعطيل الأعصاب داخل لفافة كثيفة من الجدار الجذع. الحفاظ على الأنسجة الرطبة في جميع أنحاء الداخلي من خلال تطبيق دوري قطرات من معقم 0.9٪ محلول ملحي.
- بدلا من ذلك، إزالة الأعصاب عن طريق الامساك غاياتهم القريبة بالقرب من الجدار الجذع مع ملقط والقص بالمقص الجميلة. بعد ذلك، قطع الاطراف البعيده بالقرب من الجلد (أرقام 2F - H). وأخيرا، وإزالة كثافة العملياتشرائح العصبية ervening (الشكل 2I).
- إزالة أي الأعصاب من رفرف الجلد المكشوف في الخطوة 5.4. تتكون هذه الألياف الفروع البعيدة للالأعصاب الجلدية ظهري ويبدو من مسارات المتفرعة الأبيض الموجود بشكل متقطع داخل النسيج الضام في الجانب الجلد رفرف الجلد (أرقام 2J - K).
- لإزالة هذه الفروع الجميلة، وضع ملقط غرامة توازي تقريبا على سطح الجلد، فهم الأعصاب ونتف صعودا إلى تجنب تعطيل الأوعية الدموية وثقب الجلد. يستمر إلى أن يتم نقل جميع الأعصاب واضحة.
- عن طريق تشريح حادة، يعكس الجلد في الجانب الأيمن من خط الوسط شق ظهري، ولكن لا تقم بإزالة الأعصاب. وهذا سيكون بمثابة سيطرة الشام التي تديرها المقابل.
- خياطة على طول خط الوسط الظهرية في نمط توقف بسيط لإغلاق الجرح. مراقبة الحيوان خلال فترة الانتعاش وبعد أوبراatively كما هو موضح سابقا (خطوات 2،8 حتي 10). إزالة الغرز في غضون 7-10 أيام بعد الجراحة.
- لتقييم وظيفيا مستقر إزالة التعصيب تصل إلى عدة أسابيع بعد الجراحة، وإزالة الشعر من الجلد الظهرية باستخدام المقص الكهربائي.
- وخز بلطف منطقة الجلد مزالة العصب باستخدام إبرة تحت الجلد، وملاحظة ما إذا كان الحيوان يستجيب، عادة عن طريق فزعا أو تحول رأسا على عقب. إذا كانت المنطقة الجلد وقد مزالة العصب مستقر، وسوف الحيوان تظهر استجابة ضئيلة أو معدومة.
- باستخدام علامة سوداء، الخطوط العريضة للمنطقة أي رد، فضلا عن مساحة مشابهة من حيث الحجم والموقع على الجانب المقابل صورية.
- جمع عينات من هذه المواقع كما في خطوات 2،1-2،9 لتحليلها.
ملاحظة: بدلا من ذلك، الظهرية الخلفي بأكمله الجلد، بما في ذلك المناطق مزالة العصب والشام التي تديرها، يمكن إزالة مثل ورقة واحدة لكامل جبل تلطيخ، على غرار كما هو موضح في الخطوة 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عن طريق توليد الفئران معربا-تاموكسيفين محرض Gli1-CreERT2 وأليل مراسل LacZ، فمن الممكن تصور TD ظهائر وتتبع مصائر هذه الخلايا مع مرور الوقت. وعادة ما يمكن أن تكتمل إجراءات إزالة التعصيب كامل حدود 1 ساعة في الماوس، وينبغي أن يسبب الحد الأدنى من الضيق للحيوان.
وأشارت دراساتنا السابقة أن الأعصاب أساسية للمحافظة على كل من المواد الصلبة الذائبة العادية، وكذلك يرتبط بها من زنزاناتهم كيراتين 8 + ميركل (أرقام 3A - C) 5،19. الأعصاب حاسمة لتعزيز التعبير Gli1 في TD (الشكل 3D) أيضا. ونظرا لظهور نادر نسبيا من مجموعات TD في جميع أنحاء الجلد (الشكل 1B)، فإنه لا بد من أخذ عينات أقسام المجمدة متعددة ل quantitate بدقة تردد TD. عادة، ونحن تقييم 15 غير سلبياتأقسام ecutive (كل 10 ميكرون سميكة و~ 1 سم طويلة) من كل من الشام والجلد المزالة التعصيب من كل حيوان. بعد إزالة التعصيب، وفقدان المستقرة للأعصاب، سواء في TD وفي جميع أنحاء الجلد، ويمكن التأكد من عدم وجود تلطيخ المناعى للعلامات عموم العصبي القياسية مثل خيط عصبي في أي من أقسام المجمدة أو البارافين (أرقام 3A و 3C، وكما سبق ذكرت 5). بدلا من ذلك، والأعصاب ويمكن أيضا أن تحدد بحسب تعبير عن β3 تويولين أو PGP9.5 6،9.
باستخدام Gli1، الفئران LacZ، فمن الممكن أيضا للتأكيد على حد سواء شرط الأعصاب في تفعيل الإشارات القنفذ في TD وفي الحفاظ على مصير خلية TD من خلال تغيير تسلسل إعادة التركيب التي يسببها عقار تاموكسيفين وإزالة التعصيب. إذا تم تنفيذ إزالة التعصيب قبل إعادة التركيب، على سبيل المثال، وهذا من شأنه أن اختبار شرط الأعصاب في تفعيل pathwa القنفذذ، كما رصدتها النشاط recombinase لجنة المساواة العرقية والمستويات، والتي ترتبط مع التعبير Gli1 في هذه الحيوانات. من ناحية أخرى، إذا تم تنفيذ إزالة التعصيب بعد إعادة التركيب، وهذا من شأنه أن تقييم الاحتياجات اللازمة للأعصاب في الحفاظ على الخلايا المسمى بالفعل في TD.
الرقم خزعة 1. الجلد وكله جبل LacZ تلطيخ TD ظهائر. (A) (أعلى) صورة من الماوس بعد الخزعة وقبل خياطة. (يسار السفلى) صورة مكبرة لموقع الخزعة. (أسفل اليمين) الجلد العينة التي تم الحصول عليها من الخزعة مع الجانب الأدمة فروعها المنتشرة شقة على منشفة ورقية جافة. (ب) جبل لالجامع LacZ تلطيخ من الجلد من Gli1، LacZ الماوس، بعد 7 أيام تحريض تاموكسيفين، نزعه فقط قبل خزعة لتحسين التصور الجلد. Gli1 + / وصفت LacZ + تدس كعناقيد الزرقاء مكثفة.مقياس شريط = 1 سم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. نهجين لdenervating جلد ظهري. (A) رسم بياني رسوم متحركة من الجلد الماوس معصب. الخطوط المنقطة الحمراء تشير إلى وجود الختان مرة واحدة من على طول خط الوسط الظهرية لفضح العضلات الأساسية على الحائط جذع (الأرجواني)، وكذلك الأدمة (الرمادي، النجمة) تحت الجلد ينعكس. الظهرية الأعصاب الجلدية السفر caudally يبدو أن "منعطف" كما ترك الجدار الجذع (السهم الأسود يشير إلى واحدة من هذه ينحني). شرائح الأعصاب إلى أن رفعه يتم ترسيمها من قبل الخطوط المنقطة السوداء. (ب) صورة من الأعصاب سليمة مع مواقع الانحناء أشار (السهام). تشير الأسهم الزرقاء إلى شرائح 2 العصبية التي ستكون عينيةعوفيد. (C - D) صور تظهر تقنية إزالة التعصيب. باستخدام ملقط غاية في الدقة، وقبضة الأعصاب 0.5 سم تحت مواقعهم من الانحناء وسحب الى الخارج. (E) صورة تظهر تجويف الجسم بعد إزالة من 2 شرائح العصبية (الأسهم الزرقاء). تحتاج الأعصاب المتبقية أيضا إلى إزالتها. (F - I) وصفت نهج بديل لإزالة العصب، حيث مقصوص الأعصاب في الدانية نهايتهما أقل بقليل حيث ينحني (السهام) (G)، وأيضا بشكل أقصى، على مقربة من موقع دخولهم في الجلد (السهام) (H). لاحظ أن شق خط الوسط في هذه الصور هو أطول من المعتاد لغرض تحسين التصور. (J) صورة من الجانب الجلد رفرف الجلد ينعكس على جانب واحد من خط الوسط. وترد (K) الأعصاب (الخطوط السوداء)، مع الأوعية الدموية الكبيرة المشار إليها باللون الأحمر. الأعصاب تقع على الجانب الأدمة للتزلج على الجليدتحتاج ن رفرف أيضا إلى أن رفعه. النجمة، الكامنة الأدمة من الجلد رفرف ينعكس. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. فقدان مستقرة الأعصاب وتدهور تدس بعد إزالة التعصيب. (A) المناعية تظهر TD ظهائر مع كيراتين 8 + خلايا ميركل (K8 والأخضر) وخيط عصبي + الأعصاب (NF، أحمر) في الجلد الشام التي تديرها. (ب) تصوير الكرتون، مع ظهائر TD سلط عليها الضوء في الأرجواني، وخلايا ميركل باللون الأخضر، والأعصاب الحسية في الزرقاء. (C) المناعية يظهر الجلد المزالة التعصيب (دن) تفتقر إلى مجمعات للخلية على neurite ميركل داخل منطقة TD. الخطوط الصفراء متقطع، جريب الشعر ظهارة. النجمة، backgrounد تلطيخ. (D) جبل لالجامع LacZ تلطيخ الظهرية الجلد مرة أخرى من Gli1 LacZ / + الماوس بعد 2 أسابيع إزالة التعصيب الجلد من جانب واحد. في المربع الى يسار شق خط الوسط تلتئم (السهم)، ويلاحظ وفرة ظهائر TD المسمى في الجلد الشام التي تديرها. إلى اليمين من خط الوسط، تدس ليست واضحة في الجلد المزالة التعصيب. شريط مقياس = 10 ميكرومتر ل(أ) و (C)؛ و 1 مم في (D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأعصاب تخدم وظائف حاسمة ليس فقط في الإحساس، ولكن أيضا في تطوير الجهاز الثدييات، وصيانة وتجديد 13،24-27. كما تم مؤخرا تورط الأعصاب في الأمراض الجلدية المختلفة، والأساليب المذكورة هنا يمكن أن تستخدم لدراسة متطلبات تعصيب في مجموعة متنوعة من نماذج الأمراض الحيوانية. وفي الواقع، فإن تقنية إزالة التعصيب من جانب واحد يسمح للمقارنة مباشرة من الجلد مع أي أعصاب سليمة أو تعطلت من نفس الماوس. وهذا يوفر الرقابة الداخلية المثالية للتعويض عن الاختلافات الحيوان إلى الحيوان، مع تحليل البيانات لاحقا الاستفادة من تقرن اختبار t.
في حين أن الإجراءات الموضحة هنا الاستفادة إلى حد كبير مراسل الجين LacZ، هذه التجارب يمكن تكييفها بحيث أليل Gli1-CreERT2 يتم دمجها مع مراسل فلوري أو مشروطة الأليلات أخرى لتعديل التعبير الجيني في TD. على سبيل المثال، الفئران Gli1-CreERT2 يمكن تجاوزهمع الحيوانات إيواء الأليلات المشروطة Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 لتوليد الفئران التي تشكل الأورام المستمدة TD-بعد تحريض تاموكسيفين 5. من المهم أن نلاحظ أن سلالة Gli1-CreERT2 يدفع أيضا إعادة التركيب في مجموعة فرعية من Gli1 + الخلايا الجذعية بصيلات الشعر التي تكون مفصولة ماديا عن تلك الموجودة في TD 13.
بعد إزالة التعصيب، تظل الأعصاب في الجلد ذاب مستقر لعدة أشهر (الشكل 3C) 5،19. في دراسات أخرى، ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن بعض إعادة تعصيب للتحدث مع مرور الوقت 6. وperdurance من النمط الظاهري المزالة التعصيب قد تعتمد على شمولية إزالة العصبية، كما هو في غاية الأهمية لاستئصال قطاعات العصبية بين خروجهم من جدار الصدر إلى نقطة قريبة من مواقع الإدراج في الأدمة من الجلد.
تماما removiيمكن نانوغرام الشعر من الجلد قبل خزعة تعزيز القدرة على تصور في وقت لاحق من قبل تدس كله جبل تلطيخ (الشكل 1B). ويتم إنجاز ذلك من خلال تطبيق كريم مزيل الشعر على الجلد قص لمدة 2 دقيقة، ثم يمسح الشعر بعيدا في الاتجاه الأمامي إلى الخلفي باستخدام كرات القطن. يرجى ملاحظة أن إزالة الشعر يمكن أن تؤثر على حركية دورة الشعر عن طريق تشجيع دخول مرحلة النمو التنامي. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون الشعر إزالتها تماما باستخدام شفرة حلاقة. وبالإضافة إلى ذلك، جبل بأكمله لا يمكن أن يؤديها المناعية لتصور تدس وخلايا ميركل على أوراق الظهارية فصل من الأدمة، كما وصفت سابقا 23.
يبقى احتمال أن إزالة التعصيب الجراحية قد يسبب التهاب في موقع الجراحة، يحتمل أن يتيه أي الظواهر المرصودة. في تجربتنا، ونحن لم احظت التهابا حادا بعد إزالة التعصيب، من المحتمل بسبب تلف الأنسجة ضمانات تكبد في كورونافي واحد طفيف إذا تم إجراء صحيح. للحد من إمكانية أن الالتهاب قد يؤثر على النتائج، وضوابط إضافية يمكن إدراجها في التجربة. على سبيل المثال، لاحظنا أن إزالة التعصيب مستعمل تحديدا الأورام المستمدة TD، ولكن ليس المجاور الشعر الآفات في عينات الجلد نفس المسام المصاحب، بحجة أن إزالة التعصيب وليس الناجم عن الجرح التهابات استجابة الأرجح تكون الأورام تحول دون العام في TD 5.
من المهم أن نلاحظ أن إزالة التعصيب الجراحية ablates جميع الأعصاب الجلدية، بما في ذلك الألياف الحسية ومتعاطفة 5، وبالتالي يوفر تقييما عاما وشاملا لتأثير هذه الأعصاب على أي الجلد الطبيعي أو المريضة. النهج تجريبية أخرى، على سبيل المثال باستخدام pharmacologics مثل توكسين عصبي لمنع العصبي، قد تسفر عن رؤى الآلية أكثر تفصيلا 7، على الرغم من أنه من غير الواضح ما إذا كانت هذه العوامل تمنع الوراءإفراز السيتوكينات مثل بروابط القنفذ. بدلا من ذلك، تم استخدام مركبات مثل 6-hydroxydopamine لاجتثاث الأعصاب متعاطفة في الجلد 9. وبالإضافة إلى ذلك، يستهدف مستقبلات عوامل المستمدة العصبية مثل كالسيتونين الببتيد ذات الصلة الجينات والمواد ف قد يكون من المفيد لاستجواب التفاعلات محددة بين الأعصاب والخلايا المحيطة بها في مكانها المناسب (6). في نهاية المطاف، يمكن استخدام استراتيجيات متعددة في تركيبة لتحديد، أو على الأقل استبعاد وآليات إشارات محتملة.
وأخيرا، استهدفت الحذف الوراثي من العوامل المشتقة من العصبية في النسب العصبي باستخدام Wnt1-لجنة المساواة العرقية أو Advillin-لجنة المساواة العرقية قد يمثل المعيار الذهبي لتوضيح الإشارات التي يتم تبادلها بين الأعصاب ومكانها المناسب (19). كما أيا من هذه السلالات هي تاموكسيفين-محرض، ومع ذلك، يحتاج إلى بعض الحذر الواجب اتخاذها لضمان أن تعطل هذه الإشارات لا يؤدي إلى إعاقة نمو الأعصاب أو تا السليمrgeting من afferents العصبية. استخدام لجنة المساواة العرقية تاموكسيفين-محرض مثل Advillin-CreERT2 قد يساعد في الالتفاف على هذه القضايا 29.
وعموما، فإن التقنيات وصفت هنا-مزيج من تتبع النسب، والتصور خلية والنهج قوية إزالة التعصيب، عرض الجراحية لدراسة تأثير الأعصاب على جلد طبيعي والمريضة. من ذوي الخبرة، وهذه الإجراءات لا يمكن أن يؤديها بشكل روتيني وبشكل موثوق، في حين تسبب الحد الأدنى من الضيق للحيوان أو المحقق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
- Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
- Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
- Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
- Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
- Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
- Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
- Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
- Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
- Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
- Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
- Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
- Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
- Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
- Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
- Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
- English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
- Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
- Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
- Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
- Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
- Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
- Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).
