Protocol
在此协议中描述的所有程序按照由密歇根单位的大学实验动物医学既定法规的规定执行。
1.诱导小鼠基因重组
注：TM3 中 Gli1（CRE / ERT2）ALJ / J小鼠品系（ 中Gli1-CreERT2）13启用定向三苯氧胺诱发基因重组到TD上皮。跨越这株B6.129S4-GT（ROSA）26Sor tm1Sor / J记者小鼠（LacZ的 ）22 中Gli1产生;动物LacZ的可视化通过整个安装下面染色TD细胞。
- 准备他莫昔芬溶液在玉米油中的12.5毫克/毫升的浓度。
- 在1.5ml管中，添加最多20毫克结晶他莫昔芬，并然后将1ml的玉米油。牢固胶带将管旋涡混合器，并在室温最高设置旋涡不断，直到他莫昔芬已完全溶解（2-4小时），如通过在解剖显微镜对没有他莫昔芬的微粒的下检查管证实。
- 转移溶液到15毫升管中并稀释他莫昔芬，以12.5毫克/毫升用另外的玉米油的最终浓度。通过涡旋粘稠溶液另外30秒混合。存储在黑暗中在4℃下向该溶液长达1周。
- 腹膜内注射他莫昔芬溶液进入中Gli1; LacZ的小鼠，在每个20克小鼠体重200μl的体积，对于每个20 G鼠标2.5重量毫克有效三苯氧胺的剂量。
2.嘉实皮肤活检
注：根据实验，收获皮肤活检几天到几周他莫昔芬诱导后。对于所有的手术，遵循标准协议灭鼠手术，包括使用无菌手套，戴口罩或头发网，覆盖在手术过程中，用无菌手术单的动物。
- 在水混合90毫克/毫升氯胺酮和6.5毫克/毫升的甲苯噻嗪准备10倍的股票麻醉剂的解决方案。稀释此储备溶液1:10比例无菌PBS只是在使用前，并在室温在黑暗中储存长达8个月。
- 可替代地，通过吸入异氟烷麻醉小鼠，用4％的气体浓度与氧气开始充分麻醉动物，并随后降低该至1-2％的程序的持续时间。
- 腹膜内注射麻醉剂溶液，剂量为每个20 G鼠标体重200微升。检查动物已经达到脚趾捏法镇静的正确平面，并确认心脏和呼吸率（分别约为600次每分钟160次呼吸，）是正常的。
- 使用电剪从活检网站上的背背部皮肤取下毛发，小心不要缺口或损坏肌肤底层。
- 经擦拭的剃须准备手术部位开发领域中使用聚维酮碘和酒精擦拭前 - 至 - 后方向。确保所有的头发都剪报从网站上删除。
- 介绍了使用黑色标记活检部位，放置在暖垫动物在无菌手术区，并用无菌手术悬垂覆盖（用于演示目的，无菌的悬垂性被忽略了提高知名度）。
注意：要获得毛囊纵向部分，所述活检的长边（边缘被切片用于组织学，约1厘米）应在一个前 - 后方向延伸（平行于毛囊的方向），parasagital到背中线（ 图1A）。 - 使用无菌＃11解剖刀使沿标记的区域的完整厚度切除而不损坏底层肌肉筋膜。
注意：将切下的皮肤组织包括表皮，真皮，皮下脂肪和肌层。出血通常是最小的。 - 拼合ŧ他切除上干纸巾皮肤样品，真皮侧倒，修剪掉多余的纸巾，并将样品在冷PBS存储长达1小时，如果其它样品需要被收集。准备就绪后，前往步骤3.1或3.2来处理组织学样品，或整个安装β半乳糖苷酶（lacZ）染色步骤4。
- 缝合关闭使用6-0尼龙缝线活检部位，在间隔开的大致为3毫米的简单中断模式。
- 不要返回已接受手术到同一个笼子里的其他动物，直到完全恢复后的小鼠。
- 监控动物手术后，直到他们每天回过神来，也是直到手术区已愈合，通常在1周。使用止痛剂按照指定的机构动物护理和使用指南，如果小鼠表现出疼痛或痛苦的迹象。手术后取出在7-10天内缝线。
注意：如果需要，通过稀释卡布洛芬（50毫克/毫升股票SOLUT准备镇痛液离子）1：在无菌水中100。注入肩胛骨之间的溶液皮下的颈背附近，在一个剂量的每个20克体重200微升（5毫克/千克小鼠体重）。
3.处理样品的组织学
注意：要解决和处理切除的组织，使用下面根据应用两种方法。
- 以产生石蜡包埋的组织学样品，固定在3.7％甲醛的PBS中O / N在室温在70％的乙醇对皮肤和存储长达2周。嵌入到石蜡之前取出纸巾。
- 用于产生冷冻的组织学样品，浸入所述组织在PBS中冷的4％多聚甲醛和1小时轻轻摇动。除去溶液，并用PBS 3的变化，每个大约为5分钟，洗涤样品。接着，浸没在30％蔗糖的样品在PBS中cryoprotect组织（“蔗糖下沉”）。
- 轻轻摇动O / N孵育在4℃下。次日，取出纸张束埃尔并从皮肤的真皮侧修剪掉多余的脂肪组织。嵌入组织直接进入OCT和冻块存储在-80℃。
注意：切片后，无论是石蜡或冷冻样品可通过免疫组织化学染色，以确定阵，默克尔细胞和使用抗角蛋白17，角蛋白8和神经丝，分别神经，如先前所描述5,19。
4.可视化样品中全安装的LacZ染色
- 制备的X-gal染色溶液。
- 结合0.94克磷酸二氢钠，和2.6加入磷酸氢二钠于250ml无菌水中。调节pH值至7.3。此，加入0.5毫升的1M氯化镁，0.528克亚铁氰化钾，和0.412克铁氰化钾。添加辛基苯基聚乙二醇250微升和125毫克脱氧胆。碱溶液可以储存在4℃下长达6个月在黑暗中。
- 准备50X股票的X-gal soluti关于通过加入二甲基甲酰胺的X-gal的库存瓶以产生50毫克/毫升溶液。存储在黑暗中在-20℃下向该溶液。
- 只是使用，稀释的库存的X-gal溶液1:50到的X-gal碱溶液，以产生染色溶液之前。对于较小的活检（<1 平方厘米），每个样品染色溶液等分试样1-2毫升。
- 固定在含有2％多聚甲醛/ 0.2％戊二醛在冷PBS 30分钟，在冰上轻轻晃动的溶液步骤2.7中收集的皮肤样品。对于较小的活检（<1 平方厘米），用1-2毫升，每样固定液。
注：另外，只有样品固定在2-4％多聚甲醛，或仅在0.5％的戊二醛。最佳固定条件取决于组织，LacZ的表达和应用的程度。 - 除去固定液，用PBS 3的变化，每次5分钟，于室温在摇床上漂洗样品。
- 取出纸巾样品下方，切去exces通过抓住钝钳脂肪和与解剖剪刀修整上来自皮肤的真皮侧的脂肪组织。
- 浸没在X-gal的染色液的样品，并在37℃CO / N孵育。 LacZ的表达将作为一个解剖显微镜（ 图1B）下蓝染色可见。
注意：如果信号强度较弱，更换染色液第二天，重复O / N培养。如果背景染色过于激烈，减少染色的时间，或在室温下孵育样品，而不是37℃。 - 除去染色液并在含有PBS中的3％DMSO的约5分钟，在RT轻轻摇动3变化洗样品。
- 洗涤样品，每次5分钟，70％乙醇2-3变化。商店的样品在70％的乙醇。
5.去神经外科
- 麻醉动物如步骤2.2和刮整个背部皮肤。
- 准备手术区○F使用聚维酮碘和酒精擦拭，并用无菌手术单动物的背部皮肤（用于演示目的，无菌的悬垂性被忽略了提高知名度）。用加热垫，而在无菌手术区经营保持动物温暖。
- 使用沿着从颈部的底部背中线无菌＃11解剖刀大致0.5厘米尾部上方的切口。
- 使用钝钳，轻轻反映在左侧的皮肤从侧翼远离形象化从肩胛脂肪垫下面的组织的颈部附近只后肢以上。
注意：背皮神经似乎锐弯并进入疏松结缔组织皮肤下方（ 图2）之前尾端行进穿过躯干壁的半透明面板，为白色链。 - 使用解剖显微镜下超细镊子，从阴性特质的左侧只取出神经升位于通过从拔除解剖学部位T3-12在躯干壁到其进入位点到皮肤的分段弯曲（ 图2）。
- 东方镊子垂直和由下面的弯曲部位把持约为0.5厘米，向上拉，造成神经伸展和从周围组织（ - E 图2C）分离除去神经。小心避免破裂相邻血管。
- 继续，直到从树干墙皮肤一直延伸神经都被删除。不要把后备箱壁上的密集筋膜内扰乱神经。通过周期性施加无菌的0.9％盐水溶液的液滴保持组织在整个过程湿润。
- 另外，通过把握其近端主干墙钳附近，用细剪刀剪断取下的神经。随后，切断皮肤附近的远端（ 图2F - H）。最后，去掉INTervening神经节段（ 图2I）。
- 从步骤5.4暴露皮瓣取出所有的神经。这些纤维包括背皮神经的远端分支，并出现零星位于上皮瓣真皮侧（ 图2J - K）结缔组织内白色分支链。
- 要删除这些细的分支，定位细镊子大致平行于皮肤表面，抓住神经和勇敢向上，以避免破坏血管和穿刺皮肤。继续，直到所有可见的神经已被删除。
- 使用钝性分离，反映背中线切口右侧皮肤，但不删除神经。这将作为对侧假手术对照。
- 沿着在一个简单的断续图案背中线缝合关闭切口。监视恢复和OPER后在动物atively如以前证明（步骤2.8-10）。手术后取出在7-10天内缝线。
- 在功能上评估手术后稳定去神经长达数周，使用电动推剪去除背部皮肤的毛。
- 轻轻挑破使用皮下注射针头失神经支配的皮肤区域，并注意是否动物的响应，通常由打了一个寒颤或转动它的头。如果皮肤面积已稳定失神经支配，动物会表现出很少或没有回应。
- 使用黑色标记，轮廓没有反应的区域，以及类似的大小和位置的对侧假侧的区域。
- 收集从这些站点活组织检查按照步骤2.1-2.9进行分析。
注意：可替换地，整个背侧背部皮肤，包括去神经和假手术的区域，可以作为一个单一的片材整个贴装染色，类似于如在步骤4中所描述的被移除。
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Representative Results
通过表达他莫昔芬诱导中Gli1-CreERT2产生小鼠和LacZ报道等位基因，这是可能的可视化的TD上皮和跟踪这些细胞的命运随时间。整个去神经过程通常可以每只小鼠1小时内完成，并应产生最少的困扰的动物。
我们先前的研究已经表明，神经是维持正常阵以及与其相关的角蛋白8 +默克尔细胞（ 图3A - C）的关键5,19。神经也可用于促进在TD（ 图3D） 中Gli1的表达是至关重要的。鉴于TD集群的整个皮肤（ 图1B）的相对较少的外观，当务之急是要多品尝冰冻切片准确定量TD频率。通常情况下，我们评估15个非利弊ecutive部分（各10微米厚，约1厘米长）来自假和失神经支配的皮肤从每个动物。下面去神经，神经的稳定损耗，无论是在TD和整个皮肤，可以通过没有在任一冷冻或石蜡切片（ 图3A和3C标准泛神经标记物如神经丝免疫组织化学染色进行确认，并如先前报道5）。可替代地，神经也可以通过β3微管蛋白或PGP9.5 6,9的表达鉴定。
通过使用中Gli1; LacZ的小鼠中，也有可能在激活在TD Hedgehog信号并通过改变他莫昔芬诱导的重组和去神经的序列保持TD细胞的命运，以确认这两个对神经的要求。如果去神经被重组之前进行，例如，这将测试中激活刺猬通道法对神经的要求Y，如通过Cre重组酶的活性和水平，这与在这些动物中Gli1表达相关监视。另一方面，如果去神经被重组后进行，这将评估在TD保持已标记的细胞为神经的要求。
图1.皮肤活检和TD上皮全安装的LacZ染色。（A）活检后小鼠（顶部）和照片之前，缝合。 （下左）活检部位的放大图像。从活检与干纸巾摊平的真皮侧获得（右下）皮肤样品。 （B）从皮肤中Gli1的全 安装的LacZ染色; LacZ的鼠标，他莫昔芬诱导后7天，脱毛活检，以改善皮肤的可视化前夕。 GLI1 + / LacZ的+ TD所标示为强烈的蓝色集群。比例尺= 1厘米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.去神经背部皮肤的两种方法。（A）神经支配小鼠皮肤的卡通图。红色虚线表示沿背中线，暴露于躯干壁（紫色）以及真皮（灰色，星号）的反射皮下底层肌肉单个切除。背皮神经尾端旅游出现“弯曲”，因为他们离开体壁（黑色箭头指示了一个这样的弯曲）。待切除神经节段由黑色虚线划定。完整的神经（B）与照片显示的弯曲（箭头）的网站。蓝色箭头指向2神经节段，将REMOved的。 （C - D）照片显示失神经支配的技术。采用超细镊子，夹住神经0.5厘米其弯曲和向外拉的网站下方。 （E）照片显示去除2神经节段（蓝色箭头）后，体腔。剩余的神经也需要被除去。 （F - I）的神经除去的另一种方法被描述，其中神经在它们的近端剪断端略低于那里弯曲（箭头）（G）中，并且还向远侧，靠近其入口的部位进入皮肤（箭头） （H）。注意，在这些图像中的中线切口是比典型的为更好的可视化的目的更长。反射皮瓣真皮侧（J）的照片，以中线的一侧。 （K）神经概述（黑线），以红色表示的血管较大。位于滑雪真皮侧的神经n翼板也需要切除。星号，从反射皮瓣真皮底层。比例尺= 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.神经失神经支配后，TD的恶化稳定的损失。（A）免疫组化显示，在假手术的皮肤角蛋白8 +默克尔细胞（K8，绿色）和神经丝+神经（NF，红色）TD上皮。 （B）卡通描绘，在绿色的紫色，默克尔细胞强调TD上皮细胞，并以蓝色感觉神经。 （C）免疫组化显示神经支配的皮肤（DEN）缺乏TD区内默克尔细胞突起物。虚线黄线，毛囊上皮。星号，背景和基础ð染色。 （ 四 ）背的全安装的LacZ染色背部皮肤从LacZ的 中Gli1 / +鼠标2周后皮肤单侧失神经支配。在框中愈合正中切口（箭头）的左侧，标有丰富TD上皮细胞在假手术皮肤观察。中线的右侧，阵不在去神经皮肤可见。比例尺=10μm的为（A），（C）; 1毫米（D）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
神经起到至关重要的作用不仅轰动，而且在哺乳动物器官发育，维持和再生13,24-27。作为神经最近已在不同的皮肤疾病有牵连，此处所描述的技术可以被用来研究在多种动物疾病模型的为支配的要求。的确，单方面去神经技术允许的皮肤与来自相同小鼠完整的或破坏的神经直接比较。这提供了一个理想的内部控制，以补偿从动物到动物的差异，与随后的数据分析利用配对t检验。
而这里描述的过程在很大程度上利用LacZ报告基因，这些实验可以适于使得中Gli1-CreERT2等位基因与其它荧光报道或有条件的等位基因组合以修改在TD基因表达。例如， 中Gli1-CreERT2小鼠可以越过与动物窝藏Patched1（B6N.129-PTCH1 tm1Hahn / J）28的条件基因产生形成诱导他莫昔芬后5 TD-源性肿瘤的小鼠。值得注意的是， 中Gli1-CreERT2应变也诱导重组在物理上不同于在TD 13分离中Gli1 +毛囊干细胞的一个子集是重要的。
下面去神经，皮肤神经保持数月（ 图3C）5,19稳定地烧蚀。在其他研究中，但是，一些重新支配已报道过时间6时发生。去神经表型的perdurance可取决于神经切除的完整性，因为它是绝对关键的切除从胸壁到接近于部位插入到皮肤的真皮层的点的出口之间的神经段。
完全removi纳克从活检之前的皮肤毛发可以增强随后形象化通过整个贴染色（ 图1B）阵的能力。这是通过将脱毛霜到限幅皮肤持续2分钟，然后用棉球擦拭头发远在一个前 - 至 - 后方向来实现的。请注意，脱毛可以通过促进进入生长期生长期影响毛发周期动力学。可替代地，毛发可以完全用刀片除去。此外，整个装入可进行免疫组织化学来可视化上从真皮分离上皮片阵和梅克尔细胞，如先前已描述23。
的可能性仍然是手术去神经可能在手术部位引起炎症，潜在混杂任何观察到的表型。根据我们的经验，我们还没有发现失神经后显著的炎症，可能是因为抵押品组织损伤的发生SK在该过程是否得当是轻微的。的可能性降到最低炎症可能影响结果，额外的控制可以掺入实验。例如，我们观察到去神经特异性抑制的TD源性肿瘤，但不相邻毛囊相关的相同皮肤样品中的病变，认为去神经和不一般的伤口诱导的炎症反应，有可能抑制肿瘤发生在TD 5。
要注意的是外科去神经烧蚀所有皮神经，包括感觉和交感神经纤维5是很重要的，并且因此提供了这些神经上或者是正常的或患病的皮肤的影响的一般整体评估。其他的实验方法，例如使用pharmacologics如肉毒杆菌神经毒素阻断神经传递，可能会产生更详细的机理的见解7，虽然目前还不清楚这些药剂是否抑制逆行细胞因子如刺猬配体的分泌。可替代地，已经使用诸如6-羟基化合物中的皮肤9以烧蚀交感神经。此外，对于神经源性因素如降钙素基因相关肽和P物质靶向受体可以是用于其利基6内询问神经和周围的细胞之间的特异性相互作用有用的。最终，多个策略可以组合用于识别，或至少排除，潜在的信号的机制。
最后，使用或者WNT1-Cre重组酶或Advillin-Cre重组酶可能代表阐明那些神经和自己的优势19之间交换信号的金标准有针对性的神经源性因子基因缺失的神经系。既不这些菌株是他莫昔芬诱导，然而，一些警告需要注意确保这些信号的该中断不损害神经的发育或适当た神经传入rgeting。一个他莫昔芬诱导酶Cre如Advillin-CreERT2的使用可能会有助于规避这些问题29。
总体而言，技术描述这里 - 一个谱系追踪，细胞可视化和去神经外科手术，提供了强有力的办法结合，为研究神经对正常和病变皮肤的影响。随着经验的积累，这些程序可以定期和可靠地执行，而造成最少困扰的动物或调查。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
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