Protocol
כל הנהלים המתואר בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת מישיגן היחידה לרפואת חיות מעבדה.
1. להשרות שחלוף עכברים
הערה: Gli1 TM3 (cre / ERT2) Alj / J זן העכבר (Gli1-CreERT2) 13 מאפשר מיקוד של שחלוף הנגרמת טמוקסיפן כדי TD epithelia. לחצות זן זה עם B6.129S4-GT (ROSA) 26Sor tm1Sor / עכברים הכתב J (LacZ) 22 כדי ליצור Gli1; חיות LacZ לדמיין תאים TD ידי כל הר מכתים להלן.
- הכן פתרון טמוקסיפן לריכוז של 12.5 מ"ג / מ"ל בשמן תירס.
- בתוך צינור 1.5 מ"ל, להוסיף עד 20 מ"ג טמוקסיפן גבישי, ולאחר מכן 1 מ"ל של שמן תירס. בתוקף ידביק את הצינור כדי מערבל מערבולת, מערבולת ברציפות על ההגדרה הגבוהה ביותר ב RT עד טמוקסיפן נמס לגמרי (2-4 שעות), כפיאושר על ידי בחינת הצינור תחת מיקרוסקופ לנתח עבור בהעדר חלקיקי טמוקסיפן.
- מעבירים את הפתרון צינור 15 מ"ל ו לדלל את טמוקסיפן לריכוז סופי של 12.5 מ"ג / מ"ל עם שמן תירס נוספים. מערבב על ידי vortexing הפתרון הצמיג עבור 30 שניות נוספות. אחסן את הפתרון הזה עד 1 שבוע ב 4 ° C בחושך.
- להזריק את הפתרון טמוקסיפן intraperitoneally לתוך Gli1; עכברים LacZ, בהיקף של 200 μl לכל 20 גרם של משקל גוף העכבר עבור מנה טמוקסיפן יעיל של 2.5 מ"ג משקל העכבר 20 גר '.
2. ביופסיות עור קציר
הערה: בהתאם הניסוי, ביופסיות עור הקציר כמה ימים עד שבועות לאחר אינדוקציה טמוקסיפן. לכל הניתוחים, בצע פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח מכרסם, כולל שימוש בכפפות סטריליות, לובש נטו מסכה או שיער כירורגית, ומכסה את החיה עם וילון ניתוח סטרילי במהלך ההליך.
- הכן 10x ההרדמה המניות על ידי ערבוב 90 מ"ג / מ"ל קטמין ו -6.5 מ"ג / מ"ל xylazine במים. לדלל זה פתרון המניות 01:10 לתוך PBS סטרילי רק לפני השימוש, ולאחסן ב RT בחושך במשך עד 8 חודשים.
- לחלופין, להרדים עכברי משאיפת isoflurane, החל ריכוז גז של 4% עם חמצן כדי להרדים את החיה באופן מלא, ולאחר מכן לאחר מכן הורדה זה ל 1-2% למשך ההליך.
- להזריק את חומר ההרדמה intraperitoneally במינון של 200 μl לכל משקל גוף 20 גרם העכבר. בדוק כי בעל החיים הגיעו המטוס התקין של הרגעה ידי assay קמצוץ בוהן, ולאשר כי לב ושיעורי נשימה הם נורמליות (כ 600 פעימות ו -160 נשימות לדקה, בהתאמה).
- השתמש גוזז חשמלי להסרת השיער מהאתר של ביופסיה על הגב בחזרה העור, נזהר שלא ניק או ניזק לעור הבסיסי.
- מכינים את האתר כירורגית על ידי מנגב את הגילוחתחום ד בכיוון הקדמי אל האחורי באמצעות מגבונים בבטאדין ואלכוהול. ודא כי כל קטעי השיער יוסרו מהאתר.
- התווה את אתר הביופסיה באמצעות טוש שחור, למקם את החיה על כרית חימום באזור כירורגית ספטית, ומכסי וילון ניתוח סטרילי (למטרות הדגמה, וילון סטרילי הושמט כדי להגדיל את נראות).
הערה: כדי להשיג סעיפים אורכים של זקיקי שיער, בקצה הארוך יותר של הביופסיה (לקצה להיות מחולק עבור היסטולוגיה, ~ 1 סנטימטר) צריך לרוץ לכיוון קדמי-אחורי (במקביל לכיוון של זקיקי שיער), parasagital כדי קו האמצע הגבה (איור 1 א). - השתמש אזמל # 11 סטרילי לבצע כריתה בעובי מלאה לאורך האזור המסומן מבלי לפגוע fascia שהרירי הבסיסי.
הערה: רקמת העור נכרת כולל את האפידרמיס, הדרמיס, שומן תת עורי ו מִרפָּד carnosus. הדימום הוא בדרך כלל מינימלי. - לרדד tהוא נכרת מדגם עור על מגבת נייר יבשה, הדרמיס בצד למטה, לקצץ משם מגבת נייר העודפת, ולאחסן את המדגם בקור PBS עד שעה 1 אם מדגמים אחרים צריכים להיאסף. כאשר מוכן, המשך צעדים 3.1 או 3.2 לעבד דגימות היסטולוגיה, או שלב 4 עבור מכתים כל הר β-galactosidase (LacZ).
- תפר לסגור את אתר הביופסיה באמצעות 6-0 תפרי ניילון, דפוס קטע פשוט במרווחים בערך זה מזה 3 מ"מ.
- אל תחזרו עכברים שעברו ניתוח לתוך באותו הכלוב כמו בעלי חיים אחרים עד לאחר החלמה מלאה.
- צג חיות מיד לאחר הניתוח עד שהם להכרתו, וגם על בסיס יומי עד אזור הניתוח הגליד, בדרך כלל תוך שבוע 1. השתמש במשככי כאבים על פי הנחיות לטיפול ולשימוש חיה מוסדיות המיועדות אם עכברים להפגין סימנים של כאב או מצוקה. סר תפרים בתוך 7-10 ימים לאחר ניתוח.
הערה: במידת הצורך, להכין פתרון כאבים על ידי דילול carprofen (50 מ"ג / מ"ל solut המניותיון) 1: 100 במים סטריליים. להזריק את תת עורי פתרון בין השכמות ליד בעורפו, במינון של 200 μl לכל משקל גוף 20 גרם (5 מ"ג / משקל גוף העכבר ק"ג).
3. דוגמאות תהליך עבור היסטולוגיה
הערה: כדי לתקן ולעבד את רקמת נכרת, השתמש באחת השיטות שלהלן, בהתאם ליישום.
- כדי ליצור דגימות היסטולוגית-מוטבע פרפין, לתקן את העור בפורמלין 3.7% ב PBS O / N ב RT ולאחסן באתנול 70% לתקופה של עד 2 שבועות. הסר את מגבת נייר לפני להטבעה לתוך פרפין.
- להפקת דגימות היסטולוגית קפוא, להטביע את הרקמה paraformaldehyde 4% קר PBS ולנער בעדינות במשך שעה 1. הסר את הפתרון ולשטוף את המדגם עם 3 שינויים של PBS, בערך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן, להטביע את המדגם ב סוכרוז 30% ב PBS cryoprotect הרקמה ( "טביעת סוכרוז").
- דגירה עם רעד O / N עדין על 4 מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את גרר נייראל לקצץ משם רקמת שומן עודף מצד העור של העור. הטמע הרקמה ישירות לתוך אוקטובר ולאחסן את הגוש הקפוא ב -80 מעלות צלזיוס.
הערה: לאחר חתך, או פרפין או דגימות קפואות יכול להיות מוכתם על ידי אימונוהיסטוכימיה לזהות TDS, תאי מרקל והעצבים באמצעות נוגדנים נגד קראטין 17, קראטין 8 ו neurofilament, בהתאמה, כפי שתואר לעיל 5,19.
4. דוגמאות דמיינו ידי כל הר LacZ מכתים
- כן פתרון מכתים X-gal.
- שלב monobasic פוספט 0.94 גרם נתרן, ו dibasic פוספט נתרן 2.6 גרם ב 250 מ"ל של מים סטריליים. התאם ל- pH 7.3. כדי זה, להוסיף 0.5 מ"ל של 1 M מגנזיום כלוריד, 0.528 גרם של פרוציאני אשלגן, ו 0.412 גרם של ferricyanide אשלגן. הוסף 250 μl של גליקול octylphenyl-פוליאתילן 125 מ"ג של deoxycholate. פתרון הבסיס יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים בחושך.
- כן 50x המנייה X-gal solutiעל ידי הוספת dimethylformamide לבקבוק X-gal המניות לייצר פתרון 50 מ"ג / מ"ל. אחסן את הפתרון הזה ב -20 ° C בחושך.
- רק לפני השימוש, לדלל המניה X-gal פתרון 1:50 לתוך פתרון בסיס X-gal לייצר פתרון מכתים. עבור ביופסיות קטנות (<1 סנטימטר 2), aliquot 1-2 מיליליטר של תמיסת מכתים לדגימה.
- תקן במדגם העור שנאספו שלב 2.7 בתמיסה המכילה glutaraldehyde 2% paraformaldehyde / 0.2% ב PBS קר למשך 30 דקות, רועד בעדינות על הקרח. עבור ביופסיות קטנות (<1 סנטימטר 2), להשתמש 1-2 מיליליטר של תמיסה מקבעת לדגימה.
הערה: לחילופין, לתקן דגימות paraformaldehyde 2-4% בלבד, או ב glutaraldehyde 0.5% בלבד. תנאי קיבעון אופטימלי תלוי הרקמה, מידת הביטוי LacZ ויישום. - הסר את הפתרון מקבע, ולשטוף דגימות עם 3 שינויים של PBS, 5 דקות כל אחד, על שייקר ב RT.
- הסר את מגבת נייר מתחת מדגם וחותכים ממנו excesזה רקמה שומן מצד העור של העור על ידי אחיזת השומן עם מלקחיים בוטים הזמירה במספריים לנתח.
- לצלול המדגם בתמיסה מכתים X-gal, לדגור על 37 מעלות CO / N. LacZ הביטוי יהיה גלוי כמו כתם כחול תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1 ב).
הערה: אם עוצמת האות חלשה, להחליף את הפתרון המכתים למחרת וחזור על דגירת O / N. אם מכתים הרקע הוא אינטנסיבי מדי, לצמצם את הזמן של מכתים, או דגירה המדגמת ב RT במקום 37 ° C. - הסר את הפתרון מכתים ולשטוף את דגימות 3 שינויים של PBS המכיל DMSO 3% למשך כ 5 דקות, רועד בעדינות ב RT.
- לשטוף דגימות 2-3 שינויים של אתנול 70% במשך 5 דקות כל אחד. חנות דגימות באתנול 70%.
5. denervation כירורגי
- להרדים את החיה כמו בשלב 2.2 ו לגלח את עור הגב כולו.
- מכינים את אזור הניתוח of העור בחזרה את השימוש במגבונים בבטאדין ואלכוהול, ולכסות את חיה עם וילון ניתוח סטרילי (למטרות הדגמה, הושמט וילון סטרילי כדי להגדיל את הנראות). שמור על חמי החיה באמצעות כרית חימום תוך שפעל באזור כירורגית ספטית.
- עושים חתך באמצעות אזמל # 11 סטרילי לאורך קו האמצע הגב מבסיס הצוואר בערך 0.5 ס"מ מעל הזנב.
- בעזרת מלקחיים בוטים, לשקף את העור בעדינות בצד השמאל מן האגף לדמיין את הרקמה הבסיסית מן רפידות שומן גלימה ליד הצוואר כדי בדיוק מעל הגפיים האחוריים.
הערה: עצבי עורית הגבו להופיע שערות לבנות כמו זה לנסוע caudally דרך fascia השקוף של הקיר בתא המטען לפני ביצוע עיקולים חדים והזנת רקמת החיבור הרופפת מתחת לפני העור (איור 2). - בעזרת מלקחיים Ultra- בסדר תחת מיקרוסקופ אור לנתח, להסיר את העצבים באופן בלעדי מצד שמאל של אנימהl ממוקם באתרים אנטומיים T3-12 ידי מריטת מאיפה העיקול מגזרים בכותל המטען לאתרים כניסתם לתוך העור (איור 2).
- מלקחי אוריינט אנכיים ולהסיר את העצבים תוך כדי אחיזה כ 0.5 סנטימטרים מתחת לאתרי העיקול שלהם ומושכים כלפי מעלה, גורם חוצפה למתוח ולהפריד מן הרקמה הסובבת (איור 2 ג - ה). היזהר, כדי למנוע פקיעת כלי דם סמוכים.
- המשך עד שכל העצבים המשתרעים קיר בתא המטען על העור יוסרו. אין לשבש את העצבים בתוך fascia הצפופה של הקיר בתא המטען. שמור על הרקמות לחות לאורך כל ההליך על ידי יישום טיפות התקופתי של תמיסת מלח סטרילית 0.9%.
- לחלופין, להסיר עצבים ידי אחיזת קצוות הפרוקסימלי ליד הקיר בתא המטען עם מלקחיים הוא גזרה במספריים בסדר. לאחר מכן, לנתק את הקצוות הדיסטלי ליד העור (איורים 2F - H). לבסוף, להסיר את intervening מגזרים עצבים (2I איור).
- הסר את כל העצבים מן דש העור נחשף שלב 5.4. סיבים אלו מהווים סניפים המרוחקים של עצבים עורית הגבה ומופיעים כמו שערות לבנות הסתעפות הממוקמת באופן ספוראדי בתוך רקמת חיבור בצד העור של דש העור (2J ומספרים - K).
- כדי להסיר אלה סניפים בסדר, למקם את המלקחיים בסדר בערך במקביל אל פני שטח עורי, לתפוס את העצבים למרוט כלפי מעלה כדי למנוע שיבוש כלי דם ניקוב העור. המשך עד שכל העצבים הגלויים הוסרו.
- באמצעות דיסקציה בוטה, לשקף את העור בצד ימין של חתך קו אמצע הגב, אבל לא להסיר את העצבים. זה ישמש את שליטת דמה מופעלים הנגדית.
- תפר לאורך קו האמצע הגב בדפוס קטע פשוט כדי לסגור את החתך. לפקח על בעלי חיים בזמן תהליך ההחלמה-אופר פוסטatively כפי שהוכח בעבר (שלבים 2.8-10). סר תפרים בתוך 7-10 ימים לאחר ניתוח.
- כדי תפקודי להעריך עד denervation יציבה עד מספר שבועות לאחר ניתוח, להסיר את השיער מן העור הגבה באמצעות גוזז חשמלי.
- בעדינות לדקור את שטח העור denervated באמצעות מחט המזרק, ושים לב אם מגיבה החיה, בדרך כלל על ידי רעדה או לסובב את הראש שלה. אם אזור העור כבר denervated ביציבות, החיה תפגין נמוכה, אם בכלל.
- באמצעות טוש שחור, המתאר את השטח של תשובה, כמו גם שטח של גודל ומיקום דומים בצד הדמה הנגדי.
- אסוף ביופסיות מאתרים אלה כמו שלבים 2.1-2.9 לניתוח.
הערה: לחלופין, הגבה כולו בחזרה העור, כוללים אזורי denervated ו דמה מופעל, ניתן להסיר כסיד יחיד עבור מכתים כל הר, בדומה כמתואר שלב 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על ידי עכברי יצירה להביע טמוקסיפן-מושרת Gli1-CreERT2 ו אלל כתב LacZ, אפשר לדמיין epithelia TD ולעקוב אחר גורלם של תאים אלה לאורך זמן. הליך denervation כולו בדרך כלל ניתן להשלים בתוך 1 hr לכל עכבר וצריך לגרום למצוקה מינימאלית לחיה.
המחקרים הקודמים שלנו הראו כי עצבים חיוניים לשמירה הן TDs רגיל וכן תאי קרטין 8 + מרקל הקשורים בהם (איורים 3 א - ג) 5,19. עצבים הם גם קריטי בקידום ביטוי Gli1 ב TD (איור 3D). בהתחשב המראה נדיר יחסית של אשכולות TD ברחבי העור (איור 1B), הוא הכרחי כדי לדגום חלקים קפואים מרובים כדי לכמת תדירות TD במדויק. בדרך כלל, אנו מעריכים 15-שמרנים שאינםסעיפים ecutive (כל 10 מיקרומטר עבה ~ 1 ס"מ אורך) משני דמה והעור denervated מכל חיה. בעקבות denervation, אובדן יציבה של עצבים, הן TD וברחבי העור, יכול להיות מאושרת על ידי בהעדר מכתים immunohistochemical עבור סמנים הפאן עצביות סטנדרטיים כגון neurofilament או בסעיפים קפוא או פרפין (איורים 3 א ו -3 ג, ו כמו בעבר דווח 5). לחלופין, עצבים ניתן לזהות גם על ידי ביטוי של β3 טובולין או PGP9.5 6,9.
באמצעות Gli1; עכברים LacZ, אפשר גם לאשר הן את הדרישה עצבים בהפעלת ה- Hedgehog signaling של TD ו בשמירה גורל התא TD על ידי שינוי רצף של רקומבינציה-induced טמוקסיפן ו denervation. אם denervation מתבצע לפני רקומבינציה, למשל, זה היה לבדוק את הדרישה עצבה בהפעלת pathwa הקיפודy, כמו פיקוח על ידי Cre recombinase פעילות ורמות, אשר מתואמים עם הביטוי Gli1 אצל בעלי חיים אלה. מצד השני, אם denervation מבוצעת לאחר רקומבינציה, זה היה להעריך את הדרישה עצבה בשמירת תאים כבר שכותרתו ב TD.
איור 1. ביופסית סקין כל הר מכתים LacZ של TD epithelia. (א) (למעלה) תצלום של עכבר לאחר ביופסיה לפני התפירה. (למטה משמאל) תמונה מוגדלת של אתר ביופסיה. (בפינה הימנית התחתונה) עור מדגם המתקבל ביופסיה עם הצד הדרמיס שלה רחב ושטוח על מגבת נייר יבש. (ב) כל הר LacZ מכתים של העור מפני Gli1; העכבר LacZ, 7 ימים לאחר אינדוקציה טמוקסיפן, מקולף רק לפני ביופסיה כדי לשפר להדמיה העור. Gli1 + / LacZ + TDs מתויגת אשכולות כחולים עזים.סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. שתי גישות denervating הגבה עור. (א) קריקטורה דיאגרמה של עור עכבר מעוצבבים. קווים מקווקווים אדומים מצביעים על כריתה יחידה עשתה לאורך קו האמצע גב לחשוף את השרירים הבסיסיים על הקיר בתא המטען (סגול) כמו גם בדרמיס (אפור, כוכבי) מתחת לעור המשתקף. גב עצבי עורית נסיעת caudally להופיע "לכופף" כפי שהם עוזבים את הקיר בתא המטען (החץ השחור מציין לכופף אחד כזה). עצב מגזרים להיות ניכרים מתוחמים על ידי קווים מקווקווים שחורים. (ב) תצלום של עצבים שלא ניזוקו עם אתרים של כיפוף מצוין (חיצים). חצים כחולים מצביעים על 2 מגזרים עצבים יהיה remעובד. תמונות - (D C) מראה טכניקה denervation. בעזרת מלקחיים Ultra- בסדר, אחיזה העצבים 0.5 ס"מ מתחת האתרים שלהם של כיפוף ומשוך כלפי חוץ. (ה) תמונה בה נראית חלל הגוף לאחר הסרת 2 מגזרים עצבים (חיצים כחולים). העצבים הנותרים צריך גם להסירו. (F - I) גישה חלופית להסרת עצב מתוארת, שבו עצבים גזזו את הפרוקסימלי שלהם מסתיים ממש מתחת למקום שבו הם לכופף (ראשי חץ) (G), וגם distally, קרוב לאתר של כניסתם לתוך העור (ראשי חץ) (H). ראוי לציין, כי חתך קו אמצע התמונות האלה הוא יותר טיפוסיים לצורך ויזואליזציה טובה יותר. (J) תצלום של צד העור של דש העור לידי ביטוי לצד אחד של קו האמצע. עצבים (K) מפורטים (קווים שחורים), עם כלי דם גדולים המצוין אדום. העצבים הממוקמים בצדו הדרמיס של הסקידש n גם צריך להיות ניכר. אסטריסק, שבבסיס הדרמיס מן דש העור לידי ביטוי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אובדן יציב של עצבי הידרדרות TDs לאחר denervation. (א) אימונוהיסטוכימיה מראה epithelia TD עם קראטין 8 + תאי מרקל (K8, ירוק) neurofilament + עצבים (NF, אדום) בעור המופעל באמצעות אחיזת עיניים. (ב) תיאור קריקטורה, עם epithelia TD מודגש תאים סגולים, מרקל בירוק, עצבי תחושה בכחול. (C) אימונוהיסטוכימיה מראה העור denervated (den) חסר מתחמי neurite תאי מרקל בתחום TD. קווים צהובים מקווקוים, האפיתל זקיק שיער. אסטריסק, backgrounמכתים ד. (ד) כל הר LacZ מכתים של הגב בחזרה העור מפני Gli1 LacZ / + עכבר 2 שבועות לאחר denervation העור חד-צדדית. בתיבה משמאל חתך קו האמצע הבריא (חץ), epithelia TD שכותרתו בשפע הם נצפו עור דמה מופעל. מימין לקו האמצע, TDS אינו גלוי בעור denervated. בר סולם = 10 מיקרומטר עבור (א), (ג); ו 1 מ"מ עבור (D). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עצבים לשרת פונקציות חיוניות לא רק תחושה, אלא גם בפיתוח איבר יונק, בשמירה ובחידוש 13,24-27. כפי עצבים היו מעורבים לאחרונה בהפרעות עור מגוונות, הטכניקות המתוארות כאן יכולות לשמש כדי לחקור את דרישת העצבוב במגוון דגמי המחלה בבעלי החיים. למעשה הטכניקה denervation חד-צדדית מאפשרת השוואה ישירה של העור או עם העצבים שלא ניזוקו או שיבשו מאותו עכבר. זה מספק בקרה פנימית אידיאלית כדי לפצות על הבדלים חי אל-חיה, עם הנתונים הבאים מנתחת עשיית שימוש של מבחן t מזווג.
בעוד בהתאם לנוהל המתואר בעיקר לנצל את הגן הכתב LacZ, ניסויים אלה ניתן להתאים כך אלל Gli1-CreERT2 בשילוב עם אללים הכתב או מותנה ניאון אחרים כדי לשנות ביטוי גנים TD. למשל, עכברי Gli1-CreERT2 ניתן חצועם חיות מחסה אללים מותנה של Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 כדי ליצור עכברים יוצרים גידולים שמקורם TD לאחר אינדוקציה טמוקסיפן 5. חשוב לציין כי המתח Gli1-CreERT2 גם גורם רקומבינציה משנה של תאי גזע זקיק השיער Gli1 + כי מופרדים פיזית מאלו TD 13.
בעקבות denervation, עצבים בעור להישאר ablated ביציבות במשך כמה חודשים (איור 3 ג) 5,19. במחקרים אחרים, לעומת זאת, קצת מחדש עצבוב דווח להתרחש לאורך זמן 6. Perdurance של פנוטיפ denervated תלוי היסודי של הסרת עצב, כפי שהוא קריטי שיחתכו מגזרים עצבים בין היציאה שלהם מקיר החזה עד לנקודה בקרבת האתרים של כניסה לתוך הדרמיס של העור.
לגמרי removing השיער מהעור לפני ביופסיה יכול לשפר את היכולת מכן לדמיין TDs ידי מכתים כל הר (איור 1B). מטרה זו מושגת על ידי החלת קרם מקריח לעור מקוטע למשך 2 דקות, ולאחר מכן לנגב את השיער משם לכיוון הקדמי אל האחורי באמצעות כדורי צמר גפן. שימו לב: אפילציה יכול להשפיע קינטיקה מחזור השיער באמצעות קידום כניסתו שלב הצמיחה anagen. לחלופין, שיער ניתן להסיר לחלוטין באמצעות סכין גילוח. בנוסף, הר שלם אימונוהיסטוכימיה ניתן לבצע כדי להמחיש TDs ותאי מרקל על יריעות אפיתל מופרד הדרמיס, כפי שתואר קודם לכן 23.
אך יש סבירות גבוהה כי denervation כירורגי עשוי לגרום לדלקת באתר כירורגית, פוטנציאל בלבול כלשהו פנוטיפים שנצפו. מניסיוננו, שלא הבחנו דלקת משמעותית לאחר denervation, סביר להניח כי הנזק האגבי רקמות שהתהוו במהלך skב הוא קל אם הפרוצדורה מבוצעת כראוי. כדי למזער את האפשרות כי דלקת עלולה להשפיע על תוצאותיו, בקרות נוספות ניתן לשלב הניסוי. לדוגמא, צפינו כי denervation עכבות במיוחד גידולים שמקורם TD, אבל לא שיער סמוך זקיק הקשורים נגעים בדגימות העור אותו, בטענה כי denervation-ולא דלקתי כללי נגרם פצע tumorigenesis עכבות תגובה-הנראה על TD 5.
חשוב לציין כי denervation כירורגית ablates כל העצבים עורית, כוללים סיבים חושיים ואוהד 5, ובכך מספק הערכה כוללת כללי בהשפעת העצבים אלה על עור או נורמלי או חולה. גישות ניסיוניות אחרות, למשל באמצעות pharmacologics כגון עצבי הבוטוליזם חוסמים עצביות, עשוי להניב תובנה מכניסטית מפורטות יותר 7, אם כי לא ברור אם תכשירים אלו מעכבים מדרדריםהפרשת ציטוקינים כגון הליגנדים קיפוד. לחלופין, תרכובות כגון 6-hydroxydopamine שימשו לקטוע העצבים הסימפתטית בעור 9. בנוסף, המיקוד הקולטנים לגורמי נגזרות עצבים כגון פפטיד גן הקשורות קלציטונין ו- P ואלכוהול עשוי להיות שימושי עבור לחקור אינטראקציות ספציפיות בין עצבים והתאים המקיפים בתוך הנישה שלהם 6. בסופו של דבר, אסטרטגיות מרובות עשויים להיות מנוצלות בשילוב לזהות, או לפחות לשלול, מנגנוני איתות פוטנציאליים.
לבסוף, ממוקד מחיקה גנטית של גורמי נגזרות עצבים בשושלת העצבית או באמצעות Wnt1-Cre או Advillin-Cre עשוי לייצג את תקן הזהב עבור הבהרת האותות שמועברים בין עצבי הנישה שלהם 19. כפי שאף אחד הזנים אלה הם טמוקסיפן-מושרים, לעומת זאת, קצת זהירות צריכה לנקוט כדי להבטיח שיבוש של האותות הללו אינם פוגע פיתוח עצב או ta הנאהrgeting של afferents העצבי. השתמש של Cre טמוקסיפן-מושרה כגון Advillin-CreERT2 עשוי לעזור לעקוף בעיות אלה 29.
בסך הכל, הטכניקות מתוארות כאן-שילוב של מעקב שושלת, להדמית תא וגישות עצמה כירורגית denervation-הצעה לחקר השפעת העצבים על עור בריא וחולה. עם ניסיון, נהלים אלה ניתן לבצע באופן שיגרתי ובאמינות, תוך גרימת מצוקה מינימאלית לחיה-או החוקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
- Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
- Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
- Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
- Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
- Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
- Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
- Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
- Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
- Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
- Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
- Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
- Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
- Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
- Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
- Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
- English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
- Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
- Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
- Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
- Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
- Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
- Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).
