Protocol
Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità alle norme stabilite dalla University of Michigan Unità per la Medicina di Laboratorio degli animali.
1. Indurre ricombinazione genetica nei topi
Nota: Il Gli1 TM3 (CRE / ERT2) Alj / J ceppo di topi (Gli1-CreERT2) 13 permette di mira di ricombinazione genetica tamoxifene indotta a TD epiteli. Attraversare questo ceppo con B6.129S4-Gt (ROSA) topi reporter 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 per generare Gli1, animali LacZ di visualizzare le cellule TD di tutto il montaggio colorazione di seguito.
- Preparare la soluzione tamoxifene ad una concentrazione di 12,5 mg / ml in olio di mais.
- In una provetta da 1,5 ml, aggiungere fino a 20 mg di tamoxifene cristallini, e quindi 1 ml di olio di mais. Saldamente nastro il tubo di un vortex e vortex in continuo con l'impostazione più alta a temperatura ambiente fino a quando il tamoxifene si è completamente dissolto (2-4 ore), comeconfermata esaminando il tubo sotto un microscopio da dissezione per l'assenza di particolato tamoxifene.
- Trasferire la soluzione in una provetta da 15 ml e diluire le tamoxifene ad una concentrazione finale di 12,5 mg / ml di olio di mais aggiuntivo. Mescolare vortexando la soluzione viscosa per un ulteriore 30 sec. Conservare questa soluzione per 1 settimana a 4 ° C al buio.
- Iniettare la soluzione tamoxifene via intraperitoneale nel Gli1; topi LacZ, ad un volume di 200 microlitri per 20 g di peso corporeo del mouse, per una dose tamoxifene efficace di 2,5 mg per 20 g di peso mouse.
2. biopsie cutanee Harvest
NOTA: a seconda dell'esperimento, biopsie cutanee raccolto parecchi giorni o settimane dopo l'induzione tamoxifene. Per tutti gli interventi chirurgici, seguire protocolli standard per la chirurgia roditori, tra cui l'uso dei guanti sterili, indossando una maschera o di capelli chirurgica rete, e che copre l'animale con un telo chirurgico sterile durante la procedura.
- Preparare 10x soluzione madre di anestetico miscelando 90 mg / ml di ketamina e 6,5 mg / ml in acqua xilazina. Diluire questa soluzione 1:10 in PBS sterile al momento dell'uso, e conservare a temperatura ambiente al buio per un massimo di 8 mesi.
- In alternativa, anestetizzare topi per inalazione isoflurano, iniziando con una concentrazione di gas del 4% con l'ossigeno per anestetizzare completamente l'animale, e successivamente abbassare tale al 1-2% per la durata della procedura.
- Iniettare la soluzione di anestetico per via intraperitoneale alla dose di 200 ml per 20 g di peso corporeo del mouse. Verificare che l'animale ha raggiunto il corretto piano di sedazione mediante test punta pizzico, e confermare che il cuore e la frequenza respiratoria sono normali (circa 600 battiti e 160 respiri al minuto, rispettivamente).
- Utilizzare un tagliatore elettrico per rimuovere i capelli dal sito della biopsia sulla pelle dorsale posteriore, facendo attenzione a non intaccare o danneggiare la pelle sottostante.
- Preparare il sito chirurgico pulendo la rasaturaArea D in senso antero-a-posteriore con Betadine e alcool salviette. Assicurarsi che tutti i ritagli di capelli vengono rimossi dal sito.
- Outline al sito biopsia con un pennarello nero, collocare l'animale su un blocco di riscaldamento in una zona chirurgica asettica, e coprire con un telo chirurgico sterile (per scopi dimostrativi, telino sterile è stata omessa per aumentare la visibilità).
Nota: Per ottenere sezioni longitudinali dei follicoli piliferi, il bordo più lungo della biopsia (il bordo da sezionare per istologia, ~ 1 cm) dovrebbe funzionare in direzione anteriore-posteriore (parallela alla direzione dei follicoli piliferi), parasagital per linea mediana dorsale (Figura 1A). - Utilizzare uno sterile # 11 bisturi per fare una escissione tutto spessore lungo l'area contrassegnata senza danneggiare la fascia muscolare sottostante.
Nota: Il tessuto della pelle asportato comprende l'epidermide, derma, grasso sottocutaneo e pannicolo carnosus. Il sanguinamento è in genere minima. - appiattire tha asportato campione di pelle su un tovagliolo di carta a secco, derma lato verso il basso, assetto via il tovagliolo di carta in eccesso, e conservare il campione in PBS freddo per un massimo di 1 ora se altri campioni devono essere raccolti. Quando si è pronti, procedere ai passaggi 3.1 o 3.2 per elaborare i campioni per l'istologia, o il punto 4 per β-galattosidasi (LacZ) colorazione tutto il montaggio.
- Sutura chiudere il sito di biopsia con 6-0 punti di sutura in nylon, in un modello semplice interrotto distanziati di circa 3 mm.
- Non restituire i topi che hanno subito un intervento chirurgico nella stessa gabbia, come gli altri animali fino a dopo il pieno recupero.
- Monitorare gli animali subito dopo l'intervento chirurgico fino a che riprendano conoscenza, e anche tutti i giorni fino a quando l'area chirurgica è guarita, in genere entro 1 settimana. Utilizzare analgesici in conformità con le linee guida per la cura degli animali e uso istituzionale designati se i topi mostrano segni di dolore o disagio. Rimuovere suture entro 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
Nota: Se necessario, preparare la soluzione analgesica diluendo Carprofen (50 mg / ml di solution) 1: 100 in acqua sterile. Iniettare la soluzione per via sottocutanea tra le scapole vicino alla collottola, ad una dose di 200 ml per 20 g di peso corporeo (5 mg / kg di peso corporeo del mouse).
3. I campioni di processo per Istologia
Nota: Per risolvere ed elaborare il tessuto asportato, utilizzare entrambi i metodi qui di seguito a seconda dell'applicazione.
- Per generare campioni istologici inclusi in paraffina, fissare la pelle in 3,7% di formalina in PBS O / N a temperatura ambiente e conservare in etanolo al 70% per un massimo di 2 settimane. Rimuovere il tovagliolo di carta prima di incorporare in paraffina.
- Per la generazione di campioni istologici congelati, immergere il tessuto a freddo paraformaldeide 4% in PBS e agitare delicatamente per 1 ora. Rimuovere la soluzione e lavare il campione con 3 cambi di PBS, circa 5 minuti ciascuno. Successivamente, immergere il campione nel 30% di saccarosio in PBS per cryoprotect tessuto ( "sinking saccarosio").
- Incubare con dolce O agitazione / N a 4 ° C. Il giorno successivo, rimuovere il rimorchio di cartael e tagliare via il tessuto adiposo in eccesso dal lato dermico della pelle. Incorporare il tessuto direttamente in Office e memorizzare il blocco congelato a -80 ° C.
Nota: Dopo aver sezionato, sia paraffina o campioni congelati possono essere colorati mediante immunoistochimica per identificare TD, cellule di Merkel e nervi che utilizzano gli anticorpi contro rispettivamente cheratina 17, cheratina 8 e Neurofilament, come descritto in precedenza 5,19.
4. I campioni Visualizza per tutto il montaggio colorazione LacZ
- Preparare soluzione colorante X-gal.
- Combinare 0,94 g sodio fosfato monobasico, e 2,6 g di sodio fosfato bibasico in 250 ml di acqua sterile. Regolare il pH a 7,3. Per questo, aggiungere 0,5 ml di 1 M di cloruro di magnesio, 0,528 g di ferrocianuro di potassio, e 0,412 g di ferricianuro di potassio. Aggiungere 250 ml di glicole ottilfenil-polietilene e 125 mg di desossicolato. La soluzione di base può essere conservato a 4 ° C per 6 mesi al buio.
- Preparare 50x Stock X-gal solution aggiungendo dimetilformammide nel X-gal magazzino bottiglia per generare una soluzione 50 mg / ml. Conservare la soluzione a -20 ° C al buio.
- Appena prima di utilizzare, diluire soluzione madre X-gal 01:50 nella soluzione di base di X-gal per generare soluzione colorante. Per biopsie piccole (<1 cm 2), aliquote 1-2 ml di soluzione colorante per campione.
- Fissare il campione di pelle raccolto nel passaggio 2.7 in una soluzione contenente 2% paraformaldeide / 0,2% glutaraldeide in PBS freddo per 30 minuti, agitando delicatamente su ghiaccio. Per biopsie più piccoli (<1 cm 2), usare 1-2 ml di soluzione fissativa per campione.
Nota: In alternativa, fissare campioni 2-4% paraformaldeide solo, o in 0,5% solo glutaraldeide. condizioni di fissaggio ottimali dipendono dal tessuto, grado di espressione LacZ e applicazione. - Rimuovere la soluzione fissativo, e risciacquare i campioni con 3 cambi di PBS, 5 minuti ciascuna, su un agitatore a temperatura ambiente.
- Rimuovere il tovagliolo di carta sotto il campione e tagliare via excess tessuto adiposo dal lato dermico della pelle afferrando il grasso con una pinza smussato e taglio con le forbici dissezione.
- Immergere il campione in soluzione colorante X-gal, e incubare a 37 ° CO / N. Espressione LacZ sarà visibile come una macchia blu sotto un microscopio da dissezione (Figura 1B).
Nota: Se l'intensità del segnale è debole, sostituire la soluzione colorante il giorno successivo e ripetere l'/ incubazione O N. Se la colorazione di fondo è troppo intenso, ridurre il tempo di colorazione o incubare il campione a RT invece di 37 ° C. - Rimuovere la soluzione colorante e lavare i campioni in 3 cambi di PBS contenente 3% DMSO per circa 5 minuti, scuotendo delicatamente a temperatura ambiente.
- Lavare i campioni in 2-3 cambi di etanolo al 70% per 5 minuti ciascuna. Conservare i campioni in etanolo al 70%.
5. denervazione chirurgica
- Anestetizzare l'animale come al punto 2.2 e la barba tutta la pelle dorsale.
- Preparare l'area chirurgica of indietro la pelle con Betadine e cotone imbevuto di alcol, e coprire l'animale con un telo chirurgico sterile (per scopi dimostrativi, telino sterile è stata omessa per aumentare la visibilità). Tenere il caldo animale con una piastra elettrica durante il funzionamento in una zona chirurgica asettica.
- Fare un'incisione utilizzando una sterile # 11 bisturi lungo la linea mediana dorsale dalla base del collo per circa 0,5 cm sopra la coda.
- Utilizzando pinze smussato, riflette delicatamente la pelle sul lato sinistro di distanza dal fianco di visualizzare il tessuto sottostante dai cuscinetti adiposi scapolare vicino al collo appena sopra il arto posteriore.
Nota: nervi cutanei dorsali appaiono filamenti come bianchi che viaggiano caudalmente attraverso la fascia trasparente della parete tronco prima di effettuare curve strette e inserendo il tessuto connettivo lasso sotto la pelle (Figura 2). - Utilizzando una pinza ultrafini sotto un microscopio ottico dissezione, rimuovere i nervi esclusivamente dal lato sinistro della animal situata in siti anatomici T3-12 pizzicando da dove la curva segmenti alla parete tronco ai loro siti di ingresso nella pelle (Figura 2).
- Pinze Orient verticalmente e rimuovere i nervi afferrando circa 0,5 cm sotto i loro siti di piegatura e tirando verso l'alto, causando il nervo per allungare e separare dal tessuto circostante (Figura 2C - E). Fare attenzione ad evitare la rottura dei vasi sanguigni adiacenti.
- Continuare finché tutti i nervi che si estendono dalla parete tronco alla pelle vengono rimossi. Non disturbare i nervi all'interno della fitta fascia della parete tronco. Mantenere il tessuto umido durante tutta la procedura applicando periodicamente gocce di soluzione salina sterile allo 0,9%.
- In alternativa, rimuovere i nervi afferrando loro estremità prossimali vicino alla parete tronco con una pinza e snipping con le forbici sottili. Successivamente, tagliare le estremità distali vicino alla pelle (figure 2F - H). Infine, rimuovere il intsegmenti nervosi ervening (Figura 2i).
- Rimuovere eventuali nervi dal lembo di pelle esposta al punto 5.4. Queste fibre comprendono i rami distali delle dorsali nervi cutanei e appaiono come bianche ciocche di ramificazione si trovano sporadicamente all'interno del tessuto connettivo dermico sul lato del lembo cutaneo (figure 2J - K).
- Per rimuovere queste belle rami, posizionare la pinza sottile approssimativamente parallelo alla superficie cutanea, afferrare i nervi e cogliere verso l'alto per evitare di interrompere i vasi sanguigni e pungere la pelle. Continuare fino a quando tutti i nervi visibili sono stati rimossi.
- Utilizzando smussa, riflettere la pelle sul lato destro della dorsale incisione mediana, ma non rimuovere i nervi. Questo servirà come il controlaterale di controllo sham-operated.
- Sutura lungo la linea mediana dorsale in un semplice schema interrotto per chiudere l'incisione. Monitorare l'animale durante il recupero e post-opertivamente come precedentemente dimostrato (Piazza di 2,8-10). Rimuovere suture entro 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Per valutare funzionalmente stabile denervazione fino a diverse settimane dopo l'intervento, rimuovere i capelli dalla pelle dorsale con un tagliatore elettrico.
- pungere delicatamente la zona della pelle denervato usando un ago ipodermico, e notare se l'animale risponde, in genere un brivido o girare la testa. Se l'area di pelle è stato stabilmente denervato, l'animale esporrà poca o nessuna risposta.
- Con un pennarello nero, delimitare l'area di risposta, nonché una zona di dimensioni e posizione simile sul lato controlaterale sham.
- Raccogliere biopsie di questi siti, come nei passaggi 2.1-2.9 per l'analisi.
Nota: In alternativa, tutta la schiena dorsale della pelle, comprese le regioni denervati e sham-operati, può essere rimosso come un singolo foglio per tutto il montaggio colorazione, simile a quanto descritto al punto 4.
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Representative Results
Dai topi che esprimono generando tamoxifene-inducibile Gli1-CreERT2 e un allele LacZ giornalista, è possibile visualizzare TD epiteli e tracciare le sorti di queste cellule nel corso del tempo. L'intera procedura di denervazione in genere può essere completata entro 1 ora per mouse e dovrebbe causare disagio minimo per l'animale.
I nostri studi precedenti hanno indicato che i nervi sono cruciali per mantenere entrambi i TDs normali così come le loro cellule associate cheratina 8 + Merkel (figure 3A - C) 5,19. I nervi sono anche fondamentali per promuovere l'espressione Gli1 in TD (Figura 3D). Data l'aspetto relativamente poco frequenti di cluster TD tutta la pelle (Figura 1B), è indispensabile per campionare più sezioni congelate per quantificare con precisione la frequenza TD. Tipicamente, valutiamo 15 non-conssezioni ecutive (ciascuno lungo 10 micron di spessore e ~ 1 cm) sia da farsa e la pelle denervata da ciascun animale. Dopo denervazione, perdita stabile di nervi, sia a TD e tutta la pelle, può essere confermato dall'assenza di colorazione immunoistochimica per markers pan-neurale standard come Neurofilament in entrambe le sezioni congelate o paraffina (Figure 3A e 3C, e come precedentemente segnalati 5). In alternativa, i nervi possono essere identificate da espressioni di β3-tubulina o PGP9.5 6,9.
Utilizzando Gli1; topi LacZ, è anche possibile confermare sia l'esigenza di nervi nell'attivazione Hedgehog nel TD e nel mantenimento destino cellulare TD variando la sequenza di ricombinazione tamoxifene-indotta e denervazione. Se denervazione viene eseguita prima di ricombinazione, per esempio, ciò testare il requisito di nervi nell'attivare il pathwa Hedgehogy, come monitorato da attività ricombinasi Cre e livelli, che sono correlati con l'espressione Gli1 in questi animali. D'altra parte, se viene eseguita dopo denervazione ricombinazione, ciò valutare la necessità di nervi nel mantenimento cellule già marcate in TD.
Figura 1. La biopsia della pelle e tutto il montaggio LacZ colorazione dei TD epiteli. (A) (in alto) Fotografia di topo dopo la biopsia e prima della sutura. (In basso a sinistra) immagine ingrandita sito biopsia. campione di pelle (in basso a destra) ottenuto da biopsia con il lato derma diffondere piatto su un tovagliolo di carta asciutto. (B) tutto il montaggio LacZ colorazione di pelle da una Gli1, LacZ mouse, 7 giorni dopo l'induzione tamoxifene, depilati appena prima di biopsia per migliorare la visualizzazione della pelle. Gli1 + / LacZ + TDs sono etichettati come intenso cluster blu.Scala grafica = 1 cm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Due approcci per denervating pelle dorsale. (A) Schema di cartone animato di pelle innervata mouse. Red linee tratteggiate indicano un singolo escissione fatta lungo la linea mediana dorsale per esporre la muscolatura sottostante alla parete tronco (viola) e il derma (grigio, asterisco) sotto la pelle riflessa. Dorsale nervi cutanei che viaggiano caudale sembrano "piegare" che lasciano la parete tronco (la freccia nera indica una tale curva). segmenti coraggio di essere asportati sono delimitate da linee tratteggiate nere. (B) Fotografia di nervi intatti con i siti di piegatura indicati (frecce). Le frecce blu indicano i segmenti 2 nervose che saranno remOved. (C - D) Le fotografie che mostrano la tecnica denervazione. Utilizzando pinze ultra-fine, afferrare i nervi di 0,5 cm sotto i loro siti di piegatura e tirare verso l'esterno. (E) Fotografia che mostra la cavità del corpo dopo la rimozione di 2 segmenti nervosi (frecce blu). I restanti nervi anche bisogno di essere rimossi. (F - I) Un approccio alternativo per la rimozione del nervo è raffigurato, in cui i nervi sono snipped al loro prossimale finisce appena sotto dove Bend (punte di freccia) (G), e anche distale, vicino al loro sito di entrata in pelle (punte di freccia) (H). Si noti che l'incisione mediana in queste immagini è più lungo tipico fini di una migliore visualizzazione. (J) fotografico lato dermica del lembo cutaneo riflessa su un lato della linea mediana. (K) I nervi sono delineati (linee nere), con i vasi sanguigni più grandi indicati in rosso. I nervi situati sul lato derma dello scin lembo anche bisogno di essere asportato. Asterisk, sottostante derma dal lembo cutaneo riflessa. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. perdita stabile di nervi e deterioramento del TD dopo denervazione. (A) Immunohistochemistry mostrando TD epiteli con cheratina 8 + cellule di Merkel (K8, verde) e neurofilamenti + nervi (NF, rosso) in pelle sham-operated. (B) rappresentazione del fumetto, con epiteli TD evidenziato in cellule di Merkel, viola in verde, e nervi sensoriali in blu. (C) Immunohistochemistry mostrando la pelle denervato (DEN) manca complessi cellule del neurite Merkel all'interno dell'area TD. linee gialle tratteggiate, follicolo pilifero dell'epitelio. Asterisk, background colorazione. (D) tutto il montaggio LacZ colorazione dorsale posteriore pelle da Gli1 LacZ / + topo 2 settimane dopo unilaterale denervazione pelle. Nella casella a sinistra della linea mediana incisione guarito (freccia), abbondanti epiteli TD etichettati sono stati osservati in pelle sham-operated. A destra della linea mediana, TD non sono visibili in pelle denervato. Barra di scala = 10 micron per (A), (C); e 1 mm per (D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I nervi svolgono funzioni cruciali non solo nella sensazione, ma anche nello sviluppo degli organi dei mammiferi, la manutenzione e la rigenerazione 13,24-27. Come nervi sono stati recentemente implicati in malattie della pelle diversi, le tecniche qui descritte possono essere utilizzati per studiare il requisito di innervazione in una varietà di modelli di malattia degli animali. Infatti, la tecnica denervazione unilaterale consente il raffronto diretto di pelle sia con nervi integri o interrotti dalla stessa mouse. Questo fornisce un controllo interno ideale per compensare le differenze animale a animale, con successiva analisi dei dati utilizzando un t-test accoppiato.
Mentre le procedure qui descritte ampiamente utilizzano il gene reporter LacZ, questi esperimenti possono essere adattati in modo tale che l'allele Gli1-CreERT2 è combinato con altri alleli reporter fluorescente o condizionati per modificare l'espressione genica in TD. Per esempio, i topi Gli1-CreERT2 possono essere attraversaticon gli animali ospitano alleli condizionali di Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 per generare topi che formano i tumori TD-derivati dopo l'induzione tamoxifene 5. È importante notare che il ceppo Gli1-CreERT2 induce anche ricombinazione in un sottogruppo di cellule staminali del follicolo pilifero Gli1 + che sono fisicamente separate da quelle del TD 13.
A seguito di denervazione, nervi della pelle rimangono stabilmente ablazione per diversi mesi (Figura 3C) 5,19. In altri studi, tuttavia, alcuni ri-innervazione è stato riscontrato nel corso del tempo 6. Il perdurance del fenotipo denervata può dipendere dalla completezza di rimozione del nervo, come è assolutamente critico per asportare segmenti nervosi tra loro uscita dalla parete toracica ad un punto vicino ai siti di inserimento nel derma della pelle.
completamente Removing i capelli dalla pelle prima di biopsia può migliorare la capacità di visualizzare successivamente TD di tutto il montaggio colorazione (Figura 1B). Questo si ottiene applicando la crema depilatoria sulla pelle ritagliata per 2 minuti, e poi pulire i capelli lontano in direzione anteriore-posteriore con batuffoli di cotone. Si prega di notare che la depilazione può influenzare la cinetica del ciclo dei capelli, promuovendo l'ingresso nella fase di crescita anagen. In alternativa, i capelli possono essere completamente rimosso usando una lama di rasoio. Inoltre, tutto il montaggio immunoistochimica può essere eseguita per visualizzare TD e cellule di Merkel su fogli epiteliali separati dal derma, come è stato descritto in precedenza 23.
Resta la possibilità che la denervazione chirurgica può causare infiammazione al sito chirurgico, potenzialmente confondere eventuali fenotipi osservati. Nella nostra esperienza, non abbiamo osservato notevole infiammazione dopo denervazione, probabilmente perché il danno tissutale collaterali sostenute nel skin è leggera se la procedura è fatto correttamente. Per ridurre al minimo la possibilità che l'infiammazione può influenzare i risultati, controlli aggiuntivi possono essere incorporati nel esperimento. Per esempio, abbiamo osservato che la denervazione specificamente inibisce tumori TD-derivati, ma le lesioni nelle stesse campioni di pelle non capelli adiacente follicolo-associato, sostenendo che la denervazione, e non un generale ferita indotta infiammatoria risposta-probabile tumorigenesi inibito al TD 5.
E 'importante notare che la denervazione chirurgica ablates tutti i nervi cutanei, comprese le fibre sensoriali e simpatiche 5, e quindi fornisce una valutazione complessiva generale dell'influenza di questi nervi su entrambi pelle normale o malati. Altri approcci sperimentali, per esempio utilizzando pharmacologics come la neurotossina botulinica di bloccare la neurotrasmissione, può produrre intuizioni meccanicistici più dettagliate 7, anche se non è chiaro se questi agenti inibiscono retrogradasecrezione di citochine come ligandi Hedgehog. In alternativa, composti come 6-idrossidopamina sono stati utilizzati per l'ablazione nervi simpatici nella pelle 9. In aggiunta, il targeting i recettori per i fattori nervosi-derivati, come calcitonina peptide correlato al gene e sostanza P può essere utile per interrogare le interazioni specifiche tra nervi e le cellule circostanti all'interno della loro nicchia 6. In definitiva, molteplici strategie possono essere utilizzate in combinazione per identificare, o almeno escludono, potenziali meccanismi di segnalazione.
Infine, mirata delezione genetica di fattori nervosi di derivazione nel lignaggio neurale utilizzando Wnt1-Cre o Advillin-Cre può rappresentare il gold standard per chiarire i segnali che vengono scambiati tra i nervi e la loro nicchia 19. Poiché nessuno di questi ceppi sono tamoxifene-inducibile, tuttavia, una certa cautela deve essere preso per assicurare che l'alterazione di questi segnali non mettere in pericolo lo sviluppo del nervo o il corretto targeting delle afferenze neuronali. L'uso di un Cre tamoxifene-inducibile come Advillin-CreERT2 può aiutare aggirare questi problemi 29.
Nel complesso, le tecniche descritte qui-una combinazione di stirpe tracing, la visualizzazione delle cellule e denervazione-offrono approcci chirurgici potenti per studiare l'influenza dei nervi sulla pelle normale e malati. Con l'esperienza, queste procedure possono essere eseguite di routine e affidabile, mentre causando disagio minimo per l'animale, o il ricercatore.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
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