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Medicine

皮膚外科神経切除:皮膚病のマウスモデルにおける神経のための要件をテストする方法

Published: June 26, 2016 doi: 10.3791/54050
* These authors contributed equally

Protocol

このプロトコルで説明されているすべての手順は、実験動物医学のためにミシガン大学の単位によって確立された規則に従って行われました。

1.マウスの遺伝的組換えを誘導します

:Gli1の TM3(CRE / ERT2)ALJ / Jマウス系統(Gli1の -CreERT2)13は、上皮をTDためにタモキシフェン誘導性の遺伝子組換えの標的化を可能にします。 Gli1のを生成するために22( LacZ)B6.129S4-GT(ROSA)26Sor tm1Sor / Jレポーターマウスとこの株を渡り、LacZを動物以下の染色ホールマウントにより、TD細胞を可視化します。

  1. コー​​ン油中の12.5mg / mlの濃度にタモキシフェン溶液を調製します。
    1. 1.5ミリリットルチューブでは、結晶性タモキシフェンを20mg、及びコーン油の後、1ミリリットルまで追加。タモキシフェンは、完全に(2-4時間)に溶解するまでのように、しっかりとボルテックスミキサーにチュ​​ーブをテープ、そしてRTで最高の設定で連続渦タモキシフェン微粒子の欠如のために解剖顕微鏡下で管を検査することによって確認されました。
    2. 15ミリリットルチューブにソリューションを転送し、追加のトウモロコシ油とミリリットルの12.5mg /の最終濃度にタモキシフェンを希釈します。さらに30秒間、粘性溶液をボルテックスして混合します。暗所で4℃で1週間までこの溶液を保管してください。
  2. Gli1の腹腔内にタモキシフェンソリューションを注入し、LacZのマウスを、マウス体重の20グラムあたり200マイクロリットルの容量で、20グラムのマウスの重量当たり2.5ミリグラムの有効タモキシフェン投与量のために。

2.収穫皮膚生検

注:タモキシフェン誘導後数週間の実験に応じて、収穫の皮膚生検数日。すべての手術のために、滅菌手袋を使用して、外科手術用マスクやヘアネットを身に着けている、と手順の間、滅菌外科用ドレープで動物をカバーするなどの齧歯類の手術のための標準プロトコルに従います。

  1. 水に90 mg / mlでケタミンおよび6.5 mg / mlとキシラジンを混合することにより、10倍の株式麻酔薬溶液を調製します。使用直前に無菌PBSにこの原液を1:10に希釈し、最大8ヶ月間、暗所で室温で保管してください。
    1. また、完全に動物を麻酔するために酸素と4%のガス濃度で始まる、イソフルラン吸入によってマウスを麻酔し、その後手続きの期間中、一から二パーセントにこれを下げます。
  2. 20グラムマウス体重あたり200μlの用量で腹腔内麻酔液を注入します。動物はつま先のピンチアッセイによる鎮静の適切な面に到達したことを確認し、その心を確認し、呼吸率は(それぞれ、約600拍毎分160回の呼吸)正常です。
  3. 、背部背部皮膚に生検部位から髪を削除しないニックように注意してか、下にある皮膚を損傷する電気バリカンを使用してください。
  4. 剃りを拭いて手術部位を準備ベタジンとアルコールワイプを使用して、前方対後方方向でD領域。すべての髪の切り抜きがサイトから削除されていることを確認します。
  5. 無菌手術領域に加温パッドの上に動物を配置し、黒のマーカーを用いて、生検部位を概説し、(デモの目的のために、滅菌ドレープが視認性を高めるために省略されました)滅菌外科用ドレープでカバー。
    注:毛包の長手方向部分を取得するには、生検(エッジが組織学のために切片するために、約1センチ)の長辺はにparasagital、前後方向(毛包の方向に平行)で実行する必要があります背側正中線( 図1A)。
  6. 根本的な筋肉の筋膜に損傷を与えることなく、マークされた領域に沿って全層切除を行うために、無菌#11メスを使用してください。
    注:切除した皮膚組織は、表皮、真皮、皮下脂肪と皮筋層を含んでいます。出血は通常、最小です。
  7. トンをフラット化彼は乾いたペーパータオルの上皮膚試料を切除し、真皮は、ダウンサイド過剰ペーパータオルを離れてトリム、および他のサンプルを収集する必要がある場合、最大1時間の冷PBSでサンプルを保存します。準備ができたら、組織学、または全載βガラクトシダーゼ(LacZを)染色のためのステップ4のためのサンプルを処理するためにステップ3.1または3.2に進みます。
  8. 縫合糸は、およそ3ミリメートル離間シンプル中断したパターンで、6-0ナイロン縫合糸を使用して、生検部位を閉じます。
  9. 完全回復後まで他の動物と同じケージに手術を受けたマウスを返さないでください。
  10. 手術領域は、典型的には、1週間以内に、治癒するまで、彼らは毎日も意識を取り戻す、とまでは手術直後に動物を監視します。マウスは、痛みや苦痛の徴候を示す場合、指定機関の動物の管理と使用ガイドラインに従って鎮痛薬を使用してください。手術後7-10日以内に縫合糸を取り外します。
    注:必要に応じて、(50 mg / mlで株式solutカルプロフェンを希釈することにより、鎮痛剤溶液を調製イオン)1:滅菌水で100。 20gの体重あたり200μlの(5ミリグラム/ kgのマウス体重)の用量で、首筋の近くに肩甲骨の間の溶液の皮下注射。

組織学のため3.プロセスのサンプル

注:切除した組織を修復し、処理するには、アプリケーションに応じて、以下のいずれかの方法を使用します。

  1. パラフィン包埋組織学的サンプルを生成するには、2週間まで70%エタノール中で、室温でPBS O / Nで3.7%ホルマリンで皮膚や店舗を修正。パラフィンに包埋する前にペーパータオルを削除します。
  2. 凍結した組織学的サンプルを生成するために、PBS中の冷4%パラホルムアルデヒド中で組織を沈め、ゆっくりと1時間振とうします。溶液を除去し、PBSを3回交換し、約5分ごとにサンプルを洗います。次に、組織(「ショ糖沈没」)をcryoprotectするPBS中30%スクロース中にサンプルを沈めます。
  3. 4℃で穏やかに振盪しながら、O / Nでインキュベートします。翌日、ペーパータオルを削除エルと皮膚の真皮側から過剰な脂肪組織を切り落とします。 10月に直接組織を埋め込み、-80℃で凍結したブロックを格納します。
    注意:以前に5,19に記載のように切 ​​片した後、パラフィンまたは凍結サンプルのいずれか、のTD、メルケル細胞とそれぞれケラチン17、ケラチン8およびニューロフィラメントに対する抗体を使用して神経を識別するために、免疫組織化学によって染色することができます。

ホールマウントのLacZ染色4.視覚化サンプル

  1. X-gal染色溶液を調製します。
    1. 滅菌水の250ミリリットルで0.94グラムの一塩基性リン酸ナトリウム、および2.6グラムのリン酸ナトリウム二塩基性を兼ね備えています。 7.3にpHを調整します。このために、1 M塩化マグネシウム、フェロシアン化カリウムの0.528グラム、およびフェリシアン化カリウムの0.412グラムの0.5ミリリットルを追加します。オクチルフェニルポリエチレングリコールの250μlを添加して、デオキシコール酸125mgの。塩基溶液は暗所で6ヶ月まで4℃で保存することができます。
    2. 50倍株式のX-galのsolutiを準備50 mg / mlで解決策を生成するためのX-galストックボトルにジメチルホルムアミドを添加することにより、上。暗所で-20℃でこの溶液を保管してください。
    3. 使用直前に、染色溶液を生成するために、X-GALのベース溶液に在庫のX-gal溶液を1:50に希釈します。小さ ​​な生検(<1 cm 2)を、サンプル当たりの染色溶液のアリコート1-2 mlのため。
  2. 静かに氷上で揺れ、30分間冷PBS中2%パラホルムアルデヒド/ 0.2%グルタルアルデヒドを含む溶液中で、ステップ2.7で採取した皮膚のサンプルを修正しました。小さ ​​い生検のために(<1 cm 2)を、サンプルあたりの固定液1〜2mlのを使用します。
    注:また、のみ、またはわずか0.5%グルタルアルデヒド中で2〜4%パラホルムアルデヒドでサンプルを固定します。最適な固定条件は、組織、LacZ発現およびアプリケーションの度合いに依存します。
  3. 固定剤溶液を除去し、室温でシェーカー上で、PBSを3回交換し、5分ごとにサンプルをすすいでください。
  4. サンプルの下にペーパータオルを取り外し、excesを切り取ります鈍鉗子で脂肪を把持し、解剖ハサミでトリミングすることにより、皮膚の真皮側から脂肪組織をね。
  5. X-gal染色溶液中に試料を浸し、37°C​​O / Nでインキュベートします。 LacZ発現は、解剖顕微鏡( 図1B)の下でブルー染色として表示されます。
    信号強度が弱い場合、翌日染色液を交換し、O / Nインキュベーションを繰り返します注意してください。バックグラウンド染色が強すぎる場合には、染色の時間を短縮し、またはその代わりに、37℃の室温でサンプルをインキュベートします。
  6. 染色液を外し、ゆっくりと室温で振盪しながら、約5分間、3%のDMSOを含有するPBSの3変化でサンプルを洗います。
  7. 5分間、70%エタノールの2-3の変化で洗浄サンプル。 70%エタノールに保管サンプル。

5.外科神経切除

  1. ステップ2.2のように動物を麻酔し、全体の背部皮膚を剃ります。
  2. O手術領域を準備しますベタジンとアルコール綿を使用して、背中の皮膚fおよび滅菌外科用ドレープ(デモンストレーション目的のために、滅菌ドレープが視認性を高めるために省略された)で動物をカバーしています。無菌手術領域で動作している間に加熱パッドを用いて動物を暖かく保ちます。
  3. 尾以上のおよそ0.5センチメートルに首の付け根から背側正中線に沿って滅菌#11メスを用いて切開を行います。
  4. 鈍鉗子を使用して、静かにちょうど後肢上記に首の近くに肩甲骨脂肪パッドから下にある組織を可視化するために離れてサイドから左サイドの肌を反映しています。
    注:背側皮膚神経は急カーブを作り、皮膚( 図2)の下の疎性結合組織に入る前に、トランク壁の半透明の筋膜を介して尾側に移動する白いストランドとして表示されます。
  5. 解剖光顕微鏡下で超微細鉗子を使用して、アニマの左側から独占的に神経を取り除きますどこから摘採によって解剖学的部位T3-12に位置リットル皮膚への参入サイトへのトランク壁におけるセグメントの曲がり( 図2)。
    1. オリエント鉗子垂直とその曲げサイトの下約0.5cmに把握し、上向きに引っ張り、伸ばし、周囲の組織( 図2C - E)から分離するために神経を引き起こすことによって神経を取り除きます。隣接する血管を破裂しないように注意してください。
    2. 皮膚へのトランク壁から延びているすべての神経が除去されるまで続けます。トランク壁の密な筋膜内の神経に影響を与えることはありません。定期的に0.9%滅菌生理食塩水の滴を適用することにより、作業中はしっとり組織を保管してください。
    3. また、鉗子でトランク壁の近く、その近位端を把握し、細かいハサミでつむことにより、神経を取り除きます。その後、皮膚に近い先端部を切断する( 図2F - H)。最後に、int型を削除しますervening神経セグメント( 図2I)。
  6. ステップ5.4で露出した皮膚フラップから任意の神経を削除します。これらの繊維は、背側皮膚神経の遠位枝を含み、散発的に皮弁( 図2J - K)の真皮側の結合組織内に配置された白の分岐ストランドとして表示されます。
    1. これらの細かい枝を削除するには、微細な鉗子は、大きく、皮膚表面に平行神経を把握し、血管を破壊し、皮膚を穿刺避けるために、上向きに摘み取る位置付けます。すべての可視神経が削除されるまで続けます。
  7. 鈍的切開を使用して、背側正中切開の右側の皮膚を反映するが、神経を削除しないでください。これは、反対側の偽手術対照として機能します。
  8. 切開部を閉鎖するための簡単​​な中断されたパターンで背側正中線に沿って縫合。回復とポストoperの中に動物を監視しますativelyとして以前に(ステップ2.8から10)を実証しました。手術後7-10日以内に縫合糸を取り外します。
  9. 機能的に手術後数週間に安定した除神経アップを評価するために、電気バリカンを使用して背部皮膚から毛を取り除きます。
  10. 静かに皮下注射針を使用して、除神経皮膚領域を刺すと、動物は、通常、身震いまたはその頭を回すことにより、応答するかどうかを注意してください。皮膚領域を安定的除神経された場合、動物は、ほとんどまたは全く応答を示すであろう。
  11. 黒のマーカーを使用して、反対側の偽側の無応答の面積だけでなく、同​​様のサイズと位置の領域の輪郭を描きます。
  12. 分析のための手順2.1から2.9のように、これらのサイトからの生検を収集します。
    注:別の方法として、除神経および偽手術領域を含む全体の背背中の皮膚は、ステップ4で説明したように似たホールマウント染色のための単一のシートとして除去することができます。

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Representative Results

タモキシフェン誘導性Gli1の-CreERT2およびLacZレポーター対立遺伝子を発現するマウスを生成することで、TD上皮を視覚化し、時間をかけてこれらの細胞の運命を追跡することが可能です。全体の除神経手順は、典型的にはマウスあたり1時間以内に完了することができ、動物に最小限の苦痛を引き起こす必要があります。

5,19 -我々の以前の研究では、神経が正常なのTDだけでなく、それらに関連するケラチン8 +メルケル細胞(C 図3A)の両方を維持するために重要であることが示されています。神経はまた、TD( 図3D)Gli1の発現を促進するために重要です。皮膚( 図1B)を通してTDクラスタの比較的まれな外観を与え、正確TD頻度を定量するために、複数の凍結切片をサンプリングすることが不可欠です。一般的に、我々は15の非短所を評価します各動物からの両方シャムと除神経皮膚から(それぞれ厚さ10μmと約1センチ)ecutiveセクション。 TDでと皮膚を通して次の両方の除神経、神経の安定した損失は、以前に凍結またはパラフィン切片( 図3Aおよび図3Cのいずれかでこのようなニューロフィラメントのような標準的な汎神経マーカーのための免疫組織化学染色の欠如によって確認することができ、報告された5)。また、神経もβ3チューブリンまたはPGP9.5 6,9の発現によって同定することができます。

Gli1のを使用して、LacZのマウスを、TDおよびタモキシフェン誘導性の組換え及び除神経の配列を変化させることにより、TD細胞の運命を維持するヘッジホッグシグナル伝達を活性化する神経の要件の両方を確認することも可能です。除神経は、従来の組換えを行った場合、例えば、これは、ヘッジホッグpathwaの活性化に神経の必要性をテストすることになりますY、これらの動物におけるGli1の発現と相関しているCreリコンビナーゼ活性およびレベルによってモニターされるよう。除神経を再結合した後に行われる一方、これは、TDで既に標識された細胞を維持する神経の必要性を評価するであろう。

図1
図1.皮膚生検およびTD上皮の全マウントLacZ染色。(A)生検後のマウスの(トップ)写真や縫合の前に。 (左下)生検部位の拡大画像。 (右下)皮膚サンプルは、乾燥紙タオルの上に平らに広げ、その真皮側で生検から得られました。 (B)Gli1からの皮膚のホールマウントLacZ染色;のLacZマウス、7日タモキシフェン誘導後は、肌の可視化を改善するために、生検の直前に脱毛します。 GLI1 + / LacZを+のTDは強い青色のクラスタとしてラベル付けされています。スケールバー= 1 cmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2.背部皮膚を除神経のための二つのアプローチ。神経支配マウス皮膚の(A)漫画の図。赤い点線は幹線壁(紫)と同様に、反射皮膚の下の真皮(グレー、アスタリスク)上の根本的な筋肉組織を露出するように背側正中線に沿って作られた単一の切除を示しています。彼らはトランクの壁を残すように尾側(黒い矢印は、1つのそのような曲がりを示す)「曲げ」に表示され、走行皮膚神経背側。切除されるべき神経のセグメントは、黒の点線で区画されています。 (B)示された(矢印)を曲げ部位で無傷の神経の写真。青い矢印はレムになります2神経セグメントを指しますoved。 (C - D)除神経手法を示す写真。曲げ外側に引っ張るの自分のサイトの下に神経を握り、0.5cmに超微細鉗子を使用。 (E)2神経セグメント(青い矢印)を除去した後の体腔を示す写真。残りの神経も除去する必要があります。 (F - I)神経を除去するための別のアプローチが示されている神経は、それらの近位端で切り取られている場合に、また遠位にちょうど彼らが(矢頭)(G)を曲げる場合について終了し、皮膚への参入の自分のサイト(矢頭)に近いです(H)。これらの画像で正中切開は、より良い視覚化の目的のための典型的なよりも長くなっていることに注意してください。正中線の一方の側に反映皮膚弁の真皮側の(J)写真。 (K)神経は赤で示された、より大きな血管で、(黒線)に概説されています。スキーの真皮側に位置する神経n個のフラップも切除される必要があります。アスタリスク、反射された皮膚弁から真皮の基礎となります。スケールバー= 1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
神経と神経除去後のTDの劣化の図3.安定した損失。(A)免疫組織化学は、偽手術皮膚におけるケラチン8 +メルケル細胞(緑K8)およびニューロフィラメント+神経(NF、赤)とTD上皮を示します。 TD上皮と(B)漫画の描写は、緑、紫、メルケル細胞、および青で感覚神経に強調しました。 TDエリア内メルケル細胞-神経複合体を欠く除神経皮膚 ​​を示す(C)免疫組織化学(デン)。破線黄色の線、毛包上皮。アスタリスク、backgrounD染色。 (D)バック背のホールマウントLacZ染色2週間の一方的な皮膚の除神経後のGli1の LacZを/ +マウスから肌。癒さ正中切開(矢印)の左にあるボックスでは、豊富なラベルされたTD上皮は、偽手術の皮膚で観察されています。正中線の右側には、TDが除神経皮膚には表示されません。 (A)、(C)のスケールバー= 10ミクロン。及び(D)のための1ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

神経は感覚ではなく、哺乳動物の臓器の開発、保守及び再生13,24-27だけでなく重要な機能を果たします。神経が最近多様な皮膚疾患に関与しているように、ここで説明される技術は、動物疾患モデルの様々な神経支配の要件を研究するために使用することができます。確かに、一方的除神経の技術は、同じマウスから無傷または破壊神経のいずれかで皮膚の直接比較を可能にします。その後のデータは対応のあるt-検定を利用して分析してこれは、動物への動物の違いを補償するための理想的な内部統制を提供します。

ここで説明する手順は、大部分がLacZレポーター遺伝子を利用するが、これらの実験は、Gli1の-CreERT2対立遺伝子がTDで遺伝子発現を変更するために他の蛍光レポーターまたは条件付き対立遺伝子と結合するように適合させることができます。例えば、Gli1の-CreERT2マウスを交配することができます動物はタモキシフェン誘導5の後にTD-由来の腫瘍を形成するマウスを作製するためにPatched1(B6N.129-PTCH1 tm1Hahn / J)28の条件付き対立遺伝子を保有しています。 Gli1の-CreERT2株はまた、物理的にTD 13のものから分離さGli1の +毛包幹細胞のサブセットにおいて組換えを誘導することに留意することが重要です。

除神経後、皮膚中の神経は数ヶ月間( 3C)5,19安定アブレーションされたままです。他の研究では、しかし、いくつかの再神経支配は、時間6上に発生することが報告されています。皮膚の真皮への挿入部位に近い点までの胸壁からの出口との間の神経セグメントを切除することが絶対的に重要であるとして、除神経表現型のperduranceは、神経除去の徹底に依存してもよいです。

完全removi生検の前に皮膚から毛をngのは、その後、ホールマウント染色( 図1B)でのTDを視覚化する能力を高めることができます。これは、2分間のクリップされた皮膚に脱毛クリームを適用し、次に綿球を用いて、前方対後方方向に離れて髪を拭くことによって達成されます。脱毛は、成長期、成長期への進入を促進することによって、毛周期の動態に影響を与える可能性がありますのでご注意ください。代替的に、毛髪が完全カミソリの刃を用いて除去することができます。また、全体以前23に記載されているように免疫組織化学は、真皮から分離した上皮シート上のTDおよびメルケル細胞を可視化するために行うことができるマウント。

可能性は、外科的除神経が潜在的に任意の観察された表現型を混乱させる、手術部位での炎症を引き起こす可能性があることに変わりはありません。担保組織の損傷がSKに発生するので、私たちの経験では、我々は可能性が高い除神経後の重要な炎症を、確認されていません手順が適切に行われている場合にはわずかです。炎症は、結果に影響する可能性を最小限にするために、追加の対照実験に組み込むことができます。例えば、我々は、除神経は、具体的にその除神経-なく、TD 5での一般的な創傷誘導性の炎症反応-可能性を阻害し、腫瘍形成を主張し、同じ皮膚試料における隣接する毛包に関連する病変、TD-由来の腫瘍を阻害したが、ないことを観察しました。

外科的除神経は感覚と交感神経繊維5を含むすべての皮膚神経を切除することに注意することが重要であるため、いずれかの正常または病気の皮膚上のこれらの神経の影響の一般的な全体的な評価を提供します。これらの薬剤は逆行阻害するかどうかは不明であるが、このようなボツリヌス神経毒としてpharmacologicsを使用して、インスタンスのための他の実験的アプローチは、より詳細なメカニズムの洞察7をもたらす可能性があり、神経伝達をブロックしますこのようなヘッジホッグリガンドのようなサイトカインの分泌。あるいは、6-ヒドロキシドーパミンのような化合物は、皮膚9に交感神経を除去するために使用されています。また、例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、およびサブスタンスPなどの神経由来因子のための受容体を標的とすることは、それらのニッチ6内の神経と周囲の細胞との間の特異的相互作用を問い合わせるために有用であり得ます。最終的に、複数の戦略を同定するために組み合わせて利用することができる、または少なくとも、潜在的なシグナル伝達機構を排除します。

最後に、神経およびそのニッチ19の間で交換される信号を解明するためのゴールドスタンダードを表すことができるのWnt1-CreをまたはAdvillin-Creをいずれかを使用して、神経系統の神経由来因子の遺伝子欠失をターゲットに。これらの株のいずれもタモキシフェン誘導されているように、しかし、いくつかの注意がこれらの信号の破壊が神経発達や適切なTAを損なわないように注意する必要があります神経求心性神経のrget​​ing。このようなAdvillin-CreERT2としてタモキシフェン誘導性のCreの使用は、これらの問題29回避に役立つことがあります。

全体的に、この技術は、正常および疾患、皮膚上の神経の影響を研究するための系譜トレース、細胞の可視化と外科的除神経オファー強力なアプローチのここ-組み合わせを説明しました。経験により、これらの手順は、動物または研究者に最小限の苦痛を引き起こしながら、定期的にかつ確実に行うことができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol prep pads PDI B339
AnaSed (Xylazine) Lloyd NADA 139-236
Antibody, anti-Keratin 8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I rat antibody, use at 1:500 concentration
Antibody, anti-Keratin 17 Cell Signaling #4543 rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration
Antibody, anti-Neurofilament Cell Signaling C28E10 rabbit antibody, use at 1:500 concentration
Betadine prep pads Medline MDS093917
Carprofen (Rimadyl) Zoetis
Cordless rechargable clipper Wahl trimmer model 8900
Corn Oil Sigma-Aldrich C8267
Cryostat Leica CM1860
DAPI ThermoFisher Scientific D1306 use at 1:1,000 concentration
Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Depilatory Cream Nair N/A
Dimethylforamide Sigma-Aldrich 319937
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
ImmEdge Pen Vector Laboratories H-4000
Ketamine HCl Hospira NDC 0409-2051-05
Magnesium chloride Sigma M8266
Micro cover glass VWR 48404-454
Micro Slides VWR 48311-703
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-4LP
6-0 nylon sutures DemeTECH NL166012F4P
Octylphenyl-polyethylene glycol Sigma-Aldrich I8896
O.C.T. Compound Sakura Tissue-Tek 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Pottasium ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Pottasium ferricyanide Sigma-Aldrich 702587
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G
Ultra fine forceps Dumont 0103-5-PO
Vectashield Vector Laboratories H1000
X-gal Roche 10 651 745 001 Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
  3. Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
  4. Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
  5. Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
  6. Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
  7. Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
  8. Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
  9. Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
  10. Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
  11. Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
  12. Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
  13. Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
  14. Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
  15. Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
  16. Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
  17. Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
  18. Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
  19. Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
  20. English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
  21. Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
  22. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
  23. Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
  24. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
  25. Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
  26. Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
  27. Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
  28. Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
  29. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).

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医学、問題112、マウスモデル、皮膚、表皮、毛包、タッチドーム、神経、神経除去、Creリコンビナーゼ、生検
皮膚外科神経切除:皮膚病のマウスモデルにおける神経のための要件をテストする方法
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Peterson, S. C., Brownell, I., Wong, More

Peterson, S. C., Brownell, I., Wong, S. Y. Cutaneous Surgical Denervation: A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease. J. Vis. Exp. (112), e54050, doi:10.3791/54050 (2016).

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