Protocol
Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen ble utført i samsvar med forskrift fastsatt av University of Michigan Enhet for Forsøksdyr Medicine.
1. Fremkall rekombinasjon i Mus
Merk: Gli1 tm3 (CRE / ERT2) Alj / J musestamme (Gli1-CreERT2) 13 muliggjør målretting av tamoxifen-indusert rekombinasjon til TD epitel. Krysse denne belastningen med B6.129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm1Sor / J reporter mus (LacZ) 22 for å generere Gli1, LacZ dyr å visualisere TD celler ved hel-mount flekker under.
- Fremstille tamoxifen oppløsning til en konsentrasjon på 12,5 mg / ml i maisolje.
- I et 1,5 ml tube, legge opp til 20 mg av krystallinske tamoxifen, og deretter en ml maisolje. Fast tape røret til en vortex mixer, og virvle kontinuerlig på høyeste innstilling på RT til tamoxifen har helt oppløst (2-4 timer), sombekreftes ved å undersøke rør under et disseksjonsmikroskop for fraværet av tamoxifen partikler.
- Overfør løsningen til et 15 ml rør og fortynne tamoxifen til en sluttkonsentrasjon på 12,5 mg / ml med ytterligere maisolje. Bland ved å virvle den viskøse løsning i ytterligere 30 sek. Oppbevar denne løsningen i opptil en uke ved 4 ° C i mørket.
- Injiser tamoxifen oppløsning intraperitonealt i Gli1, LacZ mus, ved et volum på 200 ul per 20 g mus kroppsvekt, for en effektiv tamoxifen dose på 2,5 mg per 20 g mus vekt.
2. Harvests hud Biopsi
Merk: Avhengig av forsøket, avling hud biopsier flere dager til uker etter tamoxifen induksjon. For alle operasjoner, følger standardprotokoller for gnager kirurgi, inkludert å bruke sterile hansker, iført en kirurgisk maske eller hårnett, og dekker dyret med en steril kirurgisk drapere under prosedyren.
- Forbered 10x lager bedøvelse oppløsning ved å blande 90 mg / ml ketamin og 6,5 mg / ml xylazin i vann. Fortynn denne stamløsning 01:10 i sterilt PBS like før bruk, og oppbevar ved romtemperatur i mørke i opp til 8 måneder.
- Alternativt bedøve mus med isofluran inhalering, som begynner med en gasskonsentrasjon på 4% med oksygen for å full bedøve dyret, og deretter senere å senke denne til 1-2% i løpet av prosedyren.
- Injiseres anestesimidlet oppløsning intraperitonealt i en dose på 200 ul per 20 g mus kroppsvekt. Sjekk at dyret har nådd riktig plan for sedasjon ved tå klype analyse, og bekrefte at hjerte og luftveis priser er normal (ca 600 beats og 160 pust per minutt, henholdsvis).
- Bruk en elektrisk klipper for å fjerne hår fra området av biopsi på dorsal tilbake hud, være forsiktig med å nick eller skade den underliggende huden.
- Forbered kirurgiske området ved å tørke av barberingd område i en anterior-til-posterior retning ved hjelp av Betadine og alkohol våtservietter. Sørg for at alle hår utklipp er fjernet fra nettstedet.
- Skissere biopsi området ved hjelp av en svart markør, legger dyret på en oppvarming pad på en aseptisk kirurgiske området, og dekk med en steril kirurgisk drapere (for demonstrasjonsformål, ble sterile drapere utelatt for å øke synligheten).
Merk: For å oppnå lengdesnitt av hårsekkene, jo lengre kant av biopsi (kanten som skal seksjoneres for histologi, ~ 1 cm) skal løpe i en anterior-posterior retning (parallelt med retningen av hårsekkene), parasagital til dorsal midtlinjen (figur 1A). - Bruk en steril # 11 skalpell til å foreta en full tykkelse excision langs merkede området uten å skade den underliggende muskel fascia.
Merk: skåret huden vev omfatter epidermis, dermis, underhudsfett og panniculus carnosus. Blødning er vanligvis minimal. - Flat tHan kuttet ut huden prøven på et tørt tørkepapir, dermis side ned, klippe bort overflødig papir håndkle, og oppbevar prøven i kaldt PBS i opptil en time hvis andre prøver må hentes. Når du er klar, går du videre til trinn 3.1 eller 3.2 for å behandle prøver for histologi, eller trinn 4 for hel-mount β-galaktosidase (LacZ) farging.
- Sutur lukke biopsi området ved hjelp av 6-0 nylon sting, på en enkel avbrutt mønster fordelt omtrent 3 mm fra hverandre.
- Ikke returner mus som har gjennomgått kirurgi i samme bur som andre dyr før etter full gjenoppretting.
- Overvåk dyrene umiddelbart etter operasjonen før de gjenvinne bevissthet, og også hver dag frem til det kirurgiske området er leget, vanligvis innen en uke. Bruk smertestillende i henhold til utpekte institusjonelle dyr omsorg og retningslinjer for bruk hvis mus viser tegn på smerte eller ubehag. Fjern suturer innen 7-10 dager etter operasjonen.
Merk: Hvis det er nødvendig, utarbeide smertestillende løsning ved å fortynne carprofen (50 mg / ml lager solution) 1: 100 i sterilt vann. Injiser oppløsningen subkutant mellom skulderbladene nær nakkeskinnet, i en dose på 200 ul per 20 g kroppsvekt (5 mg / kg musekroppsvekt).
3. Behandle Prøver for histologi
Merk: For å fikse og behandle utskåret vev, enten bruke metoden nedenfor, avhengig av programmet.
- For å generere parafininnstøpte histologiske prøver, fikse huden i 3,7% formalin i PBS O / N på RT og butikk i 70% etanol i opptil to uker. Fjern papiret håndkle før innstøping i parafin.
- For å generere frosne histologiske prøver, senk vev i kaldt 4% paraformaldehyde i PBS og rist i 1 time. Fjerner oppløsningen og vasker prøven med 3 skift av PBS, omtrent 5 min hver. Deretter senk prøven i 30% sukrose i PBS til cryoprotect vevet ( "sukrose senkingen").
- Inkuber med forsiktig risting O / N ved 4 ° C. Neste dag, fjerne papiret slepel og trimmer bort overflødig fettvev fra den dermale side av huden. Embed vevet direkte i oktober og lagre den frosne blokken ved -80 ° C.
Merk: Etter seksjonering kan enten parafin eller frosne prøvene være farget av immunhistokjemi å identifisere TDS, Merkel celler og nerver ved hjelp av antistoffer mot Keratin 17, Keratin 8 og nevrofilament, henholdsvis, som beskrevet tidligere 5,19.
4. Visualiser prøver ved Whole-mount LacZ Farging
- Forbered X-gal farging løsning.
- Kombiner 0,94 g monobasisk natriumfosfat og 2,6 g dinatriumhydrogenfosfat i 250 ml sterilt vann. Juster pH til 7,3. Til dette, tilsett 0,5 ml av en M magnesiumklorid, 0,528 g kalium ferrocyanid, og 0,412 g av kalium ferricyanide. Tilsett 250 ul av oktylfenyl-polyetylenglykol og 125 mg deoksycholat. Basen Løsningen kan bli lagret ved 4 ° C i opptil 6 måneder i mørket.
- Forbered 50x lager X-gal solutividere ved tilsetning av dimetylformamid til den X-gal lager flaske for å generere en 50 mg / ml oppløsning. Store denne løsning ved -20 ° C i mørket.
- Rett før anvendelse, fortynn lager X-gal-løsning 1:50 til X-gal baseløsning for å generere fargeløsning. For mindre biopsier (<1 cm 2), alikvoter 1-2 ml farvestoff oppløsning pr prøve.
- Løse huden prøve samlet i trinn 2,7 i en oppløsning inneholdende 2% paraformaldehyd / 0,2% glutaraldehyd i kald PBS i 30 minutter, forsiktig risting på is. For mindre biopsier (<1 cm 2), kan du bruke 1-2 ml fiksativ løsning per prøve.
Merk: Du kan også fikse prøver i 2-4% paraformaldehyde bare, eller i 0,5% glutaraldehyd bare. Optimale fikseringsbetingelser avhenger av vev, graden av LacZ-ekspresjon og anvendelse. - Fjern det bindemiddel-løsning, og skyll prøver med 3 skift av PBS, 5 minutter hver, på en rister ved romtemperatur.
- Fjern papiret håndkle under prøven og klippe bort excess fettvev fra den dermale side av huden ved å ta tak i fett med butt tang og trimming med disseksjonssaksen.
- Senke prøven i X-gal-farging løsning, og inkuber ved 37 ° CO / N. LacZ uttrykk vil være synlig som en blå flekk under et dissekere mikroskop (figur 1B).
Merk: Hvis signalstyrken er svak, må du skifte fargeløsning neste dag og gjenta O / N inkubasjon. Hvis bakgrunnsfarging er for intens, redusere tiden for farging, eller inkubere prøven ved RT i stedet for 37 ° C. - Fjern fargingsoppløsningen og vaskes prøvene i 3 skift av PBS inneholdende 3% DMSO i ca. 5 minutter, forsiktig risting ved RT.
- Vask prøver i 2-3 endringer av 70% etanol i 5 min hver. Oppbevar prøver i 70% etanol.
5. Kirurgisk denervering
- Bedøve dyret som i trinn 2,2 og barbere hele rygghuden.
- Forbered kirurgiske området of ryggen huden ved hjelp av Betadine og alkohol våtservietter, og dekker dyret med en steril kirurgisk drapere (for demonstrasjonsformål, ble sterile drapere utelatt for å øke synligheten). Holde dyret varmt bruker en varmepute under drift i en aseptisk kirurgiske området.
- Lag et snitt gjennom et sterilt # 11 skalpell langs dorsal midtlinjen fra undersiden av halsen til omtrent 0,5 cm over halen.
- Med butte pinsett, forsiktig reflektere huden på venstre side bort fra flanken til å visualisere det underliggende vev fra scapulær fettputer nær halsen til like over bakben.
Merk: Rygg kutane nerver vises som hvite tråder som reiser caudally gjennom gjennomskinnelig fascia av stammen veggen før du gjør skarpe svinger og inn i løst bindevev under huden (figur 2). - Ved hjelp av ultra-fin pinsett under et dissekere lysmikroskop, fjerne nerver utelukkende fra venstre side av animal plassert på anatomiske områder T3-12 av plukker fra hvor segmenter svingen på stammen veggen til sine oppføring områder i huden (figur 2).
- Orient tang vertikalt og fjerne nervene ved å ta tak ca 0,5 cm under deres bend områder og trekke oppover, forårsaker nerve til å strekke seg og skille seg fra omkringliggende vev (figur 2C - E). Vær forsiktig for å unngå sprekker tilstøtende blodkar.
- Fortsett til alle nerver som forløper fra stammen veggen til huden fjernes. Ikke forstyrre nervene i tett fascia av stammen veggen. Hold vev fuktig under hele prosedyren ved periodisk påføring av dråper av steril 0,9% saltoppløsning.
- Alternativt fjerne nerver ved å gripe deres nære ender nær stammen veggen med pinsett og snipping med fine saks. Etterpå bryte de distale ender nær huden (figur 2F - H). Fjern til slutt intervening nerve segmenter (Figur 2i).
- Fjern eventuelle nerver fra huden klaff eksponert i trinn 5.4. Disse fibrene omfatter distale grener av dorsal kutane nerver og vises som hvite branching tilnærmingene ligger sporadisk i bindevevet på dermal side av huden klaff (Tall 2J - K).
- For å fjerne disse fine greiner, plasserer de fine pinsett omtrent parallelt med dermal overflaten, ta tak i nervene og rykke oppover for å unngå å forstyrre blodårer og punktering av huden. Fortsett til alle synlige nerver har blitt fjernet.
- Ved hjelp av stump disseksjon, reflektere huden på høyre side av ryggmidtlinjesnitt, men ikke ta på nervene. Dette vil fungere som den kontralaterale sham-opererte kontroll.
- Sutur langs dorsal midtlinjen på en enkel avbrutt mønster for å lukke innsnitt. Overvåk dyret under utvinning og post-operatively som tidligere vist (trinn 2.8-10). Fjern suturer innen 7-10 dager etter operasjonen.
- Å funksjonelt vurdere stabil denervering opptil flere uker etter operasjonen, fjerne hår fra rygg huden ved hjelp av en elektrisk hårklipperen.
- Forsiktig stikk denerveres huden området ved hjelp av en kanyle, og merk om dyret reagerer, vanligvis ved grøsser eller snu hodet. Hvis huden området har blitt stabilt denervert, vil dyret oppvise liten eller ingen reaksjon.
- Ved hjelp av en sort tusj, skissere område i noen reaksjon, samt et område av tilsvarende størrelse og plassering på den kontralaterale sham side.
- Samle biopsier fra disse områdene som i trinn 2.1-2.9 for analyse.
Merk: Alternativt kan hele rygg tilbake huden, inkludert denerveres og humbug-opererte regioner, fjernes som et enkelt ark for hel-mount flekker, lik som beskrevet i trinn 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å generere mus som uttrykker tamoxifen-induserbar Gli1-CreERT2 og en LacZ reporter allel, er det mulig å visualisere TD epitel og spore skjebnen til disse cellene over tid. Hele denervering prosedyre vanligvis kan være ferdig i løpet av en time per mus og bør føre til minimal ubehag for dyret.
Våre tidligere studier har indikert at nervene er avgjørende for å opprettholde både normale TDS samt tilhørende Keratin 8 + Merkel celler (figur 3A - C) 5,19. Nerver er også avgjørende for å fremme Gli1 uttrykk i TD (Figur 3D). Gitt den relativt sjeldne utseendet av TD klynger gjennom huden (figur 1 B), er det viktig å prøve flere frosne snitt for nøyaktig å kvantifisere TD frekvens. Vanligvis vurderer vi 15 ikke-consbedriften en kvin- neandel seksjoner (hver 10 mikrometer tykk og ~ 1 cm lange) fra både humbug og denerveres hud fra hvert dyr. Etter denervering, stabil tap av nerver, både ved TD og gjennom huden, kan bekreftes ved fravær av immunhistokjemisk farging for standard pan-neurale markører som for eksempel neurofilament enten i frossen eller parafinsnitt (figur 3A og 3C, og som tidligere rapportert 5). Alternativt kan nerver også bli identifisert ved ekspresjon av β3-tubulin eller PGP9.5 6,9.
Ved å bruke Gli1; LacZ mus, er det også mulig å bekrefte både kravet til nerver i aktivering av pinnsvin signalering i TD og i å opprettholde TD celle skjebne ved å variere sekvensen av tamoxifen-indusert rekombinasjon og denervering. Hvis denervering utføres før rekombinasjon, for eksempel, ville denne test kravet til nerver i aktivering av pinnsvin pathway, som overvåkes av Cre rekombinase aktivitet og nivåer, som er korrelert med Gli1 ekspresjon i disse dyrene. På den annen side, hvis denervering utføres etter rekombinasjon, vil dette vurdere behovet for nerver i å opprettholde allerede-merkede celler i TD.
Figur 1. Skin biopsi og hel-mount LacZ farging av TD epithelia. (A) (Top) Fotografi av mus etter biopsi og før suturering. (Nederst til venstre) Forstørret bilde av biopsi nettstedet. (Nederst til høyre) folie prøve erholdt fra biopsi med sin dermis side spredt flatt på en tørr papirhåndkle. (B) Hel-mount LacZ farging av huden fra en Gli1, LacZ mus, 7 dager etter tamoxifen induksjon, depilated like før biopsi for å forbedre hudens visualisering. Gli1 + / LacZ + TDS er merket som intense blå klynger.Scale bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. To tilnærminger for denervating rygghuden. (A) Cartoon diagram av innervert mus hud. Røde stiplede linjer angir en enkelt excision gjort langs dorsal midtlinjen for å eksponere det underliggende muskulatur på stammen veggen (purpur), så vel som dermis (grå, asterisk) under den reflekterte huden. Dorsal kutane nervene som reiser caudally ser ut til å "bøye" som de la stammen veggen (den svarte pilen indikerer en slik bøyning). Nervesegmentene som skal skjæres ut er angitt ved sorte stiplede linjer. (B) Fotografi av intakte nerver med områder av bøying indikert (piler). Blå piler peker på to nerve segmenter som vil være remOved. (C - D) Fotografier viser denervering teknikk. Ved hjelp av ultra-fine tang, grep nervene 0,5 cm under sine områder av bøying og dra utover. (E) fotografi som viser kroppshulen etter fjerning av 2 nervesegmentene (blå piler). De gjenværende nerver også må fjernes. (F - I) En alternativ tilnærming for nerve fjerning er avbildet, hvor nervene er klippet på sin proksimale ender rett under der de bøyning (pilspisser) (G), og også distalt, i nærheten av deres nettsted trer inn i huden (pilspisser) (H). Legg merke til at midtlinjesnitt i disse bildene er lengre enn vanlig i den hensikt å bedre visualisering. (J) Fotografi av dermale side av huden reflekterte klaffen til den ene side av midtlinjen. (K) Nervene er skissert (svarte linjer), med større blodkar som er angitt i rødt. Nervene ligger på dermis side av skienn klaff må også skal kuttes. Asterisk, underliggende dermis fra den reflekterte huden klaff. Scale bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Stabil tap av nerver og forverring av TDS etter denervering. (A) Immunohistochemistry viser TD epitel med Keratin 8 + Merkel celler (K8, grønn) og nevrofilament + nerver (NF, rød) i sham-opererte hud. (B) Cartoon skildring, med TD epitel uthevet i lilla, Merkel celler i grønt, og sensoriske nerver i blått. (C) Immunohistochemistry viser denerveres hud (den) mangler Merkel celle-neurite komplekser i TD-området. Stiplede gule linjer, hårsekken epitel. Asterisk, BAKGRUNNd farging. (D) Hel-mount LacZ farging av rygg tilbake hud fra Gli1 LacZ / + mus 2 uker etter unilateral hud denervering. I boksen til venstre for helbredet midtlinjesnitt (pil), er rikelig merket TD epithelia observert i sham-opererte hud. Til høyre for midtlinjen, TDS er ikke synlige i denerveres hud. Målestokk = 10 um for (A), (C); og 1 mm for (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nerver tjener viktige funksjoner, ikke bare i følelse, men også i pattedyr organ utvikling, vedlikehold og fornyelse 13,24-27. Som nerver har nylig blitt implisert i forskjellige hudlidelser, kan de teknikker som er beskrevet her kan brukes til å studere kravet til innervasjon i en rekke dyresykdomsmodeller. Faktisk tillater den ensidige denervering teknikk for direkte sammenligning av hud med enten intakte eller ødelagte nerver fra samme mus. Dette gir en ideell intern kontroll for å kompensere for dyr-til-dyr forskjeller, med påfølgende data-analyser som gjør bruk av en paret t-test.
Mens fremgangsmåtene beskrevet her i stor grad utnytte LacZ-rapportørgenet, kan disse eksperimentene tilpasses slik at den Gli1-CreERT2 allelet er kombinert med andre fluorescerende reporter eller betinget alleler for å endre genekspresjon i TD. For eksempel kan Gli1-CreERT2 mus kryssesmed dyr skjuler betinget alleler av Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 for å generere mus som danner TD-deriverte svulster etter tamoxifen induksjon fem. Det er viktig å merke seg at Gli1-CreERT2 stammen induserer også rekombinasjon i en undergruppe av Gli1 + hårsekkceller stamceller som er fysisk atskilt fra de i TD 13.
Etter denervering, nerver i huden forblir stabilt ablated i flere måneder (figur 3C) 5,19. I andre studier har imidlertid noen re-innervasjon har blitt rapportert å forekomme over tid 6. Den perdurance av denerveres fenotype kan avhenge av grundighet av nerve fjerning, som det er helt avgjørende for å skjære nervesegmentene mellom sin exit fra brystveggen til et punkt nær nettstedene til innsetting i dermis av huden.
helt removing håret fra huden før biopsi kan styrke evnen til senere å visualisere TDS av hel-mount farging (figur 1B). Dette oppnås ved å påføre hårfjerningskrem til klippet hud i 2 minutter, og deretter tørke håret bort i en anterior-posterior til-retningen ved hjelp av bomullsdotter. Vær oppmerksom på at hårfjerning kan påvirke håret syklus kinetikk ved å fremme inntreden i anagen vekstfase. Alternativt kan håret bli helt fjernet ved hjelp av et barberblad. I tillegg er hele montere immunohistokjemi kan utføres for å visualisere TDS og Merkel celler på epiteliale ark adskilt fra dermis, som er tidligere beskrevet 23.
Muligheten er fortsatt at kirurgisk denervering kan føre til betennelse i operasjonsstedet, potensielt konfunderende eventuelle observerte fenotyper. I vår erfaring, har vi ikke observert signifikante betennelse etter denervering, sannsynligvis fordi den sivile vev skader pådratt i ski er liten hvis prosedyren er gjort riktig. For å minimere muligheten for at inflammasjon kan påvirke resultatene, kan ytterligere kontroller bli innlemmet i forsøket. For eksempel, observerte vi at denervering spesielt hemmet TD-avledet svulster, men ikke ved siden av hårsekken-assosiert lesjoner i de samme hudprøver, og hevder at denervering-og ikke en generell sår-indusert inflammatorisk respons-sannsynlig hemmet tumordannelse på TD 5.
Det er viktig å merke seg at kirurgisk denervering ablates alle kutane nerver, inkludert sensoriske og sympatiske fibre 5, og tilveiebringer således en generell samlet vurdering av påvirkning av disse nerver på enten normal eller syk hud. Andre eksperimentelle tilnærminger, for eksempel ved hjelp av pharmacologics som botulinumneurotoksin å blokkere nevrotransmisjon, kan gi mer detaljerte mekanistiske innsikt 7, selv om det er uklart om disse agentene hemme retrogradsekresjon av cytokiner så som pinnsvin ligander. Alternativt kan forbindelser slik som 6-hydroksydopamin har blitt brukt for å ablate sympatiske nerver i huden 9. I tillegg kan rettet mot reseptorene for nerve-avledede faktorer som kalsitonin-relatert peptid, og substans P være nyttig for utspørring spesifikke interaksjoner mellom nerver og de omgivende celler i sin nisje 6. I siste instans kan flere strategier anvendes i kombinasjon for å identifisere, eller i det minste utelukke, potensielle signaleringsmekanismer.
Til slutt, målrettet genetisk sletting av nerve-avledet faktorer i nevrale avstamning ved hjelp av enten Wnt1-Cre eller Advillin-Cre kan representere gullstandarden for å belyse de signaler som utveksles mellom nerver og sin nisje 19. Som ingen av disse stammene er tamoxifen-induserbar, men trenger litt forsiktighet tas for å sikre at avbrudd av disse signalene ikke svekker nerve utvikling eller riktig targeting av nevrale afferente. Bruk av tamoxifen-induserbar Cre som Advillin-CreERT2 kan hjelpe omgå disse problemene 29.
Totalt sett teknikkene beskrevet her-en kombinasjon av avstamning tracing, celle visualisering og kirurgiske denervering-tilbod effektive metoder for å studere påvirkning av nerver på normal og syk hud. Med erfaring, kan disse prosedyrene utføres rutinemessig og pålitelig, mens forårsaker minimal nød til dyre eller etterforsker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
- Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
- Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
- Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
- Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
- Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
- Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
- Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
- Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
- Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
- Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
- Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
- Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
- Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
- Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
- Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
- English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
- Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
- Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
- Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
- Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
- Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
- Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).
