Protocol
Все процедуры, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с правилами, установленными Университета Мичигана группы по лабораторных животных медицины.
1. Побудить генетической рекомбинацией у мышей
Примечание: Gli1 ТМ3 (CRE / ERT2) судья по административным делам / J штамм мыши (Gli1-CreERT2) 13 позволяет адресности тамоксифен-индуцированной генетической рекомбинации в TD эпителий. Крест этот штамм с B6.129S4-Гт (ROSA) 26Sor tm1Sor / J мышей репортер (LacZ) 22 для создания Gli1; LacZ животных для визуализации TD клетки от целого монтажа окрашивания ниже.
- Готовят тамоксифеном раствор до концентрации 12,5 мг / мл в кукурузном масле.
- В 1,5 мл пробирку, добавляют до 20 мг кристаллического тамоксифена, а затем 1 мл кукурузного масла. Твердо лента трубки к вихревой смеситель и непрерывно вихря на максимальных настройках при комнатной температуре, пока не тамоксифен полного растворения (2-4 ч), аподтвержден путем исследования трубки под микроскопом рассекает на отсутствие тамоксифена частиц.
- Перенесите раствор в 15 мл пробирку и разбавить тамоксифен до конечной концентрации 12,5 мг / мл с помощью дополнительного кукурузного масла. Смешайте встряхиванием вязкий раствор еще в течение 30 сек. Храните это решение до 1 недели при 4 ° С в темноте.
- Вводят тамоксифеном раствора внутрибрюшинно в Gli1; мышей LacZ, в объеме 200 мкл на 20 г веса тела мыши, для эффективной тамоксифена дозе 2,5 мг на 20 г веса мыши.
2. Урожай Биопсия кожи
Примечание: В зависимости от эксперимента, биопсии кожи урожай несколько дней до нескольких недель после тамоксифена индукции. Для всех операций, следуют стандартные протоколы для грызуна хирургии, в том числе с использованием стерильных перчаток, носить хирургическую маску или сетку для волос, и покрывая животное с хирургической стерильной салфетке во время процедуры.
- Приготовьте раствор 10x запас обезболивающий путем смешивания 90 мг / мл кетамина и 6,5 мг / мл ксилазина в воде. Развести этот маточный раствор 1:10 в стерильном PBS непосредственно перед использованием, и хранить при комнатной температуре в темноте в течение до 8 месяцев.
- В качестве альтернативы, анестезию мышей путем изофлуран ингаляции, начиная с концентрацией газа в 4% с кислородом, чтобы полностью анестезию животного, а затем впоследствии понижать это на 1-2% в течение длительности процедуры.
- Вводят анестезирующий раствор внутрибрюшинно в дозе 200 мкл на 20 г массы тела мыши. Убедитесь, что животное достиг надлежащей плоскости седации по схождение пинч анализа, и подтверждают, что сердце и частота дыхания являются нормальными (приблизительно 600 ударов и 160 вдохов в минуту, соответственно).
- Используйте электрическую машинку для удаления волос с сайта биопсии на коже спинной спины, стараясь не повредить или ник основной кожи.
- Подготовьте место операции, протерев бритьеd площадь в передне-к-заднем направлении с помощью Бетадин и спиртовые салфетки. Убедитесь, что все волосы вырезок удалены с сайта.
- Схема места биопсии, используя черный маркер, поместите животное на разогреве площадку в асептической хирургической области, и покрывают стерильной хирургической простыне (для демонстрационных целей, Салфетка стерильная была опущена для улучшения видимости).
Примечание: Для получения продольных срезах волосяных фолликулов, тем длиннее край биопсии (края, чтобы быть секционного для гистологического исследования, ~ 1 см) должен работать в передне-заднем направлении (параллельно направлению волосяные фолликулы), parasagital к средней линии спины (Фигура 1А). - Используйте стерильный # 11 скальпель, чтобы сделать полную толщину иссечение вдоль отмеченной области, не повреждая основной мышечной фасции.
Примечание: вырезают ткань кожи включает в себя эпидермис, дерма, подкожно-жировой клетчатки и panniculus carnosus. Кровотечение, как правило, минимальна. - Свести тон вырезан образец кожи на сухой бумажным полотенцем, дерма стороной вниз, обрежьте излишки бумажным полотенцем и хранить образцы в холодной PBS в течение 1 ч, если другие образцы должны быть собраны. Когда все будет готово, перейдите к шагам 3.1 или 3.2 для обработки образцов для гистологического исследования, или шаг 4 для всего монтажа β-галактозидазы (LacZ) окрашивания.
- Шов закрыть сайт для биопсии с использованием 6-0 нейлоновых наложения швов, в простом прерванного рисунка расстоянии примерно 3 мм друг от друга.
- Не возвращайте мышей, которые не прооперированы в той же клетке, как и другие животные, пока после полного выздоровления.
- Монитор животных сразу после операции, пока они не приходя в сознание, а также ежедневно до хирургической области не заживет, как правило, в течение 1 недели. Использование анальгетиков в соответствии с назначенными руководящими принципами институциональных уходу и использованию животных, если мыши обнаруживают признаки боли или страдания. Удалить швами в течение 7-10 дней после операции.
Примечание: В случае необходимости, подготовить анальгезирующее раствор путем разбавления карпрофен (50 мг / мл стоковый Solutион) 1: 100 в стерильной воде. Вводят подкожно раствор между лопатками вблизи шиворот, в дозе 200 мкл на 20 г веса тела (5 мг / кг массы тела мыши).
3. Способ Образцы для гистологии
Примечание: Для того, чтобы зафиксировать и обработать вырезанной ткани, использовать любой метод ниже в зависимости от применения.
- Для создания залитых парафином гистологических образцов, фиксируют кожу в 3,7% формалина в PBS O / N при комнатной температуре и хранят в 70% этаноле в течение до 2-х недель. Удалите бумажное полотенце, прежде чем вложения в парафин.
- Для получения замороженных гистологических образцов, погрузить ткань в холодной 4% параформальдегида в PBS и осторожно встряхивают в течение 1 часа. Удалить раствор и отмывки образца с 3 сменами PBS, примерно 5 минут каждый. Затем погрузить образец в 30% сахарозы в PBS для cryoprotect ткани ( "сахарозу потопление").
- Инкубируют при осторожном встряхивании O / N при температуре 4 ° С. На следующий день, снимите бумажный жгутэль и обрежьте излишки жировой ткани от кожной стороны кожи. Встраивание ткани непосредственно в OCT и хранить замороженный блок при температуре -80 ° С.
Примечание: После того, как секционирования, либо парафином или замороженные образцы можно окрашивать с помощью иммуногистохимии для выявления TDs, клетки Меркель и нервы , используя антитела против кератина 17, кератин 8 и нейрофиламентов, соответственно, как описано выше 5,19.
4. Образцы Визуализация по всей горе-LacZ Окрашивание
- Подготовить X-гал окрашивание раствора.
- Смешайте 0,94 г одноосновного фосфата натрия и 2,6 г двухосновного фосфата натрия в 250 мл стерильной воды. Доведения рН до 7,3. Для этого, добавьте 0,5 мл 1 М хлорида магния, 0,528 г ферроцианида калия и 0,412 г кровяной соли. Добавьте 250 мкл октилфенильная-полиэтиленгликоля и 125 мг дезоксихолате. Базовый раствор может храниться при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев в темноте.
- Подготовка 50x запаса X-Gal Solutiна добавлением диметилформамида в X-Gal фондовой бутылки для генерации / мл раствора 50 мг. Храните этот раствор при -20 ° С в темноте.
- Непосредственно перед использованием, развести запас X-Gal раствор 1:50 в базовый раствор X-гал для генерации окрашивания раствора. Для небольших биопсий (<1 см 2), аликвотных 1-2 мл окрашивающего раствора на образце.
- Закрепить образец кожи, собранной на шаге 2.7, в растворе, содержащем 2% параформальдегида / 0,2% глутаральдегида в PBS холодным в течение 30 мин, осторожно встряхивая на льду. Для небольших биопсий (<1 см 2), используют 1-2 мл закрепляющего раствора на образце.
Примечание: В качестве альтернативы, зафиксировать образцы в 2-4% параформальдегидом только, или только 0,5% глутаральдегида. Оптимальные условия фиксации зависят от ткани, степени выраженности LacZ и применения. - Удалите раствор фиксаторный, и прополоскать образцы с 3 сменами PBS, 5 мин каждый, на шейкере при комнатной температуре.
- Удалите бумажное полотенце под образцом и срезаны excess жировой ткани дермального стороны кожи, захватывая жир с тупыми щипцами и обрезки с анатомические ножницы.
- Погрузите образец в X-гал красящим раствором, и инкубировать при 37 ° CO / N. Выражение LacZ будет виден как пятно под синим рассекает микроскопом (рис 1В).
Примечание: Если интенсивность сигнала недостаточна, замените Окрашивающий раствор на следующий день и повторить O / N инкубации. Если фоновое окрашивание слишком интенсивное, сократить время окрашивания или инкубировать образца при комнатной температуре вместо 37 ° C. - Удалите окрашивание раствора и мыть образцы в 3 изменений PBS, содержащего 3% ДМСО в течение приблизительно 5 минут, осторожно встряхивая при комнатной температуре.
- Образцы Стирать в 2-3 смены 70% этанола в течение 5 минут каждый. Образцы Хранить в 70% этаноле.
5. Хирургическая Денервация
- Обезболить животное, как в шаге 2.2 и брить всю кожу спины.
- Подготовьте хирургическую область уплотнительноее кожу спины с помощью Бетадин и спиртовые салфетки, и покрывают животное стерильной хирургической простыне (для демонстрационных целей, Салфетка стерильная была опущена для улучшения видимости). Держите животное в тепле, используя грелку во время работы в асептической хирургической области.
- Сделать надрез с помощью стерильного # 11 скальпелем вдоль средней линии спины от основания шеи до примерно 0,5 см выше хвоста.
- Используя тупые щипцов, мягко отражают кожу на левой стороне от фланга визуализировать основную ткань из лопаточной жировым возле шеи чуть выше задней конечности.
Примечание: спинного кожных нервов появляются как белые пряди , которые путешествуют каудально через полупрозрачную фасции стенки ствола перед делать резких изгибов и входя в рыхлой соединительной ткани под кожей (рисунок 2). - С помощью ультра-тонких щипцов под рассекает световым микроскопом, удалить нервы исключительно с левой стороны от анимыл расположен в анатомических T3-12 щипком откуда сегменты согните в багажнике стены до их ввода объектов в кожу (Рисунок 2).
- Orient пинцетом по вертикали и удалить нервы, захватив около 0,5 см ниже их изгиба участков и потянув вверх, в результате чего нерв , чтобы растянуть и отделить от окружающей ткани (рис 2С - Е). Будьте осторожны, чтобы избежать разрывания соседних кровеносных сосудов.
- Продолжайте, пока все нервы, отходящие от ствола стенки к коже не будут удалены. Не нарушать нервы в плотной фасции стенок туловища. Держите ткань влажной в течение всей процедуры, периодически применяя капли стерильного 0,9% солевого раствора.
- В качестве альтернативы, удалить нервы, захватив их проксимальных концов вблизи стенки ствола с пинцетом и отрезая с тонкими ножницами. Затем, разъединить дистальных концов вблизи кожи (рис 2F - H). И, наконец, удалить Intervening нервные сегменты (рис 2i).
- Удалите все нервы из лоскута кожи подвергается на шаге 5.4. Эти волокна содержат дистальные ветви дорсальных кожных нервов и появляются в виде белых ветвящихся нитей , расположенных спорадически в соединительной ткани на кожном стороне кожного лоскута (рис 2J - K).
- Чтобы удалить эти тонкие ветви, расположите мелкие пинцетом примерно параллельно поверхности дермального, возьмитесь нервы и срывать вверх, чтобы избежать нарушения кровеносных сосудов и прокалывания кожи. Продолжайте, пока все видимые нервы не были удалены.
- Использование тупым, отражают кожу на правой стороне срединный разрез спинного, но не удаляют нервы. Это будет служить контралатеральной ложнооперированными контроля.
- Шов вдоль средней линии спины в простом прерванного шаблон, чтобы закрыть разрез. Монитор животных во время восстановления и пост-опенительно, как показано ранее (шаги 2.8-10). Удалить швами в течение 7-10 дней после операции.
- Для оценки функционально стабильной денервации до нескольких недель после операции, удаления волос с кожи спины с помощью электрического клипер.
- Осторожно проколоть денервированная участок кожи с помощью иглы для подкожных инъекций, и отметьте, отвечает ли животное, как правило, содрогаясь или поворачивая голову. Если участок кожи стабильно денервированными, животное будет проявлять мало или вообще не получить ответа.
- Используя черный маркер, очертить область без ответа, а также площадь аналогичного размера и расположения на противоположной стороне мнимым.
- Сбор биопсию из этих сайтов, как на этапах 2.1-2.9 для анализа.
Примечание: В качестве альтернативы, вся спинная обратно кожи, в том числе денервированными и ложнооперированными областей, могут быть удалены в виде единого листа для целом монтажа окрашивания, аналогично, как описано в шаге 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Генерируя мышей , экспрессирующих тамоксифен-индуцируемых Gli1-CreERT2 и LacZ - репортерного аллеля, можно визуализировать TD эпителий и отслеживать судьбы этих клеток в течение долгого времени. Вся процедура денервации, как правило, может быть завершена в течение 1 часа на мышь и должен вызвать минимальное бедствие для животного.
Наши предыдущие исследования показали , что нервы имеют решающее значение для поддержания как нормальные TDs, а также связанных с ними клеток кератина 8 + Меркель (Фиг.3А - C) 5,19. Нервы также имеют важное значение для содействия экспрессии Gli1 в TD (Рисунок 3D). Учитывая относительно нечастое появление кластеров TD по всей коже (рис 1B), необходимо , чтобы попробовать несколько замороженных срезов точно количественно оценить частоту TD. Как правило, мы оцениваем 15 не-минусыисполнитель- секции (каждая длиной 10 мкм и ~ 1 см) и от притворства и денервированного кожи от каждого животного. После денервации, стабильная потеря нервов, как на TD и по всей коже, может быть подтверждено отсутствие иммуногистохимического окрашивания для стандартных пан-нейральных маркеров , таких как нейрофиламентов в замороженном или парафиновых срезах (фигуры 3А и 3В, а также ранее сообщили 5). В качестве альтернативы, нервы могут быть также идентифицированы путем экспрессии & beta ; 3-тубулина или PGP9.5 6,9.
Используя Gli1; мышей LacZ, также возможно , чтобы подтвердить , как требование нервов при активации сигнализации Ёжик в ТД и в поддержании судьбы TD клеток путем изменения последовательности тамоксифен-стимулированной рекомбинации и денервации. Если денервации выполняется до рекомбинации, например, этот тест будет требование к нервам в активации pathwa HedgehogY, что контролируют с помощью рекомбинантному активности и уровней Cre, которые соотнесены с выражением Gli1 у этих животных. С другой стороны, если денервации выполняется после рекомбинации, эта оценка будет требование к нервам в поддержании уже меченных клеток в TD.
Рисунок 1. Биопсия кожи и в целом монтажа LacZ окрашивание TD эпителии. (A) (Top) Фотография мыши после биопсии и перед наложением швов. (Слева внизу) Увеличенное изображение участка биопсии. (Правый нижний угол) образец кожи, полученный из биопсии с его сторона дермы распространения плоской на сухой бумажным полотенцем. (B) Всего монтажа LacZ окрашивание кожи от Gli1; LacZ мыши, через 7 дней после того, как тамоксифен индукции, депилированной непосредственно перед биопсию для улучшения визуализации кожи. Gli1 + / LacZ + TDs помечены как интенсивный синий кластеров.Шкала бар = 1 см. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Два подхода к денервирующий спинной кожи. (A) Мультфильм схема Иннервируются кожи мыши. Красные пунктирные линии обозначают одну иссечение, сделанное вдоль средней линии спины, чтобы выставить основной мускулатуру на стволе стены (фиолетовый), а также в дерму (серый, звездочка) под отраженным кожи. Спинной кожных нервов, путешествующие каудально по всей видимости, "загнуть", когда они покидают ствол стены (черная стрелка указывает на один такой изгиб). сегменты Нервные быть вырезана разграничены черными пунктирными линиями. (Б) Фотография интактных нервов с участками изгиба (указанные стрелками). Синие стрелки указывают на 2 нервных сегментов, которые будут бэрOved. (C - D) Фотографии , показывающие технику денервации. Использование ультра-тонкий пинцет, сцепление нервов на 0,5 см ниже их участков изгиба и потяните наружу. (Е) Фотография показывает полость тела после удаления 2 нервных сегментов (синие стрелки). Остальные нервы также должны быть удалены. (F - I) Альтернативный подход для удаления нерва изображен, где нервы пропущено в их ближние концы чуть ниже , где они изгибаются (наконечники стрел) (G), а также дистально, близко к их месте проникновения в кожу (наконечники стрел) (H). Обратите внимание, что срединный разрез в этих изображениях длиннее, чем типичный для целей лучшей визуализации. (J) Фотография дермального стороне отраженном кожный лоскут на одну сторону от средней линии. (K) Нервы очерчены (черные линии), с более крупными кровеносными сосудами , указанных в красном цвете. Нервные, расположенные на стороне дермы лыжип лоскут также должны быть вырезаны. Звездочка, лежащая в основе дермы из отраженного лоскута кожи. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Стабильная потеря нервов и ухудшения TDs после денервации. (A) Иммуногистохимия показывает TD эпителий с кератина 8 + Merkel клеток (K8, зеленый) и нейрофиламентов + нервов (NF, красный) в ложнооперированными кожи. (B) Мультфильм изображение с TD эпителии выделены фиолетовым цветом, Меркель клеток в зеленый цвет, и чувствительных нервов в синий цвет. (C) Immunohistochemistry показывая денервированная кожи (DEN) отсутствие клеток-аксонов комплексов Меркель в районе ТД. Пунктирные желтые линии, волосяного фолликула эпителий. Звездочка, Background окрашивание. (D) Всего монтажа LacZ окрашивание спинного назад кожи от Gli1 LacZ / + мышь через 2 недели после одностороннего денервации кожи. В поле слева от исцеленном срединный разрез (стрелка), обильные меченые TD эпителий наблюдаются в ложнооперированными кожи. Справа от средней линии, TDs не видны в денервированного коже. Шкала бар = 10 мкм для (А), (С); и 1 мм для (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нервы служат важные функции не только в ощущениях, но и в развитии млекопитающих органов, поддержания и регенерации 13,24-27. Поскольку нервы в последнее время были вовлечены в различных кожных заболеваний, методы, описанные здесь, могут быть использованы для изучения потребности в иннервации в различных моделях болезней животных. Действительно, односторонний метод денервации допускает прямого сравнения с кожей или интактными, или срыву нервы от той же мыши. Это обеспечивает идеальную систему внутреннего контроля, чтобы компенсировать различия животного к животному, с последующим анализа данных использования парного Т-тест.
В то время как процедуры , описанные здесь , в основном используют ген - репортер LacZ, эти эксперименты могут быть адаптированы таким образом, что аллель Gli1-CreERT2 сочетается с другими флуоресцентный репортер или условных аллелями модифицировать экспрессию генов в TD. Например, у мышей Gli1-CreERT2 могут пересекатьсяс животных , являющихся носителями условных аллели Patched1 (B6N.129-pTCH1 tm1Hahn / J) 28 для генерирования мышей , которые образуют TD-производные опухоли после тамоксифена индукции 5. Важно отметить , что штамм Gli1-CreERT2 также индуцирует рекомбинацию в подмножестве Gli1 + волосяного фолликула стволовых клеток , которые физически отделены от тех , в TD 13.
После денервации, нервы в коже остаются стабильно ABLATED в течение нескольких месяцев (рис 3C) 5,19. В других исследованиях, однако, сообщалось некоторые повторно иннервации происходят с течением времени 6. Perdurance из денервированного фенотипа может зависеть от тщательности удаления нерва, поскольку это жизненно важно для акцизных нервных сегментов между их выхода из грудной стенки до точки, близкой к местам введения в дерму кожи.
Полностью снятия изонг волос от кожи до биопсии может повысить способность впоследствии визуализировать TDs от цельного горы окрашивания (рис 1B). Это достигается за счет применения депиляции крем для кожи подстриженными в течение 2 мин, а затем вытирая волосы прочь в передне-к-заднем направлении с помощью ватных шариков. Обратите внимание, что может повлиять на депиляции кинетики цикла волос, способствуя вхождение в фазу анагена роста. В качестве альтернативы, волосы могут быть полностью удалены с помощью лезвия бритвы. Кроме того, вся гора иммуногистохимии могут быть выполнены , чтобы визуализировать TDs и клетки Меркель эпителиальных листы , отделенные от дермы, как было описано ранее 23.
Остается возможность того, что хирургическое денервации может вызвать воспаление в месте операции, потенциально оправдав любые наблюдаемые фенотипы. По нашему опыту, мы не наблюдали сильное воспаление после денервации, вероятно потому, что сопутствующий ущерб ткани, понесенные в скв незначителен, если процедура выполняется должным образом. Для того, чтобы свести к минимуму вероятность того, что воспаление может повлиять на результаты, дополнительные элементы управления могут быть включены в эксперимент. Например, мы обнаружили , что денервация специфически ингибирует TD происхождения опухоли, но не смежны волосяной фолликул-ассоциированных поражений в одних и тех же образцах кожи, утверждая , что денервации , а не общий раневой индуцированный воспалительный ответ, вероятно подавлял туморогенез на TD 5.
Важно отметить , что хирургическое денервации ablates все кожных нервов, в том числе сенсорных и симпатических волокон 5, и , таким образом , обеспечивает общую общую оценку влияния этих нервов на любой нормальной или патологически кожи. Другие экспериментальные подходы, например , с использованием pharmacologics , такие как ботулинического нейротоксина , чтобы блокировать синапсах, может дать более детальные механистические идеи 7, хотя и неясно , будет ли ингибировать ретроградным эти агентысекрецию цитокинов, таких как Hedgehog лигандов. В качестве альтернативы, соединения , такие как 6-гидроксидопамина использовались для абляции симпатических нервов в коже 9. Кроме того, нацеливание на рецепторы для нервных производных факторов , таких как ген кальцитонина-родственный пептид и вещество P может быть полезным для опрашивая специфичных взаимодействий между нервами и окружающими клетками в их нише 6. В конечном счете, множество стратегий, могут быть использованы в комбинации для идентификации, или, по крайней мере, исключать, потенциальные механизмы сигнализации.
И, наконец, целевое генетическое удаление нервных полученных факторов в нейронального происхождения с использованием либо Wnt1-Cre или Advillin-Cre может представлять собой золотой стандарт для выяснении сигналы, которыми обмениваются между нервами и их нише 19. Поскольку ни один из этих штаммов тамоксифен-индуцируемый, однако, некоторая осторожность должны быть приняты, чтобы гарантировать, что нарушение этих сигналов не нарушает развитие нервной системы или надлежащего TArgeting нервных афферентов. Использование тамоксифен-индуцируемый Cre , такие как Advillin-CreERT2 может помочь обойти эти проблемы 29.
В целом, описанные здесь методы-сочетание отслеживании клонов, визуализации клеток и хирургических денервации предлагают мощные подходы для изучения влияния нервов на нормальной и пораженной кожи. С опытом, эти процедуры могут быть выполнены в плановом порядке и надежно, в то время вызывая минимальное страдания животному-или следователя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pads | PDI | B339 | |
| AnaSed (Xylazine) | Lloyd | NADA 139-236 | |
| Antibody, anti-Keratin 8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | rat antibody, use at 1:500 concentration |
| Antibody, anti-Keratin 17 | Cell Signaling | #4543 | rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration |
| Antibody, anti-Neurofilament | Cell Signaling | C28E10 | rabbit antibody, use at 1:500 concentration |
| Betadine prep pads | Medline | MDS093917 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Zoetis | ||
| Cordless rechargable clipper | Wahl | trimmer model 8900 | |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | use at 1:1,000 concentration |
| Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Depilatory Cream | Nair | N/A | |
| Dimethylforamide | Sigma-Aldrich | 319937 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Ketamine HCl | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Micro cover glass | VWR | 48404-454 | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-4LP | |
| 6-0 nylon sutures | DemeTECH | NL166012F4P | |
| Octylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| O.C.T. Compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pottasium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Pottasium ferricyanide | Sigma-Aldrich | 702587 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| Ultra fine forceps | Dumont | 0103-5-PO | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| X-gal | Roche | 10 651 745 001 | Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115 (2014).
- Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
- Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
- Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
- Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
- Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
- Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
- Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
- Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
- Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
- Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
- Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
- Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
- Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
- Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
- Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
- English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
- Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
- Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
- Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
- Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
- Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
- Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100 (2011).
