Summary
التلاعب المعدلة وراثيا وتحرير الجينوم حاسمة لاختبار وظيفيا دور الجينات وعناصر -regulatory رابطة الدول المستقلة. هنا يرد بروتوكول حقن مكروي مفصل لتوليد التعديلات الجينوم (بما في ذلك بوساطة Tol2-بنيات فلوري مراسل التحوير، TALENs، وCRISPRs) للأسماك نموذج الناشئة، وأبو شوكة سمك شائك threespine.
Abstract
وقد ظهرت الأسماك أبو شوكة سمك شائك threespine كنظام قوي لدراسة الأساس الجيني لمجموعة واسعة من المورفولوجية والفسيولوجية، والظواهر السلوكية. الظواهر المتنوعة بشكل ملحوظ والتي تطورت كما التكيف مع السكان البحري إلى بيئات المياه العذبة لا تعد ولا تحصى، جنبا إلى جنب مع القدرة على عبور أشكال البحرية والمياه العذبة، وتوفير نظام الفقاريات نادرة في علم الوراثة التي يمكن استخدامها لرسم خريطة مناطق الجينوم سيطرة على وصفات تطورت. هي الموارد الجينومية الممتازة المتاحة الآن، وتسهيل تشريح الوراثي الجزيئي للتغييرات تطورت. بينما التجارب رسم الخرائط توليد قوائم الجينات المرشحة للاهتمام، يطلب من التلاعب الجيني وظيفية لاختبار دور هذه الجينات. تنظيم الجينات يمكن دراستها مع البلازميدات مراسل المعدلة وراثيا والبكالوريا دمجها في الجينوم باستخدام نظام ترانسبوزاز Tol2. وظائف الجينات المرشحة محددة وعناصر -regulatory رابطة الدول المستقلة يمكن تقييمها عن طريق حفز المستهدفةالطفرات مع TALEN وكريسبر / Cas9 الكواشف تحرير الجينوم. كل الطرق تتطلب بإدخال الأحماض النووية إلى المخصبة الأجنة أبو شوكة سمك شائك-خلية واحدة، وهي مهمة صعبة من قبل المشيمه سميكة من الأجنة أبو شوكة سمك شائك وقسيم أرومي صغير نسبيا ورقيقة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة ل microinjection من الأحماض النووية في الأجنة أبو شوكة سمك شائك للالمعدلة وراثيا وتحرير الجينوم التطبيقات لدراسة التعبير الجيني وظيفة، فضلا عن التقنيات المستخدمة لتقييم نجاح transgenesis واستعادة خطوط مستقرة.
Introduction
واحد عنصرا أساسيا في فهم الكيفية التي ينشأ التنوع البيولوجي هو تحديد الأسباب الوراثية والتنموية التغيرات المظهرية تطورت في الطبيعة. الأسماك أبو شوكة سمك شائك threespine، Gasterosteus aculeatus، برزت نموذجا ممتازا لدراسة الأساس الجيني للتطور. خضعت أبو شوكة العديد من التغيرات التطورية التكيف على الأسماك البحرية قد استعمرت عدد لا يحصى من بيئات المياه العذبة في جميع أنحاء نصف الكرة الشمالي، مما أدى إلى الصرفية مثيرة والفسيولوجية، والتغيرات السلوكية 1. تم التسلسل جينومات أفراد من واحد وعشرين السكان أبو شوكة سمك شائك وتجميعها، ولقد تم إنشاء خريطة الربط عالية الكثافة لزيادة تحسين تجمع 2،3. وقد حددت التجارب رسم الخرائط الوراثية مناطق الجينوم الكامنة وراء الظواهر تطورت 4-6، وفي حالات قليلة، تم اختبار الأدوار الوظيفية من الجينات المرشحة محددة 7،8. وقد تم التعرف على عدد من مناطق الجينوم الكامنة وراء التغيرات المورفولوجية مع الجينات مرشح واعد، ولكن هؤلاء المرشحين لم يتم اختبارها وظيفيا 9-12. وبالإضافة إلى ذلك، أبو شوكة هي نماذج مشتركة لدراسات علم الوراثة السكانية / علم الجينوم 13،14، أنواع جديدة 15، والسلوك 1، الغدد الصماء 16، والسمية الإيكولوجية 17، علم المناعة 18 والطفيليات 19. والدراسات المستقبلية في كل من هذه المجالات تستفيد من القدرة على أداء التلاعب الجيني وظيفية في أبو شوكة. بالإضافة إلى التلاعب تسلسل الترميز، ودور الجينات المرشحة يمكن تقييم من خلال دراسة تسلسل -regulatory رابطة الدول المستقلة وعن طريق زيادة وظيفيا أو الخفض، أو القضاء على التعبير عن الجينات مرشح. طرق حقن مكروي وtransgenesis في أبو شوكة راسخة 7،8،20 ووضعت في البداية باستخدام بوساطة meganucleaseطريقة 21 صفت لأول مرة في الميداكا 22. وقد تم تحسين طريقة حقن مكروي المعدلة المعروضة هنا لكل من transgenesis توسط Tol2 وضعت مؤخرا الجينوم الكواشف التحرير بما في ذلك TALENs وCRISPRs.
ويعتقد أن التغييرات في العناصر رابطة الدول المستقلة -regulatory أن تكون حاسمة في تطور المورفولوجية، ورابطة الدول المستقلة -regulatory التغييرات يمكن تجنب العواقب عديد المظاهر السلبية للترميز الطفرات 23. ولذلك، أصبح اختبار ومقارنة المفترضة تسلسل -regulatory رابطة الدول المستقلة هدفا مركزيا لعدد متزايد من الدراسات التطورية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم المتغيرات الأمراض البشرية هي المتغيرات التنظيمية 24،25، ونظم نموذج الفقاريات هناك حاجة ماسة لدراسة رابطة الدول المستقلة وظيفة عنصر -regulatory والمنطق. الأسماك التي تخصيب الأجنة من الخارج بأعداد كبيرة ويعطي نظم الفقاريات قوية لدراسة -regulation رابطة الدول المستقلة. النظام ينقول Tol2، التي foreiويحيط الحمض النووي حسن الجوار لتكون متكاملة في الجينوم من Tol2 ترانسبوزاز المواقع وملزمة شارك حقنه مع Tol2 ترانسبوزاز مرنا، تعمل بكفاءة عالية لدمج بنجاح البلازميد يبني في الجينوم الأسماك 26-28. عادة، يتم استنساخ محسن محتمل المنبع المروج القاعدية (مثل hsp70l 29) والجينات مراسل فلوري مثل EGFP (تعزيز البروتين الفلوري الأخضر) أو mCherry في العمود الفقري Tol2 وحقن ترانسبوزاز مرنا 26. توفر المراقبة التعبير لمراسل الفلورسنت، سواء في الأجنة المحقونة أو ذرية مع الجينات المحورة المتكاملة مستقر، معلومات عن تنظيم الزمانية المكانية في التعبير الجيني يقودها محسن المفترضة. في تجارب أخرى، والقدرة على التحقق من صحة يمكن استخدامها لدفع overexpression الأنسجة محددة من الجينات في المصالح.
لتحليل المناطق -regulatory رابطة الدول المستقلة أكبر، جودة عالية إدراج كبير genomتم تشييد مكتبات جيم باستخدام الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (البكالوريا) لكل من أبو شوكة البحرية والمياه العذبة 30. يمكن recombineered هذه البكالوريا لتحل محل الجينات مع الجينات مراسل فلوري في سياق واسع (150-200 كيلو بايت) المنطقة الجينومية 31. ثم يتم التعبير عن مراسل فلوري في نمط الزمانية المكانية على النحو الذي يحدده تسلسل التنظيمية داخل BAC. للدراسات في الأسماك، يمكن إضافة مواقع Tol2 إلى BAC لتسهيل التكامل الجيني 32،33. في مراحل لاحقة من التطور عند التهجين الموضعي يشكل تحديا تقنيا، قراءات الفلورسنت من BAC يمكن استخدامها لدراسة أنماط التعبير الجيني، كما ثبت عن أبو شوكة سمك شائك العظام البروتين المخلق 6 (Bmp6) 20. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تتبع أنماط التعبير الفلورسنت في الفرد مع مرور الوقت، والتي لا يمكن أن يتحقق مع التهجين في الموقع. ويمكن أيضا أن تستخدم البكالوريا لإضافة additionaنسخة لتر من منطقة الجينومية لزيادة جرعة من الجينات في المصالح.
لدراسة وظيفة الجين، والتحرير الجينوم هو حقل التوسع المتفجرات التي يمكن استخدامها لإحداث تغييرات هادفة لتسلسل الجينوم في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية 34. النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs) هي وحدات، وتسلسل معين nucleases فصل أصلا من مسببات الأمراض النباتية التي يمكن تصميمها بدقة لربط مباشرة إلى التسلسل الجيني الاختيار وتوليد حبلا مزدوج كسر 35،36. تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / تم العثور على أنظمة CAS أصلا في البكتيريا واستخدام الحمض النووي الريبي دليل والبروتين Cas9 لتوليد كسر في الهدف تسلسل الحمض النووي مكملة لدليل 37. إصلاح لاحق من نهاية الشوط الاول حبلا مزدوج إنشاؤها من قبل كل من TALENs وCRISPRs غالبا ما يترك وراءه الإدراج صغير أو الحذف، والذي يمكن أن يحدث خللا في وظيفة من تسلسل الهدف35-37. في أبو شوكة، وقد استخدمت TALENs لعرقلة التعبير الجيني من خلال استهداف محسن 20، وكلا TALENs وCRISPRs نجحنا في انتاج طفرات في الترميز متواليات (بيانات غير منشورة). بروتوكول مفصل لتوليد CRISPRs للاستخدام في الزرد يمكن أن تستخدم كدليل لتطوير CRISPRs لأبو شوكة 38.
تتطلب المعدلة وراثيا والجينوم التجارب التحرير مقدمة من الأحماض النووية إلى المخصبة حديثا الجنين خلية واحدة. من خلال إدخال التحوير أو الجينوم تحرير أداة في التنمية في وقت مبكر، إلى أقصى حد ممكن من عدد الخلايا ابنة التلاعب بها وراثيا في الجنين. حقن الأجنة ثم يتم بصريا فحص لمضان أو فحص جزيئيا عن التعديلات الجينوم. إذا استهدفت خلايا المساهمة في سلالة الجرثومية بنجاح، والتحوير أو طفرة يمكن أن تنتقل إلى مجموعة فرعية من النسل، حتى عندما بعد الحقن الفتك عالية. الأسماك الفسيفساء يمكن outcrossed أوintercrossed وذريتهم فحص لاسترداد أليل متحولة أو التحوير متكاملة ثابت من الفائدة. يصف هذا البروتوكول طرق لإدخال الجينات المحورة والجينوم الكواشف التحرير في الأجنة أبو شوكة سمك شائك-خلية واحدة ورصد التعديلات الجينوم ناجحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع الأعمال الأسماك من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كاليفورنيا في بيركلي (البروتوكول رقم R330).
1. إعداد الأحماض النووية للحقن
- Tol2 البلازميد Transgenesis (مقتبس من فيشر 26).
- قطع 10 ميكروغرام ترانسبوزاز البلازميد (PCS-TP) 39 مع 10 U نوتي في المخزن الموردة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ليصبح خطي.
ملاحظة: قد تكون هناك حاجة اتفاقات نقل المواد للحصول على البلازميدات Tol2. - استخراج قطع البلازميد مع 25: مزيج 1 من الفينول: 24 الكلوروفورم: أيزو أميلي الكحول ويعجل الإيثانول مع خلات الصوديوم وفقا لبروتوكولات القياسية 40. البلازميد resuspend في 50 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز.
ملاحظة: يجب استخدام الفينول كلوروفورم في غطاء محرك السيارة والنفايات يجب التخلص بشكل صحيح وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. - إعداد رد فعل SP6 النسخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- استخدام ISOL RNAعدة أوجه لتنظيف رد فعل النسخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. و resuspend RNA في الماء 50 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية.
- إزالة قسامة 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي. الحرارة إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد الهياكل الثانوية ثم البرد على الفور على الجليد. تجميد رد فعل النسخ المتبقية في -80 درجة مئوية.
- تشغيل قسامة RNA على هلام 1٪ الاغاروز في 0.5X تاي (تريس قاعدة، وحامض الخليك، ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل) العازلة على التوالي مع معيار حجم الحمض النووي الريبي في حارة واحدة. المنتج المتوقع هو 2200 سنة مضت. تجاهل حالة ظهور> 5٪ من مجموع الحمض النووي الريبي في مسحة أصغر من 2200 سنة مضت، مما يشير إلى تدهور واسع النطاق (الشكل 1).
- تحديد الحمض النووي الريبي باستخدام معمل في 260 نانومتر. تمييع إلى 350 نانوغرام / ميكرولتر في قسامات المياه وتخزين 1 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية في -80 درجة مئوية (جيد لمدة سنة على الأقل).
- استنساخ Tol2 مراسل البلازميد (على سبيل المثال، وذلك باستخدام pT2HE 8 أو البلازميدات من عدة Tol2 41) مع رابطة الدول المستقلة- العنصر التنظيمي للمصلحة. لفترة وجيزة، PCR تضخيم تسلسل الحمض النووي الجيني في المصالح مع الاشعال تحتوي على مواقع تقييد وجدت في البلازميد، هضم المنتج PCR وناقلات مع انزيم (ق)، ligate إدراج في ناقلات، وتحويل الناتج البلازميد إلى E. المختصة القولونية 40. عزل البلازميد مع مجموعة يتضمن شطف الذيفان الداخلي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- إجراء تنقية الثانية من البلازميد Tol2 مع عدة تنقية PCR وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل في 30 المياه خالية من ريبونوكلياز ميكرولتر.
ملاحظة: العائد من هذه الخطوة قد تكون منخفضة (في بعض الأحيان أقل من 50٪ من البلازميد المدخلات). - تمييع البلازميد ~ 125 نانوغرام / ميكرولتر في ريبونوكلياز خالية من المياه.
- قطع 10 ميكروغرام ترانسبوزاز البلازميد (PCS-TP) 39 مع 10 U نوتي في المخزن الموردة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ليصبح خطي.
الشكل 1. ترانسبوزاز مرنا هلام. النسخ تنقية رد فعل المؤيدينكانت ساخنة القناة (1 ميكرولتر) إلى 65 درجة مئوية، وفتور على الجليد، وتعمل على هلام الاغاروز 1٪ مع 0.5X تاي العازلة على التوالي في 100 خامسا أحجام سلم الحمض النووي الريبي في kilobases (كيلوبايت) يشار إلى اليسار . كامل مرنا طول ترانسبوزاز هي الفرقة مشرق في ~ 2.2 كيلوبايت. وينظر الى كمية صغيرة ولكنها مقبولة من مرنا المتدهورة أو غير كاملة أدناه 2.2 كيلوبايت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- BAC Transgenesis (انظر Suster 32،33 لتقنيات BAC Recombineering)
- إعداد BAC من E. القولونية باستخدام BAC عدة تنقية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام الإيثانول هطول الأمطار لاستعادة الحمض النووي مع الصوديوم القياسي استخراج خلات الإيثانول 40 و الحمض النووي و resuspend في ~ 250 نانوغرام / ميكرولتر في ريبونوكلياز خالية من المياه.
- إعداد ترانسبوزاز مرنا كما في القسم 1.1.
- طفرة التعريفي مع TALENs (انظر سيرماك
- استخدام التطبيق على شبكة الإنترنت لتصميم TALENs لهذا الجين من الفائدة 42. إذا كان ذلك ممكنا، تصميم TALENs بتعطيل تقييد انزيم خفض الموقع لتسهيل التحليل الجزيئي.
- استنساخ TALENs وإعداد البلازميدات عن النسخ التالية نشر بروتوكول 35.
- نسخ TALEN مرنا مع رد فعل SP6 النسخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتنظيف مرنا كما هو موضح لترانسبوزاز في القسم 1.1.4. قياس مع معمل وتمييع إلى 200 نانوغرام / ميكرولتر في ريبونوكلياز المياه مجانا. تشغيل TALEN مرنا على هلام للتأكد من أنه هو الحجم المناسب وليس المتدهورة كما هو موضح في الخطوة 1.1.6.
- تصميم زوج من الاشعال PCR لتضخيم حوالي 100-200 بي بي المحيطة بالهدف تسلسل TALEN باستخدام أداة التصميم التمهيدي والهدف تسلسل الحمض النووي 43. تأمر انزيم التقييد المناسب لاختبار الآفات في الموقع المستهدف على أساس خطوة 1.3.1.
- تصميم وإعداد CRISPRs وCas9 مرنا وفقا لبروتوكول 38، والنظام المناسب الاشعال التحقق والانزيمات التقييد كما هو موضح في الخطوة 1.3.4.
2. إعداد الكواشف حقن
- استخدام البورسليكات الشعيرات الدموية لإعداد الإبر كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: هذه الشعيرات ليست الشعيرات الدموية القياسية المستخدمة ل microinjection الزرد، ومصنوعة من الزجاج سمكا وأقوى التي تعتبر ضرورية لثقب المشيماء أبو شوكة سمك شائك صعبة.- دائما ارتداء النتريل قفازات اللاتكس أو عند سحب الإبر، وعدم السماح الإبر للاتصال الجلد أو الجلد الزيوت.
- تحديد المعلمات micropipette سحب تجريبيا عن طريق اختبارات منحدر باتباع تعليمات الشركة المصنعة مجتذب micropipette في ل. على سبيل المثال، مع خيوط مربع، وردع المعلمات التاليةالملغومة لتكون الأمثل: (الحرارة = 515، سحب = 60، السرعة = 60، والتأخر = 85، الضغط = 500). هذه الإعدادات تنتج إبرة أن التناقص التدريجي بشكل حاد في ما يقرب من 12 درجة ل~ 2 مم وبعد ذلك تمديد فترة طويلة أن التناقص التدريجي في حوالي 2 درجة ل~ 6 مم (الشكل 2).
ملاحظة: سوف تختلف المعلمات المناسبة التي كتبها مجتذب وخيوط، وعلى نحو أعمى يستخدم البرنامج دون تحديد المعايير لأول مرة من خلال اختبارات منحدر يمكن أن تدمر خيوط مجتذب، والذي هو صعبة ومكلفة ليحل محل بشكل دائم. - اتبع تعليمات الشركة الصانعة لسحب لا يقل عن 4 الإبر micropipette من الزجاج البورسليكات مع الإعدادات المحددة في 2.1.2.
- متجر الإبر عموديا في جرة تخزين الشعرية مع نهاية حادة لأسفل.
- قبل الحقن، ضع جرة تخزين الشعرية على الجليد للبرد والإبر. إضافة قطعة من منشفة ورقية رطبة إلى جرة لمنع التبخر مرة تمتلئ الإبر.
- يخصب البيض (كلخطوات أجريت في RT)
- قطاع البيض مخلب من أبو شوكة سمك شائك الإناث حامل عن طريق الضغط بلطف على البطن والتمسيد في سابقة لالخلفية الاتجاه لدفع البيض من خلال مجرور وإلى 35 × 10 مم 2 طبق بيتري. إضافة قطعة رطبة من منشفة ورقية على جانب واحد من طبق بيتري (عدم لمس البيض) لإنشاء غرفة الرطوبة. وضع غطاء على طبق بيتري حتى البيض تبقى رطبة.
- الموت ببطء أبو شوكة سمك شائك الذكور في 0.025٪ تريكين-S مخزنة مع 0.1٪ بيكربونات الصوديوم.
- خفض فتح البطن، إزالة الخصيتين وأضعف في 250 حل ميكرولتر هانك (انظر Westerfield 44 لبروتوكول الكامل لإعداد محلول هانك).
- تسميد 100 على الأكثر البيض مع 50 ميكرولتر حل الحيوانات المنوية ويحرك بلطف مع طرف ماصة لضمان تلقيح جميع البيض. إذا كان القابض هو> 100 بيضة، وتسميد النصف من البيض في وقت لاحق للتأكد من أن جميع الأجنة في مرحلة خلية واحدة في وقت الحقن. البيض يمكن أن تترك غير مخصبة في RT لمدة تصل إلى ساعة واحدة، والحيوانات المنوية يستمر عادة لفترة 1-7 أيام في 4 درجات مئوية في حل هانك.
- إبقاء الأجنة مغطاة طبق بتري غطاء بعد الإخصاب لمنع جفاف. السماح 20-25 دقيقة للخلية الأولى في الظهور وتنتفخ (إعداد مواد الحقن خلال هذا الوقت).
- ملء 150 مم × 15 مم طبق بيتري مع الماء أبو شوكة سمك شائك. (لجعل المياه أبو شوكة سمك شائك، أولا إعداد 10٪ بيكربونات الصوديوم المذابة في الماء منزوع الأيونات، ثم إضافة 3.5 غرام مزيج مياه البحر الاصطناعي و0.217 مل من 10٪ بيكربونات الصوديوم لكل 1 لتر من الماء منزوع الأيونات، ويقلب / هزة بقوة بحل الملح).
- إعداد حقن الحل (بينما البيض وتسميد)
- يعد حل الحقن وفقا للجدول (1) ومتجر على الجليد.
ملاحظة: لقد تم زيادة تركيزات بعض الأحماض النووية من تلك التي نشرت لالزرد ويرجع ذلك إلى زيادة حجم وقسيم أرومي أبو شوكة سمك شائك.
- يعد حل الحقن وفقا للجدول (1) ومتجر على الجليد.
| كاشف | حقن Tol2 | حقن BAC | حقن TALEN | حقن كريسبر |
| Tol2 مرنا | 350 نانوغرام | 350 نانوغرام | - | - |
| الحمض النووي | 150-200 البلازميد نانوغرام | 200-300 نانوغرام BAC | - | - |
| TALEN مرنا | - | - | 200 نانوغرام لكل | - |
| دليل كريسبر RNA | - | - | - | 200 نانوغرام |
| Cas9 مرنا | - | - | - | 400 نانوغرام |
| برنامج تلفزيوني 0.5٪ الفينول inDulbecco الأحمر | 0.5 ميكرولتر | 0.5 ميكرولتر | 0.5 ميكرولتر | 0.5 ميكرولتر | ريبونوكلياز المياه مجانا | 5 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | 5 ميكرولتر |
الجدول 1: الكواشف حقن ينبغي إعداد جميع خلطات إلى الحجم الكلي على 5 ميكرولتر وتخزينها على الجليد.
- ملء إبر (على الجليد؛ تسمح 10 دقيقة على الأقل للإبر للتعبئة).
- الردم لا يقل عن ثلاثة الإبر من قبل pipetting 0.5 ميكرولتر حل حقن على الطرف العلوي حادة من الإبرة بينما الإبر معلقة عموديا في جرة تخزين الشعرية. كن حذرا أن انخفاض يبقى على رأس ولا بالتنقيط أسفل الجانب وتجنب الفقاعات.
- بعد السائل الأحمر استنزفت معظمها إلى المدببة من الإبرة، إضافة 0.5 ميكرولتر آخر إلى نهاية حادة من الإبرة والسماح لها استنزاف.
3. إعداد حقن تزوير والإبرة ل microinjection
ملاحظة: هذه الخطوات جوعادة ما يتم ذلك بعد تخصيب البيض.
- بدوره على ضوء تضوء للمجهر تشريح ووضع لوحة من الزجاج ~ 13 سم × 13 سم على قاعدة ضوء المجهر مع 15 سم الجص شفرة المنشار على رأس من لوحة زجاج 7. توجيه منشار عمودي على جهاز حقن مع المسافات البادئة التوجه نحو حامل الإبرة.
- تشغيل العرض الجوي وتأكد من تعيين ضغط إلى ~ 200 كيلو باسكال من الجهة المنظمة.
- تشغيل مربع التحكم وضبط الإعدادات. مجموعة الضغط إلى ~ 150-175 كيلو باسكال. تعيين مدة حقن 180 مللي ثانية.
- قم بفك حامل إبرة، اضافة الى وجود إبرة شغل في حامل حتى يمكن أن يرى مقاومة المطاط حامل، وتشديد حتى إصبع ضيق.
- ضبط زاوية الإبرة إلى ما يقرب من 45 درجة.
- استخدام عناصر التحكم micromanipulator لضبط الإبرة بحيث يتركز نهاية في مجال الرؤية. التكبير إلى ~ 40X التكبير والتركيز على رأس الإبرة، والتي لا ينبغي أن لمسالزجاج أدناه.
- كسر بلطف رأس الإبرة عن طريق الامساك بها مع ملقط ساعات. من الناحية المثالية، لا كسر عموديا، وإنما في ~ 60 درجة زاوية. كسر بالقرب من الحافة (لا يزيد عن 2-3 الاعراض الملقط بعيدا عن النهاية، الشكل 2).
الشكل 2. دون انقطاع وكسر microinjection الإبر، وإبرة العليا هي دون انقطاع، وقد تم كسر رأس الإبرة أسفل مع ملقط (السهم). تمتلئ الإبر مع محلول يحتوي على 0.05٪ الفينول الأحمر. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- اضغط على دواسة حقن القدم عدة مرات لاختبار ما إذا كانت إبرة مكسورة. بعد بضع الصنابير، يجب قطرات حمراء صغيرة تبدأ في الخروج من رانه في نهاية. إن لم يكن، في محاولة كسر إبرة أعلى قليلا.
- إذا كانت الإبرة لديها فقاعة الهواء، وزيادة حدة الضغط الظهر والضغط على دواسة عدة مرات بسرعة للعمل فقاعة خارج.
- ضبط الضغط الخلفي:
- استخدام ماصة نقل القابل للتصرف لوضع بضع قطرات من الماء أبو شوكة سمك شائك على لوحة زجاجية.
- خفض بلطف الإبرة في المياه.
- زيادة الضغط الخلفي حتى يخرج تيار خافت من السائل الوردي من الإبرة (تشير إلى ضغط إيجابي).
ملاحظة: إذا لم يكن هناك ضغط الخلفي بما فيه الكفاية، فإن إبرة تضع السيتوبلازم عن طريق العمل الشعري. إذا كان هناك الكثير من الضغط الخلفي، قد يكون حجم الحقن عن غير قصد كبير جدا. - سحب الإبرة إلى أقصى حد ممكن بحيث لن يكون معطوبا أثناء إعداد الأجنة (أنظر أدناه).
- بدلا من ذلك، ضبط الضغط الخلفي لإعداد الضغط العالي بحيث تيار قوي مستمر من السائل يخرج من إبرة ثالدجاجة هي غارقة في الماء. ثم، والضغط على دواسة القدم لحقن يصبح غير ضروري. ومع ذلك، يجب إجراء الحقن بسرعة لتجنب الإفراط في الحقن.
ملاحظة: لا تحاول هذه التقنية عندما تعلم أولا لحقن.
4. حقن مكروي
- حوالي 25 دقيقة بعد الإخصاب، واستخدام اثنين من نصائح 10 ميكرولتر الماصة لإزالة 5-10 الأجنة من مخلب ونقل إلى لوحة زجاج.
- لا تزال تستخدم نصائح الماصة، بلطف فصل الأجنة في حزوز الفردية للشفرة المنشار. توخي الحذر على عدم ثقب الأجنة.
- باستخدام الماصة نقل مع نهاية قطعت حتى الأجنة أبو شوكة سيكون مناسبا في الداخل، إضافة الماء أبو شوكة سمك شائك يكفي لتغطية الأجنة، وترك الماء لمدة 3-5 ثانية، ثم إزالة المياه الزائدة مع الماصة، وترك كمية صغيرة من الطلاء المياه كل جنين.
ملاحظة: الكثير من المياه سوف يتسبب في chorions لتتصلب وكسر الإبرة، ولكن كمية صغيرة من الماء ضروري لرفع الفصلاوريون بعيدا عن الخلية وصفار البيض (الشكل 3A - B). - بدءا من أبعد الجنين بعيدا، مرر لوحة من الزجاج وتكبير بحيث يملأ الجنين أول ما يقرب من 25٪ من مجال الرؤية.
- خفض الإبرة في مجال الرؤية، ثم استخدم 10 ميكرولتر طرف الماصة لتدوير بلطف الجنين لتحديد قسيم أرومي، وهو محبب والأصفر قليلا عثرة أثار السيتوبلازم على الجزء العلوي من صفار البيض (الشكل 3B)، ثم تناوب بحيث وقسيم أرومي مباشرة عمودي على نهاية الإبرة (مع الحفاظ على الجنين في المسافة البادئة شفرة المنشار، الشكل 3C).
ملاحظة: قد نقل قطرات صفار كما هو تناوب الجنين، لذلك لا استخدامها كإطار مرجعي لموقع قسيم أرومي. - خفض الإبرة في السيتوبلازم ولكن لا تدفع حتى صفار الأساسي. الضغط ببطء وبشكل متساو عند اختراق المشيمه لتجنب كسر إبرة. إذا كانالانحناءات إبرة بشدة، تتراجع وحاول مرة أخرى في موقع مختلف قليلا.
- خفض دواسة القدم 3-4 مرات لحقن بحيث بلعة حمراء مع حواف منتشر قليلا تملأ حول ~ 1/8 قطر السيتوبلازم (انظر الشكل 3D).
- تجنب الحصول على البلعة حمراء مع حواف حادة التي لا تبدأ لنزع فتيل، مما يدل على حقن في صفار البيض تحت السيتوبلازم (الشكل 3E).
- إذا بقعة ردي اللون الأحمر مشرق ينتشر بسرعة، وادخال الإبرة مزيد من ثقب قسيم أرومي.
- إذا تحولت البلعة حقن الصفراء على الفور، وتناوب على الجنين لضمان وقد استهدفت قسيم أرومي وحقن مرة أخرى (الشكل 3F).
الرقم 3. مظهر من الأجنة أبو شوكة سمك شائك قبل وبعد الحقن. وينتمي جميع الأجنة من عشرالبريد منظور غمط من خلال المجهر (باستثناء C "و G). (A) قبل إضافة الماء والأجنة المخصبة لها مظهر موحد مع قطرات النفط العائمة بالقرب من أعلى صفار البيض. (ب) بعد إضافة الماء، وتتضخم المشيمه، وكشف عن قسيم أرومي أن يبرز من صفار البيض ويكون مرئيا في الملف الشخصي. (ج) تناوب الجنين بحيث تدخل الإبرة عموديا على المشيمه وقسيم أرومي. (C ') عرض جانبي من إبرة الذي ثقب المشيماء مع طرف في السيتوبلازم. (D) حقن في نتائج السيتوبلازم في بقعة حمراء مع حواف منتشر أن تتلاشى مع مرور الوقت. (E) حقن في صفار البيض الكامنة وراء النتائج السيتوبلازم في بقعة حمراء مع حواف محددة. (F) حقن في صفار البيض مقابل النتائج السيتوبلازم في تحول لون الناجم عن درجة الحموضة من الأحمر إلى الأصفر. (G) الجانبيعرض النتائج الحقن، مع الصبغي X على مواقع حقن شبه مثالية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- استخدم عناصر التحكم micromanipulator لسحب الإبرة، وذلك باستخدام 10 ميكرولتر طرف الماصة إلى الاستمرار على الجنين إذا كان تتمسك الإبرة.
- بعد التراجع الإبرة، وحرك لوحة من الزجاج لمحاذاة الجنين القادم مع الإبرة.
- بعد حقن جميع الأجنة، استخدم نقل الماصة لإضافة الماء إلى الأجنة، ثم جمعها في ماصة نقل ومكان في 150 طبق بيتري ملم من الماء كامل أبو شوكة سمك شائك.
- تجف من على لوحة من الزجاج مع منشفة ورقية لتجنب تراكم الكثير من المياه.
- توزيع الأجنة الطازجة على المنشار وكرر الخطوات 4.4 خلال 4.10.
- إبقاء ~ 10٪ من الأجنة والضوابط uninjected لضمان أن الأجنة uninjected تتطور بشكل طبيعي وتستخدم عناصر التحكم من النوع البري لرانه المقايسات الجزيئية هو موضح أدناه.
5. العناية حقن المشاركة
- احتضان الأجنة في أطباق بتري في 18 درجة مئوية بعد الحقن حتى الفقس 10. وبعد الفقس، يرقات الخلفية في الأحواض المائية كما هو موضح 10.
- صب بلطف قبالة المياه أبو شوكة سمك شائك يوم واحد بعد الحقن واستبدالها بالماء أبو شوكة سمك شائك جديد. استبدال الماء أبو شوكة سمك شائك جديدة على الأقل مرة كل يومين بعد ذلك.
- تحقق من وجود أجنة ميتة أو مشوهة يوميا. إزالة هذه الأجنة لمنع تسوس من تلوث المياه.
6. تحليل نتائج حقن
- للحقن من الصحفيين الفلورسنت، ومراقبة الأجنة يوميا في غرفة مظلمة باستخدام المجهر الفلورسنت تشريح مع GFP أو مرشح طلب تقديم العروض (اعتمادا على التحوير الفلورسنت). أنماط التشريحية قياسية في التعبير الجيني مع الصور الرقمية و / أو أوصاف مكتوبة وتبويبها من عدد من الأسماك مع اكسبريس مختلفةالمجالات سيون (الأرقام 4 و 5).
ملاحظة: أبو شوكة لها autofluorescent، الخلايا النجمية الصباغ أن تكون مرئية تحت المرشحات GFP ابتداء من الساعة 4 أيام بعد الإخصاب (DPF).- لتوليد خطوط مستقرة، حفظ الأجنة مع مضان كشفها والنمو إلى مرحلة البلوغ كما هو موضح 10.
- حقن تهجين الأسماك البالغة إلى البرية من نوع السمك باستخدام المختبر في إجراء الإخصاب هو موضح في القسم 2.2 وذرية الشاشة لمضان كما هو موضح في الخطوة 6.1 للبحث عن ذرية الفلورسنت، مشيرا إلى انتقال التحوير ناجحة.
- لتصور مضان في اليرقات، السباحة الحرة، إضافة 500 ميكرولتر 0.8٪ تريكين إلى طبق بيتري 150 ملم لتخدير الأسماك والانتظار حتى توقف الأسماك تتحرك في الصورة. شطف فورا عدة مرات بالماء أبو شوكة سمك شائك جديد التالية الملاحظة والتصوير.
- اختياريا، للحفاظ على مضان لمزيد من التصوير، والموت ببطء اليرقات في0.025٪ (250 ملغم / لتر) تريكين مخزنة مع 0.1٪ بيكربونات الصوديوم وإصلاح لمدة 4 ساعة في بارافورمالدهيد 4٪ في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية. تخزين في برنامج تلفزيوني 1X لمدة تصل إلى أسبوعين.
ملاحظة: خلفية الزيادات لصناعة السيارات في مضان مع مرور الوقت.
- التشخيص PCR / انماط الهضم لالطفرة التعريفي مع CRISPRs أو TALENs - أفضل أجريت في 2 يوما بعد الإخصاب.
- استخدام الماصة نقلها إلى مكان 10 الأجنة المحقونة (2 DPF، لا يزال في chorions) في 10 بئرا أول بئر 12 أنبوب الشريط PCR. وضع الأسماك السيطرة uninjected في الآبار الماضيين.
- إزالة المياه الزائدة أبو شوكة سمك شائك.
- إضافة 50 ميكرولتر العازلة تحلل (10 ملم تريس الرقم الهيدروجيني 8.3، 50 ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl 2، 0.3٪ توين-20، و 0.3٪ NP-40) إلى كل بئر.
- مكان قبعات على أنابيب واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في thermocycler.
ملاحظة: إن صفار يتحول الأبيض والمطاطي بعد خطوة الغليان. - إزالة الأغطية واستخدام شركة كلي مختلفةعلى طرف الماصة 1000 ميكرولتر للنقع الجنين في كل أنبوب.
ملاحظة: سوف الحطام الأبيض جمع في الجزء السفلي من الأنبوب. - إضافة 2.5 ميكرولتر من 10 ملغ / مل بروتين كاف على كل جانب.
- استبدال الأغطية واحتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لهضم البروتين، تليها 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لوقف نشاط بروتين ك مخزن في -20 درجة مئوية لتجنب نمو العفن.
- أداء PCR باستخدام البلمرة عالية الدقة باتباع تعليمات الشركة الصانعة. استخدام المحللة الجنين كقالب الحمض النووي.
ملاحظة: كن حذرا لإزالة السائل من أعلى أنبوب لقالب الحمض النووي، وتجنب أي المشيمه مرئية أو الحطام الصفار في الجزء السفلي من الأنبوب. - مزيج المنتج PCR في المساواة مع حجم مزيج الرئيسي انزيم التقييد التي تحتوي على 1X العازلة انزيم معين و0.25 انزيم ميكرولتر لكل عينة. دائما حفظ نصف الناتج PCR تقطيعه لفحص على هلام لتأكيد المنتجات PCR هي حجم المتوقعة. احتضان PCR مختلطة مع الانزيم في الظروف الملائمة لانزيم قيود.
ملاحظة: بعض الإنزيمات قد تتطلب نسب أخرى من العازلة انزيم لمنتج PCR. ضبط تركيز عازلة إذا الضوابط uninjected لا تظهر الهضم الكامل. - بعد الهضم، ومنتجات تعمل على هلام الاغاروز 1٪ بجانب سلم حجم الحمض النووي لتأكيد أحجام المنتج المتوقعة.
ملاحظة: عصابات طبيعي في حقن الأجنة تشير إلى وجود آفات الجزيئية (الشكل 6) والضوابط uninjected يجب هضمها تماما لتفسير النتائج. - لتأكيد الآفات، وقطع العصابات غير المصقول من المواد الهلامية الاغاروز وتنقية الحمض النووي مع مجموعة استخراج الهلام. استخدام سانجر تسلسل، من الناحية المثالية باستخدام التمهيدي التسلسل الداخلي للالاشعال PCR، لتأكيد الآفات. في F 0 حقن الأجنة، ومزيج من الآفات المحتمل أن تكون موجودة، مما تسبب في نوعية سانجر قراءة للحط بالقرب من الموقع المستهدف.
- لإنتاج خط ثابت، وتوفير جميع الأجنة المحقونة من براثن أن فحص إيجابية للآفات الجزيئية. Gصف ما يصل الأسماك، تهجين وثم فحص مجموعة فرعية من F 1 الأجنة للآفات الجزيئية كما هو موضح في الخطوات 6.2.1 من خلال 6.2.11. إذا تم تحديد ناقلات متخالف، تنمو F المتبقية 1 الأجنة إلى مرحلة البلوغ وتحديد الأفراد متخالف باستخدام الحمض النووي المستخرج من مقطع الزعنفة الذيلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لالجينات المحورة الجين المراسل أن يكون النشاط محسن، ونجاح الحقن يؤدي إلى معين، والتعبير الخلوية من التحوير (الشكل 4A، 4C). ويمكن بعد ذلك outcrossed الأسماك حقن لإنتاج خطوط ثابتة (على سبيل المثال من BAC خط ثابت هو مبين في الشكل 4B). حقن الحمض النووي في الأجنة أبو شوكة سمك شائك يؤدي عادة في الفتك أعلى بكثير من RNA وحدها. ومن المعتاد أن نرى ما يصل الى 50٪ (وأحيانا أكثر من ذلك) الفتك أو تشوه (انظر الشكل 4D - F، 4I) بعد حقن مراسل Tol2 يبني (على غرار طريقة meganuclease الموصوفة سابقا 21). ومع ذلك، فإن النتائج تختلف بناء على نطاق واسع في بناء معين، مورفولوجيا الجنين، ومستوى المهارة. لمحسن النشط، 40-50٪ من الأجنة عموما سوف تظهر التعبير التحوير الأنسجة محددة، على سبيل المثال في المتوسط وصدري زعانف (Figure 5). درجة الخلفية ومضان غير محددة (الشكل 4G - I) يختلف استنادا على نطاق واسع على المروج المستخدمة؛ وhsp70l المروج الزرد يميل إلى أن يكون راشح، وخاصة في العضلات والأنسجة العصبية، والبكالوريا تميل إلى أن تكون تعبيرا خلفية عالية في صفار البيض (على غرار الشكل 4G). الكارب بيتا الأكتين 41 المروج أقل المتسرب ولكن أيضا يدفع التعبير GFP خفوتا بكثير. انتقال الجينات المحورة البلازميد Tol2 يمكن أن تكون عالية، مع ما يصل الى 100٪ من GFP + F 0 إنتاج الأسماك ذرية المعدلة وراثيا (الجدول 2). ومع ذلك، فإن في المئة من ذرية تحمل التحوير تختلف على نطاق واسع، من <1٪ إلى 72٪ (الجدول 2). إنقاذ GFP الوحيد + حقن الأجنة بشكل عام تزيد كفاءة الإرسال. تميل البكالوريا أن يكون أقل بكثير معدلات transgenesis، مع فقط ما يصل الى 10٪ من F 0 الأجنة أبو شوكة سمك شائك حقن تظهر مضان في الأنسجة المتوقع. وعبرمعدل مهمة البكالوريا هو أقل من يبني البلازميد، مع فقط ما يصل الى 14٪ من أبو شوكة سمك شائك فحص تحيل BAC (الجدول 2)، والذي يشبه إلى معدل نقل المبلغ عنها 15٪ في الزرد 32.
وعلى النقيض من كفاءة منخفضة نسبيا من BAC transgenesis، وعادة 70-100٪ من الأسماك فحص حقنوا TALENs ديهم آفات الفسيفساء (في ن = 10 حقن براثن التي تم فرزهم عن الآفات). يمكن أن يكون هذا العدد أقل مع زوج TALEN أقل كفاءة، ويمكن أن تختلف مع نوعية الحقن. يبين الشكل 6 الهضم PCR / تقييد لمدة 10 الأجنة من مخلب واحد حقن TALENs استهداف موقع قطع PvuII داخل Tfap2a. وamplicon تقطيعه في كل من الأجنة المحقونة (الممرات 1-10) يشير إلى أن جزء من الخلايا في كل جنين تحمل الآفات في مكان الهدف، على الرغم من كل جنين هو فسيفساء للغاية مع من النوع البري قطع فرقة كبيرة. عشريتم هضمها ه amplicon من الأجنة uninjected في الممرات 11-12 تماما مع PvuII. تنتقل الطفرات المستحثة TALEN-بسهولة إلى الجيل التالي. مع مجموعتين مختلفة TALEN، والآفات أحالت 50٪ و 90٪ من فحص F 0 الصورة إلى الأبناء، مع 20-90٪ من ذرية تحمل الآفات في براثن إيجابية (الجدول 3). في حين لم يتم الأمثل كريسبر الكفاءة / Cas9 في أبو شوكة سمك شائك، مع واحد دليل كريسبر تستهدف Pitx2، واحد من أصل ثلاثة أجنة يحقن قد الآفات على أساس سانجر تسلسل منتج PCR الهدف كريسبر (كان التسلسل الفرقة تقطيعه التالية تقييد الهضم، والشكل 7). فقدان جودة تسلسل في موقع قطع توقع يشير إلى وجود مزيج من الآفات الجزيئية موجودة. الزعانف لقطة الكبار F 0 الأسماك والكشف عن الآفات باستخدام PCR والهضم تقييد الفحص وجدت 10/22 السمك مع الآفات الجسدية في فنلندا. وأظهرت مجموعة فرعية تمثيلية من هذه الحيوانات في الشكل 8 </ قوي>. الفردي # 3 يحتوي على نسبة عالية من الحمض النووي مع الآفات، في حين الفردي # 2 يحتوي على نسبة منخفضة من الحمض النووي مع الآفات.
الشكل 4. أمثلة من الأجنة المحقونة. (A) فسيفساء الجنين حقنوا محسن الذي يدفع التعبير GFP في صدري (النجمة) وزعانف المتوسطة (رأس السهم) في 5 أيام بعد الإخصاب (DPF). شريط مقياس = 500 ميكرون. (ب) خط مستقر لBAC المراسل أن يدفع التعبير GFP في قلب الجنينية في 4 DPF. (C) فسيفساء الجنين حقنوا محسن Col2a1a الذي يدفع التعبير mCherry في الحبل الظهري في 4 DPF. تم استنساخ A1A محسن Col2 من الحمض النووي أبو شوكة سمك شائك مع الاشعال 5'-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 "و 5'-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3" الذي تضخيم محسن orthologous محفوظ ورد في دايل وTopczewski2011 45 (D) مثال على الجنين عادة النامية حقن. (E - F) أمثلة على الأجنة المشوهة مع الصدمة حقن. E ينقصنا العين اليسرى وF ديه الأنسجة الميتة على طول الجانب الأيمن (السهام). (G) مثال التعبير GFP منتشر في صفار البيض، على الأرجح نتيجة حقن في صفار البيض بدلا من قسيم أرومي. (H) مثال التعبير GFP غير محددة في البشرة (رأس السهم). (I) برايت، غير محددة، والتعبير GFP الحبيبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم حقن الشكل 5. كفاءة حقن مراسل بناء. عشرة براثن مع 190 شركة بريتيش بتروليوم أبو شوكة سمك شائك Bmp6 محسن للإنشاءUCT الذي يدفع الزعانف الصدرية والتعبير زعنفة متوسط في 5 DPF 20. من كل قابض، وسجل لا يقل عن 20 الأجنة عن وجود أنسجة محددة (الصدرية و / أو متوسط زعنفة) و / أو انوعي (جميع الأنسجة الأخرى) التعبير GFP. يتم عرض النسبة المئوية لجميع الأجنة على قيد الحياة حقن وجود تعبير غير محدد والأنسجة محددة باعتبارها boxplot. الخطوط الأفقية تشير إلى الربع الأول والوسيط والربع الثالث. شعيرات تمتد إلى مسند خلال 1.5 الربعية (مجموعة الشرائح الربعية) من الربع الأول والثالث. يتم تكييفها البيانات من إريكسون وآخرون عام 2015. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. PCR والهضم تقييد للكشف عن الآفات التي يسببها TALEN. وTALEN الزوج يستهدف Tfap2a > تم إنشاؤها وحقن حد وصفه. وقد أعد DNA كما هو موضح أعلاه من 2 DPF حقن الأجنة وكان جزء 297 نقطة أساس المحيطة تسلسل TALEN الهدف PCR تضخيمها من قبل عالية الدقة البلمرة DNA باستخدام بادئات 5'-GGGTCGTTGACGTGCGAGTAA-3 "و 5'-AGCGGGACAACGTCATCACTTA-3". يتم حقن الممرات 1-10، 11-12 الممرات هي uninjected، هضمها والضوابط، والممرات 13-14 هي uninjected، وضوابط عسر الهضم. PvuII يقطع تسلسل من النوع البري في شريطين متساوية الحجم تقريبا. وتشير العصابات طبيعي جود الآفات الجزيئية في تسلسل الهدف. جميع الأجنة المحقونة في الممرات 1-10 علامات تظهر الآفات الجزيئية (العصابات عسر الهضم)، ولكن كل من الأجنة يكون إما الطفرات monoallelic و / أو هي فسيفساء لأنها أيضا قد قطع (من النوع البري) العصابات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ه = "1"> 
الرقم 7. سانجر تسلسل من الفسيفساء F 0 كريسبر / Cas9 حقن الجنين. وكان الجيش الملكي النيبالي دليل كريسبر (5'-GTGGACCAACCTCACGG-3 ') ضد Pitx2 (كما هو موضح في الأعلى) شارك في حقن Cas9 مرنا (منقولا من pCS2-nCas9n البلازميد كما هو موضح 38) والأجنة تم فحص للآفات باستخدام فحص انزيم التقييد. وكانت الفرقة غير المصقول جل استخراج والتسلسل من قبل سانجر التسلسل. جودة تسلسل يحط في موقع انشقاق توقع (السهم أدناه) نتيجة لمزيج من الفسيفساء من الآفات الموجودة في الجنين حقن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. تحليل CRISPR F 0 مقاطع الزعنفة الذيلية. وقد تم إعداد الحمض النووي من مقاطع زعنفة من F 0 الأحداث التي تجمع من الأجنة المحقونة مع CRISPRs ضد Pitx2. تم تضخيم / Cas9 الهدف كريسبر مع الاشعال 5'-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 "و 5'-GGCCCAAATTACCCACATTT-3"، وهضم المنتج مع EcoRI. وتظهر أربعة أشخاص. منتج PCR تقطيعه على اليسار وهضم المنتج PCR هو على حق كل فرد مرقمة. المنتج حجم الفرقة تقطيعه (~ 230 شركة بريتيش بتروليوم) في حارة هضمها يشير إلى وجود الآفة. وأشار الأفراد 2 و 3 و 4 فقط تظهر علامات آفة الجزيئية، مع النجمة، مع اختلاف الاصباغ بين الأفراد. يشار إلى أحجام سلم ذات الصلة على اليسار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| بناء | GFP ذرية / مجموع F0 فحص الأسماك (٪) | ٪ ذرية F1 إيجابي | ملاحظة |
| BAC A | 6/46 (13٪) | 4-19٪ | |
| BAC B | 1/41 (2٪) | 4٪ | |
| BAC C | 5/42 (12٪) | 3-40٪ | |
| BAC D | 3/22 (14٪) | 5-15٪ | |
| البلازميد و | 2/38 (5٪) | 2-5٪ | جميع الأجنة F0 فرزهم، وليس فقط GFP + |
| البلازميد ب | 3/16 (19٪) | <1-8٪ | جميع الأجنة F0 فرزهم، وليس فقط GFP + |
| البلازميد C | 1/11 (9٪) | 10٪ | |
| البلازميد D | 2/11 (18٪) | 1-45٪ | حقن البلازميد D في2 خلفيات وراثية |
| البلازميد D | 05/05 (100٪) | 16-72٪ | |
| البلازميد E | 2/3 (67٪) | 2-22٪ | |
| البلازميد F | 2/6 (33٪) | <1-65٪ | |
| البلازميد G | 3/8 (38٪) | 2-56٪ | |
| البلازميد H | 3/18 (17٪) | لم يسجل | |
| البلازميد أنا | 5/24 (21٪) | لم يسجل |
وأثيرت كفاءة انتقال التحوير للالبكالوريا ويبني محسن F 0 حقن الأجنة إلى مرحلة البلوغ ثم outcrossed إلى البرية من نوع السمك وذرية F 1 سجل لمضان GFP: الجدول 2. عدد F 0 الأفراد التي تنتقل عن طريق التحوير هو EXPRإسيد كنسبة مئوية من كل فحص F 0 الأسماك. يتم عرض مجموعة من نسب F 1 ذرية تحمل التحوير أيضا لأولئك براثن التي كان GFP الأسماك إيجابية.
| TALEN | ٪ F0 نقل الآفات | ٪ ذرية F1 إيجابي |
| ا | 9/10 (90٪) | 20-90٪ |
| ب | 4/8 (50٪) | 20-72٪ |
الجدول 3: كفاءة نقل عن اثنين من أزواج TALEN F 0 حقن أثيرت الأجنة إلى مرحلة البلوغ ثم outcrossed إلى البرية من نوع السمك وذرية F 1 فرزهم للآفات TALEN. وأظهرت نسبة الأفراد حقن نقل الآفات، فضلا عن مجموعة من نسب ذرية المصابين بآفات في تلك براثنأن الآفات التي تنتقل عن طريق. TALEN واستهدف محسن Bmp6 20، TALEN B المستهدفة Tfap2a (غير منشورة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حقن الأجنة أبو شوكة سمك شائك-خلية واحدة لtransgenesis أو تحرير الجينوم تقدم ثلاثة تحديات رئيسية. أولا، بالنسبة للأجنة الزرد، والمشيمه أبو شوكة سمك شائك الجنينية صعبة، وكثيرا ما كسر الإبر. ويمكن التغلب على هذه المشكلة جزئيا باستخدام بال micropipettes سمكا وأقوى الزجاج وحقن عمودي على المشيمه (انظر البروتوكول، الشكل 2). التأكد من أن المياه أقل قدر ممكن يضاف إلى الأجنة (ما يكفي للتسبب في المشيمه لتنتفخ ورفع بعيدا عن الخلية) يساعد على تقليل صلابة المشيمه. المشيماء يصلب مع مرور الوقت، لذلك يعمل بسرعة بعد تبليل الأجنة هو المهم. الحفاظ على الأجنة في غرفة الرطوبة قبل الحقن بحيث لا تجف أمر بالغ الأهمية أيضا. بعض براثن والأجنة حتى الفردية لها chorions أكثر سماكة وأكثر صرامة ببساطة. تتحرك في بعض الأحيان إلى الجنين المقبل أو تحاول مع مخلب الجديد هو الحل الأسهل. انه من الاسهل بكثير لتخطي د واحد جنين ifficult من ليحل محل إبرة التالفة. وجود الإبر احتياطية جاهزة تسمح الحقن على الاستمرار في حالة الكسر إبرة. عند حقن البكالوريا، فإنه من الشائع للإبرة لتسد. إبرة يمكن unclogged عن طريق كشط بلطف أو إعادة كسر-غيض مع ملقط، أو باستخدام مفتاح ضغط الهواء المستمر لتطهير تسد.
ثانيا، تحديد الخلية الأولى في الجنين هو التحدي. في كثير من الأحيان هو بالارض تماما وصعبة للمبتدئين لنرى، وغير مرئية خاصة عند النظر إليه مباشرة. في كثير من الأحيان يمكن أن ينظر إلى قسيم أرومي فقط كما عثرة مرتفعة قليلا في الملف الشخصي. ولذلك، فمن الأفضل لتحديد الخلية في الملف (الشكل 3B)، ثم تناوب بلطف الجنين إلى الأمام وإلى الجانب وبالتالي فإن الخلايا مواجهة نهاية الإبرة الزاوية (على الرغم من خلية وغالبا ما تكون غير مرئية من هذه الزاوية، و مبالغ فيه لون أغمق من قسيم أرومي في الشكل (3) من أجل الوضوح).
e_content "> ثالثا، تستهدف السيتوبلازم من الصعب أيضا، خصوصا إذا كانت الخلية الأولى هي مسطحة خاصة. تهدف للجزء بدانة من قسيم أرومي (عادة المركز) يحسن من فرصة عن طريق الحقن في السيتوبلازم. بينما حقن في صفار البيض بالقرب من السيتوبلازم يمكن أن تنتج بنجاح الأسماك المعدلة وراثيا، ويبدو أن الكفاءة إلى زيادة وانخفض الفتك عندما يتم استهداف السيتوبلازم مع ثقب إبرة واحدة. في بعض الأحيان، وبراثن الفردية يكون عن Blastomeres رقيقة بشكل خاص، بحيث تجنب صفار يكاد يكون من المستحيل. الانتظار أطول من 25 دقيقة لبدء الحقن قد يساعد (بعض براثن لا تشكل قسيم أرومي بالحجم الكامل حتى ~ 45 دقيقة بعد الإخصاب)، ولكن إذا كان عن Blastomeres أبدا زيادة في الحجم، وغالبا ما يكون من الأسهل للحصول على القابض جديد من البيض من محاولة لحقن خلايا بالارض .قد تحدث المفرطة الفتك بعد الحقن لعدة أسباب. الإبر كليلة و / أو كبيرة جدا قد يسبب حجم إبرة تحمل رOO الكثير من الضرر إلى الخلية و / أو سبب السيتوبلازم إلى يتسرب. ويبدو أن بعض بنيات الحمض النووي لتكون قاتلة خصوصا. خفض تركيز الحمض النووي قد يحسن البقاء على قيد الحياة ولكن انخفاض أسعار transgenesis. تنظيف البلازميدات لأول مرة مع مجموعة midiprep التي تحتوي على شطف الذيفان الداخلي تليها مجموعة الثانية تنظيف PCR يقلل بناء سمية. وأخيرا، والتحرير الجينوم قد ينتج فقدان طفرة ظيفة التي هي قاتلة لتطوير الأجنة. يمكن الحد من تركيز كريسبر أو TALEN من mRNAs زيادة الاصباغ الجنين لمنع الفتك، ولكن قد يقلل متحولة كفاءة الانتعاش أليل.
وأفاد بروتوكول نشرت سابقا لتوليد أبو شوكة المعدلة وراثيا باستخدام طريقة meganuclease 21 على 4-7٪ التحوير سلالة الجرثومية معدل انتقال من F 0 الأسماك مؤسس. نتج عن طريقة Tol2 ذكرت هنا في ما يصل إلى معدل نقل التحوير سلالة الجرثومية 72٪ من F 0 الأسماك مؤسس (تشير متعددة integrat الجينيأيونات). وذكرت الدراسة السابقة باستخدام طريقة meganuclease 40٪ من الأجنة المحقونة تظهر التعبير GFP معين، مماثلة لتلك التي ذكرت هنا. وهكذا في حين لوحظ معدلات مماثلة من المعدلة وراثيا F 0 المؤسسين للأسماك المعدلة وراثيا التي تولدها كل من meganuclease وطرق Tol2، يظهر معدل انتقال سلالة الجرثومية أعلى من ذلك بكثير لنقل الجينات Tol2 بوساطة.
كما تستمر تكنولوجيا التحرير الجينوم للمضي قدما، والتلاعب الجيني حتى أكثر تحديدا يصبح من الممكن في أبو شوكة سمك شائك وغيرها من أنواع الأسماك. على سبيل المثال، سوف توجه إصلاح 46 وإعادة التركيب مثلي تسمح مقايضة أليل بين CRISPRs تعديل الجينوم أبو شوكة سمك شائك البحار والمياه العذبة، ويمكن استخدامها لتفعيل تحديدا أو تمنع التعبير الجيني 47. وهذه التقنيات المثيرة للتحرير الجينوم وتحليل تؤدي إلى رؤى جديدة حول الأساس الجيني للعديد من اهتمام المورفولوجية والفسيولوجية، والظواهر السلوكية في STICklebacks وغيرها من أنواع الأسماك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة R01 # DE021475 (CTM)، والمعاهد الوطنية للصحة دكتوراه مسبقا التدريب غرانت 5T32GM007127 (PAE)، وجبهة الخلاص الوطني العليا زمالة أبحاث (دار الوثائق القومية). نشكر كيفن Schwalbach لأداء recombineering BAC والحقن، نيك دوندي لتوليد تسلسل البيانات كريسبر سانجر، وكاثرين ليباري لتغذية راجعة مفيدة على بروتوكول الحقن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | - | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm Petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 mm x 10 mm Petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50x Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10 Kb RNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10x PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1 kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
References
- Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
- Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
- Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
- Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
- Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
- Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
- McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
- Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
- Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
- Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
- Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
- Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
- Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
