Summary
トランスジェニック操作およびゲノムの編集は、機能的遺伝子とシス -regulatory要素の役割をテストするために重要です。ここでは、ゲノム（Tol2の媒介蛍光レポーター導入遺伝子構築物を含む、TALENs、およびCRISPRs）の変更を生成するための詳細なマイクロインジェクションプロトコルが緊急モデルの魚のために提示され、イトヨ。
Abstract
イトヨの魚は、形態的、生理的、および行動の表現型の多様な遺伝的基礎を研究するための強力なシステムとして登場しました。海洋集団は、海洋と淡水のフォームを横断遺伝学は進化の特性を制御するゲノム領域をマッピングするために使用することができる希少な脊椎動物のシステムを提供する能力と組み合わせて無数の淡水環境に適応するように進化してき著しく多様な表現型。優秀なゲノムリソースが進化し変化の分子遺伝学的解剖を容易に利用できるようになりました。マッピング実験は興味深い候補遺伝子のリストを生成しながら、機能的な遺伝子操作は、これらの遺伝子の役割を試験するために必要とされます。遺伝子調節はTol2のトランスポザーゼシステムを用いて、ゲノムに組み込まれたトランスジェニックレポータープラスミドおよびBACを用いて研究することができます。特定の候補遺伝子およびシス -regulatory要素の機能は、標的誘導することによって評価することができますTALENおよびCRISPR / Cas9ゲノム編集試薬と突然変異。すべての方法は、受精1細胞トゲウオ胚に核酸を導入する必要が、タスクはトゲウオ胚と比較的小さく、薄い割球の厚い絨毛膜によって挑戦しました。ここでは、トゲウオ胚への核酸のマイクロインジェクションのための詳細なプロトコルは、トランスジェニックゲノム編集の遺伝子発現と機能を研究するためのアプリケーション、ならびに形質転換の成功を評価し、安定した株を回収する技術について記載されています。
Introduction
生物多様性が生じたどのように理解する1つの基本的な構成要素は、自然の中で進化した表現型変化の遺伝と発達拠点を決定することです。イトヨの魚、Gasterosteusアクレータスは 、進化の遺伝的基礎を研究するための優れたモデルとして登場しました。トゲウオは、海水魚は北半球の周りに無数の淡水環境を植民地化してきたように劇的な形態的、生理的で、その結果、多くの適応進化的変化を遂げ、としている行動の変化1。 20個の-1つのトゲウオ集団からの個人のゲノムを配列決定し、組み立て、及び高密度連鎖地図は、さらに、アセンブリ2,3を改善するために生成されているされています。遺伝的マッピング実験は、進化した表現型を4基礎となるゲノム領域を同定した- 6を 、そしていくつかのケースでは、特定の候補遺伝子の機能的役割は、7,8をテストされています。形態学的変化の根底にあるゲノム領域の数は、有望な候補遺伝子と同定されているが、これらの候補者はまだ機能的に9試験されていない- 12。また、トゲウオは集団遺伝学/ゲノミクス13,14、分化15、動作1、内分泌学16、生態毒性17、免疫学18および寄生虫19の研究のための一般的なモデルです。これらの各フィールドにおける今後の研究では、トゲウオで機能的な遺伝子操作を実行する能力の恩恵を受ける。そのコード配列を操作することに加えて、候補遺伝子の役割は、それらのシス -regulatory配列を研究することによって、および機能的に、増加減少、または候補遺伝子の発現を排除することによって評価することができます。トゲウオにおけるマイクロインジェクションおよび遺伝子導入方法がよく7,8,20を確立されており、最初に使用して開発されたメガヌクレアーゼ媒介方法21は、第1メダカ22に記載します。ここで紹介する修正されたマイクロインジェクション法はTol2の媒介遺伝子導入およびTALENsとCRISPRs含む最近開発されたゲノム編集試薬の両方に最適化されています。
シス -regulatory変化が変異23を符号化の負の多面的な結果を回避することができるようにシス -regulatory要素への変更は、形態学的進化に重要であると考えられています。そのため、テストと推定されるシス -regulatory配列を比較することは、進化の研究の増加の中心的な目標となっています。加えて、ほとんどのヒト疾患のバリアントは、調節変異体24,25であり、モデル脊椎動物系が痛ん-regulatory要素の機能及びロジックシス研究するために必要とされます。大量に外部に彼らの胚を受精魚はシス -regulationを研究するための強力な脊椎動物システムを提供しています。 Tol2のトランスポゾンシステム、内forei28 -ゲノムに組み込まれるべきGN DNAはTol2のトランスポザーゼ結合部位とTol2のトランスポザーゼmRNAと同時注入により隣接され、成功した魚のゲノム26にプラスミド構築物を統合するための高効率で動作します。典型的には、潜在的なエンハンサーはTol2の骨格中に（例えば、29 hsp70lなど）基本プロモーターならびにEGFP（強化緑色蛍光タンパク質）またはmCherryを、蛍光レポーター遺伝子の上流にクローニングし、トランスポザーゼmRNAの26に注入されます。蛍光レポーターの、いずれかの注入した胚または安定に組み込まれた導入遺伝子を持つ子孫における発現の観察は、推定されるエンハンサーにより駆動される遺伝子発現の時空間制御に関する情報を提供します。さらなる実験では、検証エンハンサーは、目的の遺伝子の組織特異的過剰発現を駆動するために使用することができます。
より大きなシス -regulatory地域、高品質の大インサートGENOMの分析のために細菌人工染色体（BACの）を使用してICのライブラリは、両方の海洋および淡水トゲウオ30のために構築されてきました。これらのBACは、大規模（150〜200キロバイト）のゲノム領域31の文脈における蛍光レポーター遺伝子と遺伝子を交換するrecombineeredすることができます。 BAC内の調節配列によって決定される蛍光レポーターは、次いで、時空間パターンで発現されます。魚類での研究のために、Tol2の部位は、ゲノム組込み32,33を容易にするためにBACに添加することができます。 in situハイブリダイゼーション技術的に困難である場合トゲウオの骨形成タンパク質6（BMP6）20のために示されているように、開発の後期段階では、BACの蛍光読み出しは、遺伝子発現のパターンを研究するために使用することができます。また、個々の蛍光の発現パターンは、in situハイブリダイゼーションを用いて達成することができない、時間をかけて追跡することができます。 BACがまたadditionaを追加するために使用することができますゲノム領域のL個のコピーは、目的の遺伝子の投与量を増加させます。
遺伝子機能の研究のために、ゲノム編集生物34の多種多様なゲノム配列を標的とする変化を生成するために使用することができる爆発拡張フィールドです。転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）もともと正確な選択のゲノム配列に直接結合し、二本鎖切断35,36を生成するように操作することができる植物病原体から単離されたモジュラー、配列特異的ヌクレアーゼです。クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）/ CASシステムは、もともと細菌で発見され、ガイド37と相補的な標的DNA配列の中断を生成するために、ガイドRNAとCas9タンパク質を使用しました。標的配列の機能を破壊することができ、多くの場合、小さな挿入または欠失を残すTALENsとCRISPRsの両方で作成された二本鎖切断のその後の修理、35-37。トゲウオにおいて、TALENsエンハンサー20を標的とすることによって、遺伝子発現を破壊するために使用されており、TALENsとCRISPRs両方が正常配列（未発表データ）を符号化における変異を作製しています。ゼブラフィッシュにおける使用のためのCRISPRsの生成のための詳細なプロトコールは、トゲウオ38 CRISPRsを開発するためのガイドラインとして使用することができます。
トランスジェニックゲノム編集の実験は、新たに受精した単細胞胚への核酸の導入を必要とします。開発の初期段階における導入遺伝子またはゲノム編集ツールを導入することにより、胚における遺伝子操作された娘細胞の数が最大化されます。注入した胚を視覚的蛍光についてスクリーニングまたは分子ゲノム修飾についてスクリーニングされます。生殖系列に寄与する細胞が正常に標的化される場合、導入遺伝子または変異は、ポスト噴射致死性が高い場合であっても、子孫のサブセットへ渡すことができます。モザイク魚は外部交配することができますかインタークロスとその子孫は、突然変異対立遺伝子または関心の安定に組み込まれた導入遺伝子を回復するためにスクリーニングしました。このプロトコルは、1セルトゲウオ胚に導入遺伝子およびゲノム編集の試薬を導入し、成功したゲノム修飾をモニタリングするための方法を説明します。
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Protocol
すべての魚の作業は、カリフォルニア大学バークレー校の施設内動物管理使用委員会（プロトコル番号R330）によって承認されました。
1.注射用核酸を準備します
- （フィッシャー26から適応）Tol2のプラスミド遺伝子導入。
- 線形化するために37℃で1時間、供給されたバッファに10μgのトランスポザーゼプラスミド（PCS-TP）10 U NotIで39をカットします。
注意：素材移転契約はTol2のプラスミドを得るために必要とすることができます。 - 標準的なプロトコル40に従って酢酸ナトリウムでイソアミルアルコール、エタノール沈殿物：24：フェノールの1：1混合物をクロロホルム25で切断されたプラスミドを抽出します。 50μlのRNaseフリー水で再懸濁プラスミド。
注：フェノール - クロロホルムは、フード内で使用されるべきであり、廃棄物が適切に制度ガイドラインに従って廃棄しなければなりません。 - 製造元の指示に従ってのSP6転写反応を設定します。
- RNA ISOLを使用してくださいエーションキットは、製造元の指示に従って転写反応をクリーンアップします。 50μLRNaseフリー水でRNAを再懸濁します。
- RNAの1μlのアリコートを削除します。 5分間65℃で熱が二次構造は、その後直ちに氷上に冷やし変性します。 -80℃で、残りの転写反応をフリーズします。
- 1レーンにおけるRNAサイズ標準でランニングバッファー0.5X TAE（トリス塩基、酢酸、エチレンジアミン四酢酸）中の1％アガロースゲル上でRNAのアリコートを実行します。予想される生成物は2200 bpです。全RNAの> 5％が大規模な分解を示しているスミアより小さい2200塩基対、（ 図1）に表示されている場合捨てます。
- 260nmで分光光度計を用いてRNAを定量化します。 -80℃（少なくとも2年間のために良い）で350 ngの/ RNaseフリー水と店舗1μlのアリコートでμlに希釈します。
- シスとクローンTol2のレポータープラスミド（例えば、Tol2のキット41からpT2HE 8またはプラスミドを使用して）-興味の調節要素。簡潔には、PCRは、プラスミドに見出される制限部位を含むプライマーを用いて対象のゲノムDNA配列を増幅する酵素（単数または複数）を用いてPCR産物及びベクターを消化し 、ベクターへの挿入をライゲーションし、コンピテントE.に得られたプラスミドを形質転換します大腸菌 40。製造業者のプロトコルに記載のエンドトキシンリンスを含むキットでプラスミドを分離します。
- 製造業者のプロトコルに従って、PCR精製キットでのTol2プラスミドの第二の精製を行います。 30μlのRNaseフリー水で溶出します。
注：このステップからの収率は低いかもしれない（入力プラスミドの時々の下で50％）。 - RNaseフリー水で〜125 ngの/μlにプラスミドを希釈します。
- 線形化するために37℃で1時間、供給されたバッファに10μgのトランスポザーゼプラスミド（PCS-TP）10 U NotIで39をカットします。
図1.トランスポゼースmRNAをゲル精製した転写反応プロダクト（1μl）を氷上で冷却し、65℃に加熱し、100 VでキロベースでのRNAラダー（キロバイト）のサイズが左に表示され0.5X TAEランニング緩衝液で1％アガロースゲル上で実行します。全長トランスポザーゼmRNAは〜2.2キロバイトの明るいバンドです。分解または不完全なmRNAの小さいが許容量は、2.2キロバイトの下に見られている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- BAC遺伝子組換え（BAC遺伝子改変技術のためのサスター32,33を参照してください）
- E.からBACを準備製造業者のプロトコルに従ってBAC精製キットを用いて大腸菌 。 RNaseフリー水で〜250 ngの/μlので、標準的な酢酸ナトリウム-エタノール抽出40を再懸濁DNAとDNAを回収し、エタノール沈殿を使用してください。
- セクション1.1のようにトランスポザーゼのmRNAを準備します。
- TALENsとの突然変異誘発は、（サーマクを参照してください。
- 興味42の遺伝子のためのTALENsを設計するためにWebベースのアプリケーションを使用してください。可能な場合、設計TALENs分子分析を容易にするための制限酵素切断部位を破壊します。
- クローンTALENsおよび公開されたプロトコル35次転写のためのプラスミドを準備します。
- 製造元の指示に従ってのSP6転写反応でTALENのmRNAを転写し、セクション1.1.4にトランスポザーゼについて記述としてmRNAをクリーンアップします。分光光度計で定量化し、RNaseを含まない水で200 ngの/μlに希釈します。ステップ1.1.6で説明したように、適切なサイズと劣化しないことを確認するためにゲル上TALENのmRNAを実行します。
- プライマー設計ツールおよび標的DNA配列43を用いTALEN標的配列の周囲の約100〜200塩基対を増幅するためのPCRプライマーの対を設計します。ステップ1.3.1に基づいて、標的部位に病変をテストするための適切な制限酵素を注文。
- 設計・プロトコル38、および注文適切な検証プライマー及び制限酵素に応じてステップ1.3.4で説明したようにCRISPRsとCas9のmRNAを準備します。
2.注入試薬を準備します
- 後述のように使用してホウケイ酸毛細血管は、針を準備します。
注：これらの毛細血管は、ゼブラフィッシュマイクロインジェクションのために使用される標準的な毛細血管ではない、と厳しいトゲウオの絨毛膜を穿刺することが重要です太くて強いガラスで作られています。- 常に針を引っ張るときニトリルやラテックス手袋を着用し、針が皮膚や皮脂を連絡することはできません。
- マイクロピペットプラーの製造元の指示に従って、ランプテストによって経験的パラメータを引っ張っマイクロピペットを決定します。例えば、ボックスフィラメントと、次のパラメータが阻止されました最適であることが採掘された：（ヒート= 515、プル= 60、速度= 60、= 85ディレイ、圧力= 500）。これらの設定は、〜2ミリメートル、その後〜6ミリメートル（ 図2）で約2℃で先細り長い延長のために、約12°の急先細り針を作り出します。
注：適切なパラメータは、プラーとフィラメントによって異なります、と盲目的ランプテストを介して第1パラメータを決定せずにプログラムを使用すると、永続的に交換することは困難かつ高価であるプーラーのフィラメントを、破壊することができます。 - 2.1.2で決定された設定を使用してホウケイ酸ガラスから少なくとも4マイクロピペットの針を引っ張って、製造元の指示に従ってください。
- 垂直方向に鋭い端を下に向けて毛細管保存瓶に保管針。
- 注入する前に、針を冷却するために氷上で毛細管保存瓶を置きます。針が満たされた後、蒸発を防ぐためにジャーに湿ったペーパータオルの一片を追加します。
- 卵（すべてを肥やしますRTで実行されるステップ）
- 優しく腹部を圧迫し、排出腔を通って、35×10ミリメートル2ペトリ皿に卵を押し出すために後方方向に前方にストロークすることにより、妊娠女性のトゲウオからストリップ卵のクラッチ。湿度チャンバを作成するために、ペトリ皿の片側（卵に触れていない）上にペーパータオルの湿った部分を追加します。卵は湿ったままになるようペトリ皿に蓋を置きます。
- 0.025％、0.1％炭酸水素ナトリウムで緩衝トリカイン-Sで男性トゲウオを安楽死させます。
- （ハンクス溶液の調製のための完全なプロトコルのためのウェスター44を参照）、腹部を開き、精巣を除去し、250μlのハンクス溶液中で浸軟カット。
- 50μlの精子溶液を用いて、最大で100の卵を受精し、静かにすべての卵を受精されることを保証するためにピペットチップで攪拌します。クラッチが> 100卵である場合、すべての胚は、注射の時に1細胞期にあることを保証するために、後に卵の半分を受精。卵は未受精のままにすることができますRTで1時間までのために、精子は一般ハンクス液中で4℃で1-7日間続きます。
- 乾燥を防ぐために、受精後シャーレのふたで覆われた胚を保管してください。 （この時間中に注入材料を準備）出現し、最大膨潤する最初のセルを20〜25分を許可します。
- トゲウオ水で150ミリメートル×15ミリメートルのペトリ皿を埋めます。 （第一の脱イオン水に溶解し、10％重炭酸ナトリウムを製造、トゲウオ水を行うにし五つ星中3.5 gで人工海水ミックスを追加し、脱イオン水1リットル当たり10％の重炭酸ナトリウムの0.217 mlであり、塩を溶解させ、激しく振盪/攪拌）。
- （卵が受精している間）注射液を準備します
- 表1に記載の注射液を調製し、氷上で保存します。
注：いくつかの核酸の濃度が原因でトゲウオの割球の体積増加にゼブラフィッシュのために発行されたものから増加しています。
- 表1に記載の注射液を調製し、氷上で保存します。
| 試薬 | Tol2の注射 | BAC注入 | TALEN注入 | CRISPR注入 |
| Tol2のmRNAを | 350 ngの | 350 ngの | - | - |
| DNA | 150〜200 ngのプラスミド | 200-300 NGのBAC | - | - |
| TALENのmRNA | - | - | 200 ngの各 | - |
| CRISPRガイドRNA | - | - | - | 200 ngの |
| Cas9のmRNA | - | - | - | 400 ngの |
| 0.5％のフェノールレッドinDulbeccoのPBS | 0.5μlの | 0.5μlの | 0.5μlの | 0.5μlの | RNAseを含まない水 | 5μlのへ | 5μlのへ | 5μlのへ | 5μlのへ |
表1：インジェクション試薬全ての混合物は、5μlの上の総容量に調製し、氷上で保存してください。
- ニードルズ（;埋めるために針のために少なくとも10分を許可するオンアイス）を入力します。
- 針が毛細管保存瓶に垂直に吊り下げている間に、針の鈍先端に0.5μlの注射液をピペッティングすることにより、少なくとも3針を埋め戻し。ドロップが上にとどまり、側面を下に滴下し、気泡を回避しないように注意してください。
- 赤い液体はほとんどが針の先端に排出した後、針の鈍端に別の0.5μlを添加し、それを排出させます。
3.マイクロインジェクション用を注入リグと針を準備します
注：これらの手順c通常、卵を受精後に行うこと。
- 解剖顕微鏡のための透照光をオンにして、15cmの石膏で顕微鏡光ベース上〜13センチメートル×13センチのガラス板を配置し、ガラス板7の上に刃を見ました。針ホルダーの方を向いているくぼみで噴射装置に垂直のこぎりを向けます。
- エア供給をオンにして、圧力がレギュレータから〜200キロパスカルに設定されていることを確認。
- コントロールボックスをオンにして、設定を調整します。設定圧力に〜150-175キロパスカル。 180ミリ秒に噴射時間を設定します。
- 、針ホルダを緩めゴムホルダーの抵抗が感じられるまで、ホルダーに充填された注射針を挿入し、指タイトになるまで締めます。
- 約45°に針の角度を調整します。
- 終了が視野の中心にあるように、針を調整するためにマイクロマニピュレーターコントロールを使用します。 〜40X倍率にズームインし、触れるべきではありません針の先端、に焦点を当てます以下のガラス。
- そっと時計メーカーの鉗子でそれを把握することにより、針の先端を破ります。理想的には、垂直に壊れない、むしろ〜60°の角度で。近くに先端部（以上、2-3鉗子幅離れた端から、 図2）に分割します。
図2.未破壊、壊れたマイクロインジェクション針。トップ針が壊れていないし、ボトム針の先端が鉗子（矢印）で破壊されました。針は0.05％フェノールレッドを含む溶液で満たされています。スケールバー= 1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 針が壊れているかどうかをテストするために、注入フットペダルを数回押してください。数回タップした後、小さな赤い液滴がトンから出てくるを開始する必要があります彼は終了します。ない場合は、わずかに高い針を破壊してみてください。
- 針は気泡がある場合は、背圧ユニットを増加させ、泡を動作するために迅速にペダルを数回押してください。
- バックプレッシャーを調整します。
- ガラス板上にトゲウオの数滴の水を配置するために、使い捨てのトランスファーピペットを使用してください。
- 静かに水の中に針を下ろします。
- ピンクの液体のかすかな流れが針（正の圧力を示す）から出てくるまで背圧を上げます。
注：十分な背圧が存在しない場合は、針は、毛管作用によって細胞質を描きます。あまりにも多くの背圧がある場合には、注入量が誤って過度に大きいとすることができます。 - 可能な限りの胚を準備している間、それが損傷されないように針を撤回（下記参照）。
- 液体の一定の強い流れが針Wを出るように代替的には、より高い圧力設定に背圧を調整します鶏は、水に浸漬されます。その後、注入するためにフットペダルを押すと、不要となります。しかし、注入は過注入を避けるために、迅速に実行する必要があります。
注意：最初に注入するために学んでいるときに、この技術をしようとしないでください。
4.マイクロインジェクション
- 受精後約25分で、クラッチから5月10日の胚を削除して、ガラス板に転送するために2つの10μlのピペットチップを使用します。
- それでも優しく鋸刃の個々のくぼみに胚を分離し、ピペットチップを使用しました。胚を穿刺しないよう、十分に注意してください。
- 最後に転送ピペットを使用すると、そのようにトゲウオ胚は、内部に収まる胚をカバーするのに十分なトゲウオの水を追加し、3-5秒間に水を残し、その後ピペットで余分な水分を除去し、水コーティングの小容量を残します断ちます各胚。
あまりにも多くの水が絨毛膜を硬化し、針を壊すことになりますが、少量の水は、CHを持ち上げる必要がある注：離れたセルと卵黄からオリオン（ 図3A - B）。 - 離れ胚遠いから開始して、ガラス板をスライドさせ、最初の胚が視野の約25％を満たすようにズームイン。
- 視界に針を下ろし、そっと割球、卵黄（ 図3B）の上に細胞質の粒状で、わずかに黄色の隆起したバンプを識別するために胚を回転させ、次にように回転させるために10μlのピペットチップを使用（鋸刃、 図3Cのくぼみに胚を維持しながら）割球は、針の端部に直接垂直です。
注：卵黄液滴は、胚が回転するように移動させることができるので、割球の位置のための参照フレームとして使用しないでください。 - 細胞質に針を下ろしますが、元卵黄に押し通すません。針を壊し回避するために、絨毛膜を貫通するとき、ゆっくりと均等に圧力を適用します。もし針曲がりがひどく、撤回とわずかに異なる場所で再試行してください。
- やや散漫エッジを持つ赤い塊が細胞質の程度〜1月8日の直径を埋めるように注入するためにフットペダルを3-4回を押し下げ（ 図3Dを参照）。
- 細胞質（ 図3E）の下の卵黄への注入を示して拡散し始めていないシャープなエッジを持つ赤のボーラスを、取得することは避けてください。
- 鮮やかなピンクがかった赤のスポットがすぐに拡散した場合は、割球を穿刺し、さらに針を挿入します。
- 注射ボーラスが瞬時に黄色に変わる場合は、割球が標的にされていることを確認し、（ 図3F）を再度注入するために胚を回転させます。
注射の前と後のトゲウオ胚の図3.外観。すべての胚は目から引き出されます（C 'とGを除く）顕微鏡で見下ろすの電子の視点。 （A）水を追加する前に、受精胚は、卵黄の上部付近に浮遊油滴で均一な外観を持っています。卵黄から突出したプロファイルに表示されている割球を明らかにし、水、絨毛膜が膨潤を追加した後（B）。 （C）胚の回転針は絨毛膜と割球に垂直に入射するように。 （C '）は、細胞質内のチップで絨毛膜をパンクした針の側面図。 （D）時間をかけてフェード拡散エッジに赤い斑点で質の結果への注入。定義されたエッジと赤い斑点で質の結果を基礎となる卵黄に（E）注入。赤色から黄色へのpH誘発のカラーシフトで質の結果、反対卵黄への（F）注射。 （G）横サブ理想的な注入場所の上のXと注入の結果、の図である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- それは針にこだわった場合、胚を押したままに10μlのピペットチップを使用して、針を後退させるためにマイクロマニピュレーターコントロールを使用します。
- 針を後退した後、針で次の胚を整列させるためにガラス板をスライドさせます。
- すべての胚を注入した後、その後、トゲウオの水の完全な150ミリメートルペトリ皿に転送ピペットと場所でそれらを収集し、胚に水を追加するには、転送ピペットを使用しています。
- あまりにも多くの水を蓄積避けるために、ペーパータオルでガラス板をふいて乾かします。
- のこぎりと繰り返しが4.10を介して4.4ステップに新鮮胚を配布します。
- 注射していない胚は正常に発育することを確実にし、トンのための野生型対照として使用するために注射していないコントロールとして胚の〜10％を維持彼分子アッセイは、以下に説明します。
5.ポスト噴射ケア
- 10を孵化するまで、注射後18℃でペトリ皿中の胚を培養します。孵化後、水槽内の後部幼虫10を説明したように。
- 静かに注入した後、トゲウオ水1日をオフに注ぎ、新鮮なトゲウオ水と交換してください。その後、少なくとも一日おきに新鮮なトゲウオ水と交換してください。
- 毎日死んでいるか、不正な形式の胚のために確認してください。水を汚染から腐敗を防止するために、胚を削除します。
インジェクション結果の6分析
- 蛍光レポーターの注射のために、GFPまたはRFPフィルター（蛍光導入遺伝子によって異なります）で、蛍光解剖顕微鏡を使用して、暗い部屋で毎日胚を監視します。デジタル写真および/または書面による説明と異なるEXPRESと魚の数の集計と遺伝子発現のレコードの解剖学的パターンシオンドメイン（ 図4及び5）。
注：トゲウオは、4日後に受精（DPF）から始まるGFPフィルターの下に表示されている星状色素細胞を自家蛍光を持っています。- 、安定したラインを生成し、検出可能な蛍光を持つ胚を保存し、10に記載されているように成体まで成長します。
- 異系交配が成功した導入遺伝子の伝達を示す、蛍光子孫を探すためにステップ6.1で説明したように、蛍光のためのセクション2.2と画面子孫に記載のin vitro受精の手順を使用して、野生型の魚に成魚を注入しました。
- 孵化し、自由遊泳幼虫における蛍光を可視化するために、魚をanaesthetizeや魚ストップは画像に移動するまで待機する150ミリメートルペトリ皿に500μlの0.8％トリカインを追加します。すぐに観察し、イメージング、次の新鮮なトゲウオ水で数回すすいでください。
- 必要に応じて、さらにイメージングのための蛍光を維持するために、中に幼虫を安楽死させます0.025％（250 mg / Lで）トリカイン、0.1％重炭酸ナトリウムで緩衝し、4℃で、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒド中で4時間固定します。 2週間まで1×PBS中に保管してください。
注：時間をかけて、バックグラウンド自己蛍光が増大します。
- ベスト2日後の受精に出演 - CRISPRsまたはTALENsと突然変異誘発のための診断PCR /消化ジェノタイピング。
- 12ウェルPCRストリップチューブの最初の10ウェルに（まだ絨毛膜中2 DPF）10注入した胚を配置するために、転送ピペットを使用してください。最後の2つのウェルに非注射対照魚を置きます。
- 過剰トゲウオの水を除去します。
- 各ウェルに50μlの溶解緩衝液（10 mMトリスpHが8.3の50mMのKCl、1.5mMのMgCl 2を、0.3％のTween-20、および0.3％NP-40）を加えます。
- チューブにキャップを置き、サーモサイクラー中で20分間95℃でインキュベートします。
注：卵黄は煮沸工程の後に白とゴム状になります。 - ふたを取り外し、別のCLEを使用千μlのピペットチップは、各チューブ内の胚を柔らかくします。
注：ホワイトデブリは、チューブの底に集まります。 - 各ウェルに10 mg / mlでプロテイナーゼKの2.5μlを添加します。
- 蓋を交換し、20分は、カビの成長を回避するために、-20℃でプロテイナーゼKストアを不活性化するために95°Cに続いてタンパク質を消化するために1時間、55℃でインキュベートします。
- 製造者の指示に従って高忠実度ポリメラーゼを用いたPCRを行います。 DNAテンプレートとして胚溶解液を使用してください。
注：DNAテンプレートの管の上部から液体を除去するように注意してください、チューブの底に目に見える絨毛膜や卵黄の破片を回避することができます。 - 1X酵素特異的緩衝液およびサンプル当たり0.25μlの酵素を含む制限酵素マスターミックスと等量のPCR産物を混合します。 PCR産物を確認するために、ゲルアッセイ未切断PCR産物の半分を必ずしもを保存予想サイズです。 PCRはのための適切な条件で酵素と混合培養します制限酵素。
注：一部の酵素はPCR産物を酵素緩衝液の他の比率を必要とする場合があります。注射していないコントロールは完全な消化を示さない場合は緩衝液の濃度を調整します。 - 予想される生成物のサイズを確認するために、DNAサイズラダーの隣に1％アガロースゲル上で製品を実行し、次の消化。
注：注入された胚における包茎バンドは（ 図6）の分子病変の存在を示し、非注射コントロールは完全に結果を解釈するために消化されなければなりません。 - 、病変を確認し、アガロースゲルから切断されていないバンドを切り出し、ゲル抽出キットを用いてDNAを精製するために。理想的には、病変を確認するために、PCRプライマーの内部配列決定プライマーを用いて使用サンガー配列決定、。 F 0注入された胚では、病変のミックスは、おそらくサンガーの品質は、標的部位の近くに分解するために読ん引き起こし、存在するであろう。
- 安定したラインを生成するために、分子病変に対するポジティブスクリーニングクラッチからすべての注入された胚を保存します。 G魚、異系交配を行、および6.2.11〜ステップ6.2.1で説明したように、その後の分子病変に対するF 1胚のサブセットをスクリーニングします。ヘテロ接合キャリアが確認された場合、残りのFに成体と尾鰭クリップから抽出したDNAを用いて、ヘテロ接合の個体を識別するための1胚を育てます。
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Representative Results
エンハンサー活性を有するレポーター遺伝子導入遺伝子は、成功した注射は、導入遺伝子の特異的な細胞性発現（ 図4A、4C）をもたらすであろう。注入された魚は、安定した線（ 図4Bに示されるBAC安定線の一例）を生成するために外部交配することができます。トゲウオ胚にDNAを注入することは、典型的に単独のRNAよりもはるかに高い致死性をもたらします。 （先に述べたメガヌクレアーゼ法21と同様）Tol2のレポーターコンストラクトを注入した後- 50％まで（時 にはそれ以上）の致死性や奇形を（F、4I 図4D）を参照してくださいすることが一般的です。しかし、結果は特定の構築物、胚の形態、およびスキルレベルに基づいて大きく異なります。アクティブなエンハンサーは、胚の百分の40から50までは、一般的に、中央値と胸ひれ、例えば、組織特異的な導入遺伝子発現を表示します（Figure 5）。背景と非特異的な蛍光の程度（ 図4G - I）が広く使用されるプロモーターに基づいて変化します。ゼブラフィッシュhsp70lプロモーターは、特に筋肉や神経組織で、リーキーなる傾向があり、BACが（ 図4Gに類似）卵黄に高いバックグラウンド発現を有する傾向があります。鯉のベータアクチン 41プロモーターが少ない漏出性であるが、かなり暗いGFP発現を駆動します。 Tol2のプラスミド導入遺伝子の伝達は、トランスジェニック子孫を生成するGFP + F 0魚（ 表2）の100％までで、高くすることができます。しかし、導入遺伝子を運ぶ子孫の割合は、<1％から72％（ 表2）に、大きく異なります。のみGFP +注入した胚を保存すると、一般的に伝送効率を向上させます。 BACがF 0の唯一の10％までが予想される組織で蛍光を示すトゲウオ胚を注入して、はるかに低い遺伝子導入率を有する傾向があります。トランスBACのミッション率は、ゼブラフィッシュ32中の15％の報告された伝送レートに類似しているBAC（ 表2）、送信スクリーニングトゲウオの唯一の最大14％で、プラスミド構築物のそれよりも低いです。
BAC遺伝子組換えの比較的低い効率とは対照的に、TALENsを注射したスクリーニング魚の典型的には70から100までパーセントは、（病変についてスクリーニングされたクラッチを注入中、n = 10）モザイク病変をしています。この数は、あまり効率的TALEN対で低くなる可能性があり、射出品質と異なる場合があります。 図6を TALENsがTfap2a内のPvuII切断部位を標的とする注入シングルクラッチから10の胚のためのPCR /制限消化を示しています。各胚が有意野生型切断帯域に非常にモザイク状であるが注入された胚（レーン1-10）のそれぞれにおける未切断アンプリコンは、標的遺伝子座における各胚キャリー病変における細胞の部分を示しています。目レーン11-12で非注入胚からの電子のアンプリコンは完全にPvuIIで消化されています。 TALEN誘発性の変異は容易に次の世代に伝達されます。二つの異なるTALENでは、50％およびスクリーニングF子孫の20から90パーセントが正のクラッチ（ 表3）に病変を運んで、子孫に病変を送信0秒の90％を設定します。 CRISPR / Cas9効率はトゲウオで最適化されていないがPITX2をターゲット1のCRISPRガイドと一緒に、3注入した胚のうち一つはCRISPRターゲットのPCR産物のサンガー配列決定に基づいて、病変を持っていた、（ノーカットバンドは制限消化以下の塩基配列を決定した、 図7）。予測切断部位での配列の質の損失は、分子病変のミックスが存在している示しています。 PCRおよび制限消化アッセイを用いて病変に対するフィンクリッピング大人F 0魚やスクリーニングは、フィンにおける体細胞性病変で10月22日の魚を発見しました。これらの動物の代表的なサブセットは、 図8に示されています</ strong>の。個々の＃2が病変を有するDNAの低い割合を持っていながら、個々の＃3は、病変を有するDNAの割合が高いです。
注入された胚の図4.例。（A）モザイク胚5日後に受精（DPF）でGFPの胸での発現（アスタリスク）および中央値フィン（矢じり）を駆動するエンハンサーを注射しました。スケールバー=500μmの。 （B）4 DPFで胚中心にGFP発現を駆動するレポーターBACの安定したライン。 （C）モザイク胚は4 DPFで脊索にmCherryを発現を駆動するCol2a1aエンハンサーを注射しました。 Col2には A1Aエンハンサーは、プライマー5'-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 'および5'-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3'デールとTopczewskiで報告保存されたオルソロガスエンハンサーを増幅してトゲウオのDNAからクローニングされました2011正常に注入された胚の45。（D）の例。 （E - F）注射外傷で不正な形式の胚の例としては、 Eは、左眼を欠いており、Fは、右側（矢印）に沿って壊死組織を持っています。 （G）卵黄中の拡散GFP発現の例、卵黄への注入ではなく、割球の可能性が高い結果。上皮（矢じり）における非特異的なGFP発現の（H）の例。 （I）ブライト、非特異的な、粒状のGFP発現。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.レポーター構築物の注入効率。テンクラッチは190 bpのトゲウオのBMP6エンハンサーコンストラクタを注射しました20 DPF 5で胸鰭と中央値フィン発現を駆動するUCT。各クラッチからは、少なくとも20の胚は、組織特異的（胸および/またはフィン中央値）および/または非特異的（他のすべての組織）GFP発現を持つために採点しました。非特異的および組織特異的発現を有する全ての注入生存胚の割合は、箱ひげ図として示されています。水平線は最初の四分位、中央値と第三四分位数を示しています。ウィスカーは、第1および第3の四分位数の1.5 IQR（四分位範囲）内データムに伸びています。データは、エリクソンら。2015年から採用されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6. PCRおよびTALEN誘発性病変をスクリーニングする制限消化。Tfap2a をターゲットA TALENペアご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
モザイクFから図7サンガー配列決定 0 CRISPR / Cas9は、胚に注入しました 。 PITX2に対するCRISPRガイドRNAは、（5'-GTGGACCAACCTCACGG-3 '）（上に示される）Cas9 mRNAを同時注入した（38記載のようにPCS2-nCas9nプラスミドから転写された）および胚を、制限酵素分析を用いて病変についてスクリーニングしました。ノーカットバンドをゲル抽出し、サンガー配列決定により配列決定しました。シーケンスの品質が原因で注入された胚に存在する病変のモザイクミックスに（下の矢印）の予測切断部位で分解する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8 CRIの分析SPR F 0 尾鰭クリップ。DNAはPITX2に対するCRISPRsを注入した胚から引き上げF 0少年からフィンクリップから調製しました。 CRISPR / Cas9標的プライマー5'-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 'および5'-GGCCCAAATTACCCACATTT-3'を用いて増幅し、生成物をEcoRIで消化しました。 4人が示されています。ノーカットPCR産物は、左側にあり、消化したPCR産物は、各番号の個々のために右です。製品消化レーンで切られていないバンド（〜230塩基対）の大きさは、病変の存在を示します。個人分子病変の2、3および4のすべての兆候を示すには、個人間でモザイクを変化させることで、アスタリスクで示されています。関連するラダーサイズは左側に表示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 構築します | GFPの子孫/総F0スクリーニング魚（％） | ％F1子孫正 | 注意 |
| BAC A | 46分の6（13％） | 4から19までパーセント | |
| BAC B | 1/41（2％） | 4％ | |
| BAC C | 5/42（12％） | 百分の3から40まで | |
| BAC D | 3/22（14％） | 5から15までパーセント | |
| プラスミドA | 2/38（5％） | 百分の2から5 | すべてのF0胚スクリーニングだけでなく、GFP + |
| プラスミドB | 3/16（19％） | <1から8までパーセント | すべてのF0胚スクリーニングだけでなく、GFP + |
| プラスミドC | 1/11（10％） | 10％ | |
| プラスミドD | 2/11（18％） | 1から45パーセント | プラスミドDは、内に注入しました2遺伝的背景 |
| プラスミドD | 5/5（100％） | 16から72% | |
| プラスミドE | 2/3（67％） | 2から22までパーセント | |
| プラスミドF | 2/6（33％） | <1から65パーセント | |
| プラスミドG | 3/8（38％） | 2から56までパーセント | |
| プラスミドH | 3/18（17％） | 得点ではありません | |
| プラスミドI | 5/24（21％） | 得点ではありません |
表2：のBACおよびエンハンサー構築物について導入遺伝子の伝送効率 F 0注入した胚は、成体まで上げ、その後、GFP蛍光のために獲得した野生型の魚とF 1子孫に外部交配しました。導入遺伝子を送信したF 0個体数はexprのですすべてのスクリーニングF 0魚の割合としてessed。導入遺伝子を有するF 1子孫の割合の範囲はまた、GFP陽性魚を持っていたそれらのクラッチのために示されています。
| TALEN | ％F0送信病変 | ％F1子孫正 |
| A | 9/10（90％） | 20から90パーセント |
| B | 4/8（50％） | 20から72% |
表3：2 TALENペアの伝送効率 F 0注入された胚は、成体まで上げ、その後、野生型魚やTALEN病変についてスクリーニングF 1子孫に外部交配しました。病変を送信注射した個体の割合示されているだけでなく、それらのクラッチで病変を有する子孫の割合の範囲その送信病変。 TALEN AはBMP6エンハンサー 20をターゲットに、TALEN Bは（未発表）Tfap2aをターゲットに。
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Discussion
遺伝子導入またはゲノム編集のための注入1細胞トゲウオ胚は、3つの主要な課題を提示します。まず、ゼブラフィッシュの胚に比べて、トゲウオ胚絨毛膜はタフであり、しばしば針を中断します。この問題を部分的に厚くて強いガラスマイクロピペットを使用して漿膜に垂直注入することによって克服することができる（プロトコール、 図2を参照）。できるだけ少量の水が（絨毛膜が膨潤し、離れたセルから持ち上げるさせるのに十分なだけ）の胚に追加されていることを保証することは、絨毛膜の硬度を減らすのに役立ちます。絨毛膜は、時間をかけて硬化するので、胚を湿らせた後、すぐに作業をすることが重要です。彼らは乾燥させないように、注射前に湿度チャンバー内で胚を維持することも重要です。いくつかのクラッチ、さらには個々の胚は、単にはるかに厚いと厳しい絨毛膜を持っています。時には次の胚に移動したり、新しいクラッチをしようとすると、最も簡単なソリューションです。 1つのDをスキップする方がはるかに簡単です破損した針を交換するよりもifficult胚。準備バックアップ針を持つことは、注射は針折れの場合に継続することができます。 BACを注入すると針が目詰まりすることが一般的です。針、または詰まりをパージするために一定の空気の圧力スイッチを使用して穏やかに掻き取りまたは鉗子で先端を再分割することによって目詰まりすることができます。
第二に、胚の最初のセルを特定することは困難です。それはしばしば非常に平らにし、困難な初心者が参照するために、それを直接見たときに、特に目に見えないです。多くの場合、割球は、プロファイルのみでわずかに隆起バンプとして見ることができます。したがって、（ 図3B）のプロファイル内のセルを識別するために最善であると、その後軽く前方胚を回転させると、細胞は、多くの場合、この角度からは見えないものの側にそのようにセルが（角度 のついた針の端部に直面するだろう。 図3の割球の暗い色）は、明確にするために誇張されています。
e_content ">第三に、細胞質を標的とする最初のセルが特に平坦である場合は特に、また困難である。細胞質に近い卵黄に注入しながら割球（通常は中央）の太った部分をめざしする。細胞質内に注入するチャンスを改善成功したトランスジェニック魚を生成することができ、効率が向上しているようだと致死性細胞質が単一の針穿刺の標的とされたときに減少した。時々、個々のクラッチは、このような卵黄を回避することはほぼ不可能であることが特に薄い割球を、持っています。ウェイティング長い25分より注射は（いくつかのクラッチが〜45分後に受精するまで、フルサイズの割球を形成しない）を助けるかもしれませんが、割球のサイズが増加したことがない場合は平坦化された細胞を注入しようとするよりも、卵の新しいクラッチを得ることがしばしば容易である開始します。注射後過度の致死率は、いくつかの理由で発生することがあります。ブラント針および/または大きすぎる針穴の大きさは、トンを引き起こす可能性があります漏れるために、細胞および/または原因の細胞質へのOO多くの被害。いくつかのDNA構築物は、特に致命的であるように見えます。 DNAの濃度を低下させることが、生存が、より低い遺伝子導入率を向上させることができます。第二のPCRクリーンアップキット続いエンドトキシンリンスが含まれているミディプレップキットで最初のプラスミドをクリーンアップすることは毒性を構築削減します。最後に、ゲノムの編集は、胚の開発に致死的である機能変異の損失を生成することができます。 CRISPRまたはTALEN mRNAの濃度を低減することが致死性を防止するために、胚のモザイク現象を増加させることができるが、変異対立遺伝子回収効率を低下させることができます。
メガヌクレアーゼ法21を使用して、トランスジェニックトゲウオを生成するための以前に公開されたプロトコルは、F 0始祖魚4から7パーセントの導入遺伝子の生殖系列伝達率を報告しました。ここで報告Tol2の方法は、F 0始祖魚から72％の導入遺伝子の生殖系列伝達率まで（複数のゲノムintegratを示すが生じましたイオン）。メガヌクレアーゼ法を用いた以前の研究では、ここで報告されたのと同様の特定のGFP発現を示す注入した胚の40％を報告しました。トランスジェニックF 0創始者の同様の速度は、メガヌクレアーゼとTol2のメソッドの両方で生成されたトランスジェニック魚を観察しながらこのように、生殖細胞系列の伝送速度はTol2の媒介トランスジェニックのための非常に高い表示されます。
ゲノム編集技術が進歩し続けるにつれて、さらにより具体的な遺伝子操作は、トゲウオや他の魚種で可能になります。例えば、有向修理46と相同組換えが可能になるアレル海洋および淡水トゲウオのゲノム間スワップ、および修正CRISPRsは、具体的には、遺伝子発現47を活性化または阻害するために使用することができます。ゲノム編集および分析のためのこれらの刺激的な技術は、多くの興味深い形態的、生理の遺伝的基礎に関する新しい知見、およびSTICにおける行動の表現型につながりますklebacksと他の魚種。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIH R01＃DE021475（CTM）、NIH博士号を取得する前のトレーニンググラント5T32GM007127（PAE）、およびNSF大学院研究フェローシップ（NAE）によって部分的に資金を供給されました。私たちは、注入プロトコル上で役に立つフィードバックのためにCRISPRサンガー配列決定データを生成するためのBACのリコンビや注射、ニックDondeを実行するためのケビン・シュヴァルバッハ、とキャサリンリーパリに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | - | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm Petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 mm x 10 mm Petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50x Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10 Kb RNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10x PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1 kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
References
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