Summary
Transgene manipulationer og genom-redigering er kritiske for funktionelt teste roller gener og cis reguleringsmyndigheder elementer. Her et detaljeret mikroinjektion protokol for generering af genomiske modifikationer (herunder Tol2-medierede fluorescerende reporter transgene konstruktioner, Talens og CRISPRs) præsenteres for emergente model fisk, den trepigget hundestejle.
Abstract
Den trepigget hundestejle fisk har vist sig som et kraftfuldt system til at studere den genetiske basis for en bred vifte af morfologiske, fysiologiske og adfærdsmæssige fænotyper. De bemærkelsesværdigt forskellige fænotyper der har udviklet sig som marine populationer tilpasse sig utallige ferskvandsmiljøer, kombineret med evnen til at krydse havvand og ferskvand former, giver en sjælden hvirveldyr system, hvor genetik kan anvendes til at kortlægge genomiske regioner at styre udviklet træk. Fremragende genomiske ressourcer er nu tilgængelige, lette molekylær genetisk dissektion af udviklede ændringer. Mens mapping eksperimenter generere lister over interessante kandidatgener, er funktionelle genetiske manipulationer kræves for at afprøve roller disse gener. Genregulering kan studeres med transgene reporterplasmider og BAC'er integreret i genomet ved hjælp af Tol2 transposasen systemet. Funktioner af specifikke kandidatgener og cis reguleringsmyndigheder elementer kan vurderes ved at inducere målrettetmutationer med talen og CRISPR / Cas9 genom redigering reagenser. Alle metoder kræver indføring af nukleinsyrer i befrugtede én-celle hundestejle embryoer, en opgave gjort udfordrende ved den tykke chorion af hundestejle embryoer og den relativt lille og tynd blastomer. Her er en detaljeret protokol til mikroinjektion af nukleinsyrer i hundestejle embryoner beskrevet for transgene og genom redigeringsfunktioner at studere genekspression og funktion, samt teknikker til at vurdere succes transgenese og inddrive stabile linjer.
Introduction
Et grundlæggende element i at forstå, hvordan biodiversiteten opstår er at bestemme de genetiske og udviklingsmæssige grundlag for udviklede fænotypiske ændringer i naturen. Den trepigget hundestejle fisk, Gasterosteus aculeatus, har vist sig som en fremragende model til at studere den genetiske basis for evolution. Hundestejler har gennemgået mange adaptive evolutionære ændringer som marine fisk har koloniseret utallige ferskvandsmiljøer omkring den nordlige halvkugle, hvilket resulterer i dramatisk morfologiske, fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer en. Genomerne af individer fra enogtyve hundestejle populationer er blevet sekventeret og samles, og en høj densitet binding kort er blevet frembragt for yderligere at forbedre konstruktionen 2,3. Genetisk kortlægning eksperimenter har identificeret genomiske regioner underliggende udviklede fænotyper 4 - 6, og i enkelte tilfælde har de funktionelle roller specifikke kandidatgener testet 7,8. En række genomiske regioner underliggende morfologiske ændringer er blevet identificeret med lovende kandidatgener, men disse kandidater er endnu ikke blevet funktionelt testet 9 - 12 år. Hertil kommer, hundestejler er fælles modeller for studier af populationsgenetik / genomforskning 13,14, artsdannelse 15, adfærd 1, endokrinologi 16, økotoksikologi 17, immunologi 18 og parasitologi 19. Fremtidige studier i hvert af disse områder vil drage fordel af evnen til at udføre funktionelle genetiske manipulationer i hundestejler. Ud over at manipulere deres kodende sekvenser, kan roller kandidatgener vurderes ved at studere deres cis reguleringsmyndigheder sekvenser og ved funktionelt stigende, faldende eller eliminere ekspression af kandidat-gen. Mikroinjektion og transgenese metoder i hundestejler er veletablerede 7,8,20 og blev oprindeligt udviklet ved hjælp af en meganuklease-medieretmetode 21 først beskrevet i Medaka 22. Den modificerede mikroinjektion metode præsenteres her er blevet optimeret til både Tol2-medieret transgenese og for nylig udviklet genom redigering reagenser herunder Talens og CRISPRs.
Ændringer i cis reguleringsmyndigheder elementer menes at være kritisk for morfologiske udvikling, som cis reguleringsmyndigheder ændringer kan undgå de negative pleiotropiske konsekvenser af kodende mutationer 23. Derfor tester og sammenligner formodede cis reguleringsmyndigheder sekvenser er blevet et centralt mål med et stigende antal evolutionære studier. Desuden har de fleste menneskelige sygdom varianter er regulatoriske varianter 24,25 og model hvirveldyr systemer er hårdt brug for at studere cis reguleringsmyndigheder element funktion og logik. Fisk, der befrugte deres embryoner eksternt i stort tal tilbyde kraftige hvirveldyr systemer til at studere cis -forordning. Det Tol2 transposon system, hvor udenlagn DNA, der skal integreres i genomet flankeres af Tol2 transposase binding sites og co-injiceret med Tol2 transposase mRNA, arbejder med høj effektivitet for vellykket integration plasmidkonstruktioner i fisk genomer 26 - 28. Typisk er en potentiel enhancer klonet opstrøms for en basal promotor (såsom hsp70l 29) og fluorescerende reporter gen, såsom EGFP (forstærket grønt fluorescerende protein) eller mCherry i en Tol2 backbone og injiceret med transposase mRNA 26. Observation af udtryk for den fluorescerende reporter, enten i injicerede embryoner eller afkom med stabilt integrerede transgener, giver oplysninger om den Spatiotemporal regulering af genekspression drevet af den formodede forstærker. I yderligere eksperimenter, kan validerede enhancere anvendes til at drive vævsspecifik overekspression af gener af interesse.
Til analyse af større cis reguleringsmyndigheder regioner, høj kvalitet, stor-insert genomic biblioteker med bakterie- kunstige kromosomer (BAC'er) er blevet konstrueret til både marine og ferskvands hundestejler 30. Disse BAC'er kan recombineered at erstatte et gen med en fluorescerende reporter-gen i forbindelse med et stort (150-200 kb) genomiske region 31. Den fluorescerende reporter udtrykkes derefter i en Spatiotemporal mønster som bestemt af regulatoriske sekvenser i BAC. For studier i fisk, kan Tol2 sites føjes til BAC at lette genomisk integration 32,33. I senere stadier af udvikling, når in situ hybridisering er teknisk udfordrende, kan det fluorescerende udlæsning af BAC bruges til at studere mønstre af genekspression, som det er blevet vist for hundestejle knoglemorfogenetisk protein 6 (BMP6) 20. Derudover kan fluorescerende ekspressionsmønstre i et individ spores over tid, hvilket ikke kan opnås med in situ hybridisering. AKB kan også bruges til at tilføje en additional kopi af et genomisk region for at øge doseringen af et gen af interesse.
Til undersøgelse af genfunktion, genom redigering er en eksplosivt voksende område, der kan anvendes til fremstilling af målrettede ændringer genomiske sekvenser i en lang række organismer 34. Transskriptionsaktivator-lignende effektor nukleaser (Talens) er modulopbyggede, sekvensspecifikke nukleaser oprindeligt isoleret fra plantepatogener, som kan netop manipuleret til at binde direkte til en genomisk sekvens af valg og generere en dobbeltstrengsbrud 35,36. Grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome repeats (CRISPR) / CAS systemer blev oprindeligt fundet i bakterier og bruge en guide RNA og Cas9 proteinet for at generere en pause i en mål-DNA-sekvens komplementær til føringen 37. Den efterfølgende reparation af dobbeltstrengsbrud skabt af både TALENS og CRISPRs ofte efterlader en lille insertion eller deletion, der kan forstyrre funktionen af målsekvensen35-37. I hundestejler, er Talens blevet brugt til at afbryde genekspression ved at målrette en forstærker 20, og begge Talens og CRISPRs har med succes produceret mutationer i kodning sekvenser (upublicerede data). En detaljeret protokol for generering af CRISPRs til brug i zebrafisk kan bruges som en rettesnor til at udvikle CRISPRs for hundestejler 38.
Transgene og genom redigering eksperimenter kræver introduktion af nukleinsyrer i en nyligt befrugtet én-celle embryon. Ved at indføre transgen eller genom-redigeringsværktøj tidligt i udviklingen, er antallet af genetisk manipulerede datter celler i fosteret maksimeret. Injicerede embryoer derefter visuelt screenet for fluorescens eller molekylært screenet for genommodifikationer. Hvis celler, der bidrager til kønscellelinie succes er målrettet, kan transgenet eller mutation videregives til en delmængde af afkom, selv når efter injektion dødelighed er høj. De mosaik fisk kan udkrydsede ellerintercrossed og deres afkom screenet for at inddrive de mutant alleler eller et stabilt integreret transgen af interesse. Denne protokol beskriver metoder til indførelse transgener og genom redigering reagenser i én-celle hundestejle embryoner og overvågning for vellykkede genomiske modifikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt fisk arbejde blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of California-Berkeley (protokol nummer R330).
1. Forbered nukleinsyrer til injektion
- Tol2 Plasmid Transgenese (Tilpasset fra Fisher 26).
- Skær 10 ug transposase plasmid (pcs-TP) 39 med 10 U NotI i medfølgende buffer i 1 time ved 37 ° C til linearisering.
Bemærk: Materiale Transfer aftaler kan være nødvendigt for at opnå Tol2 plasmider. - Ekstraher Skær plasmid med en 25: 24: 1 blanding af phenol: chloroform: isoamylalkohol og ethanol bundfald med natriumacetat i overensstemmelse med standardprotokoller 40. Resuspender plasmid i 50 pi RNase-frit vand.
Bemærk: Phenol-chloroform bør anvendes i en hætte og affaldet skal bortskaffes korrekt i henhold til institutionelle retningslinier. - Opsætning af en Sp6 transkription reaktion ifølge producentens instruktioner.
- Brug en RNA isolation kit til at rydde op transkription reaktion ifølge producentens instruktioner; resuspendere RNA i 50 pi RNase-frit vand.
- Fjern en 1 pi alikvot af RNA. Opvarm til 65 ° C i 5 minutter for at denaturere sekundære strukturer derefter straks chill på is. Frys resterende transkriptionsreaktion ved -80 ° C.
- Kør RNA alikvot på en 1% agarosegel i 0,5x TAE (Tris-base, eddikesyre, Ethylendiamintetraeddikesyre) løbebuffer med en RNA størrelse standard i én lane. Det forventede produkt er 2200 bp; kassere hvis> 5% af det totale RNA vises i et smear mindre end 2.200 bp, hvilket indikerer omfattende nedbrydning (Figur 1).
- Kvantificere RNA under anvendelse af et spektrofotometer ved 260 nm. Fortynd til 350 ng / ul i RNase-frit vand og opbevare en pi prøver ved -80 ° C (godt for mindst to år).
- Klon Tol2 reporter plasmid (fx under anvendelse pT2HE 8 eller plasmider fra Tol2 kit 41) med cis- Regulatorisk element af interesse. Kort beskrevet PCR amplificere et genomisk DNA-sekvens af interesse med primere indeholdende restriktionssteder findes i plasmidet, fordøje PCR-produktet og vektor med enzymet (r), ligere indsatsen i vektoren, og omdanne resulterende plasmid ind i kompetente E. coli 40. Isoler plasmid med et kit, der indeholder et endotoksin skylning ifølge producentens protokol.
- Udfør en anden oprensning af Tol2 plasmidet med et PCR oprensningskit ifølge producentens protokol. Eluere i 30 pi RNase-frit vand.
Bemærk: udbyttet fra dette trin kan være lav (undertiden under 50% af det tilførte plasmid). - Fortynd plasmid til ~ 125 ng / pl i RNase-frit vand.
- Skær 10 ug transposase plasmid (pcs-TP) 39 med 10 U NotI i medfølgende buffer i 1 time ved 37 ° C til linearisering.
Figur 1. transposase mRNA gel. Oprenset transkription reaktion prokanal (1 pi) blev opvarmet til 65 ° C, afkølet på is, og kørt på en 1% agarosegel med 0,5 x TAE løbebuffer ved 100 V. Størrelserne af RNA stigen i kilobaser (kb) er angivet til venstre . Den fulde længde transposase mRNA er en lys bånd ved ~ 2,2 kb. En lille, men acceptabel mængde nedbrudt eller ufuldstændige mRNA ses nedenfor 2,2 kb. Klik her for at se en større version af dette tal.
- BAC Transgenese (Se Suster 32,33 for BAC Recombineering Techniques)
- Forbered BAC fra E. coli ved anvendelse BAC oprensningskit ifølge producentens protokol. Brug ethanolfældning til at inddrive DNA med en standard natriumacetat-ethanol-ekstraktion 40 og resuspender DNA ved ~ 250 ng / pl i RNase-frit vand.
- Forbered transposasen mRNA som i afsnit 1.1.
- Mutation Induktion med Talens (Se Cermak
- Brug web-baseret program til at designe Talens for genet af interesse 42. Hvis det er muligt, at design Talens forstyrre et restriktionsenzym skære websted for at lette molekylær analyse.
- Klon Talens og forberede plasmider for transskription følgende offentliggjort protokol 35.
- Transskribere Talen mRNA med en Sp6 transskription reaktion i overensstemmelse med producentens anvisninger og rydde op mRNA som beskrevet for transposasen i afsnit 1.1.4. Kvantificere med et spektrofotometer og fortyndes til 200 ng / ul i RNase frit vand. Kør Talen mRNA på en gel for at sikre det er den rigtige størrelse og ikke nedbrydes som beskrevet i trin 1.1.6.
- Design et par PCR-primere til at opformere ca. 100-200 bp omkring talen målsekvensen anvendelse af en primer design værktøj og mål-DNA-sekvensen 43. Bestille det passende restriktionsenzym for at teste for læsioner på målstedet baseret på trin 1.3.1.
- Design og forberede CRISPRs og Cas9 mRNA ifølge protokol 38, og bestille passende verifikation primere og restriktionsenzymer som beskrevet i trin 1.3.4.
2. Forbered Injection Reagenser
- Brug Borosilikatrør Kapillærer Forbered nåle som beskrevet nedenfor.
Bemærk: Disse kapillærer er ikke faste kapillærer anvendes til zebrafisk mikroinjektion, og er fremstillet af et tykkere og stærkere glas, der er kritisk at punktere hårde hundestejle chorion.- Brug altid nitril eller latex handsker når trækker nåle, og tillader ikke nåle til at kontakte hud eller hud olier.
- Bestem Mikropipette trækker parametre empirisk ved rampe test efter mikropipette aftrækker er producentens anvisninger. For eksempel med en kasse filament, blev de følgende parametre afskrækkeminerede at være optimal: (Heat = 515, Pull = 60, Velocity = 60, Delay = 85, tryk = 500). Disse indstillinger producere en nål, der tilspidser stejlt på ca. 12 ° i ~ 2 mm og derefter en lang udvidelse, der tilspidser ved ca. 2 ° i ~ 6 mm (figur 2).
Bemærk: Den korrekte parametre vil variere med aftrækker og filament, og blindt ved hjælp af et program uden at bestemme de parametre, først gennem rampe tests kan permanent ødelægge aftrækker s filament, som er vanskeligt og dyrt at erstatte. - Følg producentens anvisninger til at trække mindst 4 mikropipette nåle fra borosilikatglas med de indstillinger, der er fastlagt i 2.1.2.
- Opbevar nåle lodret i kapillær opbevaring krukke med den skarpe ende nedad.
- Før injektion, placere kapillær opbevaring krukke på is til køling nåle. Tilføj et stykke fugtigt papir håndklæde til krukken for at forhindre fordampning, når nålene er fyldt.
- Gød Æg (AlleTrin, der udføres ved stuetemperatur)
- Strip æg clutch fra drægtige female hundestejle ved forsigtigt at klemme maven og optegne i en anterior til posterior retning for at skubbe æggene ud gennem kloakken og ind i en 35 x 10 mm 2 petriskål. Tilføj et fugtigt stykke køkkenrulle på den ene side af petriskålen (rører ikke æggene) til at oprette fugtighedskammer. Placer låget på petriskålen således æg bo fugtig.
- Euthanize mandlige hundestejle i 0,025% tricaine-S bufret med 0,1% natriumbicarbonat.
- Skær åbne maven, fjerne testikler og opblødes i 250 pi Hanks opløsning (se Westerfield 44 for fuld protokol for Hanks løsning forberedelse).
- Gød højst 100 æg med 50 pi sperm løsning og forsigtigt røre med pipette spids for at sikre alle æg befrugtes. Hvis koblingen er> 100 æg, befrugte halvdelen af æggene senere for at sikre, at alle embryoner på et én-celle stadiet ved injektion. Æg kan stå ubefrugtedeved stuetemperatur i op til en time, og sperm varer normalt 1-7 dage ved 4 ° C i Hanks opløsning.
- Hold embryoner dækket med petriskål låg efter befrugtningen for at forhindre udtørring. Tillad 20-25 min for den første celle at dukke og svulme op (forberede injektionsmaterialer i denne periode).
- Fyld en 150 mm x 15 mm petriskål med hundestejle vand. (For at få hundestejle vand, først forberede 10% natriumbicarbonat opløst i deioniseret vand. Derefter tilsættes 3,5 g kunstigt havvand mix og 0,217 ml 10% natriumbicarbonat hvert 1. l deioniseret vand, og der omrøres / rystes kraftigt for at opløse saltet.)
- Forbered Injection Solution (Mens Æg er Befrugtende)
- Forbered injektion løsning i henhold til tabel 1 og butik på is.
Bemærk: koncentrationerne af nogle nukleinsyrer er blevet øget fra dem, der offentliggøres for zebrafisk på grund af den øgede mængde af hundestejle blastomer.
- Forbered injektion løsning i henhold til tabel 1 og butik på is.
| Reagens | Tol2 injektion | BAC injektion | Talen injektion | CRISPR injektion |
| Tol2 mRNA | 350 ng | 350 ng | - | - |
| DNA | 150-200 ng plasmid | 200-300 ng BAC | - | - |
| Talen mRNA | - | - | 200 ng af hver | - |
| CRISPR guide RNA | - | - | - | 200 ng |
| Cas9 mRNA | - | - | - | 400 ng |
| 0,5% phenolrødt inDulbecco s PBS | 0,5 pi | 0,5 pi | 0,5 pi | 0,5 pi | RNase-frit vand | til 5 pi | til 5 pi | til 5 pi | til 5 pi |
Tabel 1:. Injection reagenser Alle blandinger bør være forberedt til et samlet volumen på 5 pi og opbevaret på is.
- Fyld Needles (On Ice, skal være mindst 10 min for Nåle Fill).
- Efterfylde mindst tre nåle ved pipettering 0,5 pi injektion opløsningen på den stumpe øverste ende af nålen, mens nåle hænger lodret i kapillær opbevaring jar. Pas på, at faldet bliver på toppen og ikke drypper ned på siden og undgå bobler.
- Efter den røde væske hovedsagelig er løbet til den tilspidsede spids af nålen, tilføje yderligere 0,5 pi til den stumpe ende af nålen og lad det dryppe.
3. Forbered Inject Rig og Needle for Mikroinjektion
Bemærk: Disse trin cen normalt ske efter befrugtende æggene.
- Slå gennemlysning lys for dissektionsmikroskop og placere en ~ 13 cm x 13 cm glasplade på mikroskopet lys bund med 15 cm gips savklinge oven på glaspladen 7. Vend saven vinkelret på injektionsapparatet med fordybningerne vender mod nåleholderen.
- Tænd lufttilførsel og sikre trykket er indstillet til ~ 200 kPa fra regulatoren.
- Tænd for kontrolboks og justere indstillingerne. Indstil tryk til ~ 150-175 kPa. Indstil injektion varighed til 180 msek.
- Løsn nåleholderen, indsætte en fyldt nål ind i holderen, indtil der kan mærkes modstand på indehaveren af gummi, og spænd indtil fingrene.
- Juster nålen vinkel til ca. 45 °.
- Brug mikromanipulator til at justere nålen, så den ende er centreret i synsfeltet. Zoome ind til ~ 40X forstørrelse og fokus på spidsen af nålen, som ikke bør røreglasset nedenfor.
- bryde forsigtigt spidsen af nålen ved at tage fat med urmager- pincet. Ideelt, ikke bryder sig vinkelret, men snarere ved en ~ 60 ° vinkel. Break tæt på spidsen (ikke mere end 2-3 pincet bredder væk fra enden, figur 2).
Figur 2. Ubrudte og punkterede mikroinjektion nåle. Den øverste nål er ubrudt og spidsen af den nederste nålen er blevet brudt med pincet (pil). Nåle er fyldt med en opløsning indeholdende 0,05% phenolrødt. Skala bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Tryk injektionen fodpedalen flere gange for at teste, om nålen er brudt. Efter et par tryk, bør små røde dråber begynder at komme ud af than ender. Hvis ikke, så prøv at bryde nålen lidt højere.
- Hvis nålen har en luftboble, øge modtrykket enheden og tryk på pedalen flere gange hurtigt at arbejde boblen ud.
- Juster modtrykket:
- Brug engangs overførselspipetten at placere et par dråber hundestejle vand på glaspladen.
- Sænk forsigtigt nålen i vandet.
- Øge modtrykket indtil en svag strøm af lyserød væske kommer ud af nålen (indikerer positivt tryk).
Bemærk: Hvis der ikke er nok modtryk, vil nålen udarbejde cytoplasmaet ved kapillarvirkning. Hvis der er for meget modtryk, kan injektionsvolumen være utilsigtet for stor. - Trække nålen så vidt muligt således at det ikke beskadiges ved fremstilling af embryoner (se nedenfor).
- Alternativt justere modtrykket til et højere tryk indstilling, så at et konstant stærk strøm af væske forlader nålen whøne det er nedsænket i vand. Derefter bliver overflødig trykke på fodpedalen at injicere; dog skal udføres injektionen hurtigt for at undgå over-injektionen.
Bemærk: Forsøg ikke denne teknik, når først lære at injicere.
4. Mikroinjektion
- Ca. 25 min efter befrugtningen, bruge to 10 pi pipettespidser at fjerne 5-10 embryoner fra koblingen og overførsel til glaspladen.
- Stadig hjælp af pipettespidser, forsigtigt adskille embryoner i individuelle fordybninger af savklingen. Vær forsigtig ikke at punktere embryoner.
- Ved hjælp af en overførsel pipette med ende afskåret så hundestejle embryoner vil passe ind, tilsæt nok hundestejle vand til at dække de embryoner, forlade vandet på i 3-5 sek, derefter fjerne det overskydende vand med pipette, efterlader en lille mængde vand belægning hver foster.
Bemærk: For meget vand vil forårsage chorions at hærde og knække nålen, men et lille volumen af vand er nødvendigt at løfte lmOrion væk fra cellen og æggeblomme (figur 3A - B). - Startende med embryo længst væk, skub glasplade og zoome ind, så den første embryo fylder ca. 25% af synsfeltet.
- Sænk nålen ned i synsfeltet, og brug derefter 10 pi pipettespids til forsigtigt at dreje embryo at identificere blastomer, en kornet, svagt gul hævet bump af cytoplasma ovenpå blommen (figur 3B), og drej så den blastomer er direkte vinkelret på enden af nålen (og samtidig holde embryoet i fordybningen af savklingen, figur 3C).
Bemærk: æggeblomme dråber kan bevæge sig som embryonet drejes, så du skal ikke bruge dem som en referenceramme for placeringen af blastomer. - Sænk nålen ind i cytoplasmaet, men ikke skubbe igennem til den underliggende æggeblomme. Pres langsomt og jævnt når piercing chorion at undgå at bryde nålen. Hvisnål bøjninger alvorligt, trække og prøv igen i en lidt anden placering.
- Tryk fodpedalen 3-4 gange at indsprøjte således at en rød bolus med lidt diffuse kanter fylder ca. ~ 1/8 diameteren af cytoplasmaet (se figur 3D).
- Undgå opnå en rød bolus med skarpe kanter, der ikke begynder at diffundere, hvilket indikerer injektion i blommen under cytoplasmaet (figur 3E).
- Hvis en lys rosa-rød plet diffunderer hurtigt, indsætte nålen yderligere at punktere blastomer.
- Hvis injektionen bolus bliver gult øjeblikkeligt, rotere embryonet at sikre blastomer er målrettet og injicere igen (figur 3F).
Figur 3. Udseende af hundestejle embryoner før og efter injektion. Alle embryoner er hentet fra the perspektiv ser ned gennem mikroskop (med undtagelse af C og G). (A) Inden tilsætning af vand, befrugtede æg har et ensartet udseende med oliedråber flydende nær toppen af blommen. (B) Efter tilsætning af vand chorion svulmer, afslører en blastomer der rager frem fra blommen og er synlig i profilen. (C) Rotation af embryoet så nålen kommer ind vinkelret på chorion og blastomer. (C ') fra siden af en nål, der har punkteret chorion med spidsen i cytoplasmaet. (D) Injektion ind i cytoplasmaet resulterer i en rød plet med diffuse kanter, der toner over tid. (E) Injektion i blommen underliggende cytoplasmaet resulterer i en rød plet med definerede kanter. (F) Injektion i blommen modsat cytoplasmaet resulterer i en pH-induceret farveskift fra rød til gul. (G) Lateralbillede af injektion resultater, med Xs end sub-ideelle injektion steder. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Brug mikromanipulator kontrol for at trække nålen, ved hjælp af 10 pi pipettespids at holde fosteret, hvis det klæber til nålen.
- Efter tilbagetrækning af nålen, skub glasplade for at tilpasse den næste foster med nålen.
- Efter injektion alle embryoner, bruge overførsel pipette for at tilføje vand til embryoner, derefter indsamle dem i overførslen pipette og plads i 150 mm petriskål fuld af hundestejle vand.
- Tør glaspladen med en papirserviet for at undgå at akkumulere for meget vand.
- Fordel friske embryoner på saven og gentage trin 4.4 gennem 4.10.
- Hold ~ 10% af embryoner som uinjicerede kontrol for at sikre, at ikke-injicerede embryoner udvikle sig normalt og bruge som kontrol vildtype for than molekylære assays beskrevet nedenfor.
5. Indlæg Injection Care
- Inkuber embryoner i petriskåle ved 18 ° C efter injektion indtil klækning 10. Efter udrugning, bageste larver i akvarier som beskrevet 10.
- Forsigtigt hæld den hundestejle vandet en dag efter injektion og erstatte med frisk hundestejle vand. Erstat med frisk hundestejle vand mindst hver anden dag efter det.
- Check for døde eller misdannede fostre dagligt. Fjern sådanne embryoner for at forhindre forfald i at forurene vandet.
6. Analyse af Injection Resultater
- For injektion af fluorescerende reportere, overvåge embryoner dagligt i et mørkelagt rum ved hjælp af en fluorescerende dissektionsmikroskop med et GFP eller RFP filter (afhængigt af fluorescerende transgen). Optag anatomiske mønstre af genekspression med digitale fotografier og / eller skriftlige beskrivelser og opstilling af antallet af fisk med forskellige expression domæner (figur 4 og 5).
Bemærk: Sticklebacks har autofluorescerende, stjerneformet pigment celler, der er synlige under GFP filtre begyndende ved 4 dage efter befrugtning (dpf).- For at generere stabile linjer, gem fostre med påviselig fluorescens og vokse til voksenalderen, som beskrevet 10.
- Udkrydsning injicerede voksne fisk til vildtype fisk ved hjælp af in vitro-befrugtning, der er beskrevet i afsnit 2.2 og skærm afkom til fluorescens som beskrevet i trin 6.1 til at lede efter fluorescerende afkom, hvilket indikerer vellykket transgen transmission.
- At visualisere fluorescens i udklækket, fritsvømmende larver, tilsættes 500 pi 0,8% tricaine til 150 mm petriskål at bedøve fisk og vente, indtil fisk stopper flytter til billedet. Skyl straks flere gange med frisk hundestejle vand efter observation og billeddannelse.
- Eventuelt at bevare fluorescens for yderligere billeddannelse, aflive larver i0,025% (250 mg / l) tricaine bufret med 0,1% natriumbicarbonat og løse i 4 timer i 4% paraformaldehyd i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) ved 4 ° C. Opbevar i 1 x PBS i op til to uger.
Bemærk: background auto-fluorescens stiger over tid.
- Diagnostisk PCR / fordøjelse Genotypning for Mutation induktion med CRISPRs eller Talens - bedst udføres på 2 dage Indlæg befrugtning.
- Brug en overførselspipette at placere 10 injicerede embryoner (2 dpf, stadig i chorions) i de første 10 brønde i en 12-brønds PCR strimmel rør. Placer ikke-injicerede kontrol fisk i de sidste to brønde.
- Fjern overskydende hundestejle vand.
- Der tilsættes 50 pi lysisbuffer (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,3% Tween-20 og 0,3% NP-40) til hver brønd.
- Placer hætter på rør og inkuberes ved 95 ° C i 20 minutter i en thermocycler.
Bemærk: blommen bliver hvide og gummiagtig efter kogning trin. - Fjern låg og bruge en anden cleen 1000 pi pipettespids at opblødes embryo i hvert rør.
Bemærk: Hvid snavs samles i bunden af glasset. - Tilføj 2,5 pi 10 mg / ml proteinase K til hver brønd.
- Erstat låg og inkuberes ved 55 ° C i 1 time til at fordøje protein, efterfulgt af 95 ° C i 20 min for at inaktivere proteinase K. Opbevares ved -20 ° C for at undgå skimmelvækst.
- Udfør PCR under anvendelse af en high-fidelity polymerase ifølge producentens anvisninger. Brug embryon-lysat som DNA-skabelon.
Bemærk: Pas at fjerne væske fra toppen af rør til DNA-template, undgå synlige chorion eller æggeblomme snavs i bunden af røret. - Bland PCR produktet i ens volumen med et restriktionsenzym mastermix indeholdende 1x enzym-specifik puffer og 0,25 pi enzym per prøve. Gem altid halvdelen af det anvendte uslebne PCR-produkt til analyse på en gel for at bekræfte PCR-produkter er den forudsagte størrelse. Inkubere PCR blandet med enzym på de rette betingelser forrestriktionsenzymet.
Bemærk: Nogle enzymer kan kræve andre forhold af enzym-buffer til PCR-produkt; justere bufferen koncentrationen, hvis de ikke-injicerede kontroller ikke viser fuldstændig fordøjelse. - Efter spaltning til at køre produkter på en 1% agarosegel ved siden af en DNA størrelse stige bekræfte forventede produkt størrelser.
Bemærk: Uncut bands i injicerede embryoner indikerer tilstedeværelsen af molekylære læsioner (figur 6) og ikke-injicerede kontroller skal være fuldt fordøjet til at fortolke resultater. - For at bekræfte læsioner, skåret ud uskårne bands fra agarosegeler og oprense DNA med en gelekstraktionskit. Brug Sanger-sekventering, ideelt under anvendelse af en sekventeringsprimer intern PCR-primerne, for at bekræfte læsioner. I F 0 injicerede embryoner, vil en blanding af læsioner sandsynligvis være til stede, hvilket kvaliteten af Sanger læste at nedbrydes nær målområdet.
- At producere en stabil linje, gemme alle injicerede embryoner fra koblinger, der screener positive for molekylære læsioner. Grække op fisk, udkrydsning, og derefter screene en delmængde af F 1 embryoner til molekylære læsioner som beskrevet i trin 6.2.1 gennem 6.2.11. Påvises heterozygote bærere, vokser de resterende F 1 embryoner til fuldvoksen og identificere heterozygote personer, der bruger DNA ekstraheret fra en halefinne klip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For reportergenassays transgener der har enhanceraktivitet, vil succesfuld injektion resultere i specifik, cellulær ekspression af transgenet (figur 4A, 4C). Injicerede fisk kan derefter udkrydsede at producere stabile linjer (Eksempel på en BAC stabil linie vist i figur 4B). Injektion DNA i hundestejle embryoner typisk resulterer i langt højere dødelighed end RNA alene. Det er typisk at se op til 50% (nogle gange endda mere) letalitet eller misdannelse (se figur 4D - F, 4I) efter injektion Tol2 reporter-konstruktioner (svarende til den tidligere beskrevne meganuklease fremgangsmåde 21). Imidlertid varierer resultaterne bredt baseret på den specifikke konstruktion, embryonet morfologi, og færdighedsniveau. For en aktiv enhancer, 40-50% af embryoner generelt viser vævsspecifik transgenekspression, fx i median og brystfinnerne (Figur 5). Graden af baggrund og uspecifik fluorescens (Figur 4G - I) varierer meget baseret på anvendte promotor; zebrafisk hsp70l promotoren tendens til at være utætte, navnlig i muskler og neuralt væv, og BAC'er tendens til at have høj baggrund ekspression i blommen (svarende til figur 4G). Den karper beta actin 41 promotor er mindre utæt, men driver også betydeligt svagere GFP udtryk. Transmission af Tol2 plasmid transgener kan være høj, med op til 100% af GFP + F 0 fisk fremstilling af transgene afkom (tabel 2). Imidlertid procent af afkom bærer transgenet varierer meget, fra <1% til 72% (tabel 2). Lagring kun GFP + injicerede embryoner generelt øger transmission effektivitet. BAC'er tendens til at have meget lavere transgenese satser, med kun op til 10% af F 0 injicerede hundestejle embryoner viser fluorescens i de forventede væv. den transmission på BAC'er er lavere end den for plasmidkonstruktioner, med kun op til 14% af den screenede hundestejle transmittere BAC (tabel 2), hvilket svarer til den rapporterede transmissionshastighed på 15% i zebrafisk 32.
I modsætning til den relativt lave effektivitet BAC transgenese, typisk 70-100% af screenede fisk injiceret med TALENS har mosaik læsioner (i n = 10 injicerede koblinger, der blev screenet for læsioner). Dette antal kan være lavere med en mindre effektiv Talen par, og kan variere med injektion kvalitet. Figur 6 viser en PCR / restriktion fordøjelse i 10 embryoner fra en enkelt kobling injiceres med Talens rettet mod en PvuII cut site inden Tfap2a. En uncut amplicon i hver af de injicerede embryoner (bane 1-10) angiver, at en del af cellerne i hvert embryo bære læsioner i mållocuset, skønt hver embryo er yderst mosaik med en signifikant vildtype-cut band. the amplikon fra ikke-injicerede embryoner i banerne 11-12 er fuldt fordøjet med Pvull. Talen-inducerede mutationer kan let overføres til den næste generation. Med to forskellige Talen sætter, 50% og 90% af screenede F 0 s transmitteret læsioner til afkom med 20-90% af afkommet bærer læsioner i positive koblinger (tabel 3). Mens CRISPR / Cas9 effektivitet ikke er blevet optimeret i hundestejle, med én CRISPR guide målretning Pitx2, en ud af tre injicerede embryoner havde læsioner baseret på Sanger sekventering af et PCR-produkt af CRISPR virksomheds (uncut bånd blev sekventeret efter restriktionsfordøjelse, figur 7). Tabet af sekvensen kvalitet til den forudsagte kløvningspunkt indikerer en blanding af molekylære læsioner er til stede. Fin klipning voksen F 0 fisk og screening for læsioner ved hjælp af en PCR og restriktionsspaltning assay fundet 10/22 fisk med somatiske læsioner i finnen. En repræsentativ delmængde af disse dyr er vist i figur 8 </ Strong>; individuel # 3 har en høj procentdel af DNA med læsioner, mens individuel # 2 har en lav procentdel af DNA med læsioner.
Figur 4. Eksempler på injicerede embryoner. (A) Mosaic embryo injiceret med en enhancer, der driver GFP-ekspression i brystfinner (stjerne) og median finner (pilespids) ved 5 dage efter befrugtning (dpf). Scale bar = 500 um. (B) Stabilt linje af en reporter BAC, der driver GFP-ekspression i embryonale hjerte ved 4 dpf. (C) Mosaic embryo injiceret med en Col2a1a enhancer, der driver mCherry ekspression i rygstrengen ved 4 dpf. Col2 A1A enhancer blev klonet fra hundestejle DNA med primerne 5'-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 'og 5'-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3', som forstærker den konserverede ortologe enhancer rapporteret i Dale og Topczewski2011 45. (D) Eksempel på en udvikler sig normalt injiceres embryo. (E - F) Eksempler på misdannede fostre med indsprøjtning traumer; E mangler det venstre øje og F har nekrotisk væv langs den højre side (pilespidser). (G) Eksempel på diffus GFP-ekspression i æggeblomme, er sandsynligvis et resultat af injektion i blommen snarere end blastomer. (H) Eksempel på uspecifik GFP-ekspression i epidermis (pilespids). (I) Lyst, ikke-specifik, kornet GFP udtryk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Effektivitet af reporter konstruktion injektion. Ti koblinger blev injiceret med en 190 bp hundestejle BMP6 forstærker constrdukt, der driver brystfinnen og median fin udtryk ved 5 dpf 20. Fra hver kobling blev mindst 20 embryoner bedømt for at have vævsspecifik (brystfinner og / eller median fin) og / eller ikke-specifik (alt andet væv) GFP-ekspression. Procentdelen af alle overlevende injicerede embryoner som har ikke-specifikke og vævsspecifik ekspression er vist som et boxplot. Vandrette linjer angiver den første kvartil, median og tredje kvartil; whiskers udvides til datum inden for 1,5 IQR (interkvartile område) af det første og tredje kvartil. Data er tilpasset fra Erickson et al. 2015. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. PCR og restriktionsspaltning at screene for Talen-inducerede læsioner. Et Talen par målrettet Tfap2a Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7. Sanger sekventering fra mosaik F 0 CRISPR / Cas9 injiceret embryo. En CRISPR guide RNA (5'-GTGGACCAACCTCACGG-3 ') mod Pitx2 (vist øverst) blev co-injiceret med Cas9 mRNA (transkriberet fra pCS2-nCas9n plasmid som beskrevet 38) og embryoner blev screenet for læsioner under anvendelse af et restriktionsenzym assay. Uncut bånd var gel ekstraheret og sekventeret ved Sanger-sekventering. Kvaliteten sekvens nedbrydes på det forudsagte spaltningsstedet (pil nedenfor) på grund af den mosaik mix af læsioner til stede i den injicerede embryo. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Analyse af CRISPR F 0 halefinne klip. DNA blev fremstillet fra fin klip fra F 0 unge rejst fra embryoner injiceret med CRISPRs mod Pitx2. CRISPR / Cas9 -målet blev amplificeret med primerne 5'-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 'og 5'-GGCCCAAATTACCCACATTT-3', og produktet blev fordøjet med EcoRI. Fire personer er vist; et uklippet PCR-produkt er til venstre og fordøjet PCR-produkt er til højre for hvert nummereret individ. Produkt af størrelsen af det anvendte uslebne bånd (~ 230 bp) i det fordøjede lane indikerer tilstedeværelsen af en læsion. Personer 2, 3 og 4 alle viser tegn på en molekylær læsion, angivet med asterisk, med varierende mosaicisme mellem individer. Relevante stigen størrelser er angivet på venstre. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Konstruere | GFP afkom / total F0 screenet fisk (%) | % F1 afkom positivt | note |
| BAC A | 6/46 (13%) | 4-19% | |
| BAC B | 1/41 (2%) | 4% | |
| BAC C | 5/42 (12%) | 3-40% | |
| BAC D | 3/22 (14%) | 5-15% | |
| plasmid A | 2/38 (5%) | 2-5% | alle F0 embryoner screenet, ikke bare GFP + |
| plasmid B | 3/16 (19%) | <1-8% | alle F0 embryoner screenet, ikke bare GFP + |
| plasmid C | 1/11 (9%) | 10% | |
| plasmid D | 2/11 (18%) | 1-45% | plasmid D injiceret i2 genetiske baggrunde |
| plasmid D | 5/5 (100%) | 16-72% | |
| plasmid E | 2/3 (67%) | 2-22% | |
| plasmid F | 2/6 (33%) | <1-65% | |
| plasmid G | 3/8 (38%) | 2-56% | |
| plasmid H | 3/18 (17%) | ikke scoret | |
| plasmid I | 5/24 (21%) | ikke scoret |
Tabel 2:. Transgene transmission effektivitet for AKB og forstærker konstruktioner F 0 injicerede embryoner blev hævet til voksenalderen og derefter udkrydsede til vildtype fisk og F 1 afkom scorede for GFP-fluorescens. Antallet af F 0 individer, der transmitteres transgenet er exprsmelteostpro- procent af alle screenede F 0 fisk. Rækken af procentdele af F 1 afkom, der bærer transgenet er også vist for de koblinger, der havde GFP positive fisk.
| Talen | % F0 transmitterer læsioner | % F1 afkom positivt |
| EN | 9/10 (90%) | 20-90% |
| B | 4/8 (50%) | 20-72% |
Tabel 3:. Transmission effektivitet for to Talen par F 0 injicerede embryoner blev hævet til voksenalderen og derefter udkrydsede til vildtype fisk og F 1 afkom screenet for Talen læsioner. Procentdelen af injicerede individer transmitterende læsioner er vist, samt udvalget af procentdele af afkom med læsioner i disse koblingerat overførte læsioner. Talen En målrettet en BMP6 forstærker 20, Talen B målrettet Tfap2a (upubliceret).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Injektion én-celle hundestejle embryoner til transgenese eller genom redigering præsenterer tre hovedudfordringer. Første, i forhold til zebrafisk embryoner hundestejle embryonale chorion er hård og vil ofte bryde nåle. Dette problem kan delvis overvindes ved anvendelse tykkere og stærkere glas mikropipetter og injektion vinkelret chorion (se protokol, figur 2). Sikring af, at så lidt vand som muligt sættes til embryonerne (lige nok til at forårsage chorion at svulme op og løfte væk fra cellen) hjælper til at reducere chorion hårdhed. Chorion hærder over tid, så arbejder hurtigt efter fugtning af embryoner er vigtig. Holde embryoner i et fugtigt kammer forud for injektion, så de ikke tørrer ud, er også kritisk. Nogle koblinger og endda enkelte embryoner simpelthen har meget tykkere og hårdere chorions; undertiden går videre til den næste embryo eller forsøger med en ny kobling er den nemmeste løsning. Det er meget lettere at springe en d ifficult embryo end at udskifte en beskadiget nål. Under backup nåle klar vil give injektioner for at fortsætte i tilfælde af nålen knækker. Ved injektion BAC'er, er det almindeligt, at nålen til at tilstoppe. Nålen kan unclogged ved forsigtigt at skrabe eller re-breaking spidsen med pincet eller ved at bruge den konstante luftvagten at rense træsko.
For det andet, at identificere den første celle i fosteret er udfordrende; det er ofte ganske fladtrykt og vanskeligt for begyndere at se, og er især usynlig, når man ser direkte på det. Ofte blastomer kan kun ses som en let hævet bump i profil. Derfor er det bedst at identificere cellen i profilen (figur 3B) og derefter forsigtigt rotere embryonet fremad og til siden, så cellen vil stå i slutningen af den vinklede nål (selvom cellen ofte vil være usynlige fra denne vinkel; den mørkere farve af blastomer i figur 3 er overdrevet for tydelighedens skyld).
e_content "> det tredje målretning cytoplasmaet er også vanskeligt, især hvis den første celle er især flad. Målet om den tykkeste del af blastomer (sædvanligvis midten) forbedrer chancen for injektion i cytoplasmaet. Mens injektion i blommen nær cytoplasmaet kan med held producere transgene fisk, effektiviteten synes at øges, og letalitet faldt når cytoplasmaet er målrettet med en enkelt nål punktering. Nogle gange vil de enkelte koblinger har særligt tynde blastomerer, således at er næsten umuligt at undgå blommen. Waiting længere end 25 min at begynde injektioner kan hjælpe (nogle koblinger ikke danner en fuld størrelse blastomer indtil ~ 45 minutter efter befrugtning), men hvis blastomererne aldrig stige i størrelse, er det ofte lettere at opnå en ny kobling af æg end at forsøge at injicere udfladede celler .Overdreven letalitet efter injektioner kan forekomme af flere årsager. Blunt nåle og / eller for stor en nål boring størrelse kan forårsage too meget skade på cellen og / eller forårsage cytoplasma at sive ud. Nogle DNA-konstruktioner synes at være særlig dødelig; sænkning af koncentrationen af DNA kan forbedre overlevelsen men lavere transgenese satser. Oprydning plasmider først med en midiprep kit, der indeholder et endotoksin skyl efterfulgt af en anden PCR cleanup kit reducerer konstruere toksicitet. Endelig kan genom redigering frembringe et tab af funktion mutation, der er dødelig for at udvikle embryoner. Reducere koncentrationen af CRISPR eller Talen mRNA'er kan øge mosaicisme af embryonet at forhindre dødelighed, men kan reducere mutante allel recovery effektivitet.
En tidligere offentliggjort protokol til at generere transgene hundestejler ved hjælp af en meganuklease metode 21 rapporterede en 4-7% transgen kønscelleoverførsel sats fra F 0 grundlægger fisk. Den Tol2 metode rapporteres her resulterede i op til et transgen kønscelleoverførsel sats 72% fra F 0 grundlægger fisk (hvilket indikerer flere genomisk inteioner). Den tidligere undersøgelse under anvendelse af en meganuklease metode rapporterede 40% af injicerede embryoer viser specifik GFP-ekspression, svarer til den rapporterede her. Således mens tilsvarende satser for transgene F 0 stiftere observeres i transgene fisk genereret af både meganukleasen og Tol2 metoder, den kønscelleoverførsel sats forekommer meget højere for Tol2 medierede transgene.
Som genom redigering teknologier fortsætte med at fremme, vil endnu mere specifikke genetiske manipulationer blevet muligt i hundestejle og andre fiskearter. For eksempel vil rettet reparations- 46 og homolog rekombination muliggøre kan anvendes allel swaps mellem marine og ferskvand hundestejle genomer, og modificerede CRISPRs til specifikt at aktivere eller inhibere genekspression 47. Disse spændende teknologier til genom redigering og analyse vil føre til nye indsigter om den genetiske basis for mange interessante morfologiske, fysiologiske og adfærdsmæssige fænotyper i sticklebacks og andre fiskearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret delvist af NIH R01 # DE021475 (CTM), en NIH Predoctoral Training Grant 5T32GM007127 (PAE), og en NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Vi takker Kevin Schwalbach til at udføre BAC recombineering og injektioner, Nick Donde til at generere CRISPR Sanger sekventering data, og Katherine Lipari til nyttige feedback på indsprøjtning protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | - | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm Petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 mm x 10 mm Petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50x Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10 Kb RNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10x PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1 kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
References
- Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
- Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
- Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
- Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
- Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
- Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
- McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
- Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
- Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
- Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
- Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
- Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
- Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
