Summary
Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur.
Abstract
threespine dikenli balık morfolojik, fizyolojik çeşitli genetik temelini incelemek için güçlü sistemi ve davranışsal fenotipleri olarak ortaya çıkmıştır. deniz ve tatlı su formlarını geçmeye yeteneği ile kombine deniz popülasyonları sayısız tatlı su ortamlarına adapte olarak geliştiğini oldukça farklı fenotipleri, genetik özellikleri gelişti kontrol edilmesi genomik bölgeleri eşleştirmek için kullanılabilecek nadir bir omurgalı sistem sağlar. Mükemmel genomik kaynakları gelişti değişikliklerin moleküler genetik diseksiyon kolaylaştırılması, artık mevcuttur. haritalama deneyleri ilginç aday genlerin listeleri oluşturmak iken, fonksiyonel genetik manipülasyonlar bu genlerin rolleri test etmek için gereklidir. Gen düzenlemesi Tol2 transposaz sistemi kullanılarak genomuna entegre transgenik raportör plazmid ve BACler ile incelenebilir. Belirli aday genler ve sis -regulatory elemanların fonksiyonları hedeflenen indükleyerek değerlendirilebilirTALEN ve CRISPR / Cas9 genom düzenleme reaktifleri ile mutasyonları. Tüm yöntemler, döllenmiş tek hücre dikenli embriyolar nükleik asitleri ilave gerektirir, bir görev dikenli embriyo kalın koryon ve nispeten küçük ve ince blastomere ile zor oldu. Burada, dikenli embriyolar nükleik asitlerin mikroenjeksiyon için ayrıntılı bir protokol transgenik ve genom düzenleme gen ekspresyonu ve fonksiyon çalışma uygulamaları yanı sıra, transgenesis başarısını değerlendirme ve kararlı çizgiler kurtarmak için teknikler tarif edilmiştir.
Introduction
biyoçeşitlilik doğada evrimleşmiş fenotipik değişikliklerin genetik ve gelişimsel üsleri belirlemektir nasıl ortaya çıktığını anlamak biri temel bileşeni. Threespine dikenli balık, Gasterosteus aculeatus evrim genetik temeli çalışmak için mükemmel bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sticklebacks deniz balıkları kuzey yarımkürede etrafında sayısız tatlı su ortamları kolonize gibi dramatik morfolojik, fizyolojik sonuçlanan birçok adaptif evrimsel değişikliklere uğramıştır, ve var davranış değişiklikleri 1. Yirmi bir dikenli popülasyonlardan bireylerin genomları dizilenmiş ve birleştirilmiş ve yüksek yoğunluklu bir bağlantı harita daha düzeneğinin 2,3 geliştirmek için oluşturulduktan edilmiştir. Genetik haritalama deneyleri gelişti fenotipler, bazan 4 yatan genomik bölgeleri belirledik - 6 ve bazı durumlarda, belirli aday genlerin fonksiyonel rolleri 7,8 sınanmıştır. Morfolojik değişikliklerin altında yatan genomik bölgelerin bir dizi vaat aday genler ile tespit edilmiştir, ancak bu adaylar henüz işlevsel 9 test edilmemiştir - 12. Buna ek olarak, Sticklebacks populasyon genetiği / genomik 13,14, türleşme 15, davranış 1, endokrinoloji 16, ekotoksikoloji 17, immünoloji 18 ve Parazitoloji 19 çalışmaları için ortak modellerdir. Bu alanların her birinde gelecek çalışmalar Sticklebacks fonksiyonel genetik manipülasyonlar yapmak için yetenek yararlanacaktır. Kendi kodlama dizileri manipüle ek olarak, bir aday genin rol cis -regulatory dizileri inceleyerek ve fonksiyonel olarak arttırmak, azaltmak ya da aday genin ifadesinin elimine ile değerlendirilebilir. Sticklebacks Mikroenjeksiyon ve transgenezi yöntemleri iyi 7,8,20 oluşturulmuş ve ilk kullanılarak geliştirilmiştir bir meganuclease aracılıyöntem, 21, birinci Medaka 22'de tarif. Burada yer alan değiştirilmiş mikroenjeksiyon yöntemi hem Tol2 aracılı genetik dönüştürme için optimize edilmiş ve en son TALENS ve CRISPRs içeren genom düzenleme reaktifleri geliştirilmiştir.
Cis -regulatory elemanlara değişiklikler cis -regulatory değişiklikler mutasyonlar 23 kodlama olumsuz pleiotropik sonuçları önlemek gibi, morfolojik evrimi kritik olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, varsayılan sis -regulatory dizileri test ve karşılaştırma evrim çalışmalarında artan sayıda merkezi hedefi haline gelmiştir. Buna ek olarak, çoğu insan hastalık varyantları şiddetle sis -regulatory eleman fonksiyonu ve mantık incelemek için gerekli olan düzenleyici varyantları 24,25 ve model omurgalı sistemleridir. Çok sayıda dışarıdan kendi embriyolar aşılamak balık sis -Yönetmeliği incelemek için güçlü omurgalı sistemleri sunuyoruz. forei burada Tol2 transpozon sistemi,genomuna entegre edilecek gn DNA Tol2 transposase siteleri ve bağlayıcı ile çevrili, Tol2 transposase mRNA ile işbirliği enjekte başarıyla plazmid balık genomları 26 içine yapıları entegre etmek için yüksek verimlilik ile çalışır - 28. Tipik olarak, potansiyel bir güçlendirici, bir Tol2 omurgada bir (örneğin hsp70l 29 gibi), bazal promotör ve flüoresan raportör gen gibi EGFP gibi (gelişmiş yeşil floresan protein) ya da mCherry akım-yukan klonlandı transposaz mRNA 26 enjekte edilir. floresan muhabiri, ya enjekte edilen embriyoların veya stabil entegre transgenlerin ile yavrularda ifade Gözlem, farazi arttırıcı tarafından yönlendirilen gen ifadesinin zamanmekansal yönetmelik hakkında bilgi sağlar. Diğer deneylerde de, geçerliliği arttırıcı ilgi genlerinin dokuya özel aşırı ekspresyonu tahrik etmek için kullanılabilir.
Büyük sis -regulatory bölgelerin analizi, yüksek kalite geniş insert genomunabakteriyel yapay kromozom (BAC) ile ic kütüphaneleri hem deniz ve tatlı su Sticklebacks 30 inşa edilmiştir. Bu BAC'ler büyük (150-200 kb) bağlamında bir flüoresan raportör geninin genomik bölge 31, bir gen yerine recombineered edilebilir. BAC olan düzenleyici diziler tarafından belirlenen flüoresan raportör sonra uzaysal model olarak ifade edilir. Balık çalışmaları için, Tol2 siteleri genomik entegrasyon 32,33 kolaylaştırmak için BAC eklenebilir. Gelişiminin sonraki evrelerinde in situ hibridizasyon teknik açıdan zor olarak, BAC floresan okuyucu dikenli kemik morfogenetik protein 6 (Bmp6) 20 için gösterildiği gibi, gen ekspresyonu örüntüleri incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir bireyde, floresan ekspresyon modelleri, in situ hibridizasyon ile başarılı olamaz zaman üzerinde takip edilebilir. BAC'ler, aynı zamanda bir additiona eklemek için kullanılabilirbir genomik bölgenin L kopya ilgi konusu bir genin dozajı artırmak.
Gen fonksiyonunun çalışması için, genom düzenleme organizmaların 34 çeşitli genomik dizileri hedef alan değişiklikleri oluşturmak için kullanılabilecek bir patlayıcı genişleyen bir alandır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ilk olarak tam olarak tercih edilen bir genomik sekansa doğrudan bağlanan ve bir çift şerit 35,36 kırmak oluşturmak için tasarlanmış olabilir bitki patojenleri izole modüler, sekansa özel nükleazlar bulunmaktadır. Kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / CAS sistemleri ilk bakterilerde bulunan ve kılavuzun 37 tamamlayıcı bir hedef DNA dizisinin bir ara oluşturmak için bir kılavuz RNA ve Cas9 proteini kullanmak edildi. genellikle TALENS ve CRISPRs ile oluşturulan çift iplik kırılım onarımı sonraki hedef sekansın fonksiyonunu bozabilir küçük ekleme veya delesyon, geride bırakır35-37. Sticklebacks olarak, TALENS bir takviye 20 hedef gen ekspresyonunu bölmek için kullanılmaktadır ve TALENS ve CRISPRs iki başarılı dizileri (yayınlanmamış veriler) kodlayan mutasyonlar üretmişlerdir. Zebrabalıkları kullanılmak için CRISPRs üretimi için ayrıntılı bir protokol Sticklebacks 38 için CRISPRs geliştirmek için bir kılavuz olarak kullanılabilir.
Transjenik ve genom düzenleme deneyleri yeni döllenmiş tek hücre embriyoya nükleik asitlerin giriş gerektirir. erken gelişim transgen ya da genom-düzenleme aracı tanıştırarak, embriyo genetik manipüle kızı hücrelerin sayısı maksimize edilir. Enjekte embriyolar daha sonra görsel floresan için tarama ya da moleküler genom değişiklikleri için taranmaktadır. germline katkıda hücreler başarıyla hedef ise, transgen veya mutasyon enjeksiyon sonrası öldürücülüğü yüksek olsa bile, yavru bir alt kümesine geçebilir. mozaik balık outcrossed olabilir veyaintercrossed ve onların yavrularının mutant allel ya da ilgi kararlı biçimde entegre edilmiş transgen kurtarmak için gösterildi. Bu protokol, tek hücreli dikenli embriyolar transgenlerin ve genom düzenleme maddeleri eklemek ve başarılı genomik değişiklik izlenmesi için yöntemler tarif etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm balık çalışmaları California-Berkeley Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası R330) tarafından onaylandı.
1. Enjeksiyon için Nükleik Asit hazırlayın
- (Fisher 26 den uyarlanmıştır) Tol2 Plazmid Transgenesis.
- Linearize 37 ° C'de 1 saat boyunca birlikte verilen tampon maddesi içinde 10 ug transposaz plazmid (PCS-Tp), 10 U Notl ile 39 kesilir.
Not: Malzeme Aktarım Anlaşmaları Tol2 plazmidler elde etmek için gerekli olabilir. - Standart protokollere 40 göre sodyum asetat ile izoamil alkol ve etanol çökelti: kloroform: 24: fenol 1 karışımı kesilmiş bir 25 ile plazmid ayıklayın. 50 mL RNaz içermeyen su içinde yeniden süspanse plazmid.
Not: Fenol-kloroform bir başlık kullanılmalı ve atık düzgün kurumsal kurallarına göre atılmalıdır. - üreticinin talimatlarına göre bir Sp6 transkripsiyon reaksiyonu ayarlayın.
- Bir RNA ISOL kullanıntirme kiti üreticinin talimatlarına göre transkripsiyon reaksiyonu temizlemek için; 50 mL RNaz içermeyen su içinde RNA tekrar süspansiyon.
- RNA, 1 ul numuneyi çıkarın. 5 dakika boyunca 65 ° C'ye kadar ısı ikincil yapılar daha sonra hemen buzda denatüre etmek için. -80 ° C de transkripsiyon reaksiyonu geri kalan dondurun.
- tek şeritli bir RNA boyut standardı ile çalışan tampon 0.5x TAE bir% 1 agaroz jeli (Tris baz, asetik asit, Etilendiamintetraasetik asit) RNA kısım çalıştırın. İstenen ürün 2,200 bp; toplam RNA>% 5 kapsamlı bozulmasını gösteren bir karalama daha küçük 2200 bp (Şekil 1) görünürse atın.
- 260 nm'de bir spektrofotometre kullanarak, RNA yı ölçmek. -80 ° C'de (en az iki yıl için iyi) 350 ng / RNase içermeyen su ve mağaza 1 ul alikotları ul seyreltin.
- Klon Tol2 raportör plasmidi cis (Tol2 kiti 41 arasında pT2HE 8 veya plazmidleri kullanılarak örnek için)- Ilgi düzenleyici element. Kısaca, PCR, plazmid bulunan kısıtlama alanları içeren primerler ile ilgi konusu bir genomik DNA sekansını yükseltmek enzim (ler), vektör içine ekleme lige PCR ürünü ve vektör sindirmek ve yeterli E. halinde ortaya çıkan plazmid dönüşümü E. coli 40. üreticinin protokolüne uygun olarak bir endotoksin durulama içeren bir kit ile plazmid izole edin.
- üreticinin protokolüne göre bir PCR saflaştırma kiti Tol2 plazmid bir ikinci saflaştırma gerçekleştirmek. 30 mL RNaz içermeyen su içinde yıkayın.
Not: Bu aşama verimi düşük olabilir (giriş plazmid bazen altında 50%). - RNase içermeyen su içinde ~ 125 ng / ul plazmid seyreltilir.
- Linearize 37 ° C'de 1 saat boyunca birlikte verilen tampon maddesi içinde 10 ug transposaz plazmid (PCS-Tp), 10 U Notl ile 39 kesilir.
Şekil 1. transposase mRNA jel. Saf transkripsiyon reaksiyonu proKanal (1 ul) sola gösterilir, 65 ° C'ye kadar ısıtıldı, buz üzerinde soğutuldu ve 0.5x TAE 100 V'de kilobaz RNA merdiveni boyutları (KB) tampon maddesi ile bir% 1 agaroz jeli üzerinde çalıştırıldı . tam uzunlukta transposase mRNA ~ 2.2 kb parlak bir grup. Bozulmuş veya eksik mRNA küçük ama kabul edilebilir miktar 2.2 kb aşağıda görülmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- BAC Transgenesis (BAC Recombineering Teknikleri Suster 32,33 bakınız)
- E. BAC hazırlayın E. coli, üreticinin protokolüne uygun olarak BAC saflaştırma kiti kullanılarak. RNase içermeyen su içinde ~ 250 ng / ul standart sodyum asetat-etanol ekstre 40 ve tekrar süspansiyon DNA ile DNA'nın geri etanol çökeltme kullanın.
- bölüm 1.1 olarak transposase mRNA hazırlayın.
- Talens ile Mutasyon İndüksiyon (Bkz Cermak
- Ilgi 42 gen Talens tasarımı, web tabanlı bir uygulama kullanın. Mümkünse, tasarım TALENS moleküler analizi kolaylaştırmak için, bir kısıtlayıcı enzim bir kesme yerine bozabilir.
- Transkripsiyon için klon TALENS hazırlamak plazmidler protokol 35 yandaki.
- üreticinin talimatlarına göre bir Sp6 transkripsiyon reaksiyonu ile TALEN mRNA uyarlamak ve Bölüm 1.1.4'de transpozaz için tarif edildiği gibi mRNA temizlemek. Bir spektrofotometre ile sayısal olarak ve RNaz içermeyen su içinde 200 ng / | il seyreltin. bu doğru boyutu ve adım 1.1.6 de açıklandığı gibi bozulmuş değil emin olmak için bir jel üzerinde TALEN mRNA çalıştırın.
- Bir Primer tasarımı aracı ve hedef DNA dizisini 43 kullanılarak TALEN hedef sekansı çevresindeki yaklaşık 100-200 bp amplifiye etmek için PCR primerleri çifti tasarımı. Adım 1.3.1 dayalı hedef bölgede lezyonlar test etmek için uygun kısıtlama enzimi sipariş edin.
- Tasarım ve hazırlamak CRISPRs ve Cas9 mRNA protokolüne 38 göre ve sipariş uygun doğrulama primerleri ve sınırlama enzimleri olarak adım 1.3.4'e.
Enjeksiyon Reaktifler hazırlayın 2.
- Aşağıda tanımlanan olarak kullanın Borosilikat Kılcal iğneler Hazırlanır.
Not: Bu kılcal zebra balığı mikroenjeksiyon için kullanılan standart kılcal değildir ve sert dikenli koryon delinme için kritik olan bir daha kalın ve daha güçlü bir camdan yapılmıştır.- Her iğne çekerken nitril veya lateks eldiven giyin ve iğneler cilt veya cilt yağları temas etmesine izin vermeyin.
- Mikropipet çektirmenin en üreticinin yönergeleri izleyerek rampa testleri ile ampirik mikropipet çekerek parametreleri belirler. Örneğin, bir kutu filamanlı aşağıdaki parametreler engellemek edildiuygun olduğu mayınlı: (Isı = 515,, = Gecikme = 85, Basınç = 500 Hız = 60 60 çekin). Bu ayarlar, dik olarak yaklaşık 12 ~ 2 mm ° ve yaklaşık ~ 6 mm (Şekil 2) için 2 ° daralan sonra uzun uzantı incelen bir iğne üretir.
Not: Uygun parametreler çektirmenin ve filamanın göre değişir ve körü körüne kalıcı zor ve yerine pahalı çektirmenin en filament, tahrip edebilir rampa testleri ile ilk parametrelerin belirlenmesinde olmadan bir program kullanarak olacaktır. - üreticinin talimatlarına 2.1.2'de belirlenen ayarlarla borosilikat camdan en az 4 mikropipet iğne çekmek için izleyin.
- dikey keskin ucu aşağı bakacak şekilde kılcal depolama kavanozda saklayın iğneler.
- Enjekte önce, iğneler chill buz üzerinde kılcal depolama kavanoz yerleştirin. iğneler dolu bir kez buharlaşmasını önlemek için kavanoz nemli kağıt havlu bir parça ekleyin.
- Yumurta (Tümünü döllerOda sıcaklığında gerçekleştirilen adımlar)
- Yavaşça karın sıkma ve kloakanın yoluyla ve 35 x 10 mm 2 Petri kabı içine yumurta dışarı itmek için yön posterior anterior okşayarak tarafından gebe kadın dikenli balıkgil gelen şerit yumurta debriyaj. nem odası oluşturmak için Petri kabı bir tarafında (yumurta dokunmadan değil) üzerine kağıt havlu nemli bir parça eklemek. yumurta nemli kalmak böylece Petri kabı kapağı yerleştirin.
- % 0.1 sodyum bikarbonat ile tamponlanmış% 0.025 Tricaine-S erkek dikenli öldürülür.
- , Karın kesip açmak testis kaldırmak ve 250 ul Hank çözeltisi (Hank çözüm hazırlanması için tam protokol için Westerfield 44 bakınız) macerate.
- 50 ul sperm solüsyonu ile en fazla 100 yumurta döllemek ve yavaşça tüm yumurtalar döllenir sağlamak için pipet ile karıştırın. Kavrama> 100 yumurta, tüm embriyolar enjeksiyonu sırasında tek hücreli aşamada olmasını sağlamak için daha sonra yumurta yarısı döller. Yumurta döllenmemiş bırakılabilirOda sıcaklığında bir saat kadar için, ve sperm genel Hank çözeltisi içinde 4 ° C'de 1-7 gün süre ile sürer.
- kurumasını önlemek için döllenmeden sonra Petri kabı kapağı ile kaplı embriyolar tutun. ortaya ve (bu süre boyunca enjeksiyon malzemeleri hazırlamak) şişer ilk hücrenin 20-25 dakika bekleyin.
- dikenli su ile 150 mm x 15 mm Petri kabı doldurmak. (Dikenli su yapmak için, öncelikle Sonra ekleyin. 3.5 g yapay deniz suyu karışımı deiyonize su içinde çözülmüş% 10 sodyum bikarbonat hazırlamak ve 0.217 ml% 10 sodyum bikarbonat deiyonize su 1 L başına ve heyecan / tuz çözmek için şiddetle çalkalanır.)
- (Yumurta gübrelenmesi iken) enjeksiyon solüsyonu hazırlayın
- Buz üzerinde Tablo 1 ve mağazaya göre enjeksiyon çözeltisi hazırlayın.
Not: Bazı nükleik asitlerin konsantrasyonları nedeniyle dikenli blastomer artan hacmi zebrabalıkları için yayınlanan olanlardan artış olmuştur.
- Buz üzerinde Tablo 1 ve mağazaya göre enjeksiyon çözeltisi hazırlayın.
| reaktif | Tol2 enjeksiyonu | BAC enjeksiyon | TALEN enjeksiyonu | CRISPR enjeksiyon |
| Tol2 mRNA | 350 ng | 350 ng | - | - |
| DNA | 150-200 ng plazmid | 200-300 ng BAC | - | - |
| TALEN mRNA | - | - | 200 ng, her | - |
| CRISPR kılavuzu RNA | - | - | - | 200 ng |
| Cas9 mRNA | - | - | - | 400 ng |
| % 0.5 fenol kırmızısı inDulbecco PBS | 0.5 ul | 0.5 ul | 0.5 ul | 0.5 ul | RNAse ücretsiz su | 5 ul | 5 ul | 5 ul | 5 ul |
Tablo 1:. Enjeksiyon reaktifler Bütün karışımlar 5 ul bir toplam hacme hazırlanır ve buz üzerinde muhafaza edilmelidir.
- (; İğneler doldurmak için en az 10 dakika bekleyin On Ice) İğneler doldurun.
- iğneler kılcal depolama kavanoz dikey olarak asılmış ise iğne küt üst ucu üzerine 0.5 ul enjeksiyon solüsyonu pipetleme en az üç iğne dolgu. damla üstünde kalır ve tarafı aşağı damla ve kabarcıkları önlemek etmediğini dikkatli olun.
- kırmızı sıvı çoğunlukla iğne sivri ucuna süzüldükten sonra, iğnenin künt sonuna kadar başka bir 0.5 ul ekleyin ve süzülmesini bekleyin.
3. Mikroenjeksiyon için enjekte Rig ve İğne hazırlayın
Not: Bu adımlar cBir genellikle yumurta gübreleme sonra yapılabilir.
- Mikroskop için transillüminasyon ışık açın ve 15 cm sıva ile mikroskop ışık üssüne ~ 13 cm x 13 cm cam plaka yerleştirmek cam levha 7 üstündeki bıçağı gördüm. iğne tutucu doğru bakan girinti çıkıntılar ile enjeksiyon cihazının dik testere yönlendirmek.
- Hava kaynağı açın ve basınç regülatörü gelen ~ 200 kPa ayarlandığından emin olun.
- kontrol kutusu açın ve ayarları yapın. Set basınç ~ 150-175 kPa. 180 msn enjeksiyon süresini ayarlayın.
- Iğne tutucu gevşetin lastik sahibinin direnci hissedilir kadar tutucu içine doldurulmuş iğne takın ve sıkı parmağınızla kadar sıkın.
- yaklaşık 45 ° 'ye iğne açısını ayarlayın.
- uç görüş alanı merkezli böylece iğne ayarlamak için mikromanipülatör denetimlerini kullanın. ~ 40X büyütme yakınlaştırmak ve dokunmadan olmamalıdır iğne ucu, odaklanmakAşağıdaki cam.
- Yavaşça saatçilik forseps ile iyice kavrayarak iğne ucu bölünürler. İdeal olarak, dik kırmak değil, aksine bir ~ 60 ° açıyla. Yakın ucu (en fazla 2-3 forseps genişlikleri uzak ucundan, Şekil 2) ile kırın.
Şekil 2. Unbroken ve kırık mikroenjeksiyon iğneler. Üst iğne kırılmamış ve alt iğne ucu forseps (ok) ile kesildi. İğneler% 0.05 fenol kırmızı ihtiva eden bir çözelti ile doldurulur. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- İğne kırık olup olmadığını test etmek enjeksiyon ayak pedalına birkaç kez basın. Bir kaç musluklar sonra minik kırmızı damlacıklar t çıkıp başlamalıdıro biter. Değilse, biraz daha yüksek iğne kırma deneyin.
- İğne bir hava kabarcığı varsa, geri basınç birimi artırmak ve balonu atlatmanın hızla pedalına birkaç kez basın.
- Geri Basınç ayarlama:
- cam plaka üzerine dikenli su birkaç damla yerleştirmek için tek transfer pipet kullanın.
- Yavaşça suya iğne düşük.
- pembe bir sıvı soluk akımı (pozitif basınç gösteren) iğneden çıkana kadar geri basıncını arttırın.
Not: Yeterince geri basınç yoksa, iğne kılcal hareket ile sitoplazma hazırlayacaktır. Çok fazla karşı basınç var ise, enjeksiyon hacmi yanlışlıkla çok büyük olabilir. - mümkün olduğu kadar embriyo hazırlarken zarar olmayacak şekilde iğne geri çekme (aşağıya bakınız).
- sıvının sürekli güçlü akım iğne w çıkar, böylece Alternatif bir yüksek basınç ayarına geri basıncını ayarlamakTavuk su içinde kalmasını. Ardından, enjekte etmek ayak pedalına basılarak gereksiz olur; Bununla birlikte, enjeksiyon aşırı enjekte edilmesini önlemek için hızlı olmalıdır.
Not: İlk enjekte öğrenirken bu tekniği çalışmayın.
4. Mikroenjeksiyon
- döllenmeden sonra yaklaşık 25 dk, cam plaka debriyaj ve transfer 5-10 embriyolar kaldırmak için iki 10 ul pipet ipuçlarını kullanın.
- Yine yavaşça testere bıçağının ayrı girintiler içine embriyolar ayrı, pipet ipuçlarını kullanarak. Embriyoların delinme değil dikkatli kullanın.
- sonu ile bir transfer pipetlemeyin yani dikenli embriyolar içine uyacak kesti kullanarak, embriyoların karşılamak için yeterli dikenli su ekleyin 3-5 saniye sonra su kaplama küçük bir hacim bırakarak, pipetle aşırı su çıkarmak su bırakın her embriyo.
Çok fazla su chorions sertleşmesine ve iğne kırılmasına neden olur, ancak su küçük bir hacim ch kaldırmak gereklidir: Notuzakta hücre ve yumurta sarısı gelen orion (Şekil 3A - B). - uzak embriyo sağdaki ile başlayarak, cam levha kaydırın ve ilk embriyo görüş alanının yaklaşık% 25'ini dolduracak şekilde yakınlaştırmak.
- Görüş alanının içine iğne indirin, daha sonra yavaşça blastomer, yumurta sarısı (Şekil 3B) üstünde sitoplazmanın grenli, hafif sarı yükseltilmiş yumru tanımlamak için embriyo döndürmek ve daha sonra ki döndürmek için 10 ul pipet ucu kullanın (testere bıçağı, Şekil 3C çentik embriyo tutarken) blastomer iğnenin ucuna dik yer almaktadır.
Not: sarısı damlacıkları embriyo döndürüldüğünde hareket edebilir, bu yüzden blastomer konumu için bir referans çerçevesi olarak bunları kullanmayın. - sitoplazma içine iğne indirin ancak altta yatan sarısı kadar itmeyin. İğneyi bozulmaması için koryon delici zaman yavaş ve eşit bir basınç uygulayın. eğeriğne virajlı ciddi, geri ve biraz daha farklı bir konumda tekrar deneyin.
- Biraz dağınık kenarlı kırmızı bir bolus sitoplazmanın yaklaşık ~ 1/8 çap dolduracak şekilde enjekte ayak pedalına 3-4 kez basın (Şekil 3D bakınız).
- Sitoplazma (Şekil 3E) altındaki sarısı içine enjeksiyon belirten, yaygın başlar yoktur keskin kenarlı kırmızı bir hap elde kaçının.
- parlak pembemsi-kırmızı nokta çabuk dağılır ise, blastomer delinme daha iğneyi.
- Enjeksiyon bolus anında sarı dönerse, yine (Şekil 3F) hedef olmuştur blastomer sağlamak ve enjekte etmek embriyo döndürün.
Dikenli embriyoların Şekil 3. Görünüm öncesi ve enjeksiyondan sonra. Tüm embriyolar inci çizilir(C 've G hariç) mikroskop ile seyir e bakış açısı. (A) su eklemeden önce, döllenmiş embriyolar yumurta sarısı üst kısmına yakın bir kayan yağ damlacıkları ile tek bir görünüme sahiptir. Sarısından çıkıntı ve profilde görünür bir blastomer açığa, su, koryon şişer ekledikten sonra (B). Embriyo (C) dönüş için iğne koryon ve blastomere dik girer. (C ') sitoplazmada ucu koryon delinmiş bir iğne yanal görünüşüdür. Zamanla solmaya yaygın kenarları kırmızı bir nokta sitoplazma sonuçlarına (D) Enjeksiyon. Tanımlanmış kenarları kırmızı bir nokta sitoplazma sonuçlarını altında yatan sarısı içine (E) Enjeksiyon. Kırmızıdan sarıya pH kaynaklı renk kayması sitoplazma sonuçları karşısında sarısı içine (F) Enjeksiyon. (G) Yanalalt ideal bir enjeksiyon yerleri üzerinde x'ler ile enjeksiyon sonuçları, görünümü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- o iğne sopalarla eğer embriyo basılı tutun 10 ul pipet ucu kullanarak, iğneyi geri çekmek için mikromanipülatör denetimlerini kullanın.
- iğneyi geri çekilmeden sonra, iğne ile bir sonraki embriyo hizalamak için cam plakayı kaydırın.
- tüm embriyolar enjekte ettikten sonra, dikenli su dolu 150 mm petri transfer pipet ve yerde, sonra embriyoların su ekleyin toplamak için transfer pipetlemeyin kullanın.
- çok su birikmesini önlemek için bir kağıt havlu ile cam plakayı kurutun.
- Testere ve tekrar 4.10 ile 4.4 adımları üzerine taze embriyolar dağıtın.
- ~ Enjeksiyon yapılmamış kontrol grubu olarak embriyoların% 10 bu enjeksiyon yapılmamış embriyolar normal geliştirmek sağlamak ve t, vahşi tip kontrol olarak kullanmak için tutunO moleküler yöntemler aşağıda tarif edilmiştir.
5. Mesaj Enjeksiyon Bakımı
- 10 kuluçka kadar enjeksiyondan sonra 18 ° C'de Petri kutularına embriyolar inkübe edin. Kuluçka ardından, Akvaryumda arka larva 10 açıklandığı gibi.
- Yavaşça enjeksiyondan sonra dikenli su bir gün kapalı dökün ve taze dikenli su ile değiştirin. en azından taze dikenli su bundan sonra her gün değiştirin.
- günlük ölü veya hatalı embriyoların kontrol edin. su karışmasını çürümesini önlemekte sanıldığı kadar embriyolar çıkarın.
Enjeksiyon Sonuçlarının 6. Analizi
- floresan gazetecilere enjeksiyonu için, bir GFP veya RFP filtre (floresan transgen bağlı olarak) bir floresan mikroskop kullanarak karanlık bir odada günlük embriyoların izlemek. dijital fotoğraf ve / veya yazılı açıklamaları ve değişik Expres ile balık sayısının çizelge ile gen ifadesinin rekor anatomik modelleryon alanları (Şekiller 4 ve 5).
Not: Sticklebacks, 4 gün sonra döllenme (dpf) başlayan GFP filtreler altında görünür Stellat pigment hücreleri autofluorescent var.- Istikrarlı çizgiler oluşturmak saptanabilir floresan ile embriyolar kaydetmek ve 10 açıklandığı gibi yetişkinliğe büyümek için.
- Outcross başarılı transgen iletimi gösteren floresan yavrular aramak için adım 6.1'de açıklandığı gibi floresan bölüm 2.2 ve ekran yavrularda tarif edilen in vitro fertilizasyon prosedürü kullanarak vahşi tip balık yetişkin balık enjekte.
- yumurtadan, serbest yüzme larvaları floresan görselleştirmek için, balık uyuşturan ve balık durdurma görüntüye hareket beklemek 150 mm Petri kabı 500 ul% 0.8 Tricaine ekleyin. Hemen gözlem ve görüntüleme aşağıdaki taze dikenli su ile birkaç kez durulayın.
- İsteğe bağlı olarak, daha fazla görüntüleme için floresan korumak için, larvaları ötenazi% 0.025 (250 mg / L) Tricaine% 0.1 sodyum bikarbonat ile tamponlanmış ve 4 ° C 'de 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehid içinde 4 saat düzeltin. en fazla iki hafta içinde 1x PBS içinde depolayın.
Not: Zamanla arka plan otomatik floresan artar.
- Teşhis PCR / CRISPRs veya Talens ile Mutasyon İndükleme sindirim Genotiplendirme - En 2 gün Gönder Döllenme de Yapılan.
- 12 gözlü PCR şeridi borunun ilk 10 oyuklarına 10 enjekte embriyolar (hala chorions 2 dpf) yerleştirilmesi için bir transfer pipeti kullanarak. Son iki kuyu uninjected kontrol balık yerleştirin.
- Fazla dikenli suyu çıkarmak.
- Her bir oyuğa 50 ul liziz tamponu (10 mM Tris pH 8.3, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 0.3% Tween-20 ve% 0.3 NP-40) ekleyin.
- borular üzerinde yer kapaklar ve bir PCR içinde 20 dakika süreyle 95 ° C de inkübe edilir.
Not: sarısı kaynama aşamasından sonra beyaz ve lastik dönecek. - kapakları çıkarın ve farklı bir cle kullanmakBir 1,000 ul pipetlemeyin ucu her tüpte embriyo macerate için.
Not: Beyaz enkaz tüpün alt kısmında toplayacak. - Her bir oyuğa, 10 mg / ml proteinaz K 2.5 ul ekle.
- kapaklarını takın ve 20 dakika küf bilmek -20 ° C'de proteinaz K deposu inaktive etmek için 95 ° C, ardından protein sindirimi 1 saat, 55 ° C'de inkübe edin.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir hi-fi polimerazı kullanılarak PCR gerçekleştirin. DNA şablonu olarak embriyo lizat kullanın.
Not: DNA örneğinin için tüpün üst sıvıyı çıkarmak için dikkatli olun, tüpün alt kısmında herhangi bir görünür koryon veya sarısı enkaz kaçınarak. - 1x enzim spesifik tampon ve örnek başına 0.25 ul enzim ihtiva eden bir sınırlandırma enzimi ana karışımı eşit hacimde bir PCR ürünü karıştırın. Her zaman PCR ürünleri tahmin boyutu onaylamak için bir jel üzerinde tahlil kesilmemiş PCR ürününün yarısını kaydedin. PCR için uygun koşullar altında enzimle karıştırılır inkübesınır enzimi.
Not: bazı enzimler PCR ürününe enzim tamponu başka oranlar gerektirebilir; uninjected kontroller tam sindirim göstermek yoksa tampon konsantrasyonu ayarlayın. - Sindirme işlemini takiben, aşağıdaki bir DNA büyüklüğü merdiveni bir% 1 agaroz jel üzerinde yapılmıştır ürünleri beklenen ürün boyutlarını için.
Not: enjekte edilen embriyolar Uncut bantları (Şekil 6) moleküler lezyonların varlığına işaret ve uninjected kontroller tamamen sonuçları yorumlamak için sindirilir olmalıdır. - , Lezyonların onaylamak agaroz jellerden kesilmemiş bantları kesip bir jel ekstraksiyon kiti ile DNA arındırmak için. ideal lezyonlar onaylamak için, PCR primerleri iç bir dizi primer kullanılarak, Sanger sıralama kullanın. F 0 embriyolar enjekte olarak, lezyon bir karışımı muhtemel Sanger kalitesini neden mevcut olacaktır hedef siteye yakın aşağılamak için okuyun.
- istikrarlı bir çizgi üretmek için moleküler lezyonlar için pozitif ekran pençelerinden tüm enjekte embriyolar kaydedin. Gbalık, outcross kadar satır ve 6.2.11 adımda 6.2.1 tarif edildiği gibi daha sonra molekül lezyonlarda F 1 embriyo bir alt ekran. Heterozigot taşıyıcı tespit edilirse, geri kalan F yetişkinliğe ve bir kuyruk yüzgeci klipten çıkarılan DNA kullanılarak heterozigot bireyler belirlemek için 1 embriyolar büyür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Güçlendirici etkiye sahip raportör gen transgenlerin için, başarılı bir enjeksiyon transgeni (Şekil 4A, 4C) spesifik hücresel ifadesi ile sonuçlanır. Enjekte balıklar sonra kararlı çizgiler (Şekil 4B'de gösterilen bir BAC stabil hattı örneği) üretilmesi için çaprazlanırlar edilebilir. dikenli embriyolara DNA enjekte tipik olarak tek başına RNA çok daha yüksek öldürücülüğü sonuçlanır. Bu% 50'ye varan görmek tipiktir (bazen daha fazla) öldürücülüğü veya malformasyon (Şekil 4D bkz - K, 4I) Tol2 muhabiri enjekte sonra (benzer daha önce tarif meganuclease yöntemine 21) oluşturur. Ancak sonuçlar yaygın özel yapı, embriyo morfolojisi ve beceri düzeyine bağlı olarak değişir. Etkin bir arttırıcı için, embriyoların% 40-50, genellikle (ortalama ve göğüs yüzgeçleri, örneğin F doku spesifik transgen ekspresyonunu gösterirŞEKIL 5). Arka plan ve spesifik olmayan floresan derecesi (Şekil 4G - I) yaygın olarak kullanılan promotör göre değişir; Zebra balığı hsp70l organizatörü özellikle kas ve sinir dokusunda, sızdıran olma eğilimindedir ve BAC (Şekil 4G benzer) sarısında yüksek arka plan ifadeye sahip olma eğilimindedir. Sazan beta aktin 41 organizatörü az sızdıran ama aynı zamanda oldukça sönük GFP sürücüler. Tol2 plazmid transgenlerin İletim GFP + F 0 balık üreten transgenik yavruları (Tablo 2) kadar% 100, yüksek olabilir. Ancak, transgen taşıyan yavruların yüzdesi arasında <% 1% 72 (Tablo 2), büyük ölçüde değişmektedir. Sadece GFP + enjekte embriyolar kaydetme genellikle iletim verimliliğini artırır. BAC beklenen dokularda floresan gösteren F 0 enjekte dikenli embriyoların sadece% 10'a kadar olan, çok daha düşük transgenesis fiyat bilgisi eğilimindedir. transBAC'lerin görevin oranı zebrabalıkları 32% 15 bildirilen aktarım oranına benzerdir BAC (Tablo 2), iletme filtrelenmiş dikenli balıkgil olduğunda, en fazla% 14 olan, plasmid konstruktlarının daha düşüktür.
BAC transgenesis nispeten düşük verimlilik aksine, filtrelenmiş balık tipik olarak% 70-100 TALENS enjekte (n = 10 lezyonlar için taranmıştır debriyajlar enjekte) mozaik lezyonlar vardır. Bu sayı, daha az verimli bir TALEN çifti ile daha düşük olabilir, ve enjeksiyon kalitesi ile değişebilir. 6 Talens Tfap2a içinde Pvull bir kesme yerine hedefleme enjekte tek kavrama 10 embriyo için bir PCR / sınırlama sindirimi göstermektedir. enjekte edilen embriyolar (kulvarlar 1-10) her biri bir kesilmemiş amplikon Her embriyo önemli bir vahşi tip kesme bant yüksek mozaik da her embriyo hücrelerinin bir kısmı, hedef lokusun lezyon taşıyan gösterir. thşerit 11-12 enjeksiyon yapılmamış embriyolar E amplikon tam PvuII ile sindirilir. TALEN indüklenen mutasyon kolaylıkla nesil iletilir. İki farklı TALEN setleri ile,% 50 ve ekranlı F 0 s% 90 pozitif kavramalar (Tablo 3) lezyon taşıyan yavruların 20-90 ile%, yavrular lezyonlar iletti. CRISPR / Cas9 verimliliği bir CRISPR kılavuz lezyonlar CRISPR hedefin PCR ürününün Sanger dizileme dayalı olan üç enjekte edilen embriyoların üzerinden PITX2, bir hedefleme ile, dikenli balıkgil optimize edilmemiş olsa da (kesilmemiş bant kısıtlama sindirim, Şekil aşağıdaki sıralandı 7). tahmin kesim yerinde dizisi kalite kaybı moleküler lezyonların karışımı mevcut gösterir. PCR ve restriksiyon sindirimi tahlili kullanılarak lezyonlarda fin kırpma yetişkin F 0 balık ve tarama fin somatik lezyonlar 10/22 balık bulundu. Bu hayvanların temsili bir alt kümesi, Şekil 8'de gösterilmiştir </ Strong>; Bireysel 2. lezyonları olan DNA'nın düşük bir yüzde sahipken bireysel 3., lezyonları olan DNA yüksek oranda bulunmaktadır.
Şekil enjekte edilen embriyoların 4. örnekleri. 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) GFP pektoral (yıldız) ifadesini ve medyan yüzgeçleri (ok başı) süren bir arttırıcı enjekte (A) Mozaik embriyo. Ölçek çubuğu = 500 mikron. (B) 4 dpf'e embriyonik kalp GFP ekspresyonu sağlayan bir muhabir BAC Kararlı hattı. 4 dpf'e Notokordun içinde MCherry ifadesini sağlayan bir Col2a1a arttırıcı enjekte (C) Mozaik embriyo. Sütun2 a1a güçlendirici primerleri ile dikenli DNA'sından klonlanmıştır Dale ve Topczewski bildirilen korunmuş ortolog arttırıcı amplifiye 5'-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 've 5'-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3'2011 Bir normal enjekte gelişen embriyonun 45. (D) Örnek. (E - F) enjeksiyon travma ile hatalı biçimlendirilmiş embriyoların örnekleri; E sol göz eksik ve F sağ tarafında (ok başları) boyunca nekrotik doku vardır. Sarısında yaygın GFP, yumurta sarısı yerine blastomere içine enjeksiyon olası sonucunun (g), Örnek. Epidermis (ok başı) spesifik olmayan GFP tanımının (H) Örnek. (I) Parlak, non-spesifik granül GFP. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. raportör yapı enjeksiyon Verimlilik. On kavramalar 190 bp dikenli Bmp6 arttırıcı konstrüksiyonlar enjekte edildi20 dpf 5 de göğüs yüzgeci ve medyan fin ifadesini tahrik UCT. Her bir kavrama olmak üzere, en az 20 embriyo dokuya özgü (Göğüs ve / veya mali medyan olarak) ve / veya spesifik olmayan (diğer tüm dokular) GFP tanımı sahip olması açısından değerlendirildi. spesifik olmayan ve dokuya özel bir ifade olan tüm enjekte kalan embriyoların yüzdesi Boxplot olarak gösterilir. Yatay çizgiler ilk çeyreğini, medyan ve üçüncü çeyreğini gösterir; bıyıkları birinci ve üçüncü quartile 1.5 IQR (çeyrekler arası aralık) içinde verisine göre uzatmak. Veri Erickson ve ark., 2015 den uyarlanmıştır bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. PCR ve restriksiyon sindirimi TALEN kaynaklı lezyonlar için ekran. Tfap2a hedefleyen bir TALEN çifti Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Mozaik F 0 CRISPR gelen Şekil 7. Sanger sıralama / Cas9 embriyo enjekte etti. (Üst kısmında gösterilir) PITX2 karşı bir CRISPR kılavuz RNA (5'-GTGGACCAACCTCACGG-3 ') birlikte enjekte Cas9 (38 tarif edildiği gibi pCS2-nCas9n plazmid transkribe) mRNA ve embriyolar ile kısıtlayıcı enzim tahlili kullanılarak lezyonlar için taranmıştır oldu. Kesilmemiş bant, jel ile ekstre edilmiş ve Sanger dizileme ile dizilenmiştir. Dizi kalitesi nedeniyle enjekte embriyo mevcut lezyonların mozaik karışımı (aşağıda ok) tahmin bölünme yerinde alçaltır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8. CRI AnaliziSPR F 0 kuyruk yüzgeci görüntüleri. DNA F fin kliplerden PITX2 karşı CRISPRs ile enjekte edilen embriyoların kaldırdı 0 gençlere hazırlandı. CRISPR / Cas9 hedef primerleri 5'-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 've 5'-GGCCCAAATTACCCACATTT-3' ile büyütüldü ve ürün EcoRI ile sindirildi. Dört kişi gösterilir; Bir kesilmemiş PCR ürünü solda ve sindirilmiş PCR ürünü her numaralı birey için sağda. Ürün sindirilmiş şeritte kesilmemiş bant (~ 230 bp) boyutu bir lezyon varlığını gösterir. Bireyler 2, moleküler lezyon 3 ve 4 tüm belirtileri gösteriyor, bireyler arasındaki Mozaiklik değişen, yıldız işareti ile belirtilmiştir. İlgili merdiven boyutları sol belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| inşa etmek | GFP yavrular / toplam F0 (%) balık ekranlı | % F1 yavrular pozitif | Not |
| BAC A | 6/46 (% 13) | 4-19% | |
| BAC B | 1/41 (% 2) | % 4 | |
| BAC C | 5/42 (% 12) | 3-40% | |
| BAC D | 3/22 (% 14) | % 5-15 | |
| plazmid | 2/38 (% 5) | % 2-5 | Tüm F0 embriyolar ekranlı, sadece GFP + |
| plazmid B | 3/16 (% 19) | <% 1-8 | Tüm F0 embriyolar ekranlı, sadece GFP + |
| plazmid C | 1/11 (% 9) | % 10 | |
| plazmid D | 2/11 (% 18) | 1-45% | plazmid D enjekte2 Genetik arka |
| plazmid D | 5/5 (% 100) | 16-72% | |
| plazmid E | 2/3 (% 67) | 2-22% | |
| plazmid F | 2/6 (% 33) | <1-65% | |
| plazmid G | 3/8 (% 38) | 2-56% | |
| plazmid H | 3/18 (% 17) | gol değil | |
| plazmit | 5/24 (% 21) | gol değil |
Tablo 2:. BACS ve güçlendirici yapıları için Transgen iletim verimliliği F 0 enjekte embriyolar yetişkinliğe kaldırdı ve sonra GFP floresan için attı yabani tip balık ve F 1 yavrulara outcrossed bulundu. Transgen iletilen F 0 bireylerin sayısı İfade olduğunuTüm elenmiş F 0 balık yüzdesi olarak işlenmesinde. Transgeni taşıyan F 1 yavru yüzdeleri aralığı da GFP pozitif balık vardı o kavramaları için gösterilir.
| TALEN | % F0 verici lezyonlar | % F1 yavrular pozitif |
| bir | 9/10 (% 90) | % 20-90 |
| B | 4/8 (% 50) | 20-72% |
Tablo 3:. İki TALEN çifti için İletim verimlilikleri F 0 embriyolar yetişkinliğe kaldırdı ve daha sonra yabani tip balık ve TALEN lezyonlar için elenmiş F 1 yavrular çaprazlanırlar enjekte edilir. lezyonlar iletilmesi enjekte bireylerin yüzdesi, bu kavramalar lezyonlarıyla yavru yüzdeleri hem de aralık gösterilirBu iletilen lezyonlar. TALEN A Bmp6 arttırıcı 20 hedef, TALEN B (yayımlanmamış) Tfap2a hedef.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
transgenesis ya da genom düzenleme için enjekte tek hücreli dikenli embriyolar üç ana zorluklar getirmektedir. İlk olarak, Zebra balığı embriyolarının göre, dikenli embriyonik koryon sert ve sık sık iğne kıracak. Bu sorun kısmen kalın ve güçlü cam mikropipetler kullanarak ve koryon dik enjekte edilerek aşılabilir (Protokolü, bakınız Şekil 2). Mümkün olduğunca az su sağlanması embriyoların eklenir (yeterli koryon şişer ve uzak hücreden kaldırmak için neden) koryon sertliği azaltmaya yardımcı olur. koryon zamanla sertleşir, bu nedenle embriyo nemlendirme sonra hızla çalışan önemlidir. kurumasını böylece enjeksiyondan önce bir nem odası embriyolar tutulması da önemlidir. Bazı kavramalar ve hatta bireysel embriyolar sadece çok kalın ve sert chorions var; bazen bir sonraki embriyo geçmeden veya yeni bir kavrama ile çalışıyor en kolay çözümdür. Bir d atlamak için çok daha kolaydır Hasarlı bir iğne yerine daha ifficult embriyo. hazır yedekleme iğnelere sahip enjeksiyonlar iğne kırılması halinde devam sağlayacaktır. BAC'ler enjekte iğne tıkayabilir için, bu yaygındır. İğne veya yapışmasına neden temizlemek için sabit hava basıncı anahtarını kullanarak hafifçe kazıma veya forseps ile ucu yeniden kırarak unclogged edilebilir.
İkincisi, embriyo ilk hücre belirlenmesi zordur; genellikle oldukça basık ve zor başlayanlar görmek için, ve ona doğrudan bakıldığında özellikle görünmez. Genellikle blastomere sadece profilinde biraz yükseltilmiş yumru olarak görülebilir. Bu nedenle, (Şekil 3B) profilinde hücreyi tespit etmek en iyisidir ve daha sonra yavaşça ileri embriyo döndürmek ve hücre genellikle bu açıdan görünmez olacak ama yan böylece hücre (açılı iğnenin ucunu karşı karşıya gelecek; Şekil 3'te blastomer karanlık renk) netliği için abartılı.
e_content "> Üçüncü olarak, sitoplazma hedefleyen ilk hücre, özellikle düz, özellikle de zordur. sitoplazma yakın sarısı içine enjekte ederken blastomer (genellikle merkezi) şişman bölümü için hedefleyen. sitoplazmaya enjekte şansını artırır başarıyla transgenik balık üretebilir, verimlilik artışı gibi görünüyor ve öldürücü sitoplazma tek iğne ile hedeflenen zaman azalmıştır. Bazen bireysel debriyaj sarısı kaçınarak neredeyse imkansız olacak şekilde, özellikle ince blastomerlerdir sahip olacaktır. Bekleyen uzun 25 dakika daha enjeksiyonlar (bazı kavramalar tam boy blastomer ~ 45 dakika sonrası döllenme kadar oluşturmayan), ancak blastomer boyutu artırmak asla eğer yardımcı olabilir başlamak için, o basık hücreleri enjekte etmek için denemek için daha yumurta yeni bir debriyaj elde etmek çoğu zaman kolay .Aşırı öldürücü aşağıdaki enjeksiyonları çeşitli nedenlerle oluşabilir. Künt iğne ve / veya çok büyük bir iğne deliği boyutu neden olabilir too hücre ve / veya neden sitoplazmaya kadar zarar sızmasına. Bazı DNA yapıları, özellikle ölümcül görünmektedir; DNA konsantrasyonu düşürücü hayatta ama daha düşük transgenesis oranlarını artırabilir. ikinci bir PCR temizleme kiti tarafından izlenen bir endotoksin durulama içeren bir midiprep kiti ile ilk plazmidler temizleniyor toksisitesini inşa azaltır. Son olarak, genom düzenleme embriyolar geliştirmek için öldürücü olan fonksiyon mutasyon kaybı üretebilir. CRISPR veya TALEN mRNA konsantrasyonunun azaltılması ölümleri önlediği embriyonun Mozaiklik artırabilir, ancak mutant alel kurtarma etkinliğini azaltabilir.
Bir meganuclease yöntemi 21 kullanılarak transgenik Sticklebacks üretmek için bir protokol daha önce yayınlanmış F 0 kurucu balık bir% 4-7 transgen germ iletim hızını bildirdi. Burada bildirilen Tol2 yöntemi F 0 kurucu balık% 72 transgen germ iletim hızı kadar (birden genomik bütünleşik belirten sonuçlandıiyonlar). Bir meganuclease yöntemi kullanarak önceki çalışma burada bildirilen benzer özel GFP ifade gösteren enjekte edilen embriyoların% 40 bildirmişlerdir. Transgenik F 0 kurucularından benzer oranlar meganuclease ve Tol2 yöntemlerle hem tarafından oluşturulan transgenik balık gözlenir Böylece, germ iletim hızı Tol2 aracılı transgenik için çok daha yüksek görünmektedir.
genom düzenleme teknolojileri ilerlemeye devam ettikçe, daha da spesifik genetik manipülasyonlar dikenli balıkgil ve diğer balık türlerinin mümkün hale gelecektir. Örneğin, yönetmenliğini onarım 46 ve homolog rekombinasyon deniz ve tatlı su dikenli genomları ve modifiye CRISPRs arasında alel swapları özellikle kullanılan etkinleştirmek veya gen ifadesini 47 inhibe olabilir sağlayacaktır. genom düzenleme ve analiz için bu heyecan verici teknolojiler birçok ilginç morfolojik, fizyolojik genetik temeli konusunda yeni anlayışlar ve STIC davranışsal fenotipleri yol açacaktırklebacks ve diğer balık türleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH R01 # DE021475 (CTM), NIH predoctoral Eğitim Hibe 5T32GM007127 (PAE), ve bir NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu (NAE) tarafından kısmen finanse edildi. Biz enjeksiyon protokolüne yararlı geribildirim için CRISPR Sanger sıralama verilerinin üretilmesi için BAC Recombineering ve enjeksiyonlar, Nick Donde gerçekleştirmek için Kevin Schwalbach teşekkür ve Katherine Lipari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | - | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm Petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 mm x 10 mm Petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50x Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10 Kb RNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10x PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1 kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
References
- Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
- Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
- Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
- Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
- Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
- Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
- McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
- Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
- Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
- Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
- Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
- Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
- Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
