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Biology

La disección y-montaje plana del esqueleto branquial de tres espinas Stickleback

Published: May 7, 2016 doi: 10.3791/54056
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

Introduction

Una cantidad increíble de la diversidad existente en el esqueleto de la cabeza entre los vertebrados, en especial entre los peces. En muchos casos esta diversidad facilita diferentes estrategias de alimentación 1-4, y puede implicar cambios importantes en tanto patrón craneofacial externa e interna. El esqueleto branquial está situado internamente en la garganta de un pez y rodea la mayor parte de la cavidad bucal. El esqueleto branquial se compone de 5 segmentos serie homóloga, la parte anterior de cuatro de los cuales apoyan las branquias. En conjunto, estos cinco segmentos funcionan como una interfaz entre el pescado y sus alimentos 5. La variación en una multitud de rasgos incluyendo branquiespinas, dientes faríngeos, y los huesos branquiales contribuyen a forrajeo eficiente en diferentes tipos de alimentos.

Espinosos han sido sometidos a una radiación adaptativa después de formas ancestrales oceánicas colonizados lagos de agua dulce y arroyos en todo el hemisferio norte. El cambio en la dietadel zooplancton pequeño en el océano para una presa más grande en el agua dulce se ha traducido en la variación trófica dramático en varios rasgos craneofaciales 6. Mientras que muchos estudios se han centrado en las diferencias craneofaciales externos en los espinosos 7 - 13, los cambios craneofaciales importantes evolucionan en repetidas ocasiones en el esqueleto branquial interno. La capacidad de crear híbridos fértiles entre poblaciones de espinosos morfológicamente distintos proporciona una excelente oportunidad para mapear la base genética de los cambios evolucionado hasta el esqueleto branquial.

Un rasgo trófica de importancia ecológica es el patrón de hendiduras branquiales, los huesos dérmicos periódicas que recubren las caras anterior y posterior de los huesos branquiales y se utilizan para filtrar los elementos de presa. Los peces que normalmente se alimentan de pequeñas presas tienden a tener más largo y más densamente espaciados Gill RäKERS en comparación con los peces que se alimentan de presas más grandes 14,15. La variación en branquiespinas ha informado tanto wentro de las especies y entre 14-19, y los aspectos de enmalle de profundidad de corte de patrones contribuyen a nichos tróficos y gimnasio 16. Décadas de investigación han documentado ampliamente el número de enmalle de profundidad de corte y la variación de la longitud de los peces espinosos de tres espinas 17 - 21; Sin embargo, estos estudios suelen centrarse en la primera fila de hendiduras branquiales. Trabajos recientes han demostrado la modularidad en el control genético del número de enmalle de profundidad de corte a través del esqueleto branquial 22,23 ya través de una sola fila en la profundidad de corte de enmalle espaciamiento 23 y 24 de longitud que destaca la importancia de estudiar más de la fila uno o un solo diente de ataque de enmalle para entender la base genética del desarrollo de la reducción de enmalle de profundidad de corte.

Un segundo rasgo trófica de tanto significado ecológico y biomédica es el patrón de los dientes faríngeos. Los dientes en los peces pueden estar situados tanto en la mandíbula oral y en el esqueleto branquial, conocido como dientes faríngeos. dientes orales se utilizan principalmente para pRey capturar mientras que los dientes faríngeos se utilizan para la masticación y la presa de manipulación 25 - 27. Ambos conjuntos se forman a través de los mecanismos de desarrollo compartidos y se consideran homólogas de desarrollo 28. Modularidad interesante se produce mediante el cual algunas especies, como el pez cebra, la falta de dientes de la faringe oral y dorsal 29, mientras que otras especies tienen múltiples ceratobranchials dentadas, pharyngobranchials y, a veces dentadas basihyal y hypobranchials 30. En los espinosos, dientes faríngeos se encuentran ventralmente en la quinta ceratobranquial y dorsalmente en la parte anterior y posterior pharyngobranchials 31. Cinemática sobre la alimentación del pez espinoso muestran la mandíbula oral se utiliza principalmente para la captura de presas y facilitar la alimentación de aspiración 9 dejando la masticación de la mandíbula faríngea. En cíclidos, menor morfología de la mandíbula faríngea varía dramáticamente 32,33 y se ha demostrado que ser adaptable y se correlacionó con nicho trófico 34. Multipoblaciones de espinosos de agua dulce ples han evolucionado aumentos espectaculares en la faringe ventral número de dientes 23,35,36. Trabajos recientes han demostrado que la base genética del desarrollo de esta ganancia diente evolucionado en gran medida es distinta en dos poblaciones derivadas independientemente de espinosos de agua dulce 36. A diferencia de los dientes de mamíferos, peces regeneran sus dientes de forma continua durante la vida adulta 37. Ambas poblaciones de agua dulce dentadas altas anteriormente descritos han evolucionado una tasa de reemplazo de dientes acelerado, proporcionando un sistema de vertebrados rara para estudiar la base genética de regeneración 36.

Un tercer rasgo trófico que se ha desarrollado en varias ocasiones en los espinosos de agua dulce es más largo y huesos epibranchial ceratobranquiales, los homólogos de arco rebajado branquiales de la mandíbula superior e inferior, respectivamente 38. Más largos huesos branquiales confieren una cavidad bucal grande y probablemente son adaptativos para permitir que las presas más grandes para ser Consumed. Por otra parte, en otro pescado, huesos epibranchial son importantes para la depresión de las placas de dientes faríngeos dorsal 25. Al igual que branquiespinas y dientes faríngeos, los huesos branquiales son internos y, por tanto, difíciles de visualizar con facilidad o cuantificar.

Aquí se presenta un protocolo detallado para diseccionar y de montaje en el esqueleto branquial plana, lo que permite una fácil visualización y cuantificación de una variedad de importantes rasgos craneofaciales. Si bien este protocolo describe una disección stickleback, este mismo método funciona en una variedad de otros peces.

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Protocol

Todo el trabajo de los peces fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California en Berkeley (número de protocolo R330). La eutanasia se realizó mediante inmersión en 0,025% tricaína-S tamponada con bicarbonato de sodio 0,1% 39. Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente.

1. Preparación

Nota: Realice los pasos 1.1-1.5 en tubos cónicos o viales de centelleo que puede sellar herméticamente y mantenerse en posición horizontal. Los peces no deben ser agitadas constantemente, pero tratan de mezclar la solución tan a menudo como sea posible invirtiendo suavemente o se agita el bastidor de tubos o viales para exponer todos los lados de los peces a la solución de tinción y permitir que la mancha penetre en el tejido de manera uniforme. No coloque un gran lote de pescado en un agitador de plataforma, como el peso pesado del líquido romperá el agitador.

  1. Fijar bien el pescado recién sacrificados o pescado almacenado en etanol con 10% de formalina tamponada neutra (NBF) durante la noche. Como alternativa, utilice el 4% paraformaldehído en solución 1x PBS en lugar de 10% NBF.
    Nota: Si la extracción de ADN, clip de una pequeña porción de las aletas caudales o pectorales antes de la fijación y almacenar en etanol.
  2. Disponer de corrección adecuadamente en una campana química y reemplazar con agua del grifo (es decir ~ pH 7,0) durante 2 horas. Evitar el uso de agua desionizada, ya que a menudo puede ser ácida y puede descalcificar el hueso.
  3. Eliminar el agua y los peces mancha con 0,008% rojo de alizarina S en el 1% de KOH en agua durante 24 horas. Para los peces de menos de 20 mm de longitud estándar, utilice 0,004% rojo de alizarina S. (Haga una solución de reserva de 100x (0,8%) de rojo de alizarina S que a continuación se puede diluir).
  4. Retirar la mancha (poner en un recipiente apropiado para desechos en la campana) y el lugar de peces en el agua del grifo para unos pocos horas. Cambiar el agua según sea necesario hasta que el agua de enjuague es mayormente despejado.
  5. Eliminar el agua y el pescado en lugar de 50% de glicerol, 0,25% de KOH para la limpieza suave y posterior disección.
    Nota: Este protocolo de tinción es una modificación de los métodos descritos anteriormente 40,41.

Nota: Véase la Figura 1 para una revisión de la morfología del esqueleto cabeza relevante.

Figura 1
Figura 1:. Stickleback cabeza de la morfología del esqueleto rojo de alizarina manchada cabeza espinoso de tres espinas fotografiado con fluorescencia bajo un conjunto de filtro de rodamina B. la morfología de utilidad tiene la etiqueta: OP = opérculo, SubOp = subopérculo, BSR = branquiostegales rayos, Preop = preopérculo, Infraorb 1-3 = 1-3 infraorbitarios (también llamados circumorbitals o suborbitales), Dent = dentario, Premax = premaxilar, maxilar = Max , NAS = nasal, Lat. ETHM = etmoidal lateral, PSPH = parasphenoid, Fron = hueso frontal. Para una descripción más detallada del esqueleto de la cabeza del espinoso, véase Anker (1974) 31. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.

  1. Coloque el pescado plano (Figura 2A) e insertar una pinza afilada # 5 de relojero en el lado del ojo en un ángulo de 45 ° ~ para perforar la membrana que cubre el ojo.
  2. Pelar la membrana lejos del ojo, similar a la descamación una tapa yogur (Figura 2B).
  3. Inserte fórceps abierto detrás del ojo, agarrar el nervio óptico detrás del ojo, y quitar el ojo (Figura 2C). No perforar el ojo, ya que se fuga de melanina. En caso de pinchazo, la melanina se puede lavar durante las etapas posteriores.
  4. Repita del otro lado.
  5. A partir de la parte posterior, coloque una pequeña cuchilla de disección tijera debajo de la solapa opérculo, la cuchilla de arrastre de tijera dorsal por encima de opérculo, luego se corta el tejido blando a través de la cuenca del ojo (Figura 2D). Cortar dorsal de la médula opérculo.
  6. Cortar el hueso frontal (dorsal a la cuenca del ojo) (Figura 2E).
  7. Cortar el hueso alrededor de la línea media parasphenoid tque el centro de las cuencas de los ojos (Figura 2F).
  8. corte opérculo Repita en el lado opuesto.
  9. Inserte fórceps bajo el opérculo y lentamente la cáscara de la cara lejos del cuerpo, el recorte de cualquier tejido blando todavía unido (Figura 2 G - H). Tenga cuidado de no perturbar la primera fila de hendiduras branquiales.
    1. Con unas pinzas, separar los ceratohyals en ambos lados de la basihyal línea media, mientras que pelar y retirar el esqueleto craneofacial anterior (toda la mandíbula incluyendo el dentario, premaxilar y maxilar; todo el esqueleto hioides incluyendo el opérculo dérmica exterior, preopérculo, subopérculo, y branquiostegales rayos y los dorsales y elementos que subyace endochondral ventral, y la parte anterior del cráneo, incluidos el nasal, etmoidal lateral, y los huesos infraorbitarios, véanse las figuras 1 y 2I).
    2. espinas pélvicas se pueden plegar hacia fuera del cuerpo, y pueden servir como un asa para unas pinzas para agarrar of cuando está presente. Espinas encajen en su sitio. Para desbloquear, tirar suavemente de la columna vertebral con una pinza en dirección opuesta a cuerpo de los peces, y doblar suavemente en sentido posterior para presionar contra la columna vertebral plana peces.
  10. Insertar cerrado fórceps posterior y ventral al esqueleto branquial (justo debajo de tubo intestinal) y las pinzas de arrastre en sentido anterior, las burlas aparte los músculos y ligamentos que quedan unidos al esqueleto branquial (Figura 2J - K).
  11. Usando la punta de unas pinzas cerradas, raspar los músculos que sujetan el dorsal esqueleto branquial a la caja craneana ventral en una posterior a la dirección anterior (Figura 2 l).
  12. Repetir 2,9 y 2,10 en el lado opuesto.
  13. Agarre la base del tubo intestinal y tire hacia delante para eliminar el esqueleto y el intestino branquial tubo (Figura 2 M - N).
  14. Separar el tubo intestinal haciendo una posterior corte perpendicular al final de la quinta ceratobranquial (Figura 2O
  15. Después de eliminar cualquier fragmento de hueso restante de la caja craneal en el lado dorsal del esqueleto branquial, insertar tijeras en la canasta branquial para hacer un corte dorsal (corte de anterior a posterior) entre los conjuntos bilaterales de placas de dientes dorsal (Figura 3A - D). corte se centra garantizar para evitar dañar las placas de los dientes dorsal.
  16. Haga dos cortes laterales poco profundas en la luz del intestino de caucho en el extremo posterior del esqueleto branquial (extremo anterior del tubo intestinal) para ayudar en la apertura de la esqueleto branquial (Figura 3E).
  17. Coloque el pescado y todas las piezas de tejido en un frasco y colocar el esqueleto branquial en un tubo de microcentrífuga con 50% de glicerol, 0,25% de KOH para continuar limpieza suave, o el 100% de glicerol, si se requiere ninguna otra compensación. frascos y tubos de etiquetas con un identificador único para que puedan ser rastreados. La cantidad de aclaramiento requerido es en gran parte una función del tamaño de los peces, peces grandes adulto (mayor de 40 mm de longitud estándar) requieren normalmente de compensación adicional.

Figura 2
Figura 2:. Stickleback disección esqueleto branquial manchado rojo de alizarina pez espinoso de tres espinas listo para la disección. El ojo está despigmentada de amplio legrado. Las flechas azules indican la dirección del movimiento. (A) Vista lateral de la cabeza del espinoso, es anterior a la derecha. (B) La eliminación de la membrana que cubre el ojo. (C) La eliminación del ojo. (D) Dorsal cortado por encima del opérculo. Corte del hueso (E) frontal. (F) Parasphenoid cortar. (G - I) La eliminación del esqueleto facial. (J) La eliminación de las conexiones de los tejidos blandos esqueleto branquial ventrales. (K - L) La eliminación de las conexiones esqueleto branquial dorsales. (<strong> M - N) La eliminación del esqueleto branquial. (O) Separar el tubo intestinal del esqueleto branquial. Consulte los pasos 2.1 a 2.16 para obtener más detalles. Barra de escala = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. branquial Esqueleto Re-tinción (si es necesario)

  1. Para teñir el más oscuro esqueleto branquial o tejido claro más, retire 50% de glicerol, solución de KOH 0,25% y se lava con 1% KOH dos veces (un lavado de 5 minutos seguido de un segundo lavado 24 hr mientras se agita horizontalmente en un agitador de plataforma).
  2. Retire 1% KOH y re-mancha con 0.008% rojo de alizarina S en 1% de KOH durante 24 h.
  3. Retire las manchas y reemplazar con 1% de KOH durante 24 horas.
  4. Retire la solución de KOH y reemplazar con 50% de glicerol, 0,25% de KOH.

4. Montaje branquial Esqueleto

  1. Retire esqueleto branquialde 50% de glicerol, 0,25% de KOH o 100% de glicerol y el lugar cerca de la parte inferior de un 22 mm x 60 mm cubreobjetos de vidrio con el lado dorsal hacia arriba (Figura 3F). Añadir unas gotas de glicerina al 50%, 0,25% KOH o 100% de glicerol en la parte superior del esqueleto branquial. Si la transición de 50% de glicerol, 0,25% de KOH al 100% de glicerol, solución de cambio en un tubo de microcentrífuga y agitar durante> 5 min antes de montar para equilibrar los tejidos.
  2. Estirar dos pequeñas bolas de arcilla de modelar y colocar en cada extremo de la hoja de la cubierta para actuar como espaciadores.
  3. Sin apretar colocar un segundo cubreobjetos en la parte superior con la presión suficiente para aplanar el esqueleto branquial anterior (Figura 3G).
  4. Abra retirando la tapa dorsal izquierda que incluye placas de dientes dorsales, aplanar, y se deslizan entre los cubreobjetos (Figura 3H).
  5. Repita técnica con la aleta dorsal derecha y empujar toda esqueleto branquial de distancia desde el borde del cubreobjetos (Figura 3I).
    1. Alterarde forma nativa, mantenga ambas aletas dorsales abiertas con unas pinzas y colocar con cuidado el cubreobjetos sobre, aplanando el esqueleto branquial con un movimiento suave.
    2. Como alternativa, montar el esqueleto branquial al revés sobre una hoja de la cubierta, extendiendo cada lado dorsal lateralmente para que la gravedad no permite que el esqueleto branquial para cerrar una copia de seguridad. A continuación, cubrir con la segunda x 60 mm cubreobjetos de vidrio de 22 mm e invierta preparación.
      Nota: Las diferentes técnicas de montaje tienden a funcionar mejor o peor para cada individuo. Pruebe cada uno y ver lo que se siente más cómodo.
  6. Presione ligeramente en la parte superior cubreobjetos para aplanar las bolas de arcilla suficientes para mantener el esqueleto branquial montado plana, pero tenga cuidado de no aplastar el espécimen.
    1. Durante el proceso de montaje, ceratobranchials pueden rotar y oscurecer una fila de rastrillos. Remediar esto mediante una pinza entre el cubreobjetos y reorientando los ceratobranchials o de todo el esqueleto branquial deslizante.
  7. Tienda prepara plana en bandejas deslizantes en rotemperatura om. Montado en el 100% de glicerol, preparaciones se pueden almacenar entre cubreobjetos puenteados durante al menos una década. pinzas limpias y tijeras con isopropanol o etanol y consejos de cubierta.

figura 3
Se muestra de montaje plana del esqueleto branquial manipulación y el montaje del esqueleto branquial: Figura 3.. Las flechas azules indican la dirección del movimiento. (A) branquial dorsal esqueleto hacia arriba. (B - D) La rotación y la incisión entre las placas dentales dorsal. (E) de corte lateral en el tejido blando para abrir aún más la base del tubo intestinal. (F) branquial esqueleto colocado en la parte inferior de un cubreobjetos listo para el montaje. (G) En segundo cubreobjetos colocado en la mitad anterior del esqueleto branquial (por encima de las placas dorsales de los dientes). (H - I)montaje plano del esqueleto branquial mediante la apertura de las aletas de la placa de los dientes dorsales y deslizamiento entre dos hojas de la cubierta. Consulte los pasos 4.1 a 4.6 para más detalles. Barra de escala = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Este protocolo da como resultado un esqueleto branquial montada diseccionado y plana (Figura 4), ​​donde una variedad de importantes rasgos tróficos se puede cuantificar. Desde una vista dorsal, todas las filas de hendiduras branquiales, todas las placas de dientes faríngeos, y casi todos los huesos branquiales pueden ser fácilmente visualizados y cuantificaron 22 - 24,35,36,38,42. Rojo de alizarina S también emite fluorescencia en una rodamina o filtro rojo similares permitiendo el doble etiquetado con otros marcadores (por ejemplo, GFP transgénica 42) y un método alternativo de visualización. La fluorescencia se desvanece rápidamente a la luz, por lo que las tiendas preparaciones en la oscuridad si se planea imágenes fluorescentes o el fenotipo. Desde un punto de vista ventral, las branquias se pueden visualizar y cuantificar su pigmentación 43. Preps se pueden almacenar en 100% de glicerol durante años.

4.jpg "/>

Figura 4:. Stickleback Representante esqueleto branquial Dos ejemplos de esqueletos branquiales manchadas y despejados se muestran. (A) Campo claro imagen que muestra el hueso etiqueta roja. (B) Imagen fluorescente bajo un conjunto de filtro de rodamina B. Ejemplos de rastrillos, los dientes y los huesos están etiquetados con símbolos de intercalación, puntas de flecha, y asteriscos, respectivamente. Las barras de escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium Hydroxide (KOH) EMD PX1480-1
Glycerol Sigma-Aldrich G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF) Azer Scientific NBF-4-G
Alizarin Red S EMD AX0485-3
Microscope Cover Glasses 22 mm x 60 mm VWR 16004-350
100 mm x 10 mm Glass Petri Dish Kimble Chase 23064-10010 To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Can be poured into glass or plastic Petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay Sargent Art 22-4000 1 lb cream
Scintillation Vials (case of 500) Wheaton 986586 Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip) FST 11252-20 Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors  FST 15003-08 Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope Leica S6E with KL300 LED Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7 ml Denville C2170
Cardboard slide tray Fisher 12-587-10

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La disección y-montaje plana del esqueleto branquial de tres espinas Stickleback
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Ellis, N. A., Miller, C. T.… More

Ellis, N. A., Miller, C. T. Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton. J. Vis. Exp. (111), e54056, doi:10.3791/54056 (2016).

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