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Biology

विच्छेदन और Threespine प्रकार की छोटी ब्रान्चियल कंकाल के फ्लैट बढ़ते

Published: May 7, 2016 doi: 10.3791/54056
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

Introduction

विविधता के एक अविश्वसनीय राशि रीढ़ के बीच सिर कंकाल में मौजूद है, विशेष रूप से मछलियों के बीच में। कई मामलों में यह विविधता अलग खिला रणनीतियों 1 की सुविधा - 4, और दोनों के बाह्य और आंतरिक craniofacial patterning के लिए बड़े बदलाव शामिल कर सकते हैं। ब्रान्चियल कंकाल एक मछली के गले में आंतरिक रूप से स्थित है और मुख गुहा के सबसे चारों ओर है। ब्रान्चियल कंकाल 5 क्रमानुसार मुताबिक़ क्षेत्रों, जिनमें से चार पूर्वकाल गहरे नाले का समर्थन शामिल है। एक साथ इन पाँच खंडों मछली और उनके भोजन 5 के बीच एक अंतरफलक के रूप में कार्य करते हैं। गिल rakers, ग्रसनी दांत, और ब्रान्चियल हड्डियों सहित लक्षण के एक भीड़ में रूपांतर भोजन के विभिन्न प्रकारों पर कुशल foraging के लिए योगदान करते हैं।

Sticklebacks पैतृक महासागरीय उत्तरी गोलार्द्ध भर में मीठे पानी की झीलों और खाड़ियों उपनिवेश रूपों के बाद एक अनुकूली विकिरण आया है। आहार में बदलावमीठे पानी में बड़ा शिकार करने के लिए समुद्र में छोटे प्राणीमन्दप्लवक से 6 कई craniofacial लक्षण में नाटकीय बदलाव पौष्टिकता में हुई है। जबकि कई अध्ययनों sticklebacks 7 में बाहरी craniofacial मतभेद पर ध्यान केंद्रित किया है - 13, महत्वपूर्ण craniofacial परिवर्तन आंतरिक ब्रान्चियल कंकाल में बार बार विकसित। आकृति विज्ञान के अलग-अलग प्रकार की छोटी आबादी के बीच उपजाऊ संकर बनाने की क्षमता ब्रान्चियल कंकाल को विकसित परिवर्तन के आनुवंशिक आधार नक्शा करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करता है।

पारिस्थितिक महत्व की एक विशेषता पौष्टिकता गिल rakers, आवधिक त्वचीय हड्डियों कि ब्रान्चियल हड्डियों के पूर्वकाल और कूल्हों चेहरों लाइन और शिकार आइटम फिल्टर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं की patterning है। मछली है कि आम तौर पर छोटे शिकार आइटम पर फ़ीड अब और अधिक घनी स्थान दिया गया गिल मछली है कि बड़े शिकार 14,15 पर फ़ीड की तुलना में rakers हो जाते हैं। गिल rakers में रूपांतर सूचित किया गया है दोनों wIthin और प्रजातियों 14-19 के बीच, और गिल घूसख़ोर patterning के पहलुओं पौष्टिकता आलों और फिटनेस के 16 में योगदान। अनुसंधान के दशक में बड़े पैमाने पर threespine sticklebacks 17 में गिल घूसख़ोर संख्या और लंबाई भिन्नता दस्तावेज है - 21; हालांकि, इन अध्ययनों में आम तौर पर गिल rakers की पहली पंक्ति पर ध्यान केंद्रित। हाल ही में काम ब्रान्चियल कंकाल 22,23 के पार और गिल घूसख़ोर में एक ही पंक्ति में 23 और लंबाई 24 रिक्ति की तुलना में एक पंक्ति या एक ही गिल घूसख़ोर समझने के लिए और अधिक अध्ययन करने के महत्व पर प्रकाश डाला गिल घूसख़ोर नंबर के आनुवंशिक नियंत्रण में प्रतिरूपकता दिखाया गया है गिल घूसख़ोर कमी के विकास के आनुवंशिक आधार।

दोनों पारिस्थितिकी और जैव चिकित्सा महत्व का एक दूसरा पौष्टिकता विशेषता ग्रसनी दांतों की patterning है। मछलियों में दांत दोनों मौखिक जबड़े में और ब्रान्चियल कंकाल में स्थित हो सकता है, ग्रसनी दांत के रूप में जाना जाता है। मौखिक दांत पी के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे हैंरे पर कब्जा है, जबकि ग्रसनी दांत चबाना और शिकार हेरफेर 25 के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं - 27। दोनों सेट साझा विकास तंत्र के माध्यम से फार्म और विकासात्मक मुताबिक़ 28 माना जाता है। दिलचस्प प्रतिरूपकता होता है जिससे इस तरह के zebrafish, कमी मौखिक और पृष्ठीय ग्रसनी दांत 29, जबकि अन्य प्रजातियों के कई दांतेदार ceratobranchials, pharyngobranchials राशि के रूप में कुछ प्रजातियों, और कभी-कभी basihyal दांतेदार 30 hypobranchials। Sticklebacks में, ग्रसनी दांत पांचवें ceratobranchial और पूर्वकाल पर पीछे की ओर पर पेट के बल पाए जाते हैं और पीछे pharyngobranchials 31। की छोटी खिला पर कीनेमेटीक्स दिखाने मौखिक जबड़े मुख्य रूप से शिकार को पकड़ने के लिए और शोषण खिला 9 की सुविधा ग्रसनी जबड़े को चबाना छोड़ने प्रयोग किया जाता है। चिचिल्ड में निचले जबड़े ग्रसनी आकृति विज्ञान नाटकीय रूप से बदलता है और 32,33 अनुकूली और पौष्टिकता आला 34 के साथ सहसंबद्ध होना दिखाया गया है। मल्टीमिसाल मीठे पानी की छोटी आबादी उदर ग्रसनी दांत नंबर 23,35,36 में नाटकीय वृद्धि विकसित किया है। हाल ही में काम दिखा दिया है कि इस विकसित दांत लाभ के विकास के आनुवंशिक आधार मीठे पानी sticklebacks 36 के दो स्वतंत्र रूप से व्युत्पन्न आबादी में काफी हद तक अलग है। स्तनधारी दांत के विपरीत, मछली वयस्क जीवन भर लगातार 37 उनके दांत पुनर्जन्म। ये पहले से वर्णित उच्च दांतेदार मीठे पानी आबादी के दोनों एक त्वरित दांत प्रतिस्थापन दर विकसित किया है, उत्थान 36 के आनुवंशिक आधार अध्ययन करने के लिए एक दुर्लभ कशेरुकी प्रणाली प्रदान करते हैं।

एक तीसरा पौष्टिकता विशेषता है कि मीठे पानी sticklebacks में बार बार विकसित किया गया है अब epibranchial और ceratobranchial हड्डियों, ऊपरी और निचले जबड़े की ब्रान्चियल चाप कमानी homologs क्रमश: 38 है। लंबे समय तक ब्रान्चियल हड्डियों एक बड़ा मुख गुहा प्रदान की संभावना है और बड़ा शिकार आइटम ग होने की इजाजत देने के लिए अनुकूल हैंonsumed। इसके अलावा, अन्य मछली में, epibranchial हड्डियों पृष्ठीय ग्रसनी दांत प्लेटों 25 के अवसाद के लिए महत्वपूर्ण हैं। गिल rakers और ग्रसनी दांत की तरह, ब्रान्चियल हड्डियों आंतरिक और इस प्रकार, मुश्किल आसानी से कल्पना या यों कर रहे हैं।

यहाँ हम टुकड़े करना एक विस्तृत प्रोटोकॉल के वर्तमान और ब्रान्चियल कंकाल फ्लैट माउंट, आसान दृश्य और महत्वपूर्ण craniofacial लक्षण की एक किस्म की मात्रा का ठहराव की इजाजत दी। इस प्रोटोकॉल एक की छोटी विच्छेदन का वर्णन करते हैं, यह एक ही विधि अन्य मछलियों की एक किस्म पर काम करता है।

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Protocol

सभी मछली काम कैलिफोर्निया-बर्कले विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल संख्या R330) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इच्छामृत्यु 0.1% सोडियम बाइकार्बोनेट 39 के साथ बफर 0.025% Tricaine-एस में विसर्जन का उपयोग किया गया था। सभी कदम कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं।

1. तैयारी

नोट: शंक्वाकार ट्यूब या जगमगाहट शीशियों कि कसकर सील कर सकते हैं और क्षैतिज रखी जा में कदम 1.1-1.5 प्रदर्शन करना। मछली लगातार हिल जाने की जरूरत नहीं है, लेकिन धीरे inverting या ट्यूब या शीशियों की रैक मिलाते धुंधला समाधान के लिए मछली के सभी पक्षों को बेनकाब और दाग समान रूप से ऊतक घुसना करने के लिए अनुमति देने के लिए द्वारा जितनी बार संभव समाधान मिश्रण करने के लिए प्रयास करें। एक मंच पर एक प्रकार के बरतन मछली की एक बड़ी खेप जगह नहीं है, के रूप में तरल पदार्थ की भारी वजन प्रकार के बरतन टूट जाएगा।

  1. या तो हौसले euthanized मछली या मछली 10% तटस्थ बफर formalin (NBF) के साथ रात भर इथेनॉल में संग्रहीत को ठीक करें। वैकल्पिक रूप से, 4% paraform का उपयोग1x पीबीएस समाधान के बजाय 10% NBF में एल्डिहाइड।
    नोट: यदि डीएनए निकालने, निर्धारण और इथेनॉल में दुकान करने से पहले दुम या छाती पर का कवच पंख के एक छोटे से हिस्से क्लिप।
  2. एक रासायनिक हुड में ठीक से तय की फेकें और नल के पानी के साथ की जगह 2 घंटे के लिए (है कि पीएच 7.0 है ~)। de-ionized पानी का उपयोग कर के रूप में यह अक्सर अम्लीय हो सकता है और हड्डी decalcify सकते बचें।
  3. पानी और दाग मछली 24 घंटे के लिए पानी में 1% KOH में 0.008% Alizarin लाल एस के साथ निकालें। मछली कम से कम 20 मिमी मानक लंबाई के लिए, का उपयोग 0.004% Alizarin लाल एस (Alizarin लाल एस के एक 100x (0.8%) शेयर समाधान जो तब पतला किया जा सकता है)।
  4. कुछ घंटे के लिए पानी के नल में दाग (हुड में उचित अपशिष्ट कंटेनर में डालने) और जगह मछली निकालें। जब तक पानी से कुल्ला मुख्य रूप से साफ है की जरूरत के रूप में पानी बदलें।
  5. 50% ग्लिसरॉल, हल्के समाशोधन और बाद विच्छेदन के लिए 0.25% KOH में पानी और जगह मछली निकालें।
    नोट: यह धुंधला प्रोटोकॉल पहले से वर्णित विधि 40,41 से संशोधित किया गया है।

ध्यान दें: प्रासंगिक सिर कंकाल की आकृति विज्ञान की समीक्षा के लिए चित्रा 1 देखें।

आकृति 1
चित्रा 1:। एक प्रकार की छोटी सिर कंकाल की आकृति विज्ञान Alizarin लाल threespine की छोटी सिर एक rhodamine बी फिल्टर सेट के तहत प्रतिदीप्ति के साथ imaged दाग। उपयोगी आकृति विज्ञान लेबल है: विपक्ष = opercle, Subop = subopercle, BSRS = branchiostegal रे, Preop = preopercle, Infraorb 1-3 = infraorbital 1-3 (भी बुलाया circumorbitals या suborbitals), सेंध = दंतिकास्थि, Premax = premaxilla, मैक्स = जबडा , Nas = नाक, लैट। ethm = पार्श्व सलाखें, Psph = parasphenoid, Fron = ललाट हड्डी। की छोटी सिर कंकाल की एक अधिक विस्तृत विवरण के लिए, Anker (1974) 31 देखें। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।

  1. मछली फ्लैट (2A चित्रा) निर्धारित करना और आंख को कवर झिल्ली पंचर करने के लिए एक ~ 45 डिग्री के कोण पर आंख के पक्ष में तेज # 5 घड़ीसाज़ संदंश डालें।
  2. झिल्ली आंख, एक दही ढक्कन (चित्रा 2 बी) छीलने के लिए इसी तरह से दूर छील।
  3. , आंख के पीछे खुले संदंश डालें आंख के पीछे ऑप्टिक तंत्रिका की पकड़ ले लो, और आंख (चित्रा -2) को हटा दें। आंख पंचर के रूप में यह मेलेनिन रिसाव जाएगा मत करो। अगर हवा निकाल दी, मेलेनिन बाद के चरणों के दौरान दूर धोया जा सकता है।
  4. दूसरी तरफ दोहराएँ।
  5. पीछे से शुरू, opercle फ्लैप के तहत एक छोटा सा विदारक कैंची ब्लेड जगह है, खींचें कैंची ब्लेड पीछे की ओर opercle ऊपर है, तो मुलायम ऊतकों थैली (चित्रा 2 डी) के माध्यम से काटा। opercle हड्डी के लिए पृष्ठीय कट।
  6. ललाट की हड्डी (थैली के लिए पृष्ठीय) (चित्रा 2 ई) में कटौती।
  7. टी चारों ओर midline parasphenoid हड्डी कटवह आँख कुर्सियां ​​(चित्रा 2 एफ) के केंद्र।
  8. विरोध पक्ष पर दोहराएँ opercle कटौती।
  9. Opercle तहत संदंश डालें और धीरे-धीरे चेहरे को शरीर से दूर छील, अभी भी जुड़ी (चित्रा 2 जी - एच) किसी भी नरम ऊतक trimming। देखभाल गिल rakers की पहली पंक्ति को बाधित करने के लिए नहीं ले लो।
    1. संदंश के साथ, midline basihyal से दोनों पक्षों पर अलग ceratohyals जबकि दूर छीलने और पूर्वकाल craniofacial कंकाल (दंतिकास्थि, premaxilla, और जबडा सहित पूरे जबड़े को हटाने; बाहरी त्वचीय opercle, preopercle, subopercle सहित पूरे कंठिका कंकाल, और branchiostegal किरणों और अंतर्निहित पृष्ठीय और उदर endochondral तत्वों; और नाक, पार्श्व सलाखें सहित खोपड़ी के पूर्वकाल हिस्सा है, और infraorbital हड्डियों, आंकड़े 1 और 2I देखें)।
    2. श्रोणि कांटा शरीर से बाहर तह किया जा सकता है, और एक संभाल संदंश पकड़ ओ हड़पने के लिए के रूप में सेवा कर सकते हैंएफ जब वर्तमान। कांटा जगह में ताला। अनलॉक करने के लिए, धीरे संदंश के साथ रीढ़ खींच सीधे मछली शरीर से दूर है, तो धीरे पीछे मोड़ रीढ़ मछली के खिलाफ फ्लैट प्रेस करने के लिए।
  10. सम्मिलित पूर्व ब्रान्चियल कंकाल और खींचें संदंश (सिर्फ पेट ट्यूब के नीचे) को संदंश पीछे और उदर बंद कर दिया गया है, के अलावा ब्रान्चियल कंकाल (चित्रा 2J - कश्मीर) से जुड़ी शेष मांसपेशियों और स्नायुबंधन चिढ़ा।
  11. बंद संदंश के सुझावों का उपयोग करना, मांसपेशियों पूर्वकाल दिशा (चित्रा 2L) के लिए एक पीछे में उदर braincase के लिए पृष्ठीय ब्रान्चियल कंकाल संलग्न दूर परिमार्जन।
  12. विरोध पक्ष पर 2.9 और 2.10 दोहराएँ।
  13. पेट ट्यूब के आधार समझ और पूर्व से खींच ब्रान्चियल कंकाल और पेट ट्यूब (चित्रा 2 एम - एन) को हटा दें।
  14. अलग (पांचवें ceratobranchial के अंत के लिए एक सीधा कटौती पीछे बना चित्रा 2O से पेट ट्यूब
  15. ब्रान्चियल कंकाल के पृष्ठीय पक्ष पर braincase से किसी भी शेष हड्डी के टुकड़े को हटाने के बाद, ब्रान्चियल टोकरी में डालने कैंची पृष्ठीय दांत प्लेटों की द्विपक्षीय सेट के बीच एक पृष्ठीय कटौती (पीछे करने के लिए पूर्वकाल काटने) (चित्रा 3 ए - डी) बनाने के लिए। सुनिश्चित कटौती पृष्ठीय दांत प्लेटों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए केंद्रित है।
  16. ब्रान्चियल कंकाल (चित्रा 3E) खोलने के साथ सहायता के लिए ब्रान्चियल कंकाल (आंत ट्यूब के पूर्वकाल अंत) के पीछे अंत में रबड़ जैसी आंत लुमेन में दो उथले पार्श्व कटौती करें।
  17. मछली और एक जार में सभी ऊतक टुकड़े प्लेस और 50% ग्लिसरॉल, 0.25% KOH के साथ एक microcentrifuge ट्यूब में ब्रान्चियल कंकाल जगह कोमल समाशोधन, या 100% ग्लिसरॉल जारी रखने के लिए यदि कोई आगे समाशोधन आवश्यक है। लेबल जार और एक अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ ट्यूब ताकि वे पता लगाया जा सकता है। आवश्यक समाशोधन की राशि काफी हद तक मछली, बड़े वयस्क मछली के आकार का एक समारोह है (40 मीटर से अधिकमानक लंबाई में मीटर) आम तौर पर अतिरिक्त समाशोधन की आवश्यकता होती है।

चित्र 2
चित्रा 2:। एक प्रकार की छोटी ब्रान्चियल कंकाल विच्छेदन Alizarin लाल विच्छेदन के लिए threespine की छोटी मछली तैयार दाग। आँख व्यापक समाशोधन से depigmented है। नीले तीर गति की दिशा का संकेत मिलता है। (ए) की छोटी सिर के पार्श्व दृश्य, पूर्वकाल सही करने के लिए है। (बी) के आंख को कवर झिल्ली का हटाया। (सी) आँखों का हटाया। (डी) पृष्ठीय opercle ऊपर से काट दिया। (ई) ललाट हड्डी में कटौती। (एफ) Parasphenoid काटा। (जी - मैं) चेहरे कंकाल का हटाया। (जे) उदर ब्रान्चियल कंकाल नरम ऊतक कनेक्शन का हटाया। (कश्मीर - एल) पृष्ठीय ब्रान्चियल कंकाल कनेक्शन का हटाया। (<strong> एम - एन) ब्रान्चियल कंकाल का हटाया। (ओ) ब्रान्चियल कंकाल से पेट ट्यूब अलग करें। अधिक जानकारी के लिए कदम 2.16 के माध्यम से 2.1 देखें। स्केल बार = 5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. ब्रान्चियल कंकाल पुनः धुंधला (यदि आवश्यक)

  1. ब्रान्चियल कंकाल गहरा या स्पष्ट ऊतक अधिक दाग करने के लिए, 50% ग्लिसरॉल, 0.25% KOH समाधान निकालने और 1% KOH दो बार (एक से पांच मिनट धोने के लिए एक दूसरे 24 घंटा धोने के द्वारा पीछा किया, जबकि एक मंच पर एक प्रकार के बरतन क्षैतिज मिलाते हुए) से धो लें।
  2. 24 घंटे के लिए 1% KOH में 1% KOH और फिर से दाग को दूर 0.008% Alizarin लाल एस के साथ।
  3. दाग को दूर करने और 24 घंटे के लिए 1% KOH के साथ बदलें।
  4. KOH समाधान निकालें और 50% ग्लिसरॉल, 0.25% KOH के साथ बदलें।

4. ब्रान्चियल कंकाल बढ़ते

  1. ब्रान्चियल कंकाल हटाये50% ग्लिसरॉल, 0.25% KOH या 100% ग्लिसरॉल और पृष्ठीय पक्ष के साथ एक 22 मिमी x 60 मिमी गिलास को कवर पर्ची के तल के पास जगह से सामना करना पड़ रहा है (चित्रा 3F)। ब्रान्चियल कंकाल की चोटी पर 50% ग्लिसरॉल, 0.25% KOH या 100% ग्लिसरॉल की कुछ बूँदें जोड़ें। एक microcentrifuge ट्यूब में 50% ग्लिसरॉल, 0.25% KOH के लिए 100% ग्लिसरॉल, परिवर्तन के समाधान से संक्रमण और> 5 मिनट के लिए ऊतक संतुलित करने के लिए बढ़ते से पहले हिला हैं।
  2. spacers के रूप में कार्य करने के लिए कवर पर्ची के दोनों छोर पर क्ले मॉडलिंग और जगह के दो छोटे गेंदों बाहर रोल।
  3. शिथिल पूर्वकाल ब्रान्चियल कंकाल (चित्रा 3 जी) को समतल करने के लिए पर्याप्त दबाव के साथ शीर्ष पर एक दूसरे coverslip जगह।
  4. पील, पृष्ठीय दांत प्लेटों सहित छोड़ दिया पृष्ठीय फ्लैप खोलने समतल, और coverslips (चित्रा 3H) के बीच स्लाइड।
  5. सही पृष्ठीय फ्लैप के साथ दोहराएँ तकनीक और coverslip (चित्रा 3I) के किनारे से दूर पूरे ब्रान्चियल कंकाल धक्का।
    1. बदलनानेटिव रूप, दोनों पृष्ठीय फ्लैप संदंश के साथ खुला रखने और ध्यान पर coverslip जगह, एक निर्बाध गति में ब्रान्चियल कंकाल सपाट।
    2. वैकल्पिक रूप से, ब्रान्चियल कंकाल माउंट एक कवर पर्ची पर ऊपर से नीचे, बाहर laterally प्रत्येक पृष्ठीय पक्ष splaying तो गुरुत्वाकर्षण ब्रान्चियल कंकाल वापस ऊपर बंद करने के लिए अनुमति नहीं है। फिर दूसरा 22 मिमी x 60 मिमी गिलास को कवर पर्ची के साथ कवर और प्रस्तुत करने का पलटना।
      नोट: विभिन्न बढ़ते तकनीक बेहतर या बदतर प्रत्येक व्यक्ति के लिए काम करते हैं। प्रत्येक प्रयास करें और देखें सबसे सहज महसूस करता है क्या।
  6. हल्के ब्रान्चियल कंकाल रखने के लिए पर्याप्त मिट्टी गेंदों समतल करने के लिए शीर्ष coverslip पर प्रेस घुड़सवार फ्लैट है, लेकिन नमूना कुचलने के लिए नहीं ख्याल रखना।
    1. बढ़ते प्रक्रिया के दौरान, ceratobranchials बारी बारी से और rakers की एक पंक्ति अस्पष्ट हो सकती है। coverslips और ceratobranchials फिर से उन्मुख या पूरे ब्रान्चियल कंकाल के बीच संदंश फिसलने से यह उपाय।
  7. स्टोर ro पर स्लाइड ट्रे में फ्लैट prepsओम तापमान। 100% ग्लिसरॉल में मुहिम शुरू की, preps कम से कम एक दशक तक पाटने coverslips के बीच संग्रहित किया जा सकता है। साफ संदंश और isopropanol या इथेनॉल और कवर सुझावों के साथ कैंची।

चित्र तीन
चित्रा 3:। फ्लैट ब्रान्चियल कंकाल हेरफेर बढ़ते और ब्रान्चियल कंकाल के बढ़ते दिखाया गया है। नीले तीर गति की दिशा का संकेत मिलता है। (ए) ब्रान्चियल कंकाल पृष्ठीय पक्ष। (बी - डी) रोटेशन और पृष्ठीय दांत प्लेटों के बीच चीरा। (ई) नरम ऊतक में पार्श्व कटौती आगे पेट ट्यूब के आधार खोलने के लिए। (एफ) ब्रान्चियल कंकाल एक coverslip के नीचे बढ़ते के लिए तैयार रखा गया है। (G) दूसरा coverslip (पृष्ठीय दांत प्लेटों के ऊपर) ब्रान्चियल कंकाल के पूर्वकाल आधे पर रखा। (एच - मैं)पृष्ठीय दांत प्लेट फ्लैप खोलने और दो कवर फिसल जाता है के बीच फिसलने से ब्रान्चियल कंकाल के फ्लैट बढ़ते। अधिक जानकारी के लिए कदम 4.6 के माध्यम से 4.1 देखें। स्केल बार = 5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

एक विच्छेदित और फ्लैट घुड़सवार ब्रान्चियल कंकाल में इस प्रोटोकॉल परिणाम (चित्रा 4) जहां महत्वपूर्ण पौष्टिकता संबंधी लक्षण की एक किस्म मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। एक पृष्ठीय दृश्य से, गिल rakers, सभी ग्रसनी दांत प्लेटें, और लगभग सभी ब्रान्चियल हड्डियों के सभी पंक्तियों को आसानी से देखे जा सकते हैं और 22 मात्रा निर्धारित - 24,35,36,38,42। Alizarin लाल भी एक rhodamine या इसी तरह लाल फिल्टर अन्य मार्कर (जैसे, ट्रांसजेनिक GFP 42) और दृश्य का एक वैकल्पिक विधि के साथ डबल लेबलिंग की अनुमति पर fluoresces। प्रतिदीप्ति प्रकाश में जल्दी fades, तो अंधेरे में दुकान preps अगर फ्लोरोसेंट इमेजिंग या phenotyping की योजना बनाई है। एक उदर दृश्य से, गहरे नाले देखे जा सकते हैं और उनके रंजकता 43 मात्रा। Preps साल के लिए 100% ग्लिसरॉल में संग्रहित किया जा सकता है।

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चित्रा 4:। प्रतिनिधि की छोटी ब्रान्चियल कंकाल सना हुआ और मंजूरी दे दी ब्रान्चियल कंकाल के दो उदाहरण दिखाए जाते हैं। (ए) brightfield छवि दिखा हड्डी लाल लेबल। (बी) के एक rhodamine बी फिल्टर सेट के तहत फ्लोरोसेंट छवि। के rakers, दांत, हड्डियों और उदाहरण हैं, क्रमशः के साथ कैरेट, तीर, और तारों के लेबल रहे हैं। स्केल सलाखों = 2 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium Hydroxide (KOH) EMD PX1480-1
Glycerol Sigma-Aldrich G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF) Azer Scientific NBF-4-G
Alizarin Red S EMD AX0485-3
Microscope Cover Glasses 22 mm x 60 mm VWR 16004-350
100 mm x 10 mm Glass Petri Dish Kimble Chase 23064-10010 To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Can be poured into glass or plastic Petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay Sargent Art 22-4000 1 lb cream
Scintillation Vials (case of 500) Wheaton 986586 Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip) FST 11252-20 Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors  FST 15003-08 Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope Leica S6E with KL300 LED Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7 ml Denville C2170
Cardboard slide tray Fisher 12-587-10

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References

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फिजियोलॉजी अंक 111 ब्रान्चियल कंकाल ग्रसनी दांत गिल घूसख़ोर ब्रान्चियल हड्डियों craniofacial की छोटी,
विच्छेदन और Threespine प्रकार की छोटी ब्रान्चियल कंकाल के फ्लैट बढ़ते
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Ellis, N. A., Miller, C. T.… More

Ellis, N. A., Miller, C. T. Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton. J. Vis. Exp. (111), e54056, doi:10.3791/54056 (2016).

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