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Biology

Dissecção e pay-per-montagem do Threespine Stickleback branquial Skeleton

Published: May 7, 2016 doi: 10.3791/54056
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

Introduction

Uma incrível quantidade de diversidade existe na cabeça do esqueleto entre os vertebrados, especialmente entre os peixes. Em muitos casos, essa diversidade facilita diferentes estratégias de alimentação 1-4, e pode envolver grandes alterações tanto padronização craniofacial externo e interno. O esqueleto branquial está localizado internamente na garganta de um peixe e rodeia a maior parte da cavidade bucal. O esqueleto branquial é composta por 5 segmentos série homóloga, o anterior quatro dos quais suportam as guelras. Juntos, esses cinco segmentos funcionar como uma interface entre o peixe e sua comida 5. Variação em uma infinidade de traços incluindo rakers Gill, dentes da faringe e ossos branquial contribuir para forrageamento eficiente em diferentes tipos de alimentos.

Sticklebacks tenham sido submetidos a uma radiação adaptativa após formas oceânicas ancestrais colonizaram lagos de água doce e riachos em todo o hemisfério norte. A mudança na dietade pequeno zooplâncton no oceano para presas maiores em água doce resultou em variação trófica dramática em várias características craniofaciais 6. Enquanto muitos estudos têm-se centrado nas diferenças craniofaciais externas em sticklebacks 7 - 13, importantes alterações craniofaciais evoluir repetidamente no esqueleto branquial interno. A capacidade de criar híbridos férteis entre as populações stickleback morfologicamente distintas proporciona uma excelente oportunidade para mapear a base genética das alterações evoluíram para o esqueleto branquial.

Um traço trófica de importância ecológica é a padronização dos rastros branquiais, ossos dérmicos periódicas que revestem as faces anterior e posterior dos ossos branquial e são usados ​​para filtrar presas. Os peixes que normalmente se alimentam de pequenos presas tendem a ter mais tempo e mais densamente Gill espaçadas rakers em comparação com os peixes que se alimentam de presas maiores 14,15. Variação de rastros branquiais tem sido relatada tanto within e entre espécies 14-19, e os aspectos de emalhar raker padronização contribuir para nichos tróficos e de fitness 16. Décadas de pesquisa têm amplamente documentado número branquiais e variação de comprimento em sticklebacks threespine 17 - 21; no entanto, esses estudos geralmente se concentram na primeira linha de rastros branquiais. Um trabalho recente tem mostrado modularidade no controle genético do número branquiais em todo o esqueleto branquial 22,23 e em uma única linha no raker Gill espaçamento 23 e comprimento de 24 destacando a importância de estudar mais de remar um ou uma única raker Gill para entender o base genética do desenvolvimento da redução branquiais.

Uma segunda característica trófica de ambos importância ecológica e biomédica é a padronização dos dentes da faringe. Os dentes em peixes pode ser localizada tanto na mandíbula oral e no esqueleto branquial, conhecido como os dentes da faringe. dentes orais são usados ​​principalmente para prey capturar enquanto os dentes da faringe são utilizados para a mastigação e presa manipulação 25-27. Ambos os conjuntos formam através de mecanismos de desenvolvimento compartilhados e são considerados developmentally homólogo 28. Modularidade interessante ocorre pela qual algumas espécies, como o peixe-zebra, a falta dentes da faringe oral e dorsal 29, enquanto outras espécies têm múltiplas ceratobranchials dentadas, pharyngobranchials, e às vezes dentada basihyal e hypobranchials 30. Em sticklebacks, dentes da faringe são encontrados ventrally no quinto ceratobranquial e dorsal sobre a anterior e posterior pharyngobranchials 31. Cinemática sobre alimentação stickleback mostrar a mandíbula oral é utilizado principalmente para a captura de presas e facilitar a alimentação de sucção 9 deixando a mastigação para a mandíbula da faringe. Em ciclídeos, inferior a morfologia da faringe mandíbula varia dramaticamente 32,33 e foi mostrada para ser adaptável e correlacionada com nicho trófico 34. multipopulações de água doce stickleback PLE têm evoluído aumentos dramáticos na faringe ventral número de dentes 23,35,36. Um trabalho recente demonstrou que a base genética do desenvolvimento deste ganho dente evoluído é em grande parte distinta em duas populações derivadas independentemente de sticklebacks de água doce 36. Ao contrário de dentes de mamíferos, peixes regenerar os dentes de forma contínua ao longo da vida adulta 37. Ambas as populações de água doce dentadas elevados previamente descritos têm evoluído uma taxa acelerada substituição de dentes, fornecendo um sistema de vertebrado rara para estudar a base genética de regeneração 36.

Uma terceira característica trófica que evoluiu repetidamente no sticklebacks de água doce é mais ossos epibranchial e ceratobranquial, os branquial homólogos arco segmentar da mandíbula superior e inferior, respectivamente 38. Mais longos ossos branquial conferem um cavidade bucal maior e provavelmente são adaptáveis ​​para permitir presas maiores para ser consumed. Além disso, em outros peixes, ossos epibranchial são importantes para a depressão das placas de dentes dorsal da faringe 25. Como rastros branquiais e dentes da faringe, os ossos branquiais são internas e, portanto, difícil de visualizar ou quantificar facilmente.

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para dissecar e de montagem fixa o esqueleto branquial, permitindo fácil visualização e quantificação de uma variedade de importantes características craniofaciais. Embora este protocolo descreve uma dissecção stickleback, este mesmo método funciona com uma variedade de outros peixes.

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Protocol

Todo o trabalho de peixe foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use da Universidade da Califórnia-Berkeley (número de protocolo R330). A eutanásia foi realizada por meio de imersão em 0,025% tricaina-S tamponada com 0,1% de bicarbonato de sódio 39. Todos os passos são realizados à temperatura ambiente.

1. Preparação

Nota: Execute as etapas 1,1-1,5 em tubos cônicos ou frascos de cintilação que pode selar firmemente e ser colocados na horizontal. Os peixes não precisam ser constantemente abalado, mas tente misturar a solução o mais rápido possível invertendo delicadamente ou sacudindo o rack de tubos ou frascos para expor todos os lados do peixe para a solução de coloração e permitir que mancha para penetrar no tecido uniformemente. Não coloque um grande lote de peixes em um agitador de plataforma, como o peso pesado do líquido vai quebrar o shaker.

  1. Fixar qualquer peixe recém-sacrificados ou peixe armazenado em etanol com 10% tamponada neutra de formalina (NBF) durante a noite. Como alternativa, use 4% paraformaldeído em solução 1x PBS em vez de NBF a 10%.
    Nota: Se extrair DNA, grampear uma pequena porção dos caudais ou barbatanas peitorais antes da fixação e armazenar em etanol.
  2. Dispor de correção adequadamente em uma capa química e substituir com água da torneira (ou seja ~ pH 7,0) durante 2 horas. Evitar o uso de água deionizada, pois muitas vezes pode ser ácida e pode descalcificação óssea.
  3. Retire a água e peixes mancha com 0,008% Alizarina S em 1% KOH em água por 24 horas. Para os peixes menos de 20 mm de comprimento padrão, utilize 0,004% Alizarina Red S. (Faça uma solução 100x (0,8%) de ações de Alizarina S, que pode então ser diluído).
  4. Remova a mancha (colocar em um recipiente adequado de lixo na capa) e colocar peixes na água da torneira para alguns hr. Mudar a água como necessário até lavagem com água é mais clara.
  5. Retire a água e coloque o peixe até 50% de glicerol, 0,25% KOH para limpeza suave e dissecção posterior.
    Nota: Este protocolo de coloração é modificado a partir de métodos anteriormente descritos 40,41.

Nota: Consulte a Figura 1 para uma revisão de cabeça relevante morfologia do esqueleto.

figura 1
Figura 1:. Cabeça Stickleback morfologia do esqueleto Alizarina Red manchado cabeça Gasterosteus aculeatus fotografada com fluorescência sob um conjunto rodamina filtro B. morfologia útil é rotulado: Op = opérculo, Subop = subopercle, BSRs = branchiostegal raios, pré-operatório = preopérculo, Infraorb 1-3 = infraorbitários 1-3 (também chamados circumorbitals ou suborbitals), Dent = dentário, Premax = pré-maxila, Max = maxila , Nas = nasal, Lat. ethm = etmóide lateral, PSPH = paresfenóide, Fron = osso frontal. Para uma descrição mais detalhada da cabeça de esqueleto stickleback, consulte Anker (1974) 31. Por favor clique aqui para ver uma versão maioresta figura.

  1. Deite o peixe plana (Figura 2A) e inserir uma pinça afiada # 5 de relojoeiro para o lado do olho com um ângulo de ~ 45 ° para perfurar a membrana que cobre o olho.
  2. Descascar a membrana afastada, a partir do olho, semelhante à da casca de uma tampa de iogurte (Figura 2B).
  3. Inserir uma pinça aberta atrás do olho, agarrar o nervo óptico por trás do olho, e remover o olho (Figura 2C). Não perfure o olho como ele vai vazar melanina. Se perfurado, a melanina pode ser lavado durante as etapas posteriores.
  4. Repita do outro lado.
  5. A partir do posterior, coloque uma lâmina de dissecação tesoura pequena sob a aba opérculo, lâmina de arrastar tesoura dorsal acima opérculo, em seguida, corte de tecidos moles até a órbita do olho (Figura 2D). Corte dorsal ao osso opérculo.
  6. Cortar o osso frontal (dorsal para a cavidade ocular) (Figura 2E).
  7. Cortar o osso paresfenóide linha média em torno de tEle centro das órbitas (Figura 2F).
  8. corte opercle Repita no lado oposto.
  9. Inserir uma pinça sob o opérculo e lentamente descascar o rosto para longe do corpo, aparando qualquer tecido mole ainda ligado (Figura 2G - H). Tome cuidado para não perturbar a primeira linha de rastros branquiais.
    1. Com uma pinça, retire as ceratohyals em ambos os lados do basihyal linha média, enquanto descascando e remover o esqueleto craniofacial anterior (toda a mandíbula, incluindo o dentário, pré-maxila, e da maxila; o esqueleto inteiro hióide incluindo o opérculo dérmica exterior, preopérculo, subopercle e raios branchiostegal e dorsal subjacente e elementos endocondrais ventral; e a parte anterior do crânio, incluindo o nasal, etmóide lateral e ossos infraorbital, ver figuras 1 e 2I).
    2. espinhas pélvico pode ser dobrada para fora do corpo, e pode servir como um identificador para uma pinça para agarrar of quando presente. Espinhos encaixado. Para desbloquear, puxe coluna com uma pinça diretamente para fora do corpo do peixe, em seguida, dobre posteriormente para pressionar espinha plana contra peixes.
  10. Inserir fechada forceps posterior e ventral ao esqueleto branquial (logo abaixo tubo digestivo) e pinça de arrasto anteriormente, provocando além dos músculos restantes e ligamentos ligados ao esqueleto branquial (Figura 2J - K).
  11. Usando as pontas de uma pinça fechadas, raspar os músculos que prendem a dorsal esqueleto branquial à caixa craniana ventral em um posterior à direção anterior (Figura 2 L).
  12. Repita 2.9 e 2.10 do lado oposto.
  13. Agarrar a base do tubo do intestino e puxar anteriormente para remover o esqueleto e intestino tubo branquial (Figura 2 M - N).
  14. Separa-se o tubo do intestino posterior, fazendo um corte perpendicular ao final do quinto ceratobranquial (Figura 2O
  15. Depois de remover quaisquer fragmentos de osso restantes da caixa craniana do lado dorsal do esqueleto branquial, inserir uma tesoura para o cesto branquial para fazer um corte dorsal (corte anterior para posterior) entre os conjuntos bilaterais de placas dorsal do dente (Figura 3A - D). Certifique-se de corte é centrada para evitar danificar as placas dorsal dente.
  16. Fazer dois cortes laterais rasa no lúmen do intestino de borracha na extremidade posterior do esqueleto branquial (extremidade anterior do tubo do intestino) para ajudar na abertura do esqueleto branquial (Figura 3E).
  17. Coloque todos os peixes e pedaços de tecido para um frasco e colocar o esqueleto branquial para um tubo de microcentrífuga com 50% de glicerol, 0,25% de KOH para continuar a limpeza suave, ou 100% de glicerol, se não mais de compensação é necessário. frascos de etiquetas e tubos com um identificador único para que eles possam ser rastreados. A quantidade de purificação necessário é em grande parte uma função do tamanho do peixe, peixe adulto grande (mais de 40 mm de comprimento padrão) normalmente exigem compensação adicional.

Figura 2
Figura 2:. Stickleback branquial esqueleto dissecção Alizarina Red manchado peixes Gasterosteus aculeatus pronto para dissecção. O olho é despigmentada da extensa clareira. As setas azuis indicam a direcção do movimento. (A) Vista lateral da cabeça stickleback, anterior está à direita. (B) A remoção de membrana que cobre o olho. (C) A remoção do olho. (D) Dorsal corte acima do opérculo. Corte ósseo (E) frontal. (F) parasphenoide corte. (G - I) A remoção do esqueleto facial. (J) A remoção do esqueleto branquial conexões de tecidos moles ventral. (K - L) Remoção de dorsais conexões esqueleto branquial. (<strong> M - N) A remoção do esqueleto branquial. (O) Separa-se o tubo digestivo do esqueleto branquial. Veja os passos 2.1 a 2.16 para mais detalhes. Barra de escala = 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. branquial esqueleto Re-coloração (se necessário)

  1. Para mancha mais escura do esqueleto branquial ou tecido mais clara, remover glicerol a 50%, solução de KOH 0,25% e lava-se com KOH a 1%, duas vezes (uma lavagem de cinco minutos, seguida por uma segunda lavagem 24 h, agitando horizontalmente num agitador de plataforma).
  2. Retirar 1% de KOH e re-mancha com 0.008% vermelho de alizarina S em 1% de KOH durante 24 h.
  3. Remover manchas e substituir com 1% de KOH durante 24 h.
  4. Remoção da solução de KOH e substituir com 50% de glicerol, 0,25% KOH.

4. Montagem branquial Skeleton

  1. Remover esqueleto branquiala partir de 50% de glicerol, 0,25% de KOH ou 100% de glicerol e local perto da parte inferior de um x 60 milímetros lamela de vidro com 22 milímetros lado dorsal voltada para cima (Figura 3F). Adicionam-se algumas gotas de 50% de glicerol, 0,25% de KOH ou 100% de glicerol em cima de esqueleto branquial. Se a transição a partir de 50% de glicerol, 0,25% de KOH e 100% de glicerol, solução mudança em um tubo de microcentrífuga e agitar durante> 5 min antes da montagem para equilibrar tecido.
  2. Rolar para fora duas pequenas bolas de massa de modelar e colocar em cada extremidade da lâmina de cobertura para agir como espaçadores.
  3. Vagamente colocar uma segunda lamela por cima com pressão suficiente para achatar o esqueleto branquial anterior (Figura 3G).
  4. Peel abrir a aba dorsal esquerda, incluindo placas de dentes dorsais, alise, e deslize entre as lamelas (Figura 3h).
  5. Técnica Repita com a aba dorsal direita e empurrar toda esqueleto branquial longe da borda da lamela (Figura 3I).
    1. Alterarnativamente, segure ambas as abas abertas dorsais com uma pinça e coloque cuidadosamente a lamela na, achatando o esqueleto branquial em um movimento suave.
    2. Alternativamente, montar o esqueleto branquial de cabeça para baixo em uma lamela, splaying cada lado dorsal lateralmente assim que a gravidade não permite que o esqueleto branquial para fechar volta. Em seguida, cubra com o segundo x 60 milímetros lamela de vidro 22 mm e inverter prep.
      Nota: Diferentes técnicas de montagem tendem a trabalhar melhor ou pior para cada indivíduo. Tente cada um e ver o que se sente mais confortável.
  6. Pressione levemente na lamela superior para achatar bolas de argila suficiente para manter o esqueleto branquial montado plana, mas tome cuidado para não esmagar o espécime.
    1. Durante o processo de montagem, ceratobranchials pode girar e obscurecer uma fileira de rastros. Remediar esta situação através de pinça entre as lamelas e re-orientar o ceratobranchials ou toda esqueleto branquial deslizante.
  7. Loja prepara apartamento em bandejas de slides no rotemperatura om. Montada em 100% de glicerol, preps pode ser armazenada entre lamelas em ponte por pelo menos uma década. forceps limpas e tesouras com isopropanol ou etanol e dicas de cobertura.

Figura 3
Figura 3:. Plano de montagem do esqueleto branquial Manipulação e montagem do esqueleto branquial é mostrado. As setas azuis indicam a direcção do movimento. Lado para cima (A) branquial esqueleto dorsal. (B - D) Rotação e incisão entre as placas dorsal dente. (E) corte lateral em tecido mole para abrir ainda mais a base do tubo digestivo. Esqueleto (F) Branquial colocado na parte inferior de uma lamela pronto para montagem. (L) Em segundo lugar lamela colocada na metade anterior do esqueleto branquial (acima placas dentárias dorsais). (H - I)montagem plana do esqueleto branquial abrindo abas placa dorsal dente e deslizando entre duas lamelas. Veja os passos 4.1 até 4.6 para obter mais detalhes. Barra de escala = 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Este protocolo resulta em um esqueleto montado branquial dissecados e plana (Figura 4), ​​onde uma variedade de importantes características tróficas podem ser quantificados. Do ponto de vista dorsal, todas as linhas de rastros branquiais, todas as placas da faringe dente, e quase todos os ossos branquiais podem ser facilmente visualizados e quantificados 22 - 24,35,36,38,42. Vermelho de Alizarina S reage também em uma ou rodamina filtro vermelho semelhante permitindo que a dupla marcação com outros marcadores (por exemplo, GFP transgénico 42) e um método alternativo de visualização. Fluorescência desaparece rapidamente na luz, para armazenar preps no escuro se imagens fluorescentes ou fenotipagem é planejado. A partir de uma vista ventral, as brânquias pode ser visualizada e a coloração quantificada 43. Preps podem ser armazenados em 100% de glicerol durante anos.

4.jpg "/>

Figura 4:. Stickleback Representante esqueleto branquial Dois exemplos de esqueletos branquial manchadas e apuradas são mostrados. (A) Brightfield imagem que mostra óssea marcado vermelho. (B) imagem fluorescente sob um conjunto rodamina filtro B. Exemplos de rastros, dentes e ossos são rotulados com carets, pontas de seta e asteriscos, respectivamente. Barras de escala = 2 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium Hydroxide (KOH) EMD PX1480-1
Glycerol Sigma-Aldrich G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF) Azer Scientific NBF-4-G
Alizarin Red S EMD AX0485-3
Microscope Cover Glasses 22 mm x 60 mm VWR 16004-350
100 mm x 10 mm Glass Petri Dish Kimble Chase 23064-10010 To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Can be poured into glass or plastic Petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay Sargent Art 22-4000 1 lb cream
Scintillation Vials (case of 500) Wheaton 986586 Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip) FST 11252-20 Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors  FST 15003-08 Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope Leica S6E with KL300 LED Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7 ml Denville C2170
Cardboard slide tray Fisher 12-587-10

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Ellis, N. A., Miller, C. T. Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton. J. Vis. Exp. (111), e54056, doi:10.3791/54056 (2016).

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