Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren Ap amyloïde plaques in de ziekte van Alzheimer muismodellen behulp methoxy-X04, die de bloed-hersenbarrière doorkruist en selectief bindt aan P-geplooide platen in dichte kern Ap-plaques. Hiermee pre-screening van plaque bevattende weefselcoupes voorafgaand aan immunokleuring en verwerking voor elektronenmicroscopie.
Abstract
Een gedetailleerd protocol is hier voorzien om amyloïde Aß plaques in de hersenen secties identificeren van de ziekte van Alzheimer muismodellen voor pre-inbedding immunokleuring (specifiek voor geïoniseerd calcium bindend adapter molecule 1 (IBA1), een calcium-bindend eiwit door microglia uitgedrukt) en de verwerking van weefsel voor elektronenmicroscopie (EM). Methoxy-X04 is een fluorescente kleurstof die de bloed-hersenbarrière doorkruist en selectief bindt aan P-geplooide platen in dichte kern Ap-plaques. Injectie van de dieren met methoxy-X04 voorafgaand aan het offeren en de hersenen fixatie laat pre-screening en selectie van de plaque met de hersenen secties voor verdere verwerking met tijdrovende manipulaties. Dit is vooral nuttig bij het bestuderen van vroege AD pathologie binnen specifieke hersengebieden of lagen die zeer weinig plaques, die aanwezig zijn in slechts een klein deel van de secties kan bevatten. Post-mortem verwerking van weefsel secties met Congo Red, Thioflavine S, en ThioflAvin T (of zelfs met methoxy-X04) kunnen labelen β-geplooide platen, maar vereist uitgebreide clearing met ethanol om overtollige verf te verwijderen en deze procedures niet verenigbaar zijn met ultrastructurele behoud. Ook zou het inefficiënt zijn om labeling uit te voeren voor Aß (en andere cellulaire merkers zoals IBA1) alle hersenplakjes van de gebieden van belang zijn, slechts een kleine fractie die Ap-plaques op de juiste plaats op te leveren. Belangrijk is Aß plaques zijn nog steeds zichtbaar na verwerking weefsel voor EM, waardoor een nauwkeurige identificatie van de gebieden (in het algemeen neer op een paar vierkante millimeters) te onderzoeken met de elektronenmicroscoop.
Introduction
Ap amyloïde plaquevorming is de voornaamste neuropathologische kenmerk van de ziekte van Alzheimer (AD). Maar meer gegevens suggereren belangrijke rol van het immuunsysteem bij ziekteprogressie 1,2. In het bijzonder, nieuwe gegevens van preklinische en klinische studies opgericht immuundisfunctie als een van de belangrijkste bestuurder en bijdrage aan AD pathologie. Met deze bevindingen, hebben de centrale en perifere immuuncellen als veelbelovende therapeutische doelen ontstaan voor AD 3. De volgende protocol combineert licht en elektronenmicroscopie (EM) tot nieuwe inzichten in de relatie tussen Aß plaque depositie en microglia fenotypische veranderingen in AD te genereren. Dit protocol maakt het mogelijk de etikettering van Ap-plaques in muismodellen van AD met behulp van in vivo injectie van de fluorescente kleurstof methoxy-X04. Methoxy-X04 is een Congo Red derivaat die gemakkelijk de bloed-hersenbarrière kan passeren naar de hersenen parenchym voeren en binden β-geplooide platen met een hogeffinity. Aangezien de kleurstof fluorescentie kan worden gebruikt voor in vivo detectie van Aß plaque depositie twee-foton microscopie 4. Eenmaal gebonden aan AB, is methoxy-X04 niet distantiëren of herdistribueren weg van plaques en behoudt hij zijn fluorescentie in de tijd. Algemeen wordt perifeer toegediend om voor niet-invasieve beeldvorming van de hersenen dynamiek 5. De fluorescentie blijft ook na aldehyde fixatie, waardoor correlatieve post-mortem analyses, met inbegrip van onderzoek van neuronale dood in de buurt van Ap-plaques 6.
Dit protocol maakt gebruik van de eigenschappen van methoxy-X04 naar de hersenen secties van APP SWE / PS1A 246e muizen te selecteren (APP-PS1; co-expressie van een dubbele mutatie op APP gen Lys670Asn / Met671Leu, en menselijke preseniline PS1-A264E variant) 7 dat AB vertonen plaques in specifieke gebieden van belang (hippocampus CA1, lagen radiatum en lacunosum-moleculare) Voorafgaand aan pre-inbedding immunokleuring tegen de microglia marker geïoniseerd-calcium bindend adapter molecule 1 (IBA1) de microglia cellichamen en processen met EM te visualiseren. De muizen krijgen intraperitoneale injectie van methoxy-X04 oplossing 24 uur vóór hersenen fixatie door middel transcardial perfusie. Coronale hersensecties worden verkregen met behulp van een vibratoom. Gedeelten met de hippocampus CA1 gescreend onder een fluorescentiemicroscoop op de aanwezigheid van Ap-plaques in strata radiatum en lacunosum-moleculare. Immunokleuring voor IBA1 worden osmiumtetroxide post-fixatie en kunststof hars inbedding vervolgens uitgevoerd op de geselecteerde hersenen secties. Aan het einde van dit protocol, kunnen de secties worden gearchiveerd zonder verdere ultrastructurele degradatie, klaar voor ultradunne snijden en ultrastructurele onderzoek. Belangrijk is, worden de plaques nog fluorescerende na immunokleuring met verschillende antilichamen, bijvoorbeeld IBA1 zoals in het onderhavige protocol. Ze worden donkerder than hun omgeving neuropil volgende osmiumtetroxide post-fixatie, onafhankelijk van methoxy-X04 kleuring, die helpt om de regio's van belang nauwkeurig te identificeren, over het algemeen tot een paar vierkante millimeter, worden onderzocht met de transmissie-elektronenmicroscoop.
Deze correlatieve aanpak biedt een efficiënte manier om specifieke hersengebieden paragrafen worden om na te gaan op het ultrastructurele niveau. Dit is vooral nuttig bij het bestuderen van vroege AD pathologie binnen bepaalde hersengebieden of lagen die slechts enkele Aß plaques aanwezig in slechts een klein deel van weefselsecties kunnen bevatten. Gedurende deze tijd bijzonder zou het inefficiënt zijn om immunokleuring voor Aß (en dubbele labeling voor andere cellulaire merkers zoals IBA1) gebruiken verschillende hersenplakjes alleen een kleine fractie die Ap-plaques op de juiste plaats op te leveren. Daarnaast injectie van levende muizen met methoxy-X04 voorafgaand aan het offeren en weefsel verwerking niet compromise de ultrastructurele behoud. Alternatieve werkwijzen zoals post-mortem kleuring met Congo Rood, Thioflavine S, Thioflavine T of methoxy-X04 op vaste weefselsecties vereisen kleuring differentiatie in ethanol, 8-11 die osmotische stress veroorzaakt en verstoort de ultrastructuur. Congo Rood is ook een bekend menselijk carcinogeen 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Alle experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional dier ethische commissie, in overeenstemming met de Canadese Raad over Animal Care richtlijnen zoals beheerd door de Animal Care Committee van de Université Laval. APP-PS1 mannelijke muizen tussen 4 en 21 maanden oud werden gebruikt. Deze dieren werden gehuisvest onder een 12 uur licht-donker cyclus bij 22-25 ° C met vrije toegang tot voedsel en water.
1. Methoxy-X04 oplossingspreparaat
- Bereid een 5 mg / ml oplossing van methoxy-X04 9 door oplossen methoxy-X04 in een oplossing van 10% dimethylsulfoxide (DMSO), 45% propyleenglycol en 45% natriumfosfaat-gebufferde zoutoplossing (0,9% NaCl in 100 mM fosfaatbuffer , pH 7,4).
- Met behulp van een microbalans Weeg 5 mg van de verbinding methoxy-X04. Onder een zuurkast, ontbinding van de methoxy-X04 in DMSO en roer tot een heldere groenachtige oplossing wordt verkregen. Achtereenvolgens voeg propyleenglycol en phosphate saline buffer onder roeren bij elke toevoeging.
- Roer de oplossing bij 4 ° C op een rotator O / N. Zorg voor een geelgroen emulsie. De oplossing kan maximaal twee maanden zonder degradatie worden bewaard bij 4 ° C.
2. Methoxy-X04 oplossing Injectie
- 24 uur voorafgaand aan perfusie, wegen de muizen en geeft elke muis een intraperitoneale injectie van methoxy-X04 in een dosis van 10 mg / kg lichaamsgewicht onder toepassing van een 27 G naald ½.
3. transcardial perfusie van de geïnjecteerde muizen
- Op de dag voor de perfusie, bereiden voldoende hoeveelheden fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 3,5% acroleïne en 4% paraformaldehyde (PFA) oplossingen 13 en bewaar ze bij 4 ° CO / N.
Opmerking: Deze oplossingen worden gebruikt voor perfusie en pre-inbedding immunohistochemie. Wees extra voorzichtig bij het werken met acroleïne, want het is bijtend en giftig voor zowelonderzoekers en het milieu. Bovendien, omdat acroleïne is bijtend voor plastic, gebruik dan altijd geschikt glaswerk tot acroleïne oplossingen voor te bereiden. - Op de dag van perfusie, filtreer de PFA en acroleïne door grove filterpapier van 25 urn partikelretentie.
- Tijdens de perfusie gebruikt een peristaltische pomp 15 ml PBS, 75 ml acroleïne en 150 ml PFA achtereenvolgens in de muis circulatie leveren, met een stroomsnelheid van 25 ml / min.
Wees voorzichtig. Voer perfusie strikt in een zuurkast om schadelijke dampen van PFA en acroleïne te vermijden.- Voor het instellen van de pomp, steek het ene uiteinde in de PBS-oplossing, vul de buis (die in totaal ongeveer 15 ml) met PBS, en vast te stellen een 25 G gevleugelde bloedafnames naald naar de andere kant. Te allen tijde, ervoor te zorgen dat de slang vrij is van luchtbellen.
- Plaats de buis direct in het acroleïne fles nadat de perfusie pomp met de buis gevuld met PBS.
- Eenaesthetize één muis tegelijk met een 90 mg / kg lichaamsgewicht dosis gewicht van natriumpentobarbital intraperitoneaal geïnjecteerd met een 27 G naald ½. Evalueren reacties op de staart / teen wringt. Ga verder alleen als de muis niet reageert op een dergelijke aversieve, pijnprikkels.
- Zet de muis in rugligging (liggend op de rug met het gezicht naar boven) door taping de voorpoten en achterpoten aan het werkvlak en zorgvuldig het hart bloot te leggen zonder schade aan andere organen. Zorg ervoor dat u snel aan het werk na het aanprikken van het middenrif.
- Voer een incisie door de huid met chirurgische schaar langs de thoracale middellijn begint caudaal van de ribbenkast en ga rostraal van het sleutelbeen.
- Voeg twee extra zijdelingse insnijdingen langs de basis van de ventrale ribbenkast. Beweeg en speld de twee kleppen van de huid, en zorg ervoor dat de gehele borstholte bloot te leggen.
- Houd de zwaardvormig proces met stompe tang om de borstholte bloot te leggen en te stabiliseren de puntige schaars. Snij door het diafragma en de ribbenkast, voorzichtig om te voorkomen dat aanprikken van de longen, en voortzetting van de snede rostraal van de sleutelbeenderen. Zorg ervoor dat u snel aan het werk na het aanprikken van het middenrif.
- Voorzichtig scheur de pericardiale zak met stompe tang. Houd het hart gestage met stompe tang, knip de juiste atrium, en start de infusie van PBS. steek de bloedafname naald in de linker ventrikel onmiddellijk.
- Perfuseren de muis met PBS (in de buis), gevolgd door acroleïne gedurende 3 minuten (overeenkomend met 75 ml) en vervolgens overschakelen naar PFA gedurende 6 minuten (overeenkomend met 150 ml). Zorg ervoor dat de pomp stroom onderbreken voordat u oplossing om te voorkomen dat luchtbellen uit het invoeren van de buis.
- Onthoofden de muis en haalt de vaste hersenen en plaats deze direct in een glazen flacon met 4% PFA gedurende ten minste 2 uur bij 4 ° C.
- Aan de hersenen te extraheren, een schaar en pincet door de huid te snijden om de schedel bloot te leggen. breken voorzichtig de schedel open in tussen de ogen, en de chip uit kleine stukjes van het aan de onderliggende hersenen bloot te leggen.
- Verwijder voorzichtig de blootgestelde hersenen en post fix met 4% PFA voor nog eens 2 uur alvorens verder te gaan voor vibratome snijden.
4. Brain Sectioning Met behulp van een Vibratome
- Was de vaste hersenen 3 maal met koud PBS. Met een scherp scheermesje, verwijder de bulbus olfactorius (tenzij deze regio wordt onderzocht) en snijd de hersenen dwars in 2-3 stukken van ongeveer gelijke lengte, die gelijktijdig om de procedure te versnellen kan worden doorgesneden.
- Lijm de stukken van hersenweefsel verticaal op het monster plaat vastgezet in de lade. Zorg ervoor dat het glad snijvlak kleeft stevig aan het monster bord en niet wordt verdreven tijdens het snijden procedure. Voeg genoeg PBS-oplossing in de lade totdat het gehele brein oppervlak volledig is ondergedompeld. Het is belangrijk om th houdene hersenen stukken en de daaropvolgende secties volledig ondergedompeld in PBS gedurende deze stap.
- Plaats de bak in de vibratome Stel de snijsnelheid tot 0,5 mm / sec, de snijbeweging frequentie 90 Hz en de voeding dikte 50 urn om 50 pm dikke secties verkregen. Vervolgens transfer secties in 20 ml glazen flesjes bevattende cryobeschermingsoplossing (40% PBS, 30% ethyleenglycol en 30% glycerol) met een fijne kwast. Bewaar de flesjes bij -20 ° C tot verder gebruik. Als alternatief houdt de secties in PBS onmiddellijk screening zoals beschreven in de volgende stappen.
5. Sectie screening op de aanwezigheid van methoxy-X04-gekleurd Plaques
- Met behulp van een stereotaxische muizenhersenen atlas 14, selecteert hersensecties die het gebied van belang, bijvoorbeeld de hippocampus CA1 zoals in het onderhavige voorbeeld. Plaats elke sectie in een put binnen een 24-well cultuur plaat met genoeg cryoprotectant oplossingom te voorkomen dat de delen uitdroogt.
- Bestudeer elke sectie achtereenvolgens, om te voorkomen dat uitdrogen van de secties, met behulp van de volgende procedure:
- Voeg een druppel PBS tot een microscoopglaasje met een wegwerpbare pipet en plaats het gedeelte over de druppel.
- Onderzoek de afdeling onder een fluorescentiemicroscoop om gebieden met methoxy-X04 gemerkt Ap-plaques te identificeren.
Opmerking: methoxy-X04 kan gemakkelijk worden gevisualiseerd met fluorescentie- ultraviolet (UV) filter (excitatie 340-380 nm).
- beelden van gebieden van belang (ROI) in helderveld en fluorescentie opnamestand zonder de microscoop podium, aangezien elk beeld hetzelfde gebied beide velden om de aanwezigheid van de plakken direct correleren met de structurele regio moeten aantonen het weefsel sectie.
- Opslaan en de naam van de foto's genomen op basis van het dier nummer. Registreer ook de put nummer in de plaat en het gebied van de foto taken. Bijvoorbeeld, Ex: 9978A1B; Dierlijk nummer: 9978; Nou nummer: A1; Field: Bright. Plaats het achterste gedeelte in goed zijn aangewezen wanneer de beeldvorming is voltooid.
Opmerking: Uiteindelijk voor elke sectie onderzochte twee beelden worden verkregen, een in helderveld en een in UV gebied. - Open de twee beelden van dezelfde ROI (één in heldere gebied en de andere in UV-gebied) in Image J, en met behulp van de MosaicJ plugin, lijn de randen van de twee beelden en sla het op elkaar afgestemd en gecombineerde beeld op basis van de goed nummer het kwam van.
- Sla de afbeelding in een aparte map met het nummer van het betreffende dier. Combineer de beelden te identificeren en lokaliseren van de plaques in de sectie weefsel en hebben een volledig zicht op de hele sectie in de twee verschillende velden (licht en UV).
- Na de screening is voltooid, slaat de onderzochte secties bij -20 ° C in een 24-well kweekplaat met cryoprotectant tot immunokleuring of verdere verwerking carried out.
6. Pre-inbedding Immunokleuring voor IBA1
Opmerking: Voer de immunokleuring voor IBA1 op geselecteerde vrij zwevende delen door het plaatsen van de plaat op een langzaam rocker bij RT.
- Grondig wassen van de secties 3 maal met ongeveer 1 ml PBS, elke wasbeurt voor de duur van 10 min.
- Quench endogene peroxidasen met 0,3% waterstofperoxide in PBS gedurende 10 min. Deze stap voorkomt niet-specifieke peroxidase activiteit, wat belangrijk is voor achtergrondkleuring voorkomen.
- Was het weefsel in PBS 3 keer gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer de secties in 0,1% natriumboorhydride in PBS oplossing gedurende 30 min. Deze stap is belangrijk om alle resterende aldehyden uit de fixatiestap verminderen, en is vooral belangrijk als acroleïne weefsels bruikbaar fixatie.
- Was het weefsel in PBS 3 keer voor 10 minuten per keer en zorg ervoor dat alle bellen te verwijderen.
- Blokkeer de secties voor 1 uur.Verschillende antilichamen kunnen verschillende blokkering tijden en oplossingen vereisen. Voor IBA1 bereiden blokkerende buffer bevattende 10% foetaal runderserum, 3% runderserumalbumine en 0,01% Triton X-100 in 50 mM Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,4).
Opmerking: De blokkeringsstap is niet-specifieke binding van het primaire antilichaam te voorkomen. De lage concentratie van Triton X-100 permeabilisatie zorgt voor kleine membranen betere kleuring en laag genoeg om de meeste ultrastructurele eigenschappen van weefsel onder EM behouden. - Verwijder de blokkerende buffer van het weefsel, en incubeer in primaire antilichaam-oplossing (konijn anti-IBA1, verdund [1: 1000] in het blokkeren van buffer) bij 4 ° CO / N.
- Wassen in TBS 3 maal gedurende 10 minuten per keer.
- Incubeer in secundair antilichaam (geit anti-konijn geconjugeerd aan biotine) [1: 200] in 0,05 M TBS gedurende 90 min.
- Wassen in TBS 5 maal gedurende 5 minuten elke keer.
- Incubeer in avidine-biotine complex oplossing (Avidin [1: 100], Biotine [1: 100]) in TBSoplossing gedurende 1 uur.
- Wassen in TBS 5 maal gedurende 5 minuten elke keer.
- Onthullen de IBA1 kleuring met 0,05% diaminobenzidine (DAB) en 0,015% waterstofperoxide in TBS gedurende 8 min.
Opmerking: De timing van de DAB-ontwikkeling kan variëren van protocol naar protocol en moet worden bepaald door snel onderzoek van de gekleurde coupes onder een lichtmicroscoop.
Opmerking: Voor IBA1, moet men in staat zijn om duidelijk te visualiseren de cel organen en processen van de IBA1 gekleurd microglia bij 20X (zie figuur 2 voor representatieve bijvoorbeeld). Voorzichtig DAB gebruiken, omdat het een bekend carcinogeen. - Voorkomen dat over-ontwikkeling door zorgvuldige bewaking van de secties (zoals hierboven beschreven) tijdens deze stap. Stop de reactie door het wassen van de secties in gekoelde PB 5 maal gedurende 5 minuten per keer.
7. Verwerking bij Electron Microscopy
- Bereid 1% osmiumtetroxide-oplossing in PBS in een glazen flesje. Osmiumtetroxide is lichtgevoelig; hebben betrekking op de glass flacon met aluminiumfolie om de oplossing tegen licht te beschermen.
Voorzichtig gebruik osmiumtetroxide, want het kan gevaarlijk chemisch. Voer deze en de volgende stappen in een zuurkast. - Verwijder de PBS uit de secties en verspreiden ze plat met een fijn penseel. Voer deze stap een goed op een moment om de secties uitdroogt. Zorg ervoor dat u de onderdelen plat onmiddellijk voor het toevoegen van osmiumtetroxide, als alle plooien in de secties permanent zal worden en een poging om af te vlakken weefsel na osmium fixatie wordt alleen de secties te breken.
- Dompel de secties in osmiumtetroxide gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, het toevoegen van een druppel osmiumtetroxide tegelijk met een transferpipet om te voorkomen dat delen van het vouwen. Bedek het goed met aluminiumfolie om de onderdelen te beschermen tegen licht.
Opmerking: Deze stap corrigeert de lipiden binnen de secties. Het weefsel zal verschijnen erg donker na osmium post-fixatie. - Terwijl de secties zijn in osmium TetroXide, bereiden kunststof hars in een wegwerp beker door het mengen van 20 g component A, 20 g component B, 0,6 g component C en 0,4 g component D. Combineer de onderdelen samen in de bovenstaande volgorde en meng ze goed met een 10 ml serologische pipet totdat een uniforme kleur wordt verkregen.
- Breng het mengsel bereid aluminium droogschalen. Zij zullen het weefsel secties zodra ze zijn uitgedroogd.
- Uitdrogen de secties in toenemende concentraties ethanol gedurende 2 min in de volgende volgorde: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- Om de resterende ethanol te verwijderen, dompel de secties in propyleenoxide 3 keer gedurende 2 minuten per keer. Verwijder het uitgedroogd-secties van de 24-well cultuur plaat in 20 ml glazen flesjes. altijd glazen flesjes bij het werken met propyleenoxide zoals kunststof oplost en onderhouden voorzichtigheid, want het is gevaarlijk.
- Gebruik een gebogen glazen pipet tip of een geldboete penseel aan de secties van propyleenoxide soluti overdragentot in de hars en verlaat O / N infiltratie bij kamertemperatuur. Wees voorzichtig niet aan de hars met propyleenoxide verdunnen.
- Insluiten deel met de hars op poly-chloor-tri-fluor-ethyleen (PCTFE) filmsheets:
- Plaats de aluminium met een gewicht van schalen met de monsters in een 50 - 60 ° C oven gedurende 10 - 15 min voorafgaand aan het inbedden van de hoofdstukken over PCTFE filmsheets.
- Bij het inbedden van secties, werken met een aluminium met een gewicht gerecht per keer. Met een fijne kwast, verf een dunne laag hars op één PCTFE filmblad.
- Verplaats een deel van het weefsel op een moment uit de aluminium wegen schotel naar de PCTFE filmblad. Verwijder overtollige hars uit rond het weefsel, en let niet te verstoren.
- Na het verplaatsen van alle secties van de ene wegen schotel naar de PCTFE filmblad, plaats een tweede PCTFE laken over het eerste, het creëren van een sandwich van weefsel en hars tussen 2 vellen.
- Polymeriseren de hars in een incubator gedurende 3 dagen bij 55-60 ° C.
- Het materiaal is nu klaar voor ultradunne coupes en ultrastructurele onderzoek gespecialiseerde technieken die vaak worden uitgevoerd door EM kernfaciliteiten. Bewaar de monsters tussen PCTFE film platen veilig bij RT zonder ultrastructurele degradatie.
Opmerking: De daaropvolgende stappen voor ultradunne snijden en transmissie elektronenmicroscopie onderzocht worden in een apart protocol 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie illustreert de resultaten die kunnen worden verkregen bij verschillende kritische stappen van het protocol. Met name de resultaten tonen voorbeelden van de hersenen secties met methoxy-X04 gekleurd plaques in specifieke regio en lagen van belang: de hippocampus CA1, lagen radiatum en lacunosum-moleculare. De plaques en regionale / lamellaire organisatie van de hippocampus achtereenvolgens gevisualiseerd door een combinatie van UV en helderveld filters (figuur 1). De geselecteerde hersengebieden worden vervolgens immunostained en verwerkt EM terwijl het bijhouden van hun Aß plaques, aangezien ze nog steeds fluorescent na immunokleuring en donkerder dan de omliggende neuropil na behandeling met osmiumtetroxide en verankering (figuur 1). Dit maakt het mogelijk om de gebieden (doorgaans enkele millimeters kwadraat) te identificeren om samen met de elektronenmicroscoop gebaseerd op de locatie van plaques. Verder wordt een verbeterde protocol voor pre-inbedding immunokleuring van microglia met IBA1 beschreven. Dit protocol levert een uitzonderlijke visualisatie van microgliale cellichamen, grote en kleine werkwijzen (figuur 2) en penetratie van de antilichamen in de hersenen secties. Het vergemakkelijkt dus de identificatie van de microglia cellichamen en processen op het ultrastructurele niveau, en de studie van hun interacties met Ap-plaques (figuren 3 en 4).
Figuur 1. Visualisatie van Ap-plaques in 21-maanden oude APP-PS1 muizen met behulp van licht Microscopy, na systemische injectie van de fluorescente kleurstof methoxy-X04. AB) Dual beeldvorming van een hippocampus deel met behulp van helderveld en fluorescentie modes. De regio's en lagen van belang worden gevisualiseerd onder felle veld(A) en de Aß plaques achtereenvolgens gelokaliseerd met UV-filter op een afstand van 340-380 nm (B). CD) Dubbele beeldvorming van andere hippocampus gedeelte voor (C) en na (D) pre-inbedding immunokleuring voor IBA1, gevolgd door post-fixatie in osmium tetroxide, dehydratatie in ethanol en inbedding in een kunststofhars zoals vereist voor transmissie elektronenmicroscopie. Te worden opgemerkt, de plaque (omringd door een stippellijn) is nog steeds zichtbaar op weefsel verwerking voor elektronenmicroscopie. Het visualiseren van de plaques bij het afsnijden van het weefsel blokken zorgt voor een nauwkeurige selectie van de gebieden op de foto met een hoge ruimtelijke resolutie. Schaal bars = 300 pm voor A en B, 150 pm voor C en D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vi sualization van Microgliale Cell Body and Fine Processen in 21-maanden oude APP-PS1 muizen door IBA1 kleuring aan het licht microscopisch niveau. AB) Voorbeelden van IBA1 gekleurd microglia met een geclusterde verdeling wanneer ze associëren met Ap-plaques (geïdentificeerd door correlatieve fluorescentiebeelvorming van methoxy-X04, omringd door een stippellijn) als waargenomen voor osmiumtetroxide post-fixatie en kunststof hars inbedding. CD) Voorbeelden van IBA1 gekleurd microglia geassocieerd met Ap-plaques na osmiumtetroxide post-fixatie en kunststof hars inbedding. Merk op dat de plaques donkerder dan hun omgeving neuropil volgende osmium post-fixatie, waardoor het bijhouden van hun locatie. Schaal bar = 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
060 / 54060fig3.jpg "/>
Figuur 3. Dual Visualisatie van Ap-plaques en IBA1-immunokleuring in 6-maanden oude APP-PS1 muizen op de Ultrastructureel niveau. A) Voorbeeld van dichte kern Ap-plaque erkend door zijn compacte fibrillaire structuur (zie inzet) en de associatie met dystrofische neurieten met ultrastructurele kenmerken van autofagie. B) Voorbeeld van IBA1 gekleurde microgliale proces (m; gekleurd violet) gevonden in de buurt van de Ap-plaque dat amyloïde afzettingen bevat. Mitochondriale veranderingen (aangegeven door sterretjes) kan ook worden gezien in de microgliale proces. Opgemerkt, werd dit beeld bij het weefsel-hars grens verkregen (wit, aan de rechterkant van de foto) waar de penetratie van antilichamen en kleuringsintensiteit maximaal. Schaal bars = 2 micrometer voor A, 1 micrometer voor B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Extra voorbeelden van IBA1-immunostained Microglia in 6-maanden oude APP-PS1 muizen als waargenomen met Transmission Electron Microscopy. AD) Voorbeelden van IBA1 gekleurd microgliale cel lichaam en processen (m) verder verkregen uit het weefsel-hars grens , die een uitstekende penetratie van de antilichamen en kleuringsintensiteit dieper in de sectie met dit protocol. bv = bloedvat, d = dendriet, in = integratie, s = dendritische wervelkolom, t = axon terminal. De pijlpunten tonen synaptische spleten. Schaal bars = 1 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol legt een korrelerende aanpak voor het richten van dichte kern Ap-plaques met EM. Methoxy-X04 in vivo injectie maakt een snelle selectie van de hersenen secties die Ap-plaques in bepaalde gebieden en lagen van het belang van de hippocampus CA1, lagen radiatum en lacunosum-moleculare bevatten, bijvoorbeeld. In het onderhavige voorbeeld werd methoxy-X04 pre-screening gecombineerd met pre-inbedding immunokleuring voor IBA1 het onderzoeken hoe verschillende microgliale fenotypes interactie met synapsen op het ultrastructurele niveau in de aanwezigheid van dichte kern Ap-plaques.
Microglia zijn ongelooflijk reageren op hun omgeving en hun ontstekingsremmende activiteit is lang onderzocht in de context ondermijnen normale hersenfunctie en verbetering van de ontwikkeling van AD. In het bijzonder werden deze cellen betrokken bij neurodegeneratieve processen vanwege hun uitgebreide activering en afgifte van pro-inflammatoire cytokines, waardoor chrONIC neuroinflammation en verstoring van de normale hersenen homeostase 15. De laatste jaren echter, deze resident immune cellen bleken ook actief te verbouwen neuronale circuits in de gezonde hersenen, waardoor identificatie van nieuwe pathogene mechanismen 16,17. Hun fysiologische functies bij synapsen kunnen ontregelde worden tijdens neuroinflammation in AD, wat resulteert in verergerd synaptische verlies, op dit moment de beste pathologische correlaat van cognitieve achteruitgang in verschillende neurodegeneratieve aandoeningen 18,19.
De wijzigingen in de vorige pre-inbedding IBA1 kleuring 13 staan nu betere penetratie van antilichamen in de hersenpreparaten, en visualisatie van microgliale cellichamen en fijne processen op het ultrastructurele niveau. Over het algemeen, het protocol moet strikt worden uitgevoerd vanaf de muis perfusie tot kunststof hars inbedding van het weefsel secties, gezien het feit dat ultrastructurele degradatiedat op elk tussenstap kan de integriteit van de celmembranen, organellen, cytoskelet-elementen, enz compromitteren.
Dit protocol kan worden uitgevoerd zonder immunokleuring (door niet punt 6) uitsluitend zichtbaar dichte kern Aß plaques, maar ook een krachtig instrument om de complexe mechanismen van de pathogenese van AD bestuderen met betrekking tot Aß afzetting, zoals verschillende antilichamen kunnen worden gebruikt om focus op verschillende celtypen, waaronder perifeer-afgeleide macrofagen, endogene microglia, astrocyten, oligodendrocyten en hun voorlopers, evenals vele neuronale subtypen.
Gezien de in vivo injectie van methoxy-X04, kan het protocol niet worden uitgevoerd op vaste hersensecties, die het gebruik met post-mortem menselijke hersenmonsters uitsluit. Ook in tegenstelling tot immunokleuring tegen Aß die oplosbare en onoplosbare vormen van Aß, het gebruik van kleurstoffen binding aan etiketten P-geplooide sheet eiwitstructuren zoals methoxy-X04 staat alleen visualisatie van dichte kern plaques, die een beperking vormt.
Niettemin kan belangrijke toepassingen zijn studie van de rol van microglia en andere celtypes, die elkaar overlappen en versterken hun activiteiten en directe effecten op plaque homeostase en neuronale functie in de loop van AD pathologie kunnen hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. è Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
