Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for visualisering av amyloid Ap-plakk i Alzheimers sykdom musemodeller ved bruk av metoksy-X04, som krysser blod-hjerne-barrieren og selektivt bindes til p-foldede ark som finnes i tett kjerne Ap-plakk. Den lar pre-screening av plakk holdig vev seksjoner før farging og behandling for elektronmikroskopi.
Abstract
En detaljert protokoll er gitt her for å identifisere amyloid Ap-plakk i hjernen seksjoner av Alzheimers sykdom musemodeller før pre-innstøping immunofarging (spesielt for ionisert kalsium-bindende adapter molekyl 1 (IBA1), et kalsiumbindende protein uttrykt av mikroglia) og behandling vev elektronmikroskopi (EM). Metoksy-X04 er et fluorescerende fargestoff som krysser blod-hjerne-barrieren og selektivt binder til P-plissert ark som finnes i tett kjerne Ap-plakk. Injeksjon av dyrene med metoksy-X04 før ofre og hjernen fiksering kan pre-screening og valg av plakk holdige hjernen seksjoner for videre behandling med tidkrevende manipulasjoner. Dette er spesielt nyttig når man vil studere tidlig AD patologi innenfor bestemte områder av hjernen eller lag som kan inneholde svært få plakk, til stede i bare en liten brøkdel av seksjonene. Post-mortem prosessering av vevssnitt med Congo Red, Thioflavin S, og Thioflavin T (eller med metoksy-X04) kan merke p-foldede ark, men krever omfattende rydding med etanol for å fjerne overflødig fargestoff og disse prosedyrene er uforenlig med ultra bevaring. Det ville også være ineffektivt å utføre merking for Ap (og andre cellulære markører så som IBA1) på alle hjerne seksjoner fra de regioner av interesse, bare for å gi en liten fraksjon inneholdende Ap-plakk på riktig sted. Viktigere, Ap-plakk er fremdeles synlige etter vev behandling for EM, slik at for en nøyaktig identifikasjon av områdene (vanligvis ned til noen få kvadratmillimeter) for å undersøke med elektronmikroskop.
Introduction
Amyloid Ap plakkdannelse er hovednevropatologiske kjennetegn på Alzheimers sykdom (AD). Men økende bevis antyder viktige roller i immunsystemet i sykdomsprogresjon 1,2. Særlig nye data fra prekliniske og kliniske studier etablert immun dysfunksjon som en hoveddriver og bidragsyter til AD patologi. Med disse funnene, har sentrale og perifere immunceller dukket opp som lovende terapeutiske mål for AD tre. Følgende protokoll kombinerer lys og elektronmikroskopi (EM) for å generere ny innsikt i forholdet mellom Ap avleiring og mikrogliaceller fenotypiske endringer i AD. Denne protokollen tillater merking av Ap-plaketter i musemodeller av AD ved hjelp av in vivo injeksjon av fluorescerende fargestoff metoksy-X04. Metoksy-X04 er et Congo Red derivat som lett kan krysse blod-hjerne barrieren for å gå inn i hjernen parenchyma og binder β-plisserte ark med høyffinity. Siden fargestoff er fluoriserende, kan det bli brukt for in vivo deteksjon av Ap-avleiring med to-foton mikroskopi 4. Når bundet til Ap, betyr metoksy-X04 ikke distansere eller redistribuere unna plakk, og den beholder sin fluorescens over tid. Det er generelt administreres perifert for å gi rom for ikke-invasiv avbildning av hjernen dynamikk 5. Fluorescens forblir også følgende aldehyd fiksering, noe som åpner for samsvarende post-mortem analyser, inkludert undersøkelse av neuronal død i nærheten av Ap-plakk 6.
Denne protokollen tar nytte av egenskapene til metoksy-X04 for å velge hjerne seksjoner fra APP SWE / PS1A 246E mus (APP-PS1, coexpressing en dobbel mutasjon ved APP-genet Lys670Asn / Met671Leu, og menneskelig presenilin PS1-A264E variant) 7 som utviser Ap plakk i bestemte områder av interesse (hippocampus CA1, strata radiatum og lacunosum-moleculare) Før pre-embedding farging mot microglial markør ionisert kalsium-bindende adapter molekyl 1 (IBA1) for å visualisere mikrogliaceller celle organer og prosesser med EM. Musene fikk en intraperitoneal injeksjon av metoksy-X04-løsning, 24 timer før fiksering hjernen gjennom transcardial perfusjon. Koronale hjernen seksjoner oppnås ved hjelp av en vibratome. Seksjoner som inneholder hippocampus CA1 er skjermet under et fluorescerende mikroskop for tilstedeværelse av Ap-plakk i strata radiatum og lacunosum-moleculare. Farging for IBA1 er osmiumtetroksyd post-fiksering, og plast harpiks innebygging deretter utføres på de valgte hjernen seksjoner. På slutten av denne protokollen, kan delene bli arkivert uten videre ultrastructural degradering, klar for ultratynne seksjonering og ultrastructural eksamen. Viktigere er plaketter fortsatt fluorescerende etter farging med forskjellige antistoffer, for eksempel IBA1 som i denne protokollen. De blir mørkere tHan deres omkringliggende neuropil følgende osmiumtetroksyd post-fiksering, uavhengig av metoksy-X04-farging, noe som bidrar til nøyaktig identifisere regioner av interesse, vanligvis ned til noen få kvadratmillimeter, som skal undersøkes med transmisjonselektronmikroskop.
Dette samsvarende tilnærmingen gir en effektiv måte å identifisere spesifikke hjerne seksjoner for å undersøke på ultra nivå. Dette er spesielt nyttig når man vil studere tidlig AD patologi, innenfor bestemte områder av hjernen eller lag som bare kan inneholde noen Ap-plaketter, som finnes i bare en liten brøkdel av vevssnitt. I disse tider spesielt, vil det være ineffektivt å bruke immunofarging for Ap (og dobbel merking for andre cellulære markører så som IBA1) ved flere hjerneseksjoner ganske enkelt for å gi en liten fraksjon inneholdende Ap-plakk på riktig sted. I tillegg injeksjon av levende mus med metoksy-X04 før ofre og vev behandling ikke compromise den ultra bevaring. Alternative metoder som post-mortem farging med Congo Red, Thioflavin S, Thioflavin T eller metoksy-X04 på faste seksjoner vev krever farging differensiering i etanol, 8-11 som fører osmotisk stress og forstyrrer ultrastructure. Congo Red er også et kjent karsinogen for mennesker 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Alle forsøkene ble godkjent og utført i henhold til retningslinjene i Institutional dyreetikk komité, i samsvar med den kanadiske Rådet for dyrestell retningslinjer som forvaltes av Animal Care komité Université Laval. APP-PS1 hannmus mellom 4 og 21 måneders alder ble brukt. Disse dyrene ble holdt under en 12 timers lys-mørke-syklus ved 22-25 ° C med fri adgang til mat og vann.
1. metoksy-X04 Løsning Forberedelse
- Fremstille en 5 mg / ml løsning av metoksy-X04 9 ved å oppløse metoksy-X04 i en oppløsning inneholdende 10% dimetylsulfoksid (DMSO), 45% propylenglykol og 45% natriumfosfat-bufret saltoppløsning (0,9% NaCl i 100 mM fosfatbuffer , pH 7,4).
- Ved hjelp av en mikrovekt, veie 5 mg av den metoksy-X04 forbindelsen. Under en avtrekkshette, oppløse metoksy-X04 i DMSO og omrør inntil det er oppnådd en klar grønnaktig løsning. Stadig legge propylenglykol og phosphate buffer saltløsning under røring med hver tilsetning.
- Omrør løsningen ved 4 ° C på en rotator O / N. Skaff en gulaktig grønn emulsjon. Løsningen kan bli lagret ved 4 ° C i opptil to måneder uten nedbrytning.
2. metoksy-X04 Solution Injection
- 24 timer før perfusjon, veie musene og gi hver mus en intraperitoneal injeksjon av metoksy-X04 ved en dose på 10 mg / kg kroppsvekt ved bruk av en 27 ½ G nål.
3. Transcardial perfusjon av Injisert Mus
- På dagen før perfusjonen fremstille hensiktsmessige volumer av fosfatbufret saltvann (PBS), 3,5% akrolein, og 4% paraformaldehyd (PFA) løsninger 13 og lagre dem ved 4 ° CO / N.
Merk: Disse løsningene skal brukes til både perfusjon og pre-embedding immunhistokjemi. Vær spesielt forsiktig når du arbeider med akrolein, som det er etsende og giftige for bådeforskere og miljø. I tillegg, siden akrolein er etsende for plast, alltid bruke egnet glass for å forberede akrolein løsninger. - På dagen for perfusjon, filtrere PFA og akrolein ved hjelp av grovt filterpapir på 25 mikrometer partikkel oppbevaring.
- Under perfusjon, bruk av en peristaltisk pumpe for å levere 15 ml PBS, 75 ml akrolein, og 150 ml av PFA suksessivt i musen sirkulasjon, ved en strømningshastighet på 25 ml / min.
Vær forsiktig. Utfør perfusjon strengt inne i en avtrekkshette for å unngå skadelige røyk av PFA og akrolein.- For å sette opp pumpen, sett den ene enden inn i PBS-løsning, fyll slangen (som holder ca 15 ml) med PBS, og fikse en 25 G bevinget blod samling nål til den andre enden. Til alle tider, sikre at slangen er fri fra alle luftbobler.
- Plasser røret direkte i akrolein flasken etter innstilling av perfusjon pumpe med røret fylt med PBS.
- enaesthetize en mus i en tid med en 90 mg / kg kroppsvekt dose av natriumpentobarbital intraperitonealt injisert med en 27 ½ G nål. Vurdere tiltak mot hale / tå klyper. Fortsett bare hvis musen ikke svarer til slike aversive, smertefulle stimuli.
- Fest musen i liggende stilling (liggende på ryggen med ansiktet oppover) ved taping forpotene og hindpaws til arbeidsflaten og nøye utsette hjertet uten å forårsake skade på andre organer. Sørg for å jobbe raskt etter punktering av membranen.
- Utfør et snitt gjennom huden med kirurgisk saks langs thorax linjen begynner hale til brystkasse og fortsett rostralt til krageben.
- Lag to ekstra laterale snitt langs bunnen av ventral brystkasse. flytte forsiktig og pin de to klaffene i huden, og pass på å utsette hele brysthulen.
- Hold xiphoid prosessen med butt pinsett for å avsløre brysthula og jevn den spisse sakses. Skjær gjennom membranen og brystkasse, er forsiktig med å unngå punktering lungene, og fortsetter snittet rostral til clavicles. Sørg for å jobbe raskt etter punktering av membranen.
- Forsiktig rive perikard sac med butt tang. Hold hjertet stødig med sløv tang, klippe høyre atrium, og starte infusjonen av PBS. Umiddelbart sette blod samling nål inn i venstre hjertekammer.
- Perfuse mus med PBS (i produksjonsrøret), etterfulgt av akrolein i 3 minutter (tilsvarende 75 ml) og deretter bytte til PFA i 6 minutter (tilsvarende 150 ml). Sørg for å stoppe pumpen flyt før du bytter løsning for å hindre bobler kommer inn i røret.
- Halshogge musen og trekke den faste hjernen og plassere den direkte inn i et hetteglass som inneholder 4% PFA i minst 2 timer ved 4 ° C.
- Å trekke ut hjernen, bruker saks og pinsett til å skjære gjennom huden for å avsløre skallen. Nøye bryte skallen open mellom øynene, og chip av små biter av det å avdekke underliggende hjernen.
- Fjern forsiktig den eksponerte hjernen og etter fikse det med 4% PFA for ytterligere to timer før du går videre for vibratome seksjonering.
4. Brain Seksjonering Ved hjelp av en Vibratome
- Vask den faste hjernen 3 ganger med kald PBS. Ved hjelp av et skarpt barberblad, fjerne luktelappen (med mindre dette er region under undersøkelse) og kuttet i hjernen på tvers inn i 2 - 3 stykker av omtrent lik høyde, som alle kan være seksjonert samtidig for å akselerere prosessen.
- Lim bitene av hjernevev vertikalt på prøveplaten festet i skuffen. Pass på at den glatte snittflaten holder seg fast til prøveplaten og blir ikke forskyves under seksjonering prosedyren. Legg nok PBS løsning inn i skuffen til hele hjernen overflaten er helt under vann. Det er viktig å holde the hjerne stykker og påfølgende avsnittene fullstendig oppslukt i PBS gjennom dette trinnet.
- Plasser skuffen i vibratome Juster snittehastigheten til 0,5 mm / sek, snitte frekvensen til 90 Hz, og mate tykkelse til 50 mikrometer for å gi 50 mikrometer tykke seksjoner. Deretter overføre seksjonene inn i 20 ml glassampuller inneholdende cryobeskyttelsesmiddeloppløsning (40% PBS, 30% etylenglykol, og 30% glycerol) ved hjelp av en fin pensel. Oppbevar ampuller ved -20 ° C inntil videre anvendelse. Alternativt holde seksjonene i PBS i umiddelbar screening som beskrevet i følgende trinn.
5. § Screening for tilstedeværelse av metoksy-X04-farget Plaketter
- Ved hjelp av en stereotaksisk musehjerne atlas 14, velger hjerneseksjoner inneholdende regionen av interesse, for eksempel, hippocampus CA1 som anvendt i det foreliggende eksempel. Plasser hver seksjon inn i en brønn i løpet av en 24-brønners dyrkingsplate inneholdende nok cryobeskyttelsesmiddeloppløsningfor derved å forhindre seksjonene i å tørke ut.
- Undersøk hver seksjon suksessivt, for å unngå uttørking delene, ved hjelp av følgende fremgangsmåte:
- Legg en dråpe PBS til et objektglass med en engangs pipette, og plasser delen på dråpe.
- Undersøk delen under et fluorescerende mikroskop for å identifisere områder som inneholder metoksy-X04 merket Ap-plakk.
Merk: metoksy-X04 lett kan visualiseres ved hjelp av en fluorescens ultrafiolett (UV) filter (eksitasjon 340-380 nm).
- Ta bilder av områder av interesse (ROI) i lyse felt, så vel som i fluorescens modus uten å bevege objektbord, ettersom hvert bilde må vise den samme region i begge felt for å korrelere nærvær av plakkene direkte til den strukturelle regionen vevet delen.
- Lagre og navngi bildene er tatt i henhold til dyret nummeret. Også registrere brønn nummer i platen og feltet av bildene TAken. For eksempel Ex: 9978A1B; Animal nummer: 9978; Brønn nummer: A1; Field: Bright. Sett delen tilbake i den tiltenkte godt når bildebehandling er fullført.
Merk: I slutten, for hver del undersøkt, er to bilder hentet, en i lyse felt og en annen i UV-feltet. - Åpne de to bildene av samme ROI (en i lyse felt og andre i UV-feltet) i bilde J, og bruker MosaicJ plugin, justere kantene på de to bildene og lagre justert og kombinert bildet i henhold til brønn nummer det kom fra.
- Lagre bildet i en separat mappe med nummeret på det aktuelle dyret. Kombiner bildene for å identifisere og lokalisere plakk i vevet delen, og har full utsikt over hele avsnitt i de to forskjellige felt (lyse og UV).
- Etter screening prosessen er fullført, lagrer de undersøkte seksjoner ved -20 ° C i en 24-brønners dyrkingsplate inneholdende kryobeskyttende middel til farging eller videre behandling er ca.rried ut.
6. Pre-embedding Farging for IBA1
Merk: Utfør farging for IBA1 på utvalgte fritt-flytende deler ved å plassere platen på en sakte beveger rocker på RT.
- Grundig vask seksjonene 3 ganger med ca. 1 ml PBS, hver vask varte i 10 min.
- Slukke endogene peroksidaser med 0,3% hydrogenperoksid i PBS-oppløsning i 10 min. Dette trinn hindrer at ikke-spesifikk peroksydase-aktivitet, noe som er viktig for å unngå bakgrunnsfarging.
- Vask vev i PBS 3 ganger i 10 minutter hver.
- Inkuber delene i 0,1% natriumborhydrid i PBS-løsning i 30 minutter. Dette trinn er viktig for å redusere eventuelt gjenværende aldehyder fra fiksertrinnet, og er spesielt viktig hvis akrolein anvendes i vev fiksering.
- Vask vevet i PBS 3 ganger i 10 minutter hver gang, og sørge for å fjerne alle boblene.
- Blokker seksjonene for en time.Ulike antistoffer kan kreve ulike sperretider og løsninger. For IBA1, forberede blokkeringsbuffer inneholdende 10% føtalt bovint serum, 3% bovint serumalbumin og 0,01% Triton X-100 i 50 mM Tris-bufret saltoppløsning (TBS, pH 7,4).
Merk: blokkeringstrinn er å forhindre ikke-spesifikk binding av det primære antistoff. Den lave konsentrasjonen av Triton X-100 gir liten permeabiliseringen av membraner for bedre farging, og er lav nok til å bevare de fleste ultrastrukturelle egenskaper av vevet under EM. - Fjern blokkeringsbuffer fra vevet, og inkuber i primær antistoffoppløsning (kanin-anti-IBA1, fortynnet [1: 1000] i blokkerende buffer) ved 4 ° CO / N.
- Vask i TBS 3 ganger i 10 minutter hver gang.
- Inkuber i sekundært antistoff (geite-anti-kanin-konjugert til biotin) [1: 200] i 0,05 M TBS i 90 min.
- Vask i TBS 5 ganger i 5 min hver gang.
- Inkuber i Avidin-Biotin-komplekset løsning (Avidin [1: 100], Biotin [1: 100]) i TBSløsning i 1 time.
- Vask i TBS 5 ganger i 5 min hver gang.
- Avsløre IBA1 farging med 0,05% diaminobenzidin (DAB) og 0,015% hydrogenperoksyd i TBS i 8 min.
Merk: Tidspunktet for DAB utbygging kan variere fra protokoll til protokoll og bør bestemmes ved raskt å undersøke de fargede seksjoner under et lysmikroskop.
Merk: For IBA1, bør man kunne klart å visualisere celle organer og prosesser av IBA1-farget microglia på 20X (se figur 2 for representativt eksempel). Vær forsiktig ved bruk av DAB, da det er en kjent kreftfremkallende. - Unngå over-utvikling ved nøye overvåking seksjonene (som beskrevet ovenfor) i løpet av dette trinnet. Stopp reaksjonen ved å vaske seksjonene i kjølt PB 5 ganger i 5 minutter hver gang.
7. Behandling for elektronmikroskopi
- Forbered 1% osmiumtetroksid løsning i PBS i et hetteglass. Osmiumtetroksyd er foto; dekke glass ampulle med aluminiumsfolie for å beskytte løsningen mot lys.
Vær forsiktig ved bruk av osmiumtetroksyd, som det er en veldig farlig kjemikalie. Utfør denne og de følgende trinnene inne i en avtrekkshette. - Fjern PBS fra seksjonene og spre dem flate med en fin pensel. Utfør dette trinnet en vel om gangen for å holde delene tørker ut. Pass på å flate ut deler umiddelbart før du legger osmiumtetroksyd, som folder i avsnittene vil bli permanent og forsøker å flate vev post osmium fiksering vil bare bryte seksjonene.
- Dyppe delene i osmiumtetroksyd i 30 minutter ved romtemperatur, tilsetning av en dråpe av osmiumtetroksyd i en tid med en overføring pipette, for å hindre delene fra å folde. Dekk godt med aluminiumsfolie for å beskytte delene mot lys.
Merk: Dette trinnet løser lipider innen seksjonene. Vevet vil vises veldig mørk etter osmium post-fiksering. - Mens delene er i osmium Tetroxide, forberede plast harpiks i en engangsbeger ved å blande 20 g komponent A, 20 g komponent B, 0,6 g komponent C, og 0,4 g komponent D. Kombiner komponentene sammen i ovennevnte rekkefølge og bland dem godt bruke en 10 ml serologisk pipette inntil en jevn farge er oppnådd.
- Overfør forberedt blandingen til aluminium som veier retter. De vil motta vevsdelene når de har blitt dehydrert.
- Dehydrere seksjonene i økende konsentrasjoner av etanol i 2 min i den følgende rekkefølge: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- For å fjerne rester av etanol, fordype seksjonene i propylenoksid 3 ganger i 2 min hver gang. Fjern de dehydrerte-seksjoner fra den 24-brønn kultur plate inn i 20 ml hetteglass. Bruk alltid hetteglass når du arbeider med propylenoksid som det løser opp plast, og opprettholde forsiktighet, da det er farlig.
- Bruk en bøyd glass pipette eller en fin pensel for å overføre seksjoner fra propylen oksid solutipå i harpiksen og la O / N for infiltrasjon ved RT. Vær forsiktig med å fortynne harpiks med propylenoksid.
- Embed seksjonen med harpiks på poly-klor-tri-fluor-etylen (PCTFE) filmsheets:
- Plasser aluminium som veier retter som inneholder prøvene inn i en 50 - 60 ° C ovn i 10 - 15 min før innebygging avsnittene om PCTFE filmsheets.
- Når embedding seksjoner, arbeide med en aluminiums veiing tallerken om gangen. Ved hjelp av en fin pensel, male et tynt lag av harpiks på en PCTFE film ark.
- Bevege en del av vevet på en gang fra aluminiumveieantennen til PCTFE filmark. Fjern overflødig resin fra hele vev, være forsiktig med å forstyrre den.
- Etter å ha flyttet alle delene fra en som veier rett til PCTFE film ark, plassere et andre PCTFE laken over den første, og skaper en sandwich av vev og harpiks i mellom 2 ark.
- Polymerisere harpiksen i en inkubator i 3 dager ved 55-60 ° C.
- Materialet er nå klart for ultratynne seksjonering og ultra undersøkelse, spesialiserte teknikker som ofte er utført av EM kjernefasiliteter. Oppbevar prøvene mellom PCTFE film ark trygt RT uten ultrastructural degradering.
Merk: De etterfølgende trinnene for ultratynne seksjonering og transmisjonselektronmikroskopi undersøkelse er forklart i en egen protokoll 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen viser resultatene som kan oppnås på ulike kritiske trinn i protokollen. Spesielt resultatene viser eksempler på hjernen seksjoner som inneholder metoksy-X04 farget plakk i bestemt region og lag av interesse: hippocampus CA1, strata radiatum og lacunosum-moleculare. Plakkene og regional / lamellær organiseringen av hippocampus ble suksessivt visualisert ved anvendelse av en kombinasjon av UV og lyse felt filtre (figur 1). De valgte hjerneseksjoner blir deretter immunfarget og behandlet for EM samtidig holde styr på sine Ap-plakk, tatt i betraktning at de fortsatt er fluorescerende etter farging, og blir mørkere enn det omgivende neuropil etter behandling med osmiumtetroksyd og innstøping (figur 1). Dette gjør det mulig å identifisere de områder (vanligvis noen få millimeter i kvadrat) for å undersøke med elektronmikroskop, basert på locasjon av plakk. Videre er en forbedret protokoll for pre-immunfarging innebygging av mikroglia med IBA1 beskrevet her. Denne protokollen gir et eksepsjonelt visualisering av mikrogliaceller cellelegemer, store og små prosesser (figur 2), så vel som inntrengning av antistoffene i hjernen seksjonene. Den muliggjør således identifisering av mikrogliaceller cellelegemer og fremgangsmåter ved ultra nivå, og studiet av deres interaksjon med Ap-plakk (figurene 3 og 4).
Figur 1. Visualisering av Ap-Plakk i 21-måneder gamle APP-PS1 Mus ved hjelp av lys Mikroskopi, etter systemisk Injeksjon av Fluorescent Dye metoksy-X04. AB) Dual avbildning av en hippocampus seksjon bruke lyse felt og fluorescens moduser. Regionene og lag av interesse er visualisert i sterkt felt(A), og Ap-plakk suksessivt lokalisert ved bruk av et UV-filter i et område på 340-380 nm (B). CD) dual avbildning av en annen hippocampus seksjon før (C) og etter (D) før innstøping farging for IBA1, etterfulgt av post-fiksering i osmiumtetroksyd, dehydrering i etanol, og innstøping i en plastisk harpiks som er nødvendig for transmisjonselektronmikroskopi. For å bli lagt merke til, plakk (omkranset av en stiplet linje) er fortsatt synlig på vev behandling for elektronmikroskopi. Visualisere plakk når trimming vevsblokker åpner for en presis utvalg av områdene til bilde med høy romlig oppløsning. Skala barer = 300 mikrometer for A og B, 150 mikrometer for C og D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Vi sualization av microglial Cell Body og fine Prosesser i 21-måneder gamle APP-PS1 mus ved IBA1 Farging på lyset mikroskopisk nivå. AB) Eksempler på IBA1-farget microglia viser en samlet fordeling når de forbinder med Ap-plaketter (identifisert av correlative fluorescens avbildning av metoksy-X04, omkranset av en stiplet linje) som ble observert før osmiumtetroksyd post-fiksering og plast harpiks innebygging. CD) Eksempler på IBA1-farget microglia assosiert med Ap-plaketter etter osmiumtetroksyd post-fiksering og plast harpiks embedding. Merk at plakk blir mørkere enn deres omkringliggende neuropil følgende osmium post-fiksering, og dermed gir sporing av deres plassering. Scale bar = 250 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
060 / 54060fig3.jpg "/>
Figur 3. Dual Visualisering av Ap-plaketter og IBA1-farging i seks måneder gamle APP-PS1 Mus på ultra nivå. A) Eksempel på tett kjerne Ap plakett anerkjent av sin kompakte fibrillary struktur (se innfelt) og tilknytning til dystrofe neurites med ultra funksjoner i autofagi. B) Eksempel på IBA1-farget microglial prosess (m; farget fiolett) funnet i nærheten Ap plakett som inneholder amyloid avleiringer. Mitokondrie endringer (vist med stjerner) kan også sees i microglial prosessen. Skal bemerkes, ble dette bilde innsamlet ved vev-harpiks kant (hvit, til høyre i bildet) hvor penetreringen av antistoffer og fargeintensitet er maksimal. Skala barer = 2 mikrometer for A, 1 mikrometer for B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tilleggs Eksempler på IBA1-immunostained Microglia i seks måneder gamle APP-PS1 Mus som ble observert med transmisjonselektronmikroskopi. AD) Eksempler på IBA1-farget microglial cellekroppen og prosesser (m) kjøpte fjernere fra vev-harpiks grensen og viser en utmerket gjennomtrengning av antistoffene og fargeintensitet dypere i seksjonen ved hjelp av denne protokollen. bv = blodkar, d = Dendritt, i = inkludering, s = dendrittiske ryggrad, t = axon terminalen. Pilene viser synaptiske spalter. Skala barer = 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen forklarer en samsvarende tilnærming for målretting tett kjerne Ap-plaketter med EM. Metoksy-X04 in vivo injeksjon tillater raske utvalg av hjerne seksjoner som inneholder Ap-plakk i bestemte regioner og lag av interesse, for eksempel hippocampus CA1, strata radiatum, og lacunosum-moleculare. I det foreliggende eksempel ble metoksy-X04 pre-screening kombinert med forhånds innstøping farging for IBA1 å studere hvordan ulike mikrogliaceller fenotyper samvirke med synapser på ultra nivå i nærvær av tett kjerne Ap-plakk.
Microglia er utrolig lydhør overfor sine omgivelser og deres inflammatorisk aktivitet har vært lenge studert i sammenheng for å undergrave normal hjernefunksjon og styrke utvikling av AD. Spesielt ble disse celler involvert i neurodegenerative prosesser på grunn av deres omfattende aktivering og frigjøring av pro-inflammatoriske cytokiner, fører til chronic nevroinflammasjon, og forstyrrelse av normal hjerne homeostase 15. I de senere år er imidlertid disse hørende immunceller ble også vist til aktivt å fornye nevrale kretser i friske hjernen, som fører til identifisering av nye patogene mekanismer 16,17. Deres fysiologiske roller i synapsene kan bli feilregulert under nevroinflammasjon i AD, noe som resulterer i forsterket synaptiske tap, for tiden den beste patologisk korrelerer med kognitiv svikt på tvers av ulike nevrodegenerative tilstander 18,19.
Endringene som er gjort i forrige pre-embedding IBA1 fargemetode 13 nå tillate bedre penetrasjon av antistoffer over hjernen seksjoner, samt visualisering av mikrogliaceller celle organer og fine prosesser på ultra nivå. Totalt sett må protokollen som skal utføres strengt fra mus perfusjon til plast harpiks innebygging av vev seksjoner, med tanke på at ultrastructural degraderingforekommer når som helst i mellom skritt kan kompromittere integriteten til cellemembraner, organeller, cytoskeletal elementer, osv.
Denne protokollen kan bli utført uten noen immunfarging (ved å utelate seksjon 6) for utelukkende å visualisere tett kjerne Ap-plakk, men den gir også et kraftig verktøy for å studere de komplekse mekanismer for AD patogenese med hensyn til Ap deponering, som forskjellige antistoffer kan brukes for å fokuserer på forskjellige celletyper, inkludert perifer-avledede makrofager, endogene mikroglia, astrocytter, oligodendrocytter og deres forløpere, så vel som mange neuronal subtyper.
Vurderer in vivo injeksjon av metoksy-X04, kan denne protokollen ikke utføres på faste hjerne seksjoner, som utelukker bruken med post-mortem menneskelige hjerne prøver. Også, ordreantallene til farging mot Ap hvilke etiketter løselig og uløselig former for Ap, bruk av fargestoffer binding til p-plisserte sHEET proteinstrukturer som metoksy-X04 bare tillater visualisering av tette kjerne plakk, hvilket utgjør en annen begrensning.
Likevel kan viktige bruksområder er å studere roller microglia og andre ulike celletyper, som overlapper og utvider sine aktiviteter, og kan ha direkte effekter på plakett homeostase og nevronale funksjon i løpet av AD patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. è Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
